厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌。該重組工程菌為SEQ ID NO.1所示的堿基序列。本發(fā)明獲得的工程菌，縮短了厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶表達(dá)時(shí)間，極大地提高該基因的表達(dá)量及功能活性，實(shí)現(xiàn)了厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶在厭氧氨氧化工藝上的應(yīng)用。厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌將其發(fā)酵后應(yīng)用于低碳氮比廢水的處理。
【專利說明】厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，由于生活水平的提供，飲食結(jié)構(gòu)的改善，導(dǎo)致生活污水碳氮 比失衡。對于低碳氮比生活污水按原有設(shè)計(jì)水質(zhì)運(yùn)行的二級污水處理廠大多數(shù)不能達(dá)標(biāo) 排放，使污水廠資源和資金浪費(fèi)較大。同時(shí)，在傳統(tǒng)的硝化/反硝化工藝處理低碳氮比污 水時(shí)，因碳源不足，造成在生物脫氮過程中硝化/反硝化過程不完全，導(dǎo)致亞硝酸鹽大量累 積，脫氮效率低，使出水總氮含量嚴(yán)重超過排放標(biāo)準(zhǔn)。因此，處理低碳氮比的生活污水迫在 眉睫。
[0003] 厭氧氨氧化（Anaerobic ammonium oxidation, Anammox)是指在厭氧或缺氧條 件下，微生物以NH4+-N為電子供體，以Ν02_-Ν為電子受體，將NH 4+-N、N02_-N轉(zhuǎn)變?yōu)镹2和少量 NCV-N的生物氧化過程。Jetten和Tal等研究發(fā)現(xiàn)，相比傳統(tǒng)硝化/反硝化工藝，厭氧氨氧 化是自養(yǎng)的微生物過程，不需投加有機(jī)物以維持反硝化，該過程可降低50%的曝氣量、100% 的有機(jī)碳源以及90%的運(yùn)行費(fèi)用，解決了低碳氮比污水處理過程中有機(jī)碳源不足限制微生 物生長的問題，且污泥產(chǎn)量少，非常適合低碳氮比廢水的處理。Ruiz等研究表明，以厭氧氨 氧化為主體的污水處理工藝的研究和開發(fā)，給我國目前污水處理界面臨的低碳氮比廢水脫 氮難、能耗高、污泥產(chǎn)量大等問題帶來了曙光。
[0004] 厭氧氨氧化技術(shù)的關(guān)鍵是保持反應(yīng)器內(nèi)足量的厭氧氨氧化菌，以保證較高的處 理能力。但自然的厭氧氨氧化菌生長緩慢，時(shí)代周期長達(dá)11天，生長條件苛刻，不能短時(shí) 間高濃度富集培養(yǎng)，使將聯(lián)氨氧化為最終的環(huán)境友好型產(chǎn)物N 2的厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化 酶HZO在厭氧氨氧化反應(yīng)過程中的應(yīng)用受限，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)大量聯(lián)氨（又稱肼）累積，由于 肼極毒，當(dāng)其從細(xì)菌內(nèi)釋放到水體時(shí)會嚴(yán)重污染水體，從而影響人類活動及健康。近年，對 Anammox菌中HZO酶的研究日益增多，王惠和祖波等研究發(fā)現(xiàn)HZO酶是厭氧氨氧化過程中 極其重要的酶。Quan Z X和Li X R等人從分子生物學(xué)角度，先后成功的利用Ana-hzolf (5, -TGTGCATGGTCAATTGAAAG-3'）/Ana-hzo2r (5, -ACCTCTTC (A/T) GCAGGTGCAT-3'）引物對厭 氧氨氧化反應(yīng)器污泥中Anammox細(xì)菌HZO酶進(jìn)行功能基因基礎(chǔ)上的擴(kuò)增，為研究厭氧氨氧 化提供了新思路。因此，從分子生物學(xué)角度，采用基因重組方法可有效解決厭氧氨氧化細(xì) 菌富集難問題，同時(shí)，重組細(xì)菌HZO酶基因的高效表達(dá)可實(shí)現(xiàn)累積聯(lián)氨（又稱肼）的高效去 除，解決低碳氮比廢水脫氮難，污泥產(chǎn)量大等問題，解除污水中聯(lián)氨對人體的潛在危害。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧 化酶的重組工程菌。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供該重組工程菌的構(gòu)建方法。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌，其特征在于該重組工程菌為SEQ ID NO. 1所不的喊基序列。
[0008] -種質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒包含上述的重組工程菌。
[0009] -種宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞包含上述的重組工程菌。
[0010] 一種構(gòu)建上述的厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌的方法，其特征在于，構(gòu) 建方法如下： a. 以聯(lián)氨氧化酶HZO基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR采用的引物為： 正向引物 hzoFl :5，-TGTGCATGGTCAATTGAAAG-3，； 反向引物 hzoRl :5，- CAACCTCTTCWGCAGGTGCATG-3，； b. 將步驟a所得PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA連接酶4°C過夜連接到pGEM-T載體上，得到厭氧氨氧 化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌。
[0011] 上述的PCR擴(kuò)增的具體步驟為： a. PCR擴(kuò)增體系為：每50ml反應(yīng)體系中含37. 75μ L的ddH20,5y L的10 X Ex Buffer， 4 μ L 的 dNTP，1 μ L 的 Primer 1，1 μ L 的 Primer 2,1 μ L 的 DNA 和 0· 25 μ L 的 Ex Taq ; b. PCR擴(kuò)增條件為： 94°C預(yù)變性5min

【權(quán)利要求】
1. 一種厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌，其特征在于該重組工程菌為SEQ ID NO. 1所不的喊基序列。
2. -種質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒包含根據(jù)權(quán)利要求1中所述的重組工程菌。
3. -種宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求1中所述的重組工程菌。
4. 一種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1所述的厭氧氨氧化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌的方法，其 特征在于，構(gòu)建方法如下： a. 以聯(lián)氨氧化酶HZO基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR采用的引物為： 正向引物 hzoFl :5，-TGTGCATGGTCAATTGAAAG-3，； 反向引物 hzoRl :5，- CAACCTCTTCWGCAGGTGCATG-3，； b. 將步驟a所得PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA連接酶4°C過夜連接到pGEM-T載體上，得到厭氧氨氧 化菌聯(lián)氨氧化酶的重組工程菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的具體步驟為： a. PCR擴(kuò)增體系為：每50ml反應(yīng)體系中含37.75 iiL的ddH20,5iiL的10 X Ex Buffer， 4 ii L 的 dNTP，I ii L 的 Primer 1，I ii L 的 Primer 2,1 ii L 的 DNA 和 0? 25 ii L 的 Ex Taq ; b. PCR擴(kuò)增條件為： 94°C預(yù)變性5min
【文檔編號】C12N15/53GK104498421SQ201410749991
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】陸永生, 陳學(xué)萍, 楊興興, 劉冬秀, 錢光人 申請人:上海大學(xué)