一種HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于病毒體外核酸檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種HBVcccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明首先設(shè)計(jì)HBVcccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)探針組合物，試劑盒包括含有檢測(cè)探針組合物的容器和含有肝臟穿刺組織DNA提取物純化試劑容器。該試劑盒使用的步驟包括：提取肝臟穿刺組織中DNA，并采用PSAD酶對(duì)HBVrcDNA進(jìn)行消化；以數(shù)字PCR檢測(cè)芯片為反應(yīng)容器，采用復(fù)合熒光多重PCR引物在數(shù)字PCR芯片檢測(cè)微孔中對(duì)靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增；依據(jù)數(shù)據(jù)PCR檢測(cè)芯片每一微孔中的熒光信號(hào)，得到每個(gè)細(xì)胞中HBVcccDNA的定量結(jié)果。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便、快速，不需要對(duì)HBVcccDNA與HBVrcDNA進(jìn)行分離抽提，克服了傳統(tǒng)HBVcccDNA檢測(cè)中的缺陷，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】-種HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒體外核酸檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè) 試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB)是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)在人肝細(xì)胞中慢性感染所致的一種肝臟炎癥疾病，其持續(xù)進(jìn)展可導(dǎo)致肝硬化、 肝功能衰竭及肝癌。據(jù)估計(jì)，全世界目前有HBV攜帶者約3. 5億人，每年約有100萬人死于 HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)和中國醫(yī)學(xué)會(huì)感 染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約 9300萬，其中CHB患者超過2000萬。
[0003] 對(duì)于CHB，無論是中國的還是歐洲肝病協(xié)會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》均指 出，抗病毒治療是最重要的治療措施。在CHB的抗病毒治療中，核苷(酸）類似物(包括拉米 夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾夫韋酯等）以其口服方便、抗病毒療效確切成 為CHB患者中應(yīng)用最為廣泛的一類藥物，其中恩替卡韋及替諾福韋酯為國內(nèi)外指南推薦的 一線用藥。
[0004] 無論是采用核苷(酸）類似物還是干擾素等進(jìn)行抗HBV治療，抗病毒療效監(jiān)測(cè)均采 用傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)CHB患者外周血中的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，即HBV DNA定 量檢測(cè)。當(dāng)采用核苷(酸)類似物進(jìn)行抗HBV治療時(shí)，國內(nèi)外的相關(guān)治療指南中均指出，需將 CHB患者外周血中的HBV DNA控制在現(xiàn)有檢測(cè)手段檢測(cè)不到的水平。然而，國內(nèi)外的研究 均表明，人肝臟細(xì)胞才是HBV感染的最為主要的宿主細(xì)胞以及HBV復(fù)制的主要場所，人外周 血中的HBV是來自于肝細(xì)胞內(nèi)的HBV復(fù)制與分泌外排。在人肝細(xì)胞中，HBV復(fù)制的起始模 板并不是分泌外排的成熟HBV顆粒中的松弛環(huán)狀HBV DNA (即HBV rcDNA)，而是一種共價(jià) 閉合環(huán)狀HBV DNA (即HBV cccDNA)。換言之，只有肝細(xì)胞內(nèi)的HBV cccDNA徹底清除，才能 表明慢性乙型肝炎得到治愈。人外周血中HBV DNA定量作為抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)是 可靠的。然而，當(dāng)采用傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)外周血HBV DNA為陰性時(shí)并不能說明患者肝 細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的存在狀態(tài)。因此在長期的抗病毒治療過程中，尤其當(dāng)采用傳統(tǒng)的實(shí)時(shí) 熒光PCR技術(shù)檢測(cè)提示外周血HBV DNA已呈陰性時(shí)，外周血中HBV DNA的監(jiān)測(cè)對(duì)于藥物遠(yuǎn) 期療效的判斷、治療終點(diǎn)的選擇已意義有限。這也是目前在國內(nèi)外相關(guān)治療指南中對(duì)于核 苷(酸）類似物抗HBV治療時(shí)均未給出明確的治療終點(diǎn)的重要原因之一。當(dāng)前，對(duì)于CHB患 者，采用核苷(酸）類似物抗HBV治療時(shí)無明確療程，即無法停藥，這已成為學(xué)界共識(shí)。
[0005] 造成這一局面的一個(gè)重要原因是在抗HBV治療過程中，當(dāng)外周血HBV DNA已呈陰 性后，目前尚無有效手段對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)的HBV復(fù)制模板HBV cccDNA的量進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。既往 臨床上有采用原位PCR的方法來檢測(cè)肝臟穿刺組織中HBV DNA的分布情形。然而，這一方 法操作復(fù)雜、靈敏度低且不能區(qū)分肝細(xì)胞內(nèi)的HBV rcDNA與HBV cccDNA。
[0006] HBV cccDNA檢測(cè)的難點(diǎn)在于，如何規(guī)避HBV rcDNA的"非特異擴(kuò)增"對(duì)HBV cccDNA 檢測(cè)結(jié)果的影響。HBV cccDNA與HBV rcDNA的序列是一致的，因此，所謂HBV rcDNA的"非特 異性擴(kuò)增"并非真正意義上的引物非特異性擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，HBV cccDNA與HBV rcDNA二者 在結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。HBV rcDNA負(fù)鏈相對(duì)完整，僅在HBV DNA直接重復(fù)序列I (Direct Repeats 1，DR1)區(qū)上游存在一個(gè)小的缺口，通常稱之為"nick"，即缺刻；而其正鏈則存在 一個(gè)大的缺口，通常稱之為"gap'HBV cccDNA則不存在上述缺刻或缺口，正、負(fù)鏈均呈完整 環(huán)狀，類似于質(zhì)粒。目前多數(shù)學(xué)者設(shè)計(jì)的HBV cccDNA檢測(cè)方法即是依據(jù)HBV rcDNA與HBV cccDNA這種結(jié)構(gòu)上的差異，將HBV引物設(shè)計(jì)在HBV rcDNA正鏈的缺口區(qū)域和缺刻的下游，檢 測(cè)探針設(shè)計(jì)在引物的下游。在這種設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，再輔以綠豆核酸酶或PSAD酶等可以降解 單鏈DNA的核酸酶消化HBV rcDNA，從而對(duì)HBV cccDNA進(jìn)行純化處理以達(dá)到HBV cccDNA的 相對(duì)特異性檢測(cè)。然而，雖然如此，有研究表明，在總HBV定量結(jié)果在IXlO5 copies/ml以 上時(shí)，仍無法避免HBV rcDNA對(duì)HBV cccDNA檢測(cè)的影響，因?yàn)?，在傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 系統(tǒng)中，HBV cccDNA與HBV rcDNA是同時(shí)存在的。而大量的研究表明，肝細(xì)胞內(nèi)HBV rcDNA 的量通常約為HBV cccDNA的1000倍以上。
[0007] 當(dāng)前,對(duì)于CHB抗病毒治療,何時(shí)能夠停藥已成為一個(gè)最為關(guān)鍵的問題,也是目前 國內(nèi)外學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題?？紤]到中國CHB患者基數(shù)龐大以及恩替卡韋等一線抗 HBV治療藥物價(jià)格不菲，若采用終身治療方案，無論是個(gè)人還是社會(huì)所承擔(dān)的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) 均不可估量。而要對(duì)這一問題進(jìn)行有效、科學(xué)的研究，HBV cccDNA特異、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)工 具將是不可或缺的手段。因此，國內(nèi)外學(xué)界均迫切需要一種可對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA進(jìn)行 定量的快速、簡便、特異、靈敏的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)以上存在的現(xiàn)實(shí)需求以及傳統(tǒng)基于實(shí)時(shí)突光PCR定量技 術(shù)等方法檢測(cè)HBV cccDNA的不足，提供一種HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明首先設(shè)計(jì)HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)探針組合物，包括：第一 PCR反應(yīng) 引物對(duì)、第二PCR反應(yīng)引物對(duì)與第三PCR反應(yīng)引物對(duì)，以及相應(yīng)的檢測(cè)探針和競爭性探針。 其中： 所述第一 PCR反應(yīng)引物對(duì)（即檢測(cè)HBV cccDNA的特異性引物對(duì)）是SEQ ID No. 1 (即 P3+P9+P1)和SEQ ID No. 2 (即P4+P2)所示的核苷酸序列；相應(yīng)的檢測(cè)HBV cccDNA的特 異性探針是SEQ ID No. 5 (即P5)所示核苷酸序列； 第二PCR反應(yīng)引物對(duì)（即檢測(cè)內(nèi)參基因 RPP40的引物對(duì)）是SEQ ID No. 6 (即P3+P6) 和SEQ ID No. 7 (即P4+P7)所示的核苷酸序列；相應(yīng)的檢測(cè)內(nèi)參基因 RPP40的特異性探針 是SEQ ID No. 8 (即P8)所示核苷酸序列； 第三PCR反應(yīng)引物對(duì)（即HBV cccDNA和內(nèi)參基因 RPP40擴(kuò)增反應(yīng)中公用引物對(duì))是SEQ ID No. 3 (即P3)和SEQ ID No. 4 (即P4)所示的核苷酸序列； 所述競爭性探針為SEQ ID No. 10 (即P10)所示核苷酸序列。
[0010] 其中，其中Pl段與P2段為HBV特異性序列；P6段與P7段為人單拷貝基因 RPP40 特異性序列。
[0011] SEQ ID No. 9所示核苷酸序列（即P9)，為P3、Pl間的鏈接序列。
[0012] SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 10核苷酸序列與修飾特征見表1。
[0013] 表I SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 10核苷酸序列與修飾_ 備汪：Cdd為雙脫氧胞嘧哫。

【權(quán)利要求】
1. 一種HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：引物與探針容器，肝 臟穿刺組織DNA提取物純化試劑容器；引物與探針容器內(nèi)分別含有HBV cccDNA數(shù)字PCR定 量檢測(cè)探針組合物，具體說來，所述引物與探針容器內(nèi)含有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8 和SEQ ID No. 10的溶液；所述DNA提取物純化試劑容器內(nèi)包含有PSAD酶、PSAD酶緩沖液 和ATP溶液；其中： SEQ ID No. 1即P3+P9+P1和SEQ ID No. 2即P4+P2所示的核苷酸序列為所述第一 PCR反應(yīng)引物對(duì)即檢測(cè)HBV cccDNA的特異性引物對(duì)；SEQ ID No. 5即P5所示核苷酸序列 為相應(yīng)的檢測(cè)HBV cccDNA的特異性探針； SEQ ID No. 6即P3+P6和SEQ ID No. 7即P4+P7所示的核苷酸序列為第二PCR反應(yīng) 引物對(duì)即檢測(cè)內(nèi)參基因RPP40的引物對(duì)；SEQ ID No. 8即P8所示核苷酸序列為相應(yīng)的檢 測(cè)內(nèi)參基因RPP40的特異性探針； SEQ ID No. 3即P3和SEQ ID No. 4即P4所示的核苷酸序列為第三PCR反應(yīng)引物對(duì) 即HBV cccDNA和內(nèi)參基因RPP40擴(kuò)增反應(yīng)中公用引物對(duì)； SEQ ID No. 10即P10所示核苷酸序列為HBV競爭性探針； 其中，P1段與P2段為HBV特異性序列；P6段與P7段為人單拷貝基因RPP40特異性序 列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 8 工作濃度范圍依次為：35 ?65nmol/L、35 ?65nmol/L、35 ?65nmol/L、35 ? 65nmol/L、350 ?650nmol/L、350 ?650nmol/L、100 ?175nmol/L、100 ?175nmol/L，競爭 性探針SEQ ID No. 10的反應(yīng)濃度為200?400nmol/L ;設(shè)計(jì)濃度為10倍反應(yīng)濃度。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒在在慢性乙型肝炎 患者HBV cccDNA定量檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下： (1) 提取肝臟穿刺組織中DNA，并采用PSAD酶對(duì)HBV rcDNA進(jìn)行消化； (2) 以數(shù)字PCR檢測(cè)芯片為反應(yīng)容器，使用HBV cccDNA數(shù)字PCR定量檢測(cè)試劑盒，采用 復(fù)合熒光多重PCR引物在數(shù)字PCR芯片檢測(cè)微孔中對(duì)靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增： 第一 PCR反應(yīng)的引物對(duì)為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2; 第二PCR反應(yīng)的引物對(duì)為SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7; 第三PCR反應(yīng)的引物對(duì)為公用引用的SEQ ID No. 3即P3和SEQ ID No. 4即P4 ; 以第一 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，P3、P4與熒光素FAM標(biāo)記探針P5即SEQ ID No. 5產(chǎn) 生HBV cccDNA特異性檢測(cè)信號(hào)，以第二PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，P3、P4與熒光素VIC標(biāo)記 探針P8即SEQ ID No. 8產(chǎn)生RPP40特異性檢測(cè)信號(hào)；由于芯片的檢測(cè)微孔數(shù)遠(yuǎn)高于反應(yīng) 體系中HBV cccDNA分子數(shù)，每一微孔中的檢測(cè)信號(hào)均為相應(yīng)模板的單分子檢測(cè)信號(hào)； (3) 依據(jù)數(shù)據(jù)PCR檢測(cè)芯片每一微孔中的熒光信號(hào)，藍(lán)色熒光微孔數(shù)即為總反應(yīng)體 系中HBV cccDNA定量結(jié)果，0. 5倍的綠色熒光微孔數(shù)即為總反應(yīng)體系中所檢測(cè)到細(xì)胞數(shù)， 藍(lán)色熒光微孔數(shù)與〇. 5倍綠色熒光微孔之比即為肝臟穿刺標(biāo)本中平均每個(gè)細(xì)胞中HBV cccDNA的定量結(jié)果；RPP40基因檢測(cè)信號(hào)同時(shí)作為PCR擴(kuò)增體系的內(nèi)部質(zhì)控。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟（1)中所述提取肝臟穿刺組織中DNA， 是采用QIAamp DNA mini Kit試劑盒從肝組織中抽提總DNA，包括HBV cccDNA、HBV rcDNA 和人基因組DNA ;對(duì)提取物采用PSAD酶消化HBV rcDNA，體系如下： DNA提取物 32 ill PSAD 酶，10U/ii 1 2. 0 u 1 10X酶切緩沖液 4.0 ill ATP,25mM 2. 0 u 1 總體積為40微升，37°C溫育60分鐘，然后95°C溫育10分鐘。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104388598SQ201410755640
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】徐文勝, 趙書民, 杭小峰, 趙翊均, 繆曉輝 申請(qǐng)人:上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司