一種制備花生四烯酸的方法
【專利摘要】一種制備花生四烯酸的方法，涉及花生四烯酸。對(duì)高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分批發(fā)酵，在優(yōu)化培養(yǎng)基中以酵母粉和玉米漿為氮源分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，對(duì)高山被孢霉進(jìn)行高糖馴化及對(duì)馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L，培養(yǎng)168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
【專利說明】一種制備花生四烯酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及花生四烯酸，尤其是涉及一種制備花生四烯酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 花生四稀酸（Arachidonic Acid，簡稱ARA，即5,8,11，14-二十碳四稀酸）屬于 ?-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，由于人體內(nèi)不具備相應(yīng)的酶系統(tǒng)來合成特定的不飽和雙 鍵，因此被認(rèn)為是人體必需脂肪酸，是許多二十碳衍生物如前列腺素E 2(PGE2)、前列環(huán)素 (PGI2)、血栓烷 A2(TXA2)、白三烯 Leukotirene B4(LTB4)*C4(LTC4)的直接前體。ARA 還具 有調(diào)節(jié)體內(nèi)多種離子通道作用，控制細(xì)胞膜的通透性，維持機(jī)體保水性等許多重要的生理 功能。同時(shí)研宄表明，花生四烯酸對(duì)嬰兒的大腦發(fā)育和視覺功能的完善有著極為重要的意 義，花生四烯酸對(duì)高血壓、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的預(yù)防與治療也有顯著的效果 (Roger et al. Biotechnology Bioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四稀酸 既是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，又是人類重要的保健品。ARA作為人體必需脂肪酸發(fā)揮著無可替代的 作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] ARA主要來源有植物、動(dòng)物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但ARA在動(dòng)物組織 中含量低，來源也有限，而微生物發(fā)酵法則為生產(chǎn)ARA開辟了新途徑，它具有不受原材料及 氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、ARA含量高等特點(diǎn)，近年來已成為國內(nèi)外研宄的熱 點(diǎn)。國際上開展產(chǎn)多不飽和脂肪酸（PFUAs)的微生物研宄主要集中在以下幾個(gè)方面：（1)產(chǎn) PFUAs菌種的分離與選育；（2)培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化；（3)培養(yǎng)方式的研宄（包括批 式、補(bǔ)料、連續(xù)培養(yǎng)工藝等）；(4) PFUAs的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。目前，人們僅發(fā)現(xiàn)接合菌綱 是比較具有研宄價(jià)值的的一個(gè)綱，而且普遍看好被孢霉，認(rèn)為它是生產(chǎn)ARA、EPA、DHA最有 潛力的菌種。目前，日本、美國等國家已經(jīng)先后問世了 ARA的發(fā)酵產(chǎn)品，國內(nèi)在這一領(lǐng)域的 研宄起步晚，雖對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA方面作了一些研宄，但還存在著生物量偏低，油脂含 量較低等問題，離大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)仍有一定的距離。
[0004] 中國專利CN101613724公開一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法， 包括有下述步驟：首先在恒溫?fù)u床中將高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵 培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計(jì)為10%? 90% ;發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進(jìn)行浸提 或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進(jìn)一步處理獲得目標(biāo)產(chǎn)品，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提 后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌柏，該發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花 生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種制備花生四烯酸的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取 4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;pH 6. 0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm 培養(yǎng)5?6d，得到優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿lOg/L ;谷氨酸1. Og/L ; MgS04-7H200. lg/L ;KH2P042. Og/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ; 混合維生素lmL/L ;pH調(diào)至6. 0 ;
[0008] 2)對(duì)高山被孢霉進(jìn)行高糖馴化及對(duì)馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行 2L分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加 600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L，培養(yǎng)168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
[0009] 在步驟1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、 CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20等；所述混合維生素可包括維生素B12、生物素、維生 素&、泛酸鈣等。
[0010] 在步驟2)中，所述2L分批發(fā)酵的具體方法可為：首先采用固體培養(yǎng)基馴化，將菌 種逐級(jí)涂布于梯度高糖平板（含糖量分別為2%、5%、7%、10%和15%)培養(yǎng)，挑選經(jīng)固體 馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉(zhuǎn)接到兩種含不同氮源的梯度高糖（含糖量分別 為3%、4%、5%和6%)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，接著對(duì)該馴化后的菌種，使用步驟2)中所 述的混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵；所述干菌體可得58g/L，油脂可得28g/L，ARA可得 16g/L〇
[0011] 所述高山被孢霉可以接種適量的被孢霉至載有培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床上培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100?300rpm，較好的為150?200rpm。
[0012] 本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基的組成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麥芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是較適宜的碳源，來源簡單，價(jià)格低廉，使用量為30? 80g/L。對(duì)于搖瓶種子培養(yǎng)，一般將使用量降低至10?30g/L，可根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間及所要求 的生物量密度來選擇用量。具體合適的用量選擇，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)操作確 定碳源的種類及合適用量。同時(shí)，可視微生物的生長情況，選擇一次性加入全部碳源或者分 批補(bǔ)入。氮源可以選擇酵母粉、玉米漿、蛋白胨、大豆粉等中的至少一種，酵母粉或者玉米漿 被認(rèn)為是比較好的氮源，添加濃度在5?15g/L，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作 確定氮源的種類及用量。
[0013] 可選擇使用單一氮源或混合氮源，更好的結(jié)果是使用混合氮源（玉米漿、酵母粉） 為發(fā)酵罐培養(yǎng)的適宜氮源，且二者的質(zhì)量比例對(duì)于油脂的積累影響較大，可利用響應(yīng)面分 析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步優(yōu)化碳氮源的組合，較好的兩種氮源比例為3:8 (w/w)。
[0014] 溫度低于20°C高山被孢霉將會(huì)開始大量產(chǎn)生EPA，而培養(yǎng)要求得到較高含量的 ARA，同時(shí)盡量減低或避免產(chǎn)生EPA，培養(yǎng)溫度通常保持在25?30°C。微生物發(fā)酵生產(chǎn) PUFAs，其最高產(chǎn)量一般是在對(duì)數(shù)期后期或穩(wěn)定期前期，因此要在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最大可 能的生物量及總脂肪酸的含量，一般來說，最適收獲ARA的時(shí)間是在第5?6天。
[0015] 真菌生長的pH范圍較廣，更偏好于在偏酸環(huán)境中生長，pH在4. 0至8. 0之間均可 以正常生長，本發(fā)明的實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)，初始pH 6. 0?6. 5,培養(yǎng)過程中pH在7?8之間有 利于ARA的積累；pH 4?5之間有利于生物量的積累，在培養(yǎng)過程中可分階段的調(diào)節(jié)pH水 平以適應(yīng)所要求的生長環(huán)境。
[0016] 接種量可以在2%至14% (V/V)，接種量低，生物量達(dá)不到所要求的水平，接種量 高，在生物量積累到一定程度將會(huì)抑制菌體的繼續(xù)生長，在搖瓶培養(yǎng)中，接種控制在3%? 5% (V/V)，而在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，接種量控制在8%?10% (V/V)能得到較好的結(jié)果。
[0017] 培養(yǎng)基中碳氮比影響真菌油脂的積累，碳氮比在10 : 1至60 : 1之間，較好的是 40 : 1至50 : 1，在培養(yǎng)過程中可以選擇滅菌前一次性加入或培養(yǎng)開始后分批加入。
[0018] 微生物的生長需要維生素等生長因子，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中缺乏維生素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)RNA、 DNA以及蛋白質(zhì)的含量會(huì)下降。添加維生素&、維生素B 12、生物素及泛酸鈣最有利于ARA的 積累，其用量分別在50?150mg/L、300?600 y g/L、400?600 y g/L及80?150mg/L之 間。谷氨酸可以提高細(xì)胞中G6TOH的活性，為被孢霉細(xì)胞的生長提供核酸原料，從而與花生 四烯酸的合成緊密相關(guān)，在培養(yǎng)基中添加〇. 5?2g/L的谷氨酸有利于ARA的積累。
[0019] 為了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存過程中的穩(wěn)定性，可對(duì)菌種進(jìn)行了高糖馴 化培養(yǎng)，馴化后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種的耗糖能力及產(chǎn)油能力明顯提升，ARA的含量呈倍數(shù)增長。
[0020] 發(fā)酵培養(yǎng)過程可采用分批發(fā)酵或補(bǔ)料-分批發(fā)酵，分批發(fā)酵要求營養(yǎng)物質(zhì)一次性 加入，營養(yǎng)物含量過高可能在培養(yǎng)前期抑制真菌的生長而延長延滯期，發(fā)酵周期隨之延長， 而營養(yǎng)物含量過低，在培養(yǎng)后期無法滿足真菌生長需要的營養(yǎng)補(bǔ)充。本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可 以通過一系列實(shí)驗(yàn)操作確定適宜的碳氮營養(yǎng)物含量；補(bǔ)料-分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中，必須對(duì) 培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行檢測，特別是當(dāng)葡萄糖濃度小于5g/L時(shí)，需要及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖， 這是需要分別滅菌的。上述兩種培養(yǎng)方式，在實(shí)施過程中，可能會(huì)出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，這是不希 望出現(xiàn)的，可以選擇在滅菌之間加入適量消泡劑或者在起泡現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)，適時(shí)地加入消泡 劑防止產(chǎn)生過量泡沫。
[0021] 根據(jù)上述優(yōu)化高山被孢霉的發(fā)酵條件，能夠獲得較高的生物量及總油脂含量，可 以每12h或24h取樣測定生物量、油脂及ARA含量，或者培養(yǎng)結(jié)束收獲生物質(zhì)測定。
[0022] 可以用多種方法對(duì)生物質(zhì)體進(jìn)行收獲，例如過濾、真空抽濾、離心、膜分離、絮凝沉 淀等，一般的，選擇成本低且方便操作的過濾或真空抽濾收獲生物質(zhì)體。收獲后，可以選擇 采用干菌體或濕菌體進(jìn)行油脂的萃取，本實(shí)施過程中，對(duì)菌體進(jìn)行干燥至含水量小于4%， 此時(shí)，使用丙酮、乙醇、異丙醇等醇類、烷烴如正己烷、正庚烷等萃取油脂是較適宜的，但正 己烷最佳。干燥后的菌體加入正己烷，進(jìn)行研磨、勻漿或減法破壁萃取，得到的萃取液進(jìn)行 離心分離取上層，蒸發(fā)除去其中的有機(jī)溶劑，得到總油脂即粗油。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：原料易購、價(jià)格適中、培養(yǎng)基配制方 便、發(fā)酵工藝簡便、花生四烯酸合成穩(wěn)定、油脂產(chǎn)量為16?28g/L，其中花生四烯酸產(chǎn)量在 6. 5?16g/L，解決了花生四烯酸的發(fā)酵生產(chǎn)效率和產(chǎn)量低的問題、適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0025] 圖2高山被孢霉在添加了維生素、氨基酸和微量元素的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0026] 圖3高山被孢霉在實(shí)施例3培養(yǎng)基中添加了混合氮源的發(fā)酵結(jié)果。
[0027] 圖4馴化后的高山被孢霉在實(shí)施例4中的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0028] 圖1?4分別為實(shí)施例2?5中不同培養(yǎng)基對(duì)高山被孢霉的生物量、總油脂和 ARA產(chǎn)量的影響結(jié)果。在圖1?4中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（h)，左縱坐標(biāo)為葡萄糖消耗情 況Glucose (，g/L)，右縱坐標(biāo)分別為生物量Biomass (?，g/L)，總油脂Total fatty acid ( ★，g/L)和ARA產(chǎn)量（▲，g/L)。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1.利用高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0031] 在一個(gè)250mL搖瓶中培養(yǎng)高山被孢霉，載液量為50mL的活化培養(yǎng)基，150rpm， 28°C，活化3天。再將活化后的菌株接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量250mL的搖瓶裝入50mL的基 礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量10% (v/v)，于28°C往復(fù)式搖床培養(yǎng)5?6d，轉(zhuǎn)速150rpm，28°C，培養(yǎng)5d 后收獲，抽濾收獲生物質(zhì)，將其恒溫干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸發(fā)除去有機(jī)容 劑后，得到總油脂5g/L。
[0032] 活化培養(yǎng)基組成（g/L):
[0033] 葡萄糖 30 酵母粉 4 kh2po4 0.1 MgS04-7H20 0.3 其余為水，pH 6.0。
[0034] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成（g/L):
[0035] 葡萄糖 40 酵母粉 5 MgS04-7H20 0.1 KH2PO4 0.5 CaCO：, 0.05 ZnS04-7H20 0.1 其余為水，pH6.0.
[0036] 實(shí)施例2.利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基在發(fā)酵罐培養(yǎng)高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0037] 2L發(fā)酵罐培養(yǎng)，裝液量1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如實(shí)施例1)，將初始葡萄糖濃度定為 60?65g/L，單獨(dú)滅菌，發(fā)酵溫度維持在28°C，初始攪拌轉(zhuǎn)速150?200rpm，通氣量lvvm的 條件下對(duì)高山被孢霉菌進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，滅菌前將pH調(diào)節(jié)至6. 5?7. 0,滅菌后的初始 pH在6. 0?6. 5，培養(yǎng)12h后溶氧開始迅速下降，生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)48h之后生長開始進(jìn) 入穩(wěn)定期，在整個(gè)生長周期中，初始pH值為6. 0?6. 5,過程中pH值先升高后降低再升高， 隨著穩(wěn)定期的到來，最后pH值穩(wěn)定在7. 0?7. 9之間；溶氧隨著生物量的增加迅速下降，在 對(duì)數(shù)生長期維持溶氧在0. 5%?10%。
[0038] 培養(yǎng)期間每12h取樣進(jìn)行生物質(zhì)及脂肪酸的分析。培養(yǎng)至第168h，開始收獲菌體， 采用實(shí)施例1的方法，獲得干菌體18g/L，總油脂7g/L，ARA 2. 7g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度 從初始的60g/L降至15g/L，具體結(jié)果如圖1所示。
[0039] 實(shí)施例3.氨基酸、維生素和微量元素對(duì)高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響 [0040] 在實(shí)施例2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了生長因子（維生素、氨基酸），以及微量元素來 提尚廣量。
[0041] 加入的生長因子包括：
[0042] 維，丨.:尜 B! 100?300f_ig/L 維 1.:尜 Bl2 500?650 pg/L 生物素 500?700昭/L 泛酸120 ?丨 80 mg/L 谷氨酸 0.5?2 g/L
[0043] 維生素配成500 X濃縮液，使用0. 2 y m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保 存，待接種前直接加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加量為2mL/L。谷氨酸在滅菌前配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí) 加入，隨培養(yǎng)基一同滅菌。
[0044] 加入的微量元素包括（g/L):
[0045] FeCl3-6H20 0.2-0,4 H3BO3 0.5-0.75 MnCl2-4H20 0.8?1.0 CoC12-6H20 0.005?0.01 CuS04-5H2〇 0,002?0.004 NiS04-6H20 0.05-0.09
[0046] 微量元素配成1000 X濃縮液（g卩1L培養(yǎng)基中加入lmL微量元素濃縮液），調(diào)至pH 7。使用0. 2 y m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保存，待接種前直接加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中。
[0047] 為了制備接種菌體，將使用的種子接種在3個(gè)含50mL活化培養(yǎng)基的搖瓶中，在 28°C、150rpm培養(yǎng)3天后，菌體在發(fā)酵液中呈現(xiàn)的形態(tài)為球狀，直徑為2?4mm，或松散的菌 絲聚集體。接種至載液量為1.5L的2L發(fā)酵罐，接種量10% (V/V)，若種子在搖瓶中生長的 密度較低，則在接種至發(fā)酵罐時(shí)適當(dāng)?shù)脑黾咏臃N量。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基為添加了生長因子 (維生素、氨基酸）和微量元素的優(yōu)化培養(yǎng)基，進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)。其中初始葡萄糖濃度為 60?65g/L，分開滅菌，120°C滅菌30min。
[0048] 發(fā)酵罐的參數(shù)如下：溫度：28°C;通氣：0. 5?lvvm;pH:用25%氨水維持在6. 0左 右；初始攪拌轉(zhuǎn)速：150rpm。
[0049] 第12h，溶氧開始迅速下降，pH也開始下降，菌體生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，將轉(zhuǎn)速調(diào)至 200rpm，此后1?2h內(nèi)開始產(chǎn)生泡沫，加入適量消泡劑。此后將轉(zhuǎn)速調(diào)至250rpm。
[0050] 接種時(shí)，發(fā)酵罐中的菌體是直徑為1?2mm的小球狀，外緣光滑，培養(yǎng)至12h開始， 球體開始變大，至24h，球體形狀更清晰，繼續(xù)變大，48h開始罐內(nèi)菌體密度增大，至72h，球 體外緣顯得蓬松，且出現(xiàn)類似羽毛絮狀的松散菌絲體，這可能由于較大的球狀菌體開始解 體，至120h，球的直徑在2?4mm之間，同時(shí)形成了許多松散的菌絲聚集體。每隔12h對(duì) 發(fā)酵罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物量及脂肪酸的分析，168h后發(fā)酵結(jié)束，罐內(nèi)發(fā)酵液的最終體積為 1. 2L。獲得干菌體21g/L，總油脂9g/L，ARA 3. 8g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度從初始的65g/ L降至13g/L，具體結(jié)果如圖2所示。
[0051] 實(shí)施例4.混合氮源對(duì)高山被孢霉高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響
[0052] 這一組實(shí)驗(yàn)通過使用混合氮源來進(jìn)一步提高產(chǎn)量，過程與實(shí)施例3基本相同，添 加的混合氮源的組成成分及比例通過一系列實(shí)驗(yàn)得到。
[0053] 添加的混合氮源包括（g/L):
[0054] 玉米漿 3
[0055] 酵母粉 7
[0056] 發(fā)酵罐在第llh，溶氧開始迅速下降，在約第14h開始產(chǎn)生少量泡沫，通過人工加 入消泡劑控制。至24h，菌體為直徑1?2mm的球狀，至48h，菌體為直徑2?3mm的球狀， 外緣光滑，至72h，開始出現(xiàn)松散的羽毛絮狀菌絲聚集體，球體外緣松散。每隔12h對(duì)發(fā)酵 罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物量及脂肪酸的分析，168h后收獲，獲得干菌體36g/L，總油脂16g/L， ARA6. 5g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度從初始的60g/L降至5g/L，具體結(jié)果如圖3所示。
[0057] 實(shí)施例5.利用馴化后的高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0058] 為使高山被孢霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收更為充分，減少原料的浪 費(fèi)，提高菌種耗糖能力，對(duì)菌種進(jìn)行了馴化，主要通過固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基的逐級(jí)高糖 馴化，提高菌體的耗糖能力，且馴化后的菌種均呈現(xiàn)為有利于油脂積累的外緣帶刺狀的松 散球體。利用該馴化后的菌種，使用實(shí)施例4中所述的優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，及 當(dāng)葡萄糖濃度降至l〇g/L左右，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L左右，其余操作過 程與實(shí)施4相同。
[0059] 發(fā)酵過程中用25 %氨水調(diào)節(jié)控制pH在6. 0?6. 5。
[0060] 第12h，菌體開始生長，菌體為外緣刺狀的小球，直徑1?2mm，之后隨著菌體大量 生長，呈現(xiàn)為外緣刺狀的松散的球狀，直徑2?5mm，此時(shí)pH開始下降，這是糖代謝先產(chǎn)生酮 酸等有機(jī)酸，而后被利用再逐漸上升，此時(shí)，允許pH降至4. 5,至72h，pH會(huì)隨著菌體進(jìn)入穩(wěn) 定期緩慢回升，此時(shí)菌體主要為外緣刺狀的松散的球狀，其次為羽毛絮狀的菌絲聚集體，至 98h，將pH緩慢升至6. 5?7. 5之間，但不高于8. 0。每隔12h對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物 量及脂肪酸的分析，
[0061] 培養(yǎng)168h后開始收獲，獲得干菌體58g/L，總油脂28g/L，ARA 16g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí) 發(fā)酵液中的葡萄糖濃度趨于零。根據(jù)本實(shí)施例進(jìn)行的分批發(fā)酵結(jié)果顯示，ARA產(chǎn)量較之前 已有大幅度提高，具體結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備花生四烯酸的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取 4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶，28°C、150rpm培養(yǎng)5?6d，得到 優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1. Og/L ;MgS04-7H200. lg/L ; KH2P042. Og/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ;混合維生素 lmL/ L ;pH調(diào)至6. 0 ;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ；CaC030. 05g/L ；ZnS04-7H20 0. lg/L ；pH 6. 0 ； 2) 對(duì)高山被孢霉進(jìn)行高糖馴化及對(duì)馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L 分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加 600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L，培養(yǎng)168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
2. 如權(quán)利要求1所述一種制備花生四烯酸的方法，其特征在于在步驟1)中，所述混合 微量元素包括 FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、CoCl2 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20。
3. 如權(quán)利要求1所述一種制備花生四烯酸的方法，其特征在于在步驟1)中，所述混合 維生素包括維生素 B12、生物素、維生素&、泛酸隹
4. 如權(quán)利要求1所述一種制備花生四烯酸的方法，其特征在于在步驟2)中，所述2L分 批發(fā)酵的具體方法為：首先采用固體培養(yǎng)基馴化，將菌種逐級(jí)涂布于梯度高糖平板培養(yǎng)，挑 選經(jīng)固體馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉(zhuǎn)接到兩種含不同氮源的梯度高糖液體 培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，接著對(duì)該馴化后的菌種，使用步驟2)中所述的混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn) 行分批發(fā)酵。
5. 如權(quán)利要求4所述一種制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述梯度高糖平板的含 糖量分別為2%、5%、7%、10%和15%;所述兩種含不同氮源的梯度高糖的含糖量分別為 3%、4%、5%和 6%〇
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104450810SQ201410800525
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】盧英華, 曾思鈺, 凌雪萍, 敬科舉, 吳意珣, 陳翠雪 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)