一種用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，通過脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)，構(gòu)建了含有p63基因的慢病毒載體，所述的含p63基因的重組載體是pLV.EX3d.P/neo-EF1A>TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒將p63基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞，通過Q-PCR檢測 ， 其表達(dá)超過未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞，改良后的脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞的分化能力超過未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞，達(dá)到快速有效的覆蓋并修復(fù)創(chuàng)面的效果，本發(fā)明具有目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)的特性；同時(shí)具有取材方便、生長迅速、自體組織無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于燒傷、整形外科領(lǐng)域。
【專利說明】一種用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞和基因工程的【技術(shù)領(lǐng)域】。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用基因工 程技術(shù)改造脂肪干細(xì)胞，影響其分化方向，并且這種改造后的改良式脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于表 皮損傷修復(fù)中應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚是人體或動(dòng)物體最大的器官，覆蓋全身，使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、 機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲，具有重要的生理功能。由于炎癥、潰瘍、燒傷等因素 造成的皮膚損傷，嚴(yán)重的可危及生命。臨床治療方式有自體皮膚移植、異體皮膚移植以及 異種皮膚移植。通過皮膚移植可以挽救病生命、并有助于創(chuàng)面愈合。表皮干細(xì)胞（ESC)等 干細(xì)胞移植治療，在正常情況下，保證了皮膚的微環(huán)境和毛發(fā)生長，在組織損傷后參與其修 復(fù)，同時(shí)其也是潛在的多能干細(xì)胞，完全可以利用其構(gòu)建出具有完整表皮、真皮、皮膚附屬 器的功能健全的人工皮膚，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面由暫時(shí)性解剖修復(fù)向功能永久性修復(fù)的轉(zhuǎn)變；當(dāng)燒傷 面積超過50%時(shí)，由于自體皮膚來源有限，因此在大多數(shù)情況下無法應(yīng)用自體皮膚移植，而 且自體皮膚移植給患者造成新的創(chuàng)傷，治療費(fèi)用巨大。盡管異體皮膚移植和異種皮膚移植 可以克服以上問題，充當(dāng)臨時(shí)的傷面覆蓋物，但是伴隨移植會產(chǎn)生排斥反應(yīng)和可能的一些 移植疾病。
[0003] 脂肪干細(xì)胞ret/ce/J^ADSCs)是一種具有多向分化潛能的 干細(xì)胞，ADSCs在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，在體內(nèi)體外具有多向分化潛能，不同的誘導(dǎo)因 子作用下可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及胰島細(xì) 胞分化，而且可以分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子。
[0004] 大面積深度燒傷以及慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)一直是臨床治療的難點(diǎn)。隨著干細(xì)胞 研究的開展和深入，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明位于皮下脂肪組織內(nèi)的脂肪干細(xì)胞 ste? cd/s，ADSCs)可以有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。脂肪源性干細(xì)胞是一類與骨髓源性干細(xì) 胞相類似的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能；同時(shí)脂肪源性干細(xì)胞具有少量組織可獲取大 量干細(xì)胞及取材方便等優(yōu)點(diǎn)。而在細(xì)胞移植前，將目的基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，可增強(qiáng)細(xì)胞治療的 效果，因此細(xì)胞治療與基因技術(shù)結(jié)合具有良好的應(yīng)用前景。
[0005] 目前，在整形外科和燒傷外科的手術(shù)中，皮膚組織缺損的修復(fù)是常見問題。如燒 傷、外傷或體表腫物切除等原因造成皮膚缺損，均需考慮患處皮膚組織的恢復(fù)問題。大面積 的輕度燒傷或小面積的皮膚全層缺損，可以通過殘存皮膚附件的細(xì)胞再生或臨近皮膚的上 皮細(xì)胞遷移而愈合；而深度燒傷創(chuàng)面或大面積的皮膚全層缺損，則需要采用自體皮膚移植 或人工組織工程化皮膚進(jìn)行修復(fù)。臨床常用的修復(fù)方法存在著許多缺點(diǎn)，如造成供區(qū)的損 傷、大面積燒傷患者缺乏足夠的自體皮膚；而異體皮移植存在免疫排斥反應(yīng)，且目前應(yīng)用于 臨床的皮膚組織工程產(chǎn)品仍存在一定的免疫排斥反應(yīng)、治療效果欠佳等問題。因此如何能 夠快速覆蓋并修復(fù)創(chuàng)面，是臨床上急需且具有重要的研究價(jià)值和治療前景的方向。
[0006] Ramos等證實(shí)，將分選純化后的脂肪干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈 合，且具有表皮細(xì)胞再生的能力a人 Χ￡///7〇5·(9 5·?6? side population in the mouse. J Tissue Eng Regen Med . 2009)。有國內(nèi)研究證明， 轉(zhuǎn)表皮生長因子基因的脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)成活并繼續(xù)分化為表皮細(xì)胞，同時(shí)通過自分泌 的途徑協(xié)同促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)(王先成.EGF基因轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)表皮細(xì)胞修復(fù) 創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究[D].中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2006. )。Koster認(rèn)為，p63基因是上皮感應(yīng)復(fù) 層化指令的分子開關(guān)，它在決定體表外胚層向表皮細(xì)胞系分化步驟中起至關(guān)重要的作用 (JCoster MI, Kim S，Mills AA, et a I. p63 is themolecu larsw itch for in it i at ion of an epi thelia lstrat if i cat ion program [ J ] . Genes Dev, 2004, 18( 2 ): 126-131.)。因此，根據(jù)以上研究，可以認(rèn)為選取合適的刺激環(huán)境，能夠有效調(diào)控脂肪干細(xì)胞 分化的程度和方向，提高皮膚修復(fù)的質(zhì)量。
[0007] 隨著干細(xì)胞治療技術(shù)在臨床上的逐漸應(yīng)用，越來越多的技術(shù)投向干細(xì)胞治療大面 積皮膚缺損的修復(fù)。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已表明，脂肪干細(xì)胞可成功的向成表皮細(xì)胞。如能實(shí)現(xiàn) 脂肪干細(xì)胞的體外迅速擴(kuò)增，那將為組織工程學(xué)研究注入新的生命力。
[0008] 目前國內(nèi)外有關(guān)本領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，目前臨床上用于深度燒傷或大面積的皮膚缺 損創(chuàng)面的修復(fù)方法，存在著許多缺點(diǎn)，如造成供區(qū)的損傷、大面積燒傷患者缺乏足夠的自體 皮膚、而異體皮移植及皮膚組織工程產(chǎn)品存在免疫排斥反應(yīng)、治療效果欠佳等問題。因此如 何能夠快速覆蓋并修復(fù)創(chuàng)面，是臨床上急需且具有重要的研究價(jià)值和治療前景的方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對目前國內(nèi)外在臨床上用于深度燒傷或大面積的皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)方法中 客觀存在著許多缺點(diǎn)，如造成供區(qū)的損傷、大面積燒傷患者缺乏足夠的自體皮膚、而異體皮 移植及皮膚組織工程產(chǎn)品存在免疫排斥反應(yīng)、治療效果欠佳等現(xiàn)實(shí)問題的研究現(xiàn)狀。本發(fā) 明旨在于提供一種用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案： 本發(fā)明通過提供一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，通過脂肪干細(xì)胞的 分離及體外培養(yǎng)，構(gòu)建了含有P63基因的慢病毒載體，所述的含p63基因的重組載體是pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒將p63基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞，通 過Q-PCR和western-blot檢測，均發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞特異性標(biāo)志物p63,其表達(dá)均遠(yuǎn)超過未轉(zhuǎn) 染的脂肪干細(xì)胞，表明改良后的脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞的分化能力超過未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì) 胞。驗(yàn)證了本發(fā)明制備的改良式脂肪干細(xì)胞擁有更好的向表皮細(xì)胞分化的能力，證實(shí)了制 備獲得改良式脂肪干細(xì)胞用于皮膚組織缺損修復(fù)具有顯著突出的技術(shù)效果。
[0011] 本發(fā)明提供一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，通過脂肪干細(xì)胞的 分離及體外培養(yǎng)，構(gòu)建了含有確定基因的慢病毒載體，利用慢病毒將確定基因轉(zhuǎn)載至脂肪 干細(xì)胞，通過慢病毒轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞，促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞向表皮分化，改良式脂肪干細(xì)胞 具體通過如下方法制備獲得。
[0012] (1)脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定： 無菌獲取人脂肪組織并進(jìn)行體外培養(yǎng)鑒定，以膠原酶振蕩消化后離心收集細(xì)胞，常規(guī) 傳代及凍存，并對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長曲線及⑶44、⑶45、⑶29、⑶105表面標(biāo)志物的流式細(xì) 胞鑒定。
[0013] (2)脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能鑒定： 對所獲人脂肪干細(xì)胞分別進(jìn)行成脂和成骨分化鑒定，即分別以成脂和成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo) 細(xì)胞，2周后分別對成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行油紅染色和茜素紅染色的鑒定。
[0014] (3)構(gòu)建含P63基因的慢病毒載體： 從GeneBank中查尋TP63 (p63?)基因序列，設(shè)計(jì)引物，分別以attBl-Koza k_TP63_F, attB2-flag_R為引物，進(jìn)行目的基因 TP63的PCR擴(kuò)增；再利用Gateway Technology構(gòu)建 pDown- TP63_flag，最后利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV.EX3d. P/neo-EFlA > TP63/ flag>IRES/eGFP慢病毒載體，通過菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質(zhì)粒并測序。
[0015] (4)將上述制備的含P63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞： 所獲得的口1^』乂3(1.?/116〇4?認(rèn)>了?63/打38>11?5/66--慢病毒載體轉(zhuǎn)染到293卩丁 細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，收集培養(yǎng)上清對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定；最后將 Lenti-TP63-eGFP/Ne〇和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干細(xì)胞，通過脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；熒光 顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，并進(jìn)行PCR、WB和免疫熒光檢測。
[0016] (5)利用P63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供構(gòu)建含p63基因的慢病毒載體，所述的重組載體是pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP。
[0018] 本發(fā)明同時(shí)提供了 p63基因序列具體參見附后的序列表SEQ ID NO. 1所不的喊基 序列。本發(fā)明所述的TP63也是p63另一種表達(dá)。
[0019] 本發(fā)明上述所述的含？63基因的慢病毒載體？1^』乂3(1.?/1^〇4?認(rèn)>了?63/ flag>IRES/eGFP具有如序列表SEQ ID NO. 2所示的堿基序列。
[0020] 同時(shí)，本發(fā)明提供一種促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞向表皮分化的方法，所述的方法具體如 下。
[0021] (1)人脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)：無菌獲取人脂肪組織并進(jìn)行體外培養(yǎng)，以膠 原酶振蕩消化后離心收集細(xì)胞，常規(guī)傳代及凍存；對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長曲線及CD29、CD44、 CD45、CD105表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞鑒定；此外對所獲人脂肪干細(xì)胞進(jìn)行對成脂和成骨分 化鑒定，以確定其多向分化潛能。
[0022] (2)構(gòu)建 了含有 p63 基因的慢病毒載體 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/ flag>IRES/eGFP。
[0023] 一是目的基因片段獲取。
[0024] 引物設(shè)計(jì)：從GeneBank中查尋p63基因序列，分別設(shè)計(jì)引物 attBl-Kozak-TP63-F、flag-TP63-R 和 ttB2-flag-R 如下， attBl-Kozak-TP63_F: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG; flag-TP63-R ： TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG; attB2-flag-R ： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
[0025] PCR擴(kuò)增目的基因：分別以attBl-Kozak-TP63_F，attB2-flag_R為引物，進(jìn)行目 的基因 TP63的PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為50 μ L，目的基因 TP63的PCR反應(yīng)循環(huán)條件：98°C 3 min - ( 94°C 30 s -6(TC 30 s -72°C 2.5m) 30 循環(huán)一72°C 10 min -4°C ;PCR擴(kuò) 增獲得 attBl-Kozak-TP63-flag -attB2 片段。
[0026] 二是利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_f lag 載體。25°C，BP 反應(yīng) I h ; 反應(yīng)體系：attBl-K_TP63-flag-attB2 100 ng，pD0NR221 100 ng，BP clonase I μ 1，TE buffer up to 5 μ?;加入0. 5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到大 腸桿菌3吐13，把10(^1^轉(zhuǎn)化物涂到含有5〇118/1^1^11的1^平板上，371：孵育過夜 ；菌 落PCR篩選陽性克隆，體積30 yl，PCR鑒定程序：94°C 3 min94°C，30 S ; 60°C，30 S ;72°C，1.5min(2kb/min);29個(gè)循環(huán)，72°C 5min，PCR鑒定結(jié)果；陽性克隆質(zhì)粒測序驗(yàn)證 反應(yīng)。
[0027] 三是利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/ eGFP 〇
[0028] 25°C，LR 反應(yīng) 16 h ;反應(yīng)體系：pUp-EFlA 12. 89 ng, pDown- TP63-flag 15. 21 ng，pTail_ IRES/eGFP 13.03 ng，母載體 pLV.Des3d.P/neo 60.28 ng，LR clonase I μ 1， TE buffer up to 5 μ?;加入0.5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min;轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物 到Stbl3 ;菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質(zhì)粒，測序驗(yàn)證。
[0029] (3)利用慢病毒將p63基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞。
[0030] 所獲得的 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/f lag>IRES/eGFP 慢病毒載體轉(zhuǎn)染到 293FT細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，收集培養(yǎng)上清對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定；最后將 Lenti-TP63-eGFP/Ne〇和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干細(xì)胞，通過脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；熒光 顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，并進(jìn)行PCR、WB和熒光顯微鏡檢測。
[0031] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供上述提供制備的改良式脂肪干細(xì)胞在皮膚組織缺損修復(fù)方面 的應(yīng)用，其包括，根據(jù)P63是目前所知基因中唯一確定的表皮干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，對維 持表皮干細(xì)胞的生存具有重要作用；P63是最早啟動(dòng)外胚層層化的分化標(biāo)志物，被證實(shí)是 外胚層感應(yīng)復(fù)層化指令的分子開關(guān)這一發(fā)現(xiàn)，通過構(gòu)建了 P63基因的慢病毒載體，將其轉(zhuǎn) 染到體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。
[0032] 本領(lǐng)域熟知，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的過程中加入不同的刺 激因子，模擬皮膚的微環(huán)境，能誘導(dǎo)成為具有各種表型的細(xì)胞；P63是目前所知基因中唯 一確定的表皮干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，對維持表皮干細(xì)胞的生存具有重要作用。
[0033] 本發(fā)明提供的一種改良式脂肪干細(xì)胞將應(yīng)用于臨床的大面積皮膚創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域， 具有材料豐富、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0034] 通過實(shí)施本發(fā)明具體的內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。
[0035] (1)臨床上收治的大面積燒傷或皮膚缺損的患者，一方面在自體皮膚不足的情況 下，需要有效的皮膚覆蓋方法，而目前本【技術(shù)領(lǐng)域】無論異體皮膚移植或組織工程學(xué)產(chǎn)品，都 存在一定的排異反應(yīng)；另一方面，利用自體干細(xì)胞移植治療，又必須滿足取材方便、易于培 養(yǎng)、生長迅速等要求。本發(fā)明所提供的改良后脂肪干細(xì)胞，由于其為自體組織，因此無排異 反應(yīng)；同時(shí)由于脂肪干細(xì)胞的生長特性，采用體外培養(yǎng)可以滿足臨床要求。
[0036] (2)采用本發(fā)明提供的改良后的脂肪干細(xì)胞，其p63表達(dá)超過未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì) 胞；通過Q-PCR檢測報(bào)告檢測結(jié)果顯示，改良后的脂肪干細(xì)胞，其p63表達(dá)超過未轉(zhuǎn)染的脂 肪干細(xì)胞（16930. 77%)。
[0037] (3)采用本發(fā)明提供的改良后的脂肪干細(xì)胞，向表皮細(xì)胞的分化能力超過未轉(zhuǎn)染 的脂肪干細(xì)胞；通過Q-PCR檢測報(bào)告檢測結(jié)果顯示，改良后的脂肪干細(xì)胞，向表皮細(xì)胞的分 化能力超過未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后的脂肪干細(xì)胞有明顯的表皮細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白 cklO (112. 28%)、ckl5 (84.79%)、ckl9 (52. 71%)表達(dá)及整合素 β? (76. 69%)表達(dá)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1顯示為不同代次人脂肪干細(xì)胞形態(tài)圖。圖中，a、b、c分別為40倍視野下 P4、P6、Pll代人脂肪干細(xì)胞形態(tài)，d、e、f分別為100倍視野下P4、P6、Pll代細(xì)胞形態(tài)。
[0039] 圖2顯示為人脂肪干細(xì)胞成脂分化鑒定圖。圖中，a (40x)、b (IOOx)分別為成脂 分化2周后油紅0染色結(jié)果。
[0040] 圖3顯示為人脂肪干細(xì)胞成骨分化鑒定圖。圖中，a (40x)、b (IOOx)分別為成骨 誘導(dǎo)后茜素紅染色結(jié)果。
[0041] 圖4顯示為人脂肪干細(xì)胞生長曲線圖。
[0042] 圖5顯示為人脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)記流式分析圖。
[0043] 圖 6 顯示為 PCR 鑒定篩選 pLV. EX3d. P/neo -EFlA >TP63/flag>IRES/eGFP 圖。圖 中，圖中，M: Ikb DNA Marker，Lanel ?Lane4: pLV.EX3d.P/ne〇-EFlA > TP63/flag>IRES/ eGFP①?④號克隆。
[0044] 圖7顯示為載體結(jié)構(gòu)圖譜。
[0045] 圖8顯示為病毒包裝結(jié)果圖。圖中，圖中A、B為TP63陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 48h病變情況，200 X視野，20mm熒光曝光率：C、D為eGFP/neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h病變 情況圖，200 X視野，20mm熒光曝光率。
[0046] 圖9顯示為細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)果圖。
[0047] 圖10顯示為轉(zhuǎn)染后人脂肪干細(xì)胞的western-blot檢測圖。圖中，1、2、3號樣本分 別為：hADSC/ TP63、hADSC /GFP、hADSC。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的結(jié)構(gòu)組成及其工作模式與原理作進(jìn)一步說明，但是， 本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0049] 本發(fā)明中設(shè)備和材料有： 脂肪來源：在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于人的任何部 位的脂肪組織，較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織；本發(fā)明 所述的TP63也是p63另一種表達(dá)。
[0050] 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：研究級倒置顯微鏡（OLYMPUS 1X51);潔凈工作臺（蘇凈安 泰 SW-CJ-2FD);二氧化碳孵箱（Nuaire NU4750E) ;DMEM(Hyclone) ;PCR 儀，美國 BI0-RAD， 型號PTC-220/ALS-1296G/ALD1244G ;電泳儀，北京市六一儀器廠，型號DYY-12 ;水平電泳 槽，北京市六一儀器廠，型號DYCP-31DN ;UV transilluminator，美國UVP，型號M-26 ;微 波爐，中國美的，型號麗721AAU-PW;風(fēng)熱式電熱恒溫干燥箱，廣州東方電熱干燥設(shè)備廠， 型號東方一 B ;恒溫水浴鍋，HENGA0,型號HWT-6B ;全溫空氣搖床，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限 公司，型號QYC-200 ;各種量程移液器，美國Thermo ;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems，型號AB7500 ;小型高速離心機(jī)，美國Eppendorf，型號5418 ;微型離心機(jī)，東勝 創(chuàng)新，型號EW-6000;超微量分光光度計(jì)，美國Thermo,型號NANO DROP 2000。水平搖床，北 京市六一儀器廠，型號WD-940? ;核酸蛋白測定儀，Thermo,型號NAN0DR0P2000 ;微型垂直 電泳槽，Tanon，型號 VE180 ;Fiuorchem，Cell biosciences，型號 HD2 ; 主要化學(xué)試劑及耗材：〇. 25胰蛋白酶（Hyclone);胎牛血清（Gibcol) ; I型膠原酶 (Sigma);細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Costar) ;RIPA裂解液（強(qiáng)）（碧云天，P0013B) ;ECL蛋白印記底物 (Thermo, NC14109) ；30%Acry/Bis ；10°/〇 SDS ；10%APS ；TEMED ；1. 5M Tris/HCl (PH 8. 8) ；1M Tris/HCl (PH 6. 8);Trizol Reagent (Ambion，15596026);三氯甲烷（國產(chǎn)分析純）；異丙 醇（國產(chǎn)分析純）；無水乙醇（國產(chǎn)分析純）；DEPC(上海生工生物，DB0154-5mL);DNase I， RNase-free (Thermo,#EN0521)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, #K1622);SYBR Green Realtime PCR Master Mix (T0Y0B0，QPK-201);10 uM 引物溶液 (上海捷瑞生物）；Gateway? BP Clonase? II Enzyme Mix，invitrogen，貨號 11789-020; Gateway? LR Clonase ? II Plus Enzyme Mix，invitrogen，貨號 12538-120 ;QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN,貨號 28704 ;質(zhì)粒小提試劑盒，TIANGEN，目錄號 DP103-02 ; Taq DNA Polymerase，美國 Fermentas，貨號 #EP0404 ;dNTP Mix，美國 Fermentas，貨號 #R0192;PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，Takara，貨號 DROlOS ;GeneRuler? Ikb DNA Ladder，F(xiàn)ermentas，貨號 #SM0311。
[0051] 本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí) 施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0052] 實(shí)施例一：用于表皮損傷修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞的制備 1.人脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定： 人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：脂肪組織剪成糜狀，用PBS沖洗數(shù)遍，以0. 1%膠原酶I置 37°C搖床消化，離心30 min去上清，沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，移入培 養(yǎng)皿中；隔天更換培養(yǎng)液；達(dá)到對數(shù)生長期后，用〇. 25%胰酶消化，按1 :3的比例進(jìn)行傳代， 結(jié)果參見附圖1。
[0053] 生長曲線的檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化，洗滌離心，制備單細(xì)胞 懸液，接種到24孔板中。每天隨機(jī)取4孔細(xì)胞消化、記數(shù)，取其均值，連續(xù)7天，即可制備 生長曲線，結(jié)果參見附圖4,由附圖4可知人脂肪干細(xì)胞倍增時(shí)間為26h。
[0054] 流式細(xì)胞檢測：流式細(xì)胞儀對第3代脂肪干細(xì)胞表面相對特異性抗原進(jìn)行檢測。 0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1500r /分離心10分鐘，在細(xì)胞沉淀中（細(xì)胞數(shù)量約I* IO6 )分別加入FITC-CD105熒光抗體，PE-CD29熒光抗體，F(xiàn)ITC-CD45，，F(xiàn)ITE-CD44熒光抗 體各20ul，4°C孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍，最后用10%福爾馬林固定細(xì) 胞，上流式細(xì)胞儀測定抗原的陽性率，結(jié)果參見附圖5,由附圖5可知，在人脂肪干細(xì)胞中， 表面標(biāo)記分子 CD45 含量為 0. 23%，CD29 為 99. 24%，CD44 為 85. 7%，CD105 為 96. 49%。
[0055] 2.人脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能鑒定： 對所獲人脂肪干細(xì)胞分別進(jìn)行成脂和成骨分化鑒定，即分別以成脂和成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo) 細(xì)胞，2周后分別對成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行油紅染色和茜素紅染色的鑒定。
[0056] 2. 1.成脂分化：細(xì)胞貼壁100%匯合后，加入間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)72 小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合,細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形 或多邊形，油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀，結(jié)果參見附圖2可知，a (40x)、b (IOOx)分別 為成脂分化2周后油紅0染色結(jié)果，可見細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量多并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)?圓形或多邊形，提示有大量脂質(zhì)沉淀。
[0057] 2.2.成骨分化：取第3代細(xì)胞，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液加10 mol / L地塞米松、10 mmmol / LP -甘油磷酸鈉、50 mg / L抗壞血酸），誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后， 細(xì)胞體積增大，呈短梭形；誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；14天，胞質(zhì)內(nèi) 充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積；29天，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合 失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，結(jié)果參見附圖3可知，a (40x)、 b (IOOx)分別為成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色結(jié)果，可見加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液后，細(xì)胞結(jié)節(jié) 中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。
[0058] 3.含p63基因的慢病毒載體的構(gòu)建。
[0059] 3.1.目的基因片段獲取。
[0060] 3. I. L引物設(shè)計(jì)：從GeneBank中查尋TP63基因序列，設(shè)計(jì)引物 從GeneBank中查尋p63基因序列，分別設(shè)計(jì)引物attBl-Kozak-TP63_F、flag_TP63_R 和 ttB2_flag_R 如下， attBl-Kozak-TP63_F: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG; flag-TP63-R ： TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG; attB2-flag-R ： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
[0061] 3. I. 2. PCR 擴(kuò)增目的基因：分別以 attBl-Kozak-TP63-F，attB2-flag-R 為引物， 進(jìn)行目的基因 TP63的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μ L，目的基因 TP63的PCR反應(yīng)循環(huán)條件： 98°C 3 min - ( 94? 30 s -6(TC 30 s -72°C 2.5m) 30 循環(huán)一72? 10 min -4? + ;PCR 擴(kuò)增獲得 attBl-Kozak-TP63-flag -attB2 片段。
[0062] 3· 2·利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_flag 載體。
[0063] 25°C，BP反應(yīng)I h。反應(yīng)體系： attBl-K-TP63-flag-attB2 100 ng PD0NR221 100 ng BP clonase I μ I TE buffer up to 5 μ I 加入0. 5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stbl3,把 100 μ L轉(zhuǎn)化物涂到含有50 μ g/mL Kan的LB平板上，37°C孵育過夜；菌落PCR篩選陽性克 隆；體積 30 μ 1，PCR 鑒定程序：94°C 3 min94°C，30 S ; 60°C，30 S ; 72°C，I. 5min (2kb/min) ;29個(gè)循環(huán)，72°C 5min;陽性克隆質(zhì)粒測序驗(yàn)證反應(yīng)。
[0064] 3. 3.利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/ eGFP 〇
[0065] 25°C，LR反應(yīng)16 h。反應(yīng)體系： pUp-EFlA 12.89 ng pDown- TP63-flag 15.21 ng pTail- IRES/eGFP 13.03 ng 母載體 pLV. Des3d. P/neo 60. 28 ng LR clonase I μ I TE buffer up to 5 μ I 加入0. 5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min ;轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物到Stbl3 ;菌落PCR篩 選陽性克隆，鑒定結(jié)果參見附圖6,由附圖6可知，PCR鑒定條帶理論大小為2100bp，與目 的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆；挑取陽性克隆質(zhì)粒，測序驗(yàn)證，獲得載體圖譜見附圖 7。
[0066] 4.將上述制備的含p63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞。
[0067] 4. L病毒包裝：對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，DNA- Lipofectamine 2000復(fù)合物添加到293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；轉(zhuǎn)染后72小時(shí) 再次收集濃縮；對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定，結(jié)果參見附圖8。
[0068] 4. 2.細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)：待人脂肪干細(xì)胞完全貼壁后，選取兩孔細(xì)胞分別加入30μ L的 Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo,充分的搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí) 后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。待細(xì)胞擴(kuò)增 至足夠細(xì)胞量，然后將細(xì)胞傳代接種6孔板以及24孔板用于PCR、WB和免疫熒光檢測，結(jié)果 參見附圖9、附圖10。
[0069] 由附圖9可知，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后觀察TP63和GFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)率分別在50%和90%左右， 其中TP63的熒光表達(dá)較弱，在傳代培養(yǎng)后熒光液沒有明顯提升，但GFP的表達(dá)則較強(qiáng)。
[0070] 5.利用p63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。
[0071] 5. L細(xì)胞蛋白提取。
[0072] 5. I. 1.將100 X PMSF按比例加入到RIPA裂解液中，同時(shí)將PBS置于冰上，預(yù)冷備 用。
[0073] 5. 1.2.將待提取蛋白的細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，置于冰上，加入適量預(yù)冷的PBS清洗2 次。
[0074] 5. 1. 3.吸去PBS，加入80 μ I RIPA裂解液，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使裂解液覆蓋整個(gè)皿，冰 上裂解5min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移EP管中，12000 rmp/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到 新的EP管中。
[0075] 5. 1. 4.用核酸蛋白測定儀測定樣品蛋白總濃度。
[0076] 5. 2. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0077] 5. 2. 1.按照8%分離膠和5%的濃縮膠配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠。
[0078] 5. 2. 2.調(diào)整上樣量為總蛋白量 lOOug，加入 5XSDS-PAGE Loading Buffer，混勻， 95 °C水浴5分鐘。濃縮膠中8 OV電泳，分離膠中120 V電泳。
[0079] 5. 3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移以及膜的封閉。
[0080] 5. 3. I. 300mA，濕法轉(zhuǎn)膜 70 分鐘。
[0081] 5. 3. 2.取出膜，置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)。
[0082] 5. 4.抗原抗體反應(yīng)。
[0083] 5. 4. 1.將一抗以適當(dāng)濃度的比例加入到5%脫脂牛奶封閉液中稀釋。
[0084] 5. 4. 2.將封閉后的PVDF膜放入封閉袋中，加入4 mL -抗，室溫震蕩孵育1小時(shí) 后，放4°C冰箱孵育過夜，第二天取出，再室溫震蕩孵育1小時(shí)。
[0085] 5. 4. 3.棄去一抗，用1XTBS/T洗膜3次，每次5分鐘，以除去過量的一抗。 5.4.4.將膜轉(zhuǎn)移至另一新的封閉袋中，加入4 mL適當(dāng)稀釋二抗，室溫振蕩孵育1小 時(shí)。
[0086] 5. 4. 5.用1XTBS/T洗膜3次，每次5分鐘，以除去未結(jié)合的二抗。
[0087] 5. 5. ECL 顯色。
[0088] 5. 5. L將ECL A液和B液以I :1 (V/V)混合，室溫反應(yīng)1-2分鐘。
[0089] 5. 5. 2.將混合液滴加于PVDF膜表面，孵育1 -2分鐘，置于Fiuorchem HD2凝膠 成像分析系統(tǒng)中，觀察、拍照，結(jié)果見圖10。
[0090] 實(shí)施例二：促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞向表皮分化的方法 1.人脂肪干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)鑒定。
[0091] I. 1.通將脂肪組織剪成0· 3cmX0. 3cmX0. 3cm大小，用0· lmmol / L磷酸鹽緩沖 液（PBS)沖洗后移入瓶中，以0. 1%膠原酶I消化，反復(fù)剪碎至糊狀后置37°C搖床，1000 r/ min離心30 min去上清，沉淀重懸于0.075mmol/L氯化鉀，靜置IOmin后離心去上清，沉淀 重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，移入培養(yǎng)皿中；隔天更換培養(yǎng)液。達(dá)到對數(shù)生長 期后，用0. 25%胰酶37°C消化，按1 :3的比例進(jìn)行傳代結(jié)果參見附圖1。
[0092] 1. 2.繪制細(xì)胞生長曲線，參見附圖4,流式細(xì)胞儀檢測抗原cdl05、cd29、cd44、 cd45,結(jié)果見圖5,分別進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，參見附圖2 ;成骨誘導(dǎo)分化參見附圖3。
[0093] 2.慢病毒載體的制備。
[0094] 2.1.目的基因片段獲取。
[0095] 2. I. L引物設(shè)計(jì)：從GeneBank中查尋TP63基因序列，設(shè)計(jì)引物 從GeneBank中查尋p63基因序列，分別設(shè)計(jì)引物attBl-Kozak-TP63_F、flag_TP63_R 和 ttB2_flag_R 如下， attBl-Kozak-TP63_F: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAATTTTGAAACTTCACGGTGTG; flag-TP63-R ： TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTCCCCCTCCTCTTTGATGCG; attB2-flag-R ： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC。
[0096] 2. I. 2. PCR 擴(kuò)增目的基因：分別以 attBl-Kozak-TP63_F，attB2-flag_R 為引 物，進(jìn)行目的基因 TP63的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μ L，目的基因 TP63的PCR反應(yīng)循 環(huán)條件：98°C 3 min - ( 94? 30 s - 6(TC 30 s - 72? 2. 5m) 30 循環(huán)一72°C 10 min - 4°C ;PCR 擴(kuò)增獲得 attBl-Kozak-TP63-flag -attB2 片段。
[0097] 2· 2·利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_flag 載體 25°C，BP反應(yīng)I h。反應(yīng)體系： attBl-K-TP63-flag-attB2 100 ng PD0NR221 100 ng BP clonase I μ I TE buffer up to 5 μ I 加入0. 5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stbl3,把 100 μ L轉(zhuǎn)化物涂到含有50 μ g/mL Kan的LB平板上，37°C孵育過夜。菌落PCR篩選陽性克 隆。體積 30 yl，PCR 鑒定程序：94°C 3 min94°C，30 S ; 60°C，30 S ; 72°C，1.5min (2kb/min) ;29個(gè)循環(huán)，72°C 5min，PCR鑒定結(jié)果參見附圖6 ;陽性克隆質(zhì)粒測序驗(yàn)證反應(yīng)； 載體結(jié)構(gòu)參見附圖7。
[0098] 2. 3.利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/ eGFP 〇
[0099] 25°C，LR反應(yīng)16 h。反應(yīng)體系： pUp-EFlA 12.89 ng pDown- TP63-flag 15.21 ng pTail- IRES/eGFP 13.03 ng 母載體 pLV. Des3d. P/neo 60. 28 ng LR clonase I μ I TE buffer up to 5 μ I 加入0. 5ul蛋白酶K于37°C終止反應(yīng)10 min。轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物到Stbl3。菌落PCR 篩選陽性克隆，鑒定結(jié)果參見附圖6。挑取陽性克隆質(zhì)粒，測序驗(yàn)證，獲得載體圖譜參見附圖 7。
[0100] 3.病毒包裝。
[0101] 3. 1.取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每個(gè)IOcm 的培養(yǎng)皿5 X 106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜； 3. 2.第二天轉(zhuǎn)染前去除舊的培養(yǎng)液，加入5mL新鮮的含10%血清DMEM培養(yǎng)液；制備 DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物，以一個(gè)IOcm培養(yǎng)皿的用量為示范：一支無菌的5mL離心 管，先加入 I. 5mL 無血清 0pti_MEM?I 培養(yǎng)液，再加入 pLV/helper_SL3、pLV/helper_SL4、 pLV/helper-SL5、目的質(zhì)粒(各4ug)，輕輕顛倒混勻；另外一支無菌的5mL離心管里，加入 I. 5mL無血清0pti-MEM?I培養(yǎng)液和40 μ L的Lipofectamine 2000,輕輕顛倒混勻；室溫孵 育5分鐘；5分鐘后，將已稀釋DNA加入到含有Lipofectamine 2000的無血清0pti-MEM?I 培養(yǎng)液，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20分鐘。
[0102] 3. 3.將DNA- Lipofectamine 2000復(fù)合物一滴一滴地添加到293FT細(xì)胞中，輕輕 地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物。放置37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
[0103] 3. 4.轉(zhuǎn)染后一天，更換IOmL含10%血清DMEM培養(yǎng)液。放置37°C、5%C02飽和濕度 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0104] 3. 5.轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；加入IOml新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再次收集濃縮；3000rpm低速離心15min，上清用0. 45 μ m濾器進(jìn)行過濾，以 徹底去除細(xì)胞碎片；每個(gè)UT離心管裝20mL濾液，50000 X g高速離心90min沉淀病毒顆粒， 棄去上清；每管沉淀用200ul培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，分裝進(jìn)2個(gè)0. 5ml進(jìn)口 AXYGEN管中，每 管 IOOul。
[0105] 3. 6.分裝好的病毒放置_80°C保存，病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果參見附圖8。
[0106] 4. Western Blot檢測對比未轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì) 胞分化能力。
[0107] 4. L細(xì)胞蛋白提取。
[0108] 4. I. 1.將100 XPMSF按比例加入到RIPA裂解液中，同時(shí)將PBS置于冰上，預(yù)冷備 用。
[0109] 4. 1.2.將待提取蛋白的細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，置于冰上，加入適量預(yù)冷的PBS清洗2 次。
[0110] 4. 1.3.吸去PBS，加入80 μ I RIPA裂解液，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使裂解液覆蓋整個(gè)皿，冰 上裂解5min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移EP管中，12000 rmp/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到 新的EP管中。
[0111] 4. 1.4.用核酸蛋白測定儀測定樣品蛋白總濃度。
[0112] 4. 2. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0113] 4. 2. 1.按照8%分離膠和5%的濃縮膠配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠。
[0114] 4. 2. 2.調(diào)整上樣量為總蛋白量 lOOug，加入 5XSDS-PAGE Loading Buffer，混勻， 95 °C水浴5分鐘。濃縮膠中8 OV電泳，分離膠中120 V電泳。
[0115] 4. 3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移以及膜的封閉。
[0116] 4.3.1. 300mA，濕法轉(zhuǎn)膜 70 分鐘。
[0117] 4.3.2.取出膜，置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)。
[0118] 4.4.抗原抗體反應(yīng)。
[0119] 4.4. 1.將一抗以適當(dāng)濃度的比例加入到5%脫脂牛奶封閉液中稀釋。
[0120] 4. 4. 2.將封閉后的PVDF膜放入封閉袋中，加入4 mL -抗，室溫震蕩孵育1小時(shí) 后，放4°C冰箱孵育過夜，第二天取出，再室溫震蕩孵育1小時(shí)。
[0121] 4.4. 3.棄去一抗，用1XTBS/T洗膜3次，每次5分鐘，以除去過量的一抗。 4.4.4.將膜轉(zhuǎn)移至另一新的封閉袋中，加入4 mL適當(dāng)稀釋二抗，室溫振蕩孵育1小 時(shí)。
[0122] 4. 4. 5.用1XTBS/T洗膜3次，每次5分鐘，以除去未結(jié)合的二抗。
[0123] 4.5. ECL 顯色。
[0124] 4. 5. 1.將ECL A液和B液以I :1 (V/V)混合，室溫反應(yīng)1-2分鐘。
[0125] 4. 5. 2.將混合液滴加于PVDF膜表面，孵育1 -2分鐘，置于Fiuorchem HD2凝膠 成像分析系統(tǒng)中，觀察、拍照，結(jié)果參見附圖10。
[0126] 實(shí)施例三：Q-PCR檢測試驗(yàn) I. RNA抽提。
[0127] I. 1.吸去培養(yǎng)液，加入I mL Trizol，室溫放置5分鐘后反復(fù)吹打細(xì)胞，將細(xì)胞裂 解物移入一個(gè)I. 5 mL EP管。
[0128] 1. 2.劇烈振蕩15秒，加入0. 2倍體積氯仿，振蕩15秒，室溫放置2?3分鐘。
[0129] 1. 3. 12000 rpm，離心 10 分鐘。
[0130] 1. 4.吸取上層水相，移到另一新EP管中，加入I. 1倍體積的異丙醇，充分混勻，室 溫放置10分鐘。
[0131] 1. 5. 12000 rpm，離心10分鐘，棄去上清液。
[0132] L 6.加入ImL無水乙醇洗滌RNA沉淀。
[0133] I. 7· 7500 rpm，離心5分鐘，棄去上清液。
[0134] L 8.充分吸干乙醇?xì)埩粢?，稍微瞭干2?3分鐘，加入20 uL DEPC-treated water 溶解RNA沉淀。
[0135] 1. 9.用超微量分光光度計(jì)測定抽提的RNA濃度和純度，_80°C保存。
[0136] 2.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0137] 2. LRNA lug； oligo (dT)18 primer 1 μ L； DEPC-treated water up to 12 μ L ； 65 °C孵育5分鐘后立即放在冰上； 依次加入： 5 X Reaction Buffer 4 μ L ； RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μ L) I μ L ； 10 mM dNTP Mix 2 μ L ； RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/μ L)I μ L ； 2. 2.離心混合均勻：42°C孵育60分鐘；70°C孵育5分鐘。
[0138] 2. 3.合成后的cDNA樣品-20 °C保存。
[0139] 3. Real-time PCR〇
[0140] 3. 1.引物序列： TP63-F1 ：AGTTGTGTTGGAGGGATGAACCG TP63-R1 ：TCCGAAACTTGCTGCTTTCTGATG Human GAPDH-F :GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG Human GAPDH-R :ACCACCCTGTTGCTGTAGCC 3. 2.反應(yīng)體系：見如下表1。
[0141] 表1:PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，通過脂肪干細(xì)胞的分離及體外培 養(yǎng)，構(gòu)建了含有確定基因的慢病毒載體，利用慢病毒將確定基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞，通過慢 病毒轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞，促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞向表皮分化，其特征在于，具體通過如下方法制 備獲得： (1) 脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定：無菌獲取人脂肪組織并進(jìn)行體外培養(yǎng)鑒 定，以膠原酶振蕩消化后離心收集細(xì)胞，常規(guī)傳代及凍存，并對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長曲線及 ⑶44、⑶45、⑶29、⑶105表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞鑒定； (2) 脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能鑒定：對所獲人脂肪干細(xì)胞分別進(jìn)行成脂和成骨分化 鑒定，即分別以成脂和成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞，2周后分別對成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行油紅染 色和茜素紅染色的鑒定； (3) 構(gòu)建含p63基因的慢病毒載體：從GeneBank中查尋p63基因序列，設(shè)計(jì)引物，分 別以attBl-Koza k-TP63-F，attB2-flag-R為引物，進(jìn)行目的基因TP63的PCR擴(kuò)增；再利 用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_f lag，最后利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/f lag>IRES/eGFP慢病毒載體，通過菌落PCR篩選陽性克隆，挑取 陽性克隆質(zhì)粒并測序； (4) 將上述制備的含p63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞：所獲得的pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝，收 集培養(yǎng)上清對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定；最后將Lenti-TP63-eGFP/Ne〇和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干細(xì)胞，通過脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，并進(jìn)行 PCR、WB和免疫熒光檢測； (5) 利用p63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞，其特征在 于，所述的用于皮膚組織缺損修復(fù)的改良式脂肪干細(xì)胞通過如下具體方法制備獲得： (1) 脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)鑒定：脂肪組織剪成糜狀，用PBS沖洗數(shù)遍，以0. 1% 膠原酶I置37°C搖床消化，離心30 min去上清，沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 液中，移入培養(yǎng)皿中；隔天更換培養(yǎng)液；達(dá)到對數(shù)生長期后，用〇. 25%胰酶消化，按1 :3的比 例進(jìn)行傳代； 生長曲線的檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化，洗滌離心，制備單細(xì)胞懸液， 接種到24孔板中；每天隨機(jī)取4孔細(xì)胞消化、記數(shù)，取其均值，連續(xù)7天，即可制備生長曲 線. 流式檢測脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)記：流式細(xì)胞儀對第3代脂肪干細(xì)胞表面相對特異性抗原 進(jìn)行檢測；〇. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1500r/分離心10分鐘，在細(xì)胞沉淀中細(xì)胞數(shù)量 為 1* 106，分別加入 FITC- CD105 熒光抗體，PE - CD29 熒光抗體，F(xiàn)ITC-CD45，F(xiàn)ITE-CD44 熒光抗體各20ul，4°C孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍，最后用10%福爾馬林 固定細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀測定抗原的陽性率； (2) 脂肪干細(xì)胞定向分化及鑒定： 成脂分化：細(xì)胞貼壁100%匯合后，加入間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)72小時(shí)后，細(xì) 胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)，約2周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形， 油紅0染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀； 成骨分化：取第3代細(xì)胞，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液加10 mol / L地塞 米松、10 mmmol / L0 -甘油磷酸鈉、50 mg / L抗壞血酸，誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，細(xì)胞體積增大， 呈短梭形；誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多；14天，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞 呈集落樣生長，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積；29天，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)； (3) 構(gòu)建含p63基因的慢病毒載體：PCR擴(kuò)增attBl-Kozak-TP63-flag -attB2,再利 用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_f lag，最后利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pLV. EX3d.P/ne〇-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP，挑取陽性克隆質(zhì)粒，送交陽性克隆測序； (4) 將上述制備的含p63基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人脂肪干細(xì)胞： 病毒包裝：對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，DNA- Lipofectamine2000復(fù)合 物添加到293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再次收集濃 縮；對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定； 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)：待人脂肪干細(xì)胞完全貼壁后，選取兩孔細(xì)胞分別加入30yL的 Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo,充分的搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí) 后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果；待細(xì)胞擴(kuò)增 至足夠細(xì)胞量，然后將細(xì)胞傳代接種6孔板以及24孔板用于PCR、免疫熒光檢測； (5) 利用p63基因的作用促使脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化。
3. -種含p63基因的慢病毒載體，其特征在于，所述的含p63基因的慢病毒載體pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種含p63基因的慢病毒載體，其特征在于，所述的含p63基因 的慢病毒載體 pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/f lag>IRES/eGFP 具有如序列表 SEQ ID NO. 2 所不的喊基序列。
5. -種促進(jìn)人脂肪肝細(xì)胞向表皮分化的方法，其特征在于，所述的促進(jìn)人脂肪肝細(xì)胞 向表皮分化的具體方法如下： (1) 脂肪干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)：脂肪組織剪成糜狀，用PBS沖洗數(shù)遍，以0. 1%膠原 酶I置37°C搖床消化，離心30 min去上清，沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中， 移入培養(yǎng)皿中；隔天更換培養(yǎng)液；達(dá)到對數(shù)生長期后，用0. 25%胰酶消化，按1 :3的比例進(jìn) 行傳代； (2) 構(gòu)建了含有p63基因的慢病毒載體，含p63基因的重組載體是pLV. EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP，含 p63 基因的重組載體通過 PCR 擴(kuò)增 attBl-Kozak_TP63-f lag _attB2,再利用 Gateway Technology 構(gòu)建 pDown- TP63_f lag，最 后利用Gateway Technology構(gòu)建pLV.EX3d. P/neo-EFlA > TP63/flag>IRES/eGFP，挑取陽 性克隆質(zhì)粒，送交陽性克隆測序等過程構(gòu)建； (3) 利用慢病毒將p63基因轉(zhuǎn)載至脂肪干細(xì)胞： 病毒包裝：對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，DNA- Lipofectamine2000復(fù)合 物添加到293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再次收集濃 縮；對病毒進(jìn)行熒光表達(dá)觀察及滴度測定； 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)：待人脂肪干細(xì)胞完全貼壁后，選取兩孔細(xì)胞分別加入30yL的 Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo,充分的搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí) 后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效果；待細(xì)胞擴(kuò)增 至足夠細(xì)胞量，然后將細(xì)胞傳代接種6孔板以及24孔板用于PCR、免疫熒光檢測。
【文檔編號】C12N5/10GK104403998SQ201410828141
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】馮樹梅, 王瑋, 譚周, 賴成霞, 李甜, 白生賓, 郭瓊, 鐘近潔, 秦紋 申請人:新疆醫(yī)科大學(xué), 馮樹梅