一種具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建，屬于酶工程領(lǐng)域。通過把釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、β-果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列按順序合成，在兩端加上限制性內(nèi)切酶位點，通過酶切構(gòu)建到pPIC9K質(zhì)粒中，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中得到具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株，其生產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的回收率達(dá)到82%，發(fā)酵后β-果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活達(dá)到95.0 U/g濕酵母。本發(fā)明實現(xiàn)了β-果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)和同步濃縮回收的一步完成，降低了能源消耗和成本，具有較強(qiáng)的實用性。
【專利說明】—種具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有生產(chǎn)和回收β_果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建。

【背景技術(shù)】
[0003]β -果糖基轉(zhuǎn)移酶能夠在蔗糖的果糖基上連接1-3個果糖基而形成一系列果糖寡聚體。低聚果糖是一種水溶性膳食纖維，長期服用可以降低血清膽固醇，改善脂質(zhì)代謝，經(jīng)動物和人體實驗證實。人體攝入低聚果糖后，體內(nèi)有益菌群雙歧桿菌數(shù)量可抑制外源致病菌和腸內(nèi)固有腐敗細(xì)菌如沙門氏菌等生長繁殖，減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的生長和積累，促進(jìn)腸道蠕動，防止便秘和腹瀉。低聚果糖是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維，能有效降低血清膽固醇、甘油三脂、游離脂肪酸的數(shù)量，對于因血脂高而引起的高血壓、動脈硬化等一系列心血管疾病有較好的改善作用。低聚果糖在大腸內(nèi)被細(xì)菌發(fā)酵生成L-乳酸，可以溶解鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)，促進(jìn)人體對礦物質(zhì)的吸收。實驗證實，低聚果糖促進(jìn)鈣的吸收率達(dá)70.8%。因此，低聚果糖可以促進(jìn)生長發(fā)育和防止骨質(zhì)疏松癥。同時還可促進(jìn)維生素B1、Β2、Β3、Β6、Β12及葉酸的自然形成，從而提高人體新陳代謝水平，提高免疫力和抗病力。預(yù)防及改善由于體內(nèi)毒而引起的皮膚性疾病，可防止面瘡、黑斑、雀斑、青春痘、老人斑，使皮膚亮麗、老化減緩。雙歧桿菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大腸桿菌、沙門氏菌和梭狀芽胞桿菌等腐敗菌發(fā)生作用，減少毒性代謝物(如吲哚、亞硝基氨)的生成，同時迅速將毒性代謝物排出體夕卜，減輕肝臟負(fù)擔(dān)，起到保護(hù)肝臟的作用，預(yù)防各種慢性病、癌癥等作用明顯，低聚果糖極少會被消化道中的胃酸和酶分解，極難被人體吸收。據(jù)測定，低聚果糖的熱值為1.5Kcal/g以下，而蔗糖熱值為4.6 Kcal/g，因此攝入低聚果糖后，不會引起肥胖，是理想的、低熱值的功能性甜味劑。低聚果糖不能被突變鏈球菌利用生成不溶性葡聚糖而提供口腔微生物沉積/產(chǎn)酸和腐蝕的場所(牙垢)，因此可以防止齲齒。低聚果糖生產(chǎn)的關(guān)鍵是生產(chǎn)低成本的果糖轉(zhuǎn)移酶。
[0004]液體發(fā)酵具有發(fā)酵體積大，易實現(xiàn)自動化控制等特點，因而液體發(fā)酵在許多產(chǎn)品的生產(chǎn)上體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。特別是在現(xiàn)在勞動力成本上升，國際大力推進(jìn)機(jī)械化和自動化背景下，液體發(fā)酵具有更廣闊的空間。β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)也有越來越傾向于液體發(fā)酵的優(yōu)勢。但是液體發(fā)酵生產(chǎn)的酶類產(chǎn)品濃度低的特征。生產(chǎn)的β_果糖基轉(zhuǎn)移酶等都游離在發(fā)酵醪液中，為得到高濃度的β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的固體墳?zāi)梗枰獙Πl(fā)酵醪液進(jìn)行濃縮。為純化濃縮β_果糖基轉(zhuǎn)移酶往往需要通過真空蒸發(fā)或噴霧干燥等工藝來濃縮。在蒸發(fā)濃縮或噴霧干燥的過程中，β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了生產(chǎn)成本，在蒸發(fā)或噴霧干燥的過程中，消耗大量的能源如電或燃?xì)獾?。因此降低濃縮成本，成為降低液體發(fā)酵生產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)成本的必然選擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供用于構(gòu)建上述酵母菌株的DNA片段。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供用于構(gòu)建上述酵母菌株的質(zhì)粒。
[0008]本發(fā)明的目的還在于提供上述酵母菌株的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β -果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、β -果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQ ID N0.1?5所示。
[0010]優(yōu)選的，所述的用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β -果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β -果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒為包含上述DNA片段的真核表達(dá)質(zhì)粒。所述的真核表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為PPIC9K質(zhì)粒。
[0012]所述的用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β -果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒通過包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內(nèi)切酶識別位點含有上述DNA片段的序列,通過限制性內(nèi)切酶連接到真核表達(dá)質(zhì)粒上。所述的真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K質(zhì)粒時，限制性內(nèi)切酶優(yōu)選為Bgl II和FspA I。
[0013]一種具有生產(chǎn)和回收纖β_果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質(zhì)粒。所述的酵母菌株優(yōu)選為酵母菌株SMDl 168。
[0014]所述的具有生產(chǎn)和回收β -果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將上述質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)酵母中得到。
[0015]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果:
本發(fā)明的酵母菌株能在生產(chǎn)β_果糖基轉(zhuǎn)移酶的同時，把β_果糖基轉(zhuǎn)移酶吸附在菌株自身表面，通過簡單過濾，就能達(dá)到濃縮β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的目的。
[0016]本發(fā)明大大簡化了果糖基轉(zhuǎn)移酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該發(fā)明具有較強(qiáng)的實用性。
[0017]本發(fā)明把果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在酵母內(nèi)表達(dá)，并實現(xiàn)了果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)和同步濃縮回收的一步完成，現(xiàn)有技術(shù)未有相關(guān)報道，具有較高的創(chuàng)新型。
[0018]本發(fā)明酵母菌株生產(chǎn)β_果糖基轉(zhuǎn)移酶的回收率達(dá)到82%，發(fā)酵后β_果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活達(dá)到95.0U/g濕酵母。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0020]實施例1
(l)pPIC9K質(zhì)粒的提取 I)接1%含PPIC9K質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2mL LB培養(yǎng)基。
[0021]2) 37°C振蕩培養(yǎng) 12h。
[0022]3)取1.5mL菌液于EP管，以4000rpm離心3min,棄上清液。
[0023]4)加 0.1mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50mM EDTA ρΗ8.0, 25mM Tris-HCl ρΗ8.0)充分混入口 ο
[0024]5)加入0.2mL溶液II (0.2mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。
[0025]6)加入0.15mL預(yù)冷溶液III (5mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5min。
[0026]7)以1000rpm離心20min,取上清液于另一新EP管中。
[0027]8)加入等體積的異戊醇，混勻后靜置1min。
[0028]9)再以 1000rpm 離心 20min,棄上清。
[0029]10)用70%乙醇0.5mL洗滌一次,抽干所有液體。
[0030]11)待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE緩沖液中。
[0031](2)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
I)將大腸桿菌DH5 a置于LB或其它營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng)。
[0032]2)高溫滅菌大的離心瓶(250?500mL)以備第二天搖瓶用。
[0033]3)準(zhǔn)備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用。
[0034]4)轉(zhuǎn)移0.2?ImL過夜培養(yǎng)物至裝有20mL LB (或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基)的10mL搖瓶。
[0035]5) 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)6小時。
[0036]6)監(jiān)控0D600值(培養(yǎng)I小時后每半小時測定一次)。
[0037]7)當(dāng)0D600值達(dá)到0.5?1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0038]8)細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0039]9)用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞，先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0040]10)照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液。
[0041]11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。
[0042]12)離心，棄上清液。
[0043]13)用20mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞。
[0044]14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)。
[0045]15)用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2?3mL。
[0046]16)將細(xì)胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于_80°C保存。
[0047](3)pPIC9K重組質(zhì)粒構(gòu)建
I)用限制性內(nèi)切酶Bgl I1、FspA I分別酶切質(zhì)粒pPIC9K。限制性內(nèi)切酶Bgl I1、FspA I(TAkaRA)各 1.5μ?，提取的 pPIC9K 質(zhì)粒溶液 6μ?，10ΧΚ Buffer WL 加入到 ΙΟΟμ? EP 管中，在30°C水浴鍋中酶切60min。再通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的質(zhì)粒pPIC9K得到的三個片段中最大的一個片段。
[0048]2)序列合成和酶切
合成兩端具有Bgl II和FspA I識別序列的序列GGAGATCTTCTAGACC-釀酒酵母TDH3啟動子序列-釀酒酵母分泌信號肽編碼序列-果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列-釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列-釀酒酵母TDH3終止子序列-GGTGCGCACCC，各片段及全長片段如SEQ ID N0.1?6所示。將合成的全長片段也用Bgl II和FspA I進(jìn)行酶切并回收。
[0049]3)連接
酶切的全長片段2(^1^，酶切的口？1091(質(zhì)粒541^，10\131^€61 5μ?, ddH20 ΙΟμ?, Τ4 DNA連接酶(Takara) 5μ?加入ΙΟΟμ? EP管中，16°C連接過夜。
[0050]4)將上述連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，電轉(zhuǎn)化具體方法如下:
4.1)在冰上解凍大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，添加I?10 μ L連接產(chǎn)物，冰上放置約5分鐘。
[0051]4.2)轉(zhuǎn)移連接產(chǎn)物/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器中。
[0052]4.3)加載電轉(zhuǎn)儀 P1000，準(zhǔn)備好 300 μ L LB 或 2ΧΥΤ。
[0053]4.4)對電穿孔容器進(jìn)行脈沖(200歐姆，25 μ F，2.5千伏)，檢查時間常數(shù)，應(yīng)該在3以上。
[0054]4.5)立即添加300yL的LB或2ΧΥΤ至電轉(zhuǎn)杯中。
[0055]4.6) 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至I小時以復(fù)蘇。
[0056]4.7)復(fù)蘇后離心棄掉150 μ L上清，剩余150 μ L重懸菌體涂布到含有氨芐(10Pg/mL)的LB或2XYT培養(yǎng)基的固體平板上，于37°C培養(yǎng)過夜。
[0057]5)挑去固體平板上生長的單克隆,通過培養(yǎng),提取質(zhì)粒,用Bgl II和FspA I對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒再進(jìn)一步測序，得到PPIC9K重組質(zhì)粒。
[0058](4)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
I)挑一環(huán)酵母菌(SMD1168)接種于5mL YEPD培養(yǎng)基中，30°C、250?300rpm培養(yǎng)過夜得到一級種子。
[0059]2)取ImL—級種子分別接種于兩瓶50mL YEI3D培養(yǎng)基中，30°C、250?300rpm培養(yǎng)約 16 ?18h (0D600 約 1.3 ?1.5)。
[0060]3)于4°C離心收集菌體,用25mL冰預(yù)冷無菌水洗漆一次后,細(xì)胞用1mL冰預(yù)冷無菌水重懸，可換成較小的離心管。
[0061]4)加入ImL ρΗ7.5的10ΧΤΕ緩沖液，搖晃均勻，再加入ImL 1XLiAc,旋轉(zhuǎn)搖勻，于30 °C輕輕搖動45min。
[0062]5)再加入0.4mL lmol/L DTT，并同時旋轉(zhuǎn)搖動，于30°C輕輕搖動15min。
[0063]6)于4°C離心，棄上清(用槍吸)，再用25mL冰預(yù)冷無菌水洗滌。
[0064]7) 2.5mL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清(用槍吸)。
[0065]8)每管用100 μ L lmol/L山梨醇溶解，分裝于3個EP管中(80 μ L/管)，于_70°C冰箱保存。
[0066](5 ) pPIC9K重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母
I)向酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入約5?1yg (體積小于10μυΡΡΚ9Κ重組質(zhì)粒，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min。
[0067]2)擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù):1.5KV,25uF,200歐姆。
[0068]3)立即加入ImL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇，轉(zhuǎn)移至離心管中，于30°C靜置lh。
[0069]4)離心，棄上清，加入ImL YEPD后，于30°C、200rpm培養(yǎng)2h。
[0070]5)離心得菌體后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂lOOPg/mL氨芐YEPD板于30°C培養(yǎng)至長出轉(zhuǎn)化子。
[0071](6)酵母轉(zhuǎn)化子發(fā)酵
挑取的轉(zhuǎn)化子在YEro培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)24h，以10%接種量(v/v)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，50mM檸檬酸緩沖液)中。發(fā)酵在500mL搖瓶中發(fā)酵，裝液量為20% (v/v )，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培48h。
[0072](7) β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的回收
發(fā)酵液在離心機(jī)中4000r/m離心lOmin，收集上清液(上清液中有游離的β -果糖基轉(zhuǎn)移酶，用于β -果糖基轉(zhuǎn)移酶回收率的計算)，按酵母沉淀濕重與蒸餾水質(zhì)量比1:10的比分例加入蒸餾水，用蒸餾水洗滌兩次，收集酵母沉淀，β -果糖基轉(zhuǎn)移酶吸附在酵母表面。
[0073](8) 果糖基轉(zhuǎn)移酶活測定:試管中分別加入ImL上清液或1.0g酵母沉淀，力口A 50mmol/L pH6.0磷酸緩沖液溶解的10% (w/w)鹿糖,40°C下保溫60min, 95°C保溫5min。高效液相色譜法測定剩余量，通過計算可得蔗糖的減少量。色譜條件:色譜柱為Watercarbohydrate (250mmX4.6mm);流動相為乙腈:水溶液(75:25);流速 lmL/min ;進(jìn)樣量15 μ L ;檢測波長283nm ;柱溫35 °C。
[0074]酶活定義為:在40°C，pH值6.0條件下，每分鐘分解IMfflol蔗糖的酶量為1U。
[0075]β -果糖基轉(zhuǎn)移酶回收率(％)=酵母沉淀的酶活/ (上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)X 100%O
[0076]經(jīng)過測定β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的回收率達(dá)到82%，發(fā)酵后β -果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活達(dá)到95.0U/g濕酵母。β -果糖基轉(zhuǎn)移酶較高的回收率，說明在發(fā)酵的時候，構(gòu)建的酵母能很好的富集濃縮β -果糖基轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)了發(fā)酵和濃縮的一步完成。
[0077]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β-果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、β -果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分別如SEQID N0.1?5所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收β_果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒，其特征在于:為包含權(quán)利要求1-3任一項所述的DNA片段的真核表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒,其特征在于:所述的真核表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于:通過包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內(nèi)切酶識別位點含有權(quán)利要求1-3任一項所述的DNA片段的序列，通過限制性內(nèi)切酶連接到真核表達(dá)質(zhì)粒上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒,其特征在于:所述的真核表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K質(zhì)粒時，限制性內(nèi)切酶為Bgl II和FspA I。
8.一種具有生產(chǎn)和回收β_果糖基轉(zhuǎn)移酶雙重功能的酵母菌株，其特征在于:包含權(quán)利要求4-7任一項所述的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株為酵母菌株SMDl168。
10.權(quán)利要求8或9所述的酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟:制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將權(quán)利要求4-7任一項所述的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)酵母中得到。
【文檔編號】C12R1/865GK104498513SQ201410839854
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】章軼鋒, 薛棟升 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)