專利名稱：減少亞硝胺類的微生物和用其減少亞硝胺類的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及煙葉熟化和儲存過程中降解煙葉中形成的亞硝胺類的微生物和通過使用該微生物減少熟化過程和/或儲存過程中煙葉中形成的亞硝胺類的方法。
背景技術：
煙葉中含有的亞硝胺類(煙草特定的亞硝胺類，下文稱作“TSNA”)在剛收獲后的煙葉(即綠葉)中并不存在，而在此后熟化和儲存過程中通過煙葉中含有的生物堿與腈之間的反應形成。這種腈由存在于煙葉表面上且具有減少硝酸鹽能力的微生物形成。
熟化和隨后的儲存過程中形成的主要TSNA為N’-亞硝基降煙堿(下文稱作“NNN”)、4-(N-亞硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(下文稱作“NNK”)、N’-亞硝基新煙草堿(下文稱作“NAT”)、N’-亞硝基假木賊堿(下文稱作“NAB”)等。
通常稱作減少煙葉中TSNA含量的方法的方法實例包括(1)抑制TSNA形成的方法；和(2)除去已經形成的TSNA的方法。
抑制TSNA形成的方法的實例包括通過減少氮肥的量而使煙葉中的生物堿含量下降的方法；減少熟化過程中形成的TSNA的方法，該方法通過采取間接加熱類型的熟化室取代直接加熱類型的熟化室來進行(該方法主要用于煙熏煙)；育種具有較少生物堿含量的新煙草變種的方法，該發(fā)依賴于育種技術的發(fā)展；等。
此外，近來報導了通過微波照射抑制TSNA形成的方法(PCT國際公開號2001-503247)。然而，作為上述用微波處理產生的這類快速干燥和熟化沒有使煙葉中的成分類型充分改變，而可以在常規(guī)熟化過程中以令人滿意的方式進行這種改變。因此，比使用常規(guī)方法更為快速熟化得到的煙葉在吸煙時表現出極差的氣味和味道。
就從煙葉中除去TSNA(由此形成的)的方法而言，對其報導的實例的數量少于抑制TSNA形成的方法的數量。作為這些實例之一，已知通過超臨界提取從煙葉中除去TSNA的方法(WO 01/65954)。然而，該方法就其成本而言不切實際。
由于上述情況，所以存在對減少已知煙葉熟化和儲存過程中形成的TSNA含量的新方法的需求。
此外，存在對具有相對較少含量的TSNA并對消費者維持令人滿意的良好氣味和味道的作為香煙原料的煙葉的需求。
因此，本發(fā)明的目的是提供能夠減少常規(guī)熟化和儲存過程中形成的TSNA含量的方法。
另外，已知屬于曲霉屬的為分離自未精制的大豆來源的絲狀真菌的微生物可降解亞硝胺類(日本專利申請KOKAI公開號10-276681)。然而，已經指出屬于曲霉屬的微生物需要高含濕量才能存活，這種高含濕量可以對煙葉的質量、尤其是對其氣味和味道產生不良影響。因此，在處理煙葉中應用如上所述的這類微生物可以使煙草質量產生問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個方面提供了減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物處理煙葉的步驟，所述的微生物具有減少TNSA的能力且選自少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌組成的組。
本發(fā)明的第二個方面提供了減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于包括用選自少動鞘氨醇單胞菌LG5菌株和熒光假單胞菌LG38菌株組成的組的微生物處理煙葉的步驟。
本發(fā)明的第三個方面提供了屬于少動鞘氨醇單胞菌或熒光假單胞菌且具有減少煙葉中至少一種類型的TSNA含量的能力的微生物，所述的至少一種類型的TSNA選自N’-亞硝基降煙堿、4-(N-亞硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亞硝基新煙草堿和N’-亞硝基假木賊堿組成的組，其中這些TSNA在煙葉熟化和儲存過程中形成。
本發(fā)明的第四個方面提供了能夠減少煙葉中TSNA含量的少動鞘氨醇單胞菌LG5菌株(FERM BP-7830)。
本發(fā)明的第五個方面提供了能夠減少煙葉中TSNA含量的熒光假單胞菌LG38菌株(FERM BP-7831)。
本發(fā)明的最佳實施方式作為對煙葉熟化和儲存過程中形成TSNA的研究和分析結果，本發(fā)明的本發(fā)明者已經發(fā)現在存在于煙葉上的微生物中存在可以降解TSNA的微生物，由此完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的本發(fā)明者分析熟化煙葉中TSNA的形成過程時，他們從存在于煙葉上的微生物中分離了可以降解形成的TSNA的微生物。此外，本發(fā)明的本發(fā)明者發(fā)現通過用所述的微生物處理熟化的煙葉和/或熟化過程后儲存的煙葉可以減少煙葉中的TSNA含量。
已經基于細菌學特性將在分離(收集)的微生物中尤其表現出高降解活性的兩種類型的微生物分別鑒定為動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌。本發(fā)明的本發(fā)明者命名為菌株少動鞘氨醇單胞菌“LG5”(下文稱作“LG5”或“LG5”菌株)和菌株熒光假單胞菌“LG38”(下文稱作“LG38”或“LG38”菌株)。已經于2001年12月18日將LG5和LG38寄存在微生物國際專利保藏所(International Patent Organism Depositary)(IPOD)，國家高級工業(yè)化科學和技術研究院(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并分別給予寄存號FERM BP-7830和FERM BP-7831。
這些微生物LG5和LG38有效地減少了煙葉中的TSNA，而沒有對熟化的煙葉和/或儲存中的煙葉的質量產生任何不良影響。
此外，本發(fā)明的方法可以通過用微生物處理煙葉而便利地減少TSNA含量，但不改變常規(guī)的熟化方法。因此，可以可靠地維持該煙葉的質量、氣味和味道。
菌株LG5和LG38的活性如下。
LG5具有特異性降解NNK的活性。LG38具有降解NNN、NNK、NAT和NAB的活性。
本發(fā)明處理的煙葉可以為任意煙草，條件是該煙草可以進行常規(guī)的熟化操作。其具體的實例包括作為空氣熟化類型(air-cured type)的日本家用煙草(Japanese domestic tobacco)，白萊煙(Burley tobacco)和用設備熟化的煙熏煙(flue-cured tobacco)，但并不限于它們。
對用本發(fā)明微生物處理煙葉的時間沒有特別限定且可以從煙葉中形成TSNA前立即到將煙葉加工成香煙之間的任意時間進行處理。優(yōu)選在熟化煙葉和/或儲存煙葉期限中進行處理。就在熟化過程中進行處理而言，優(yōu)選在收獲后TSNA形成前立即到變黃階段和變褐階段之間的期限中進行處理。就在儲存過程中進行處理而言，優(yōu)選在熟化過程后開始儲存時進行處理，不過，可以在儲存期過程中的任意時間進行處理。如果需要，基本上可以由操作者從開始熟化過程到完成儲存過程之間的期限中選擇處理時間。
或者，可以接受的是在收獲前立即在田地上用微生物處理煙葉且然后收獲并熟化。
用本發(fā)明微生物處理的次數并不限于一次。可以在處理期中連續(xù)進行兩次以上處理，其中每次處理之間有預定的間隔。
本發(fā)明的處理并不限于在熟化和/或儲存過程中的處理且可以在將煙葉加工成香煙過程中進行處理。
可以通過任意已知方法進行本發(fā)明的處理，其實例包括噴懸浮有微生物的混懸液和涂布含有微生物細菌細胞的粉末層。即操作者可以選擇適當的方法進行處理。另外可以接受的是將煙葉浸入含有微生物的液體。
如上所述，優(yōu)選用于本發(fā)明的微生物為LG5菌株和LG38菌株。不過，本發(fā)明并不限于這些菌株。屬于少動鞘氨醇單胞菌或熒光假單胞菌且具有減少TSNA能力的任意微生物種類均包括在本發(fā)明范圍內。
在本說明書中，術語“減少TSNA”表示減少煙葉中TSNA的含量。例如，降解熟化和儲存過程中形成的煙葉中的每種TSNA成分包括在術語“減少TSNA”范圍內。
作為用于培養(yǎng)本發(fā)明中所用微生物的培養(yǎng)基，可以使用用于培養(yǎng)微生物的各種類型的已知培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)條件方面，溫度可以在25-35℃、優(yōu)選28-32℃且pH可以在6.0-8.0、優(yōu)選約7.0。
在本發(fā)明中，在培養(yǎng)預定期限后，通過離心收集微生物?？梢允褂脩腋∮诨鞈乙褐泻笫占募毦毎Ａ硪环矫?，可以使用通過凍干得到的粉末形式的收集的細菌細胞。
在將收集的細菌細胞懸浮于特定的緩沖液以制備微生物混懸液的情況中，可以將無菌蒸餾水、磷酸鹽緩沖液等用作緩沖液。
懸浮于緩沖液中的細菌細胞的濃度可以為107-1012、優(yōu)選108-1010個細胞/1ml緩沖液。在用于用微生物處理煙葉時，優(yōu)選以如上所述的這類濃度懸浮細菌細胞。
本發(fā)明可以通過使用如上所述獲得的細菌細胞進行使用微生物處理煙葉。
通過將無菌蒸餾水加入到含有必須量細菌細胞的細菌混懸液中來制備接種入煙葉的微生物接種溶液。將由此制備的接種溶液均勻地噴在煙葉上?？梢栽谑旎^程到儲存過程之間的任意時間進行這種處理。就使用空氣熟化的煙草的情況而言，可以在熟化過程和此后的儲存期中的任意時間進行這種處理。就使用煙熏煙的情況而言，在熟化過程的開始階段(變黃階段)或熟化過程后的儲存過程中進行這種處理。優(yōu)選在上述過程中的變黃階段進行這種處理。就空氣熟化的煙草的情況而言，優(yōu)選在熟化過程中的變褐階段進行這種處理。
在噴的接種溶液的量方面，當在收獲或熟化過程的開始階段進行處理時，每1片煙葉上施用2-10ml接種溶液。當在熟化過程的中間階段或此后進行處理時，每1片煙葉上施用0.5-3ml接種溶液。
在處理次數方面，在熟化和/或儲存過程中至少處理一次是足夠的。優(yōu)選在熟化和/或儲存過程中進行2-3次處理，每次處理之間有一定間隔。
本發(fā)明的這些方面沒有對熟化條件進行顯著改變，但用微生物處理煙葉且由此能夠減少TSNA的含量，而不會對煙葉的天然氣味和味道產生不良影響。
實施例實施例11)從煙葉中分離微生物從生長在Oyama-shi，Tochigi縣田地上的煙葉中收集微生物。
收集3次微生物，即在收獲煙葉后立即收集、在熟化期中的第3天收集(即當葉子的顏色完全變黃時)并在熟化期中的第8天收集(即當葉子的顏色完全變褐時)。
收獲屬于白萊煙的Michinoku 1的葉莖部位并將收獲的煙葉的葉片切短作為樣品。將由此獲得的樣品精細地切成5mm×5mm的正方形。由此將約10g樣品放入300ml錐形瓶。向其中加入200ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)并勻化該混合物。將由此獲得的混懸液用作含有來源于收獲時的煙葉的微生物的“收獲時混懸液”。
使用如上所述收獲且然后進行熟化過程的煙葉、按照與收獲期收集微生物類似的方式從熟化期中的煙葉中收集微生物(即在熟化過程的第3天收集，此時顏色完全變黃；且在熟化過程的第8天收集，此時顏色完全變褐)。特別將如上所述收獲的Michinoku 1的葉莖部位懸掛在鋼管室內，它是一種常用的空氣熟化煙草的熟化室。此后再第3天和第8天，將由此熟化的煙葉的葉片部分切短成樣品。將由此獲得的樣品精細地切成5mm×5mm的正方形。收集由此切成的約10g樣品并放入300ml錐形瓶。向其中加入200ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)并勻化該混合物。將由此獲得的混懸液用作含有來源于熟化期的煙葉的微生物的“熟化時混懸液”。
在3次不同時間收集的每次中，從取樣后2小時內勻化收集的煙葉。
用上述磷酸鹽緩沖液將收獲時混懸液和熟化時混懸液分別稀釋成可以分離微生物的濃度(特別為102-105倍)。通過在YG板上滴1次0.1ml施用每種由此獲得的稀釋混懸液(培養(yǎng)基的濃度如下1.0g酵母提取物；1.0g葡萄糖；0.3g K2HPO4；0.2g KH2PO4；0.2g MgSO4·7H2O；15.0g瓊脂；和調節(jié)量的蒸餾水至制成總體積為1000ml培養(yǎng)基，pH6.8)。在30℃下將由此施用的微生物培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，通過使用新制的YG板將生長的菌落分離成單菌落。將由此分離的的微生物保存在-80℃下至用于實驗為止。
在如上所述的這類方式中，從熟化時的煙葉中分離了87株微生物菌株且從變褐的煙葉中分離的176株微生物菌株。具有不同菌落形態(tài)的菌株選自這些收集的菌株并用于此后的實驗。
2)降解TSNA的微生物的初步篩選在來源于1)中收集的煙葉的菌株中，將包括從收獲階段的煙葉中收集的14株菌株和從熟化階段煙葉中收集的37株菌株在內的51株菌株選作候選菌株用于初步篩選。
a)培養(yǎng)基的選擇檢驗用于篩選降解TSNA的微生物的培養(yǎng)基。通過使用在上述1)中選擇的菌株檢驗每一菌株在含有NNN、NNK、NAT和NAB的培養(yǎng)基上的生長情況。結果是當將1/10 TS肉湯用作基礎培養(yǎng)基時，獲得了最佳結果。因此，將1/10 TS肉湯用作隨后培養(yǎng)中的基礎培養(yǎng)基。1/10 TS肉湯自身的組成和含有1/10 TS肉湯和微生物的培養(yǎng)基的組成依次如下所示。

-終體積通過添加蒸餾水調節(jié)至1000ml-酪蛋白1.7g-D-葡萄糖 0.25g-NaCl 0.5g-K2HPO42.5g-1/10胰胨豆胨(由Difco Co.，Ltd.生產，細菌用胰胨豆胨肉湯；大豆-酪蛋白消化培養(yǎng)基)[用于篩選降解TSNA的微生物的培養(yǎng)基]-終體積35ml-1/10 TS肉湯(含有5ppm NNN、5ppm30mlNAT、5ppmNAB和5ppmNNK)-接種用微生物混懸液5ml通過下列方法制備用于篩選降解TSNA的微生物的上述培養(yǎng)基。將含有1000ppm NNN的150μl二氯甲烷、含有1000ppm NAT的150μl二氯甲烷、含有1000ppm NAB的150μl二氯甲烷和含有1000ppm NNK的150μl二氯甲烷放入錐形瓶且然后使瓶中的二氯甲烷完全揮發(fā)。接下來向瓶中加入1/10TS肉湯以便將NNN、NAT、NAB和NNK的濃度分別調節(jié)至5ppm/10ml。在NNN、NAT、NAB和NNK溶解后，將30ml該混合物各自放入50ml錐形瓶。下一步將5ml用于接種的微生物混懸液加入到50ml錐形瓶中，由此得到用于篩選降解TSNA的微生物的培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基在30℃下保溫24小時，同時進行振搖。
b)降解TSNA的微生物的初步篩選通過使用由此制備的培養(yǎng)基對降解TSNA的微生物進行初步篩選。
在振搖的同時在1/10 TS肉湯中各自培養(yǎng)用于初步篩選的候選菌株且然后通過離心收集每種菌株的細菌細胞。用無菌蒸餾水將由此收集的細菌細胞洗滌兩次并懸浮于無菌蒸餾水中。接下來用無菌蒸餾水將微生物在每一混懸液中的濃度調節(jié)至108-1010cfu/ml，由此制備了每一候選菌株的混懸液。
將由此獲得的5-10株混懸液形式的候選微生物菌株彼此混合，其中混合的5-10株菌株來源于相同階段的煙葉。由此制備了7組候選微生物的混懸液混合物。
按照與上述1)中相似的方式培養(yǎng)這7組候選微生物的混懸液混合物，其中將1/10 TS肉湯用作篩選降解TSNA的微生物的培養(yǎng)基，但不包括使用上述7組候選微生物的混懸液混合物。
作為對照組，加入5ml無菌蒸餾水取代候選微生物混懸液。
在30℃下和振搖的同時將7組混合的候選微生物混懸液和對照組保溫24小時。
此后測定相應的TSNA的含量。
通過下列方法測定相應的TSNA的含量。特別使用氣相色譜、按照Spiegelhalder改進的方法分別測定獲自每一培養(yǎng)基的樣品中含有的NNN、NAT、NAB和NNK含量(Spiegelhalder B.，Kubacki S.和Fischer S.(1989)Beitr.Tabakforsch.Int.，14(3)，135-143；Fischer S.和Spiegelhalder B.(1989)Beitr.Tabakforsch.Int.，14(3)，135-143)。
首先通過使用如下的柱色譜法純化每一培養(yǎng)基。首先通過使用濾紙(ADVANTEC，No.5)過濾整個培養(yǎng)基。然后使10ml的每一濾液上填充了Kieselgur(顆粒直徑60-160nm，由MERCK Co.，Ltd.生產)和抗壞血酸的柱。通過用二氯甲烷溶解級分收集樣品必需的級分。將由此獲得的級分用作氣相色譜的樣品。通過使用安裝了柱DB-17(由J & W Co.，Ltd.生產)和檢測器TEA-543(由Thermedics Co.，Ltd.生產)的氣相色譜HP 6890(由Hewlett-Packard Co.，Ltd.生產)分析由此獲得的樣品。
上述7組和對照組中相應TSNA含量的測定結果如表1中所示。
表1 初步篩選結果


表1中的1組和2組各自表示從收獲后的煙葉中立即收集的菌株混懸液混合物。3組、4組和5組各自表示從屬于熟化過程的開始階段的變黃階段(熟化過程的第3天)的煙葉中收集的菌株混懸液混合物。6組和7組各自表示從變褐階段(熟化過程的第8天)的煙葉中收集的菌株混懸液混合物。在該表中，“％”表示各組中相應的TSNA的含量(％)，此時將對照組中的相應含量表示為100％。
正如從表1中明顯看出的，在所有微生物混合物的組中，TSNA的含量均比對照組的TSNA含量下降。特別就TSNA的總量而言，與對照組的TSNA總量相比，1組和2組的TSNA總量分別下降至47.87％和64.95％(表1)。
從這些結果中證實已經成功地從煙葉中分離了降解TSNA的多種類型的有用的微生物。
3)降解TSNA的微生物的二次篩選基于上述2)的結果，進一步對表現出極佳降解TSNA能力的1組和2組進行用于二次篩選的測試。
對1組和2組中含有的14株微生物菌株中的每一種測試了其降解相應TSNA的能力。
按照與上述2)中所述類似的方式測試14株菌株中每一種降解相應TSNA的能力，但每一微生物混懸液(混懸液各自與1/10 TS肉湯混合)中含有的微生物類型的數量限于選自上述1)中收集的微生物菌株中的一種菌株。
每一測定的含量值為通過兩次重復測定獲得的平均值。
由此獲得的結果如表2中所示。
表2 每一菌株降解TSNA的能力

正如從表2中明顯看出的，LG38菌株、LG48菌株、LG51菌株和LG43菌株能夠降解NNN、NAT、NAB和NNK。特別是LG38菌株分別將NNN、NAT、NAB和NNK減少至67.43％、75.40％、66.66％和60.63％。LG38菌株將總TSNA含量減少至68.00％。
此外，LG2菌株、LG5菌株和LG77菌株能夠特別降解NNK。特別是LG5菌株將NNK含量減少至3.24％。
基于上述結果，選擇了能夠特別降解NNK的LG5菌株和特別降解相應的TSNA的LG38菌株。
上述結果表明可以通過用上述微生物處理煙葉顯著減少煙葉中的TSNA。上述微生物分離自煙葉且由此在將它們置于煙葉上時表現出極佳的穩(wěn)定性。推斷由于具有固定在煙葉上的能力，所以所述的微生物可以以足夠穩(wěn)定的方式在煙葉上表現出降解TSNA的活性。
4)微生物的鑒定將由此篩選的LG5菌株LG38菌株的細菌學特性概括在表3和表4中。
表3LG5菌珠的細菌學特性


表4LG38菌珠的細菌學特性


基于上述結果，將LG5菌株鑒定為屬于少動鞘氨醇單胞菌的微生物并將LG38鑒定為屬于熒光假單胞菌的微生物。
借助于日本食品研究實驗室(Japan Food Research Laboratories)對上述細菌進行鑒定。已經于2001年12月18日在微生物國際專利保藏所(International Patent Organism Depositary)寄存了LG5(FERM BP-7830)。類似地，已經于2001年12月18日在微生物國際專利保藏所(InternationalPatent Organism Depositary)寄存了LG38(FERM BP-7831)。
實施例2通過用LG38菌株處理減少熟化過程中的TSNA含量將LG38菌株接種入1/10 TS肉湯并在30℃下培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)后，對含有細菌細胞的培養(yǎng)基以5000rpm進行離心以使細菌細胞分離并收集。用無菌蒸餾水將由此收集的細菌細胞洗滌兩次并將其懸浮于無菌蒸餾水中。通過用無菌蒸餾水稀釋該混懸液將混懸液中微生物的濃度調節(jié)至108-1010cfu/ml。
用由此調節(jié)至預定濃度的微生物混懸液處理已經收獲并進行熟化過程的白萊煙(Kitakami 1)的煙葉。進行三次處理，即在收獲后立即處理、在收獲后3天處理和在收獲后8天處理。在每次處理中，通過噴射將所述混懸液噴在煙葉的上表面和下表面，使得每1片煙葉上噴有10ml所述混懸液。
通過使用鋼管室熟化由此處理的煙葉。在熟化過程的第10天和第21天收集煙葉。切割由此收集的煙葉以便分離葉片和莖。然后通過使用混合器勻化葉片和莖。將葉片部分用于測定TSNA含量。
按照于上述2)中所述類似的方式對主要4種類型的TSNA(NNN、NNK、NAT和NAB)進行測定。
將總TSNA含量表示為4種主要類型TSNA(NNN、NNK、NAT和NAB)中相應含量的總量。將結果表示在表5中。
表5TSNA的含量(μg/g)

表5中用水處理的組表示僅用不含每次處理中的細菌細胞的水處理的組。
從表5中得知所有組中TSNA的含量隨時間的消耗而增加且用水處理的組中TSNA的含量特別明顯。當將用LG38菌株處理的組于不接受處理的組比較時，前者在第21天時表現出的TSNA含量低于后者。
這些結果證實LG38菌株能夠減少TSNA含量。
此外，還研究了亞硝酸鹽(-氮)含量對用LG38處理的作用。
對如上所述處理的煙葉的亞硝酸鹽-氮含量進行測定。下文描述了測定方法。
首先從各組煙葉中收集0.5g葉片并放入50ml離心管。接下來向其中加入25ml下述提取溶液。將該混合物攪拌30分鐘且然后提取亞硝酸鹽。通過使用濾紙(ADVANTEC，No.1)過濾提取物。收集10ml濾液，向其中加入0.5g活性炭并將該混合物攪拌15分鐘。此后通過使用濾紙(ADVANTEC，No.5)除去活性炭。將由此獲得的濾液用作測定亞硝酸鹽-氮含量的樣品。
提取溶液KCl (1％KCl)磺酰胺(sulfanylamide) (0.5％磺酰胺)Triton X-100 (0.1％Triton X-100)在測定提取物中亞硝酸鹽-氮含量的過程中，使用自動分析儀(由BRAN+LUEBBE Co.，Ltd.，AACSII生產)并通過將550nm處濾波器的透射比轉化成亞硝酸鹽-氮含量得到亞硝酸鹽-氮含量。為了使亞硝酸鹽-氮著色，使用1％的磺酰胺和0.1％的N-萘基乙二胺二鹽酸鹽。結果如表6中所示。
表6亞硝酸鹽-氮的含量(μg/g)

從表6中明顯看出，在熟化過程的第10天用水處理的組中屬于TSNA形成中的物質的亞硝酸鹽-氮含量顯著增加。相反，當在熟化過程中第10天將用LG38菌株處理的組與不接受處理的組比較時，前者的亞硝酸鹽-氮含量稍低于后者的亞硝酸鹽-氮含量。
基于細菌學特性將LG38菌株鑒定為能夠減少硝酸鹽的菌株。然而，上述結果證實與未接受處理的組相比，LG38菌株顯著抑制硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。
實施例3用LG5菌株處理對NNK含量的作用按照與實施例2中所述類似的方式測定NNK含量，但用LG5取代實施例2方法中使用的微生物。
結果如表7中所示。
表7NNK的含量(μg/g)

正如從表7中明顯看出的，在不接受處理的組中，NNK含量增加至第21天，而在第32天的NNK含量(當熟化過程完成時)低于第21天的含量。在用水和用LG5菌株處理的兩組中，直到第21天NNK含量仍相對較高，而在不接受處理的組合中，在第32天時的NNK含量低于第21天時的含量。當將用LG5菌株處理的組與不接受處理的組進行比較時，前者第32天時的NNK含量稍低于后者第32天時的NNK含量。這些結果證實LG5菌株能夠減少NNK含量。
應注意將本說明書中涉及的所有參考文獻的全部內容引入本文作為參考。
本領域技術人員易于設計本發(fā)明的進一步優(yōu)點和改變。由這類較大范圍確定的本發(fā)明并不限于如上所示和所述的本發(fā)明的具體和有代表性的方面。因此，能夠對本發(fā)明進行各種修改而不會脫離由待批權利要求及其等同范圍所定義的本發(fā)明全面的實質和范圍。
實施例4用降解TSNA的細菌處理對煙葉粉末中TSNA含量的作用分別將LG5菌株和LG38菌株接種在1/10 TS肉湯上并在30℃下培養(yǎng)72小時。對含有細菌細胞的培養(yǎng)基以5000rpm進行離心以便收集細菌細胞。用無菌蒸餾水將細菌細胞洗滌兩次并將其懸浮于無菌蒸餾水中。將各混懸液中細菌細胞的濃度調節(jié)至108-1010cfu/ml，由此得到微生物混懸液作為接種物。
在LG5菌株的實驗中，使用Japan Tobacco Inc的生長在煙葉研究中心(Leaf Tobacco Research Center)(Oyama-shi，Tochigi縣)的煙草植物(品種Kitakami 1)的切碎凍干粉。在LG38菌株的實驗中，使用與如上所述相同的煙草植物的葉莖部位的凍干粉。
將經測定量的每種相應類型的煙草粉放入研缽并向其中加入微生物混懸液，使得該混合物的含濕量達到預定值。用研杵混合該混合物，使得粉末表現出含濕量的均勻分布。經由此獲得的經測定量的粉末放入錐形瓶并始終保留在預定溫度下。
分別對取自上述用微生物處理前的煙草粉末的樣品和取自處理后保留4周的煙草粉末進行分析。將5g各樣品放入200ml錐形瓶，向其中加入100ml的0.01M MaOH水溶液(含有100μg/ml的乙基汞硫代水楊酸鈉)并通過使用攪拌器在室溫下提取2小時。此后，用濾紙(ADVANTEC，No.5)過濾提取物。
接下來通過實施例1中所述的方法分析NNN、NNK、NAT和NAB。
用微生物處理前和處理后4周的TSNA含量如表8和9中所示。
表8用LG38菌株處理導致的煙葉粉末中TSNA含量的改變



*未顯示NAB和NNK的含量值，因為這些數值低于檢測極限。
表9用LG5菌株處理導致的煙葉粉末中NNK含量的改變

*未顯示NAB的含量值，因為它低于檢測極限。
從上述實驗中已經證實LG5菌株特別降解NNK且LG38降解NNN、NAT、NAB和NNK。
與處理前相比，用LG5菌株處理后4周的煙草植物切碎粉末中的NNK含量下降。當將用LG38菌株處理后4周的煙草植物葉莖部位粉末中的NNN和NAT含量與處理前比較時，在所有處理的組中NNN和NAT含量均下降。即在測試煙草粉末的實驗中，按照與上述實驗中觀察到的類似的方式，LG5菌株降解NNK且LG38菌株降解NNN和NAT。
實施例5用降解TSNA的細菌處理對儲存中的煙葉中的TSNA含量的作用將LG38菌株接種入1/10 TS肉湯并在30℃下培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)后，對含有細菌細胞的培養(yǎng)基以5000rpm進行離心以便收集細菌細胞。用無菌蒸餾水將由此收集的細菌細胞洗滌兩次并將其懸浮于無菌蒸餾水中。將混懸液中細菌細胞的濃度調節(jié)至108-109cfu/ml，由此得到微生物混懸液作為接種物。
將由此制備的微生物混懸液噴在處于鋼管室熟化過程中的白萊煙煙葉的上表面和下表面(干燥葉莖的最終階段，第29天，品種Kitakami 1)，使得每1片煙葉上噴有10ml所述的混懸液。將由此處理的煙葉在鋼管室內再熟化3天且然后用于儲存測試。
分析樣品的收集在開始儲存煙葉前，將取自鋼管室的熟化煙葉的一半葉片選作樣品，此后進行處理。儲存剩余一半帶莖的葉片。在溫度和濕度各自保持恒定的預定條件下進行儲存。在儲存條件方面，分別設定3組溫度20℃和濕度70％；溫度20℃和濕度80％；以及溫度30℃和濕度80％。在儲存開始后1個月和3個月進行取樣。在與上述相同的條件下儲存熟化的煙葉，但不用微生物處理煙葉，并將獲得的煙葉用作對照組樣品。將由此取樣的煙葉分離成葉片和莖且然后通過使用混合器磨碎凍干的葉片樣品。僅將葉片樣品用于測定TSNA含量。
將如上所述處理的5g各組葉片樣品放入200ml錐形瓶，向其中加入100ml的0.01M MaOH水溶液(含有100μg/ml的乙基汞硫代水楊酸鈉)并通過使用攪拌器在室溫下提取2小時。此后，用濾紙(ADVANTEC，Co.，Ltd.，No.5)過濾提取物。
通過實施例1中所述的方法分析NNN、NNK、NAT和NAB。
結果如表10中所示。
表10 用微生物處理導致的儲存中的煙葉中TSNA含量的改變


在未處理的組中，儲存后1個月TSNA的含量在“20℃-70％組”和“30℃-70％組”中增加。特別地，在未處理的組中，儲存后3個月TSNA的含量在“30℃-70％組”和“30℃-80％組”中顯著增加。在用LG38菌株處理的組中，觀察到TSNA含量在1個月和3個月后均下降的趨勢。在用LG38菌株處理的組中，儲存后1個月TSNA含量特別顯著地下降。
權利要求
1.減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物處理煙葉的步驟，所述的微生物具有減少TNSA的能力且選自少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌組成的組。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于在收獲煙葉前立即和/或從開始熟化過程到完成儲存過程的時限中用能夠減少TNSA的微生物對煙葉進行處理。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于用能夠減少TNSA的微生物處理煙葉的步驟通過將所述微生物的細菌細胞以混懸液態(tài)或干態(tài)噴或涂布在煙葉上來進行。
4.權利要求2所述的方法，其特征在于用能夠減少TNSA的微生物處理煙葉的步驟通過將所述微生物的細菌細胞以混懸液態(tài)或干態(tài)噴或涂布在煙葉上來進行。
5.權利要求1所述的方法，其特征在于TSNA是至少一種類型的TSNA，它選自N’-亞硝基降煙堿、4-(N-亞硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亞硝基新煙草堿和N’-亞硝基假木賊堿組成的組。
6.權利要求1的減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于煙葉獲自煙草品種，所述的煙草品種選自日本家用品種和白萊煙品種組成的組。
7.減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物處理煙葉的步驟，所述的微生物能夠減少TNSA且選自少動鞘氨醇單胞菌LG5菌株和熒光假單胞菌LG38菌株組成的組。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于在收獲煙葉前立即和/或從開始熟化過程到完成儲存過程的期限中用能夠減少TNSA的微生物對煙葉進行處理。
9.權利要求7所述的方法，其特征在于用能夠減少TNSA的微生物處理煙葉的步驟通過將所述微生物的細菌細胞以混懸液態(tài)或干態(tài)噴或涂布在煙葉上來進行。
10.權利要求7所述的方法，其特征在于所述的TSNA是至少一種類型的TSNA，它選自N’-亞硝基降煙堿、4-(N-亞硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亞硝基新煙草堿和N’-亞硝基假木賊堿組成的組。
11.權利要求7的減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于煙葉獲自煙草品種，所述的煙草品種選自日本家用品種和白萊煙品種組成的組。
12.屬于少動鞘氨醇單胞菌或熒光假單胞菌且具有減少煙葉中至少一種類型的TSNA含量的能力的微生物，所述的至少一種類型的TSNA選自N’-亞硝基降煙堿、4-(N-亞硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N’-亞硝基新煙草堿和N’-亞硝基假木賊堿組成的組，其中這些TSNA在煙葉熟化和儲存過程中形成。
13.能夠減少煙葉中TSNA含量的少動鞘氨醇單胞菌LG5菌株(FERMBP-7830)。
14.能夠減少煙葉中TSNA含量的熒光假單胞菌LG38菌株(FERMBP-7831)。
15.減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于包括用微生物處理煙葉的步驟，所述的微生物具有降解TSNA的能力且選自少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及減少煙葉中TSNA含量的方法，其特征在于使用微生物進行處理，所述的微生物選自屬于少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌的微生物組成的組且能夠減少TSNA的量。
文檔編號A24B15/20GK1652702SQ03810579
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權日2002年5月10日
發(fā)明者古賀一治, 勝屋聰 申請人:日本煙草產業(yè)株式會社