專利名稱：：一種香煙過濾嘴的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及金屬硫蛋白的用途，尤其涉及金屬硫蛋白在制備香煙過濾嘴中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及了一種香煙過濾嘴，尤其是一種可減少香煙煙氣氣相自由基的香煙過濾嘴。
背景技術(shù)：
：香煙中含有大量有害的自由基，包括固相自由基和氣相自由基。固相自由基包括多環(huán)芳烴自由基、醌/半醌自由基，具有壽命長、性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，能被生物濾嘴截留。而氣相自由基包括烷氧自由基、垸過氧自由基等，具有活性高、壽命短的特點(diǎn)。氣相自由基可以損傷細(xì)胞成份，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)可以刺激巨噬細(xì)胞在肺部聚集和活化，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)和釋放活性氧自由基，引起更嚴(yán)重的損傷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供金屬硫蛋白在制備香煙過濾嘴中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種可減少香煙氣相自由基的的香煙過濾嘴，可以過濾香煙氣相中的自由基。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的一種可減少香煙煙氣氣相自由基的香煙過濾嘴，其特征在于過濾嘴中含有金屬硫蛋白。所述的香煙過濾嘴中含lmg5mg金屬硫蛋白。所述的金屬硫蛋白可以直接采用現(xiàn)有的金屬硫蛋白方式添加；為達(dá)到更好的過濾煙氣中氣相自由基的效果，本發(fā)明優(yōu)選采用GST—MT蛋白溶液方式添加。所述的GST—MT蛋白溶液通過以下方法制備利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過構(gòu)建了含有金屬硫蛋白(MT)基因的BL21大腸桿菌，得到BL21—PET—GST—MT工程菌菌株，將得到的工程菌菌株進(jìn)行超聲破菌得到包涵體表達(dá)產(chǎn)物，再以脫氧膽酸鈉(DOC)提純后進(jìn)行柱層析得到GST—MT蛋白溶液。本發(fā)明提供的香煙過濾嘴中含有金屬硫蛋白可以清除香煙煙氣中的氣相自由，避免香煙中氣相自由基損傷細(xì)胞成份導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)減少刺激巨噬細(xì)胞在肺部聚集和活化，避免產(chǎn)生呼吸爆發(fā)和釋放活性氧自由基引起更嚴(yán)重的損傷。圖1是添加了GST-MT蛋白溶液的生物濾嘴香煙煙氣氣相自由基ESR分析圖譜；圖2是添加了PBS的生物濾嘴香煙煙氣氣相自由基ESR分析圖譜；圖3是添加血紅蛋白溶液生物濾嘴香煙煙氣氣相自由基ESR分析圖譜。具體實(shí)施方式為了更好地了解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，以下通過實(shí)施例及試驗(yàn)對
發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行闡述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。所述
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。1、制備純化金屬硫蛋白(1)用蛋白質(zhì)工程方法構(gòu)建含有金屬硫蛋白基因的大腸桿菌工程菌菌株利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM—MT和閉環(huán)質(zhì)粒pET—GST，然后采用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、Nhel雙酶切質(zhì)粒pGEM—MT和閉環(huán)質(zhì)粒pET—GST，經(jīng)低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠分離并回收MT和質(zhì)粒載體片段，再用連接酶連接成PET—GST—MT，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BI21，測序驗(yàn)證質(zhì)粒DNA序列正確性(上海博亞)，從而得到含金屬硫蛋白基因的大腸桿菌(即BL21—PET—GST—MT工程菌菌株)。(2)將上述工程菌菌株接種于安芐青霉素(Amp+)的LB培養(yǎng)板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCL10g/L，瓊脂粉15g/L)培養(yǎng)過夜，然后挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)液(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCL10g/L)中3(TC搖菌活化，以體積比為1:100稀釋到Amp+豐富LB培養(yǎng)液，搖菌至OD60(p0.5時(shí)，加入1X(W/L)葡萄糖溶液，0.5%(W/L)異丙基-P-硫代半乳糖苷(IPTG)混合均勻，在升溫至37'C繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。(3)所得菌液4000r/m離心10分鐘，去上清，用PH=7.5的磷酸緩沖溶液(PBS)稀釋沉淀，冰浴下超聲破菌，每次250W超聲波處理2分鐘，間歇1分鐘，共循環(huán)6次。超聲破菌后10000r/m離心15分鐘收集包涵體，用50mMTris-Cl(PH=8)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，2X脫氧膽酸鈉(DOC)緩沖液洗滌包涵體；再用PH=7.5的磷酸緩沖溶液和0.5XN-十二烷基肌氨酸鈉(SKL)緩沖液溶解包涵體。溶解液過濾后，上樣至5倍柱體積緩沖液平衡的N產(chǎn)親和層析柱，以IO倍柱體積緩沖液洗脫蛋白，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，并收集280nm波長下具有吸收峰的蛋白液，將收集到的目的蛋白液合并，裝進(jìn)截留分子量為5000的透析袋，4'C用PH-8的磷酸緩沖溶液充分透析復(fù)性，收集復(fù)性后的金屬硫蛋白溶液。所述的5倍柱體積緩沖液中含PH為8的50mM磷酸緩沖溶液，150mMNaCl，20mM咪唑。所述的10倍柱體積緩沖液中含PH為8的50mM磷酸緩沖溶液，150mMNaCl，200mM咪唑。2、制備香煙生物過濾嘴在香煙生物過濾嘴中加入金屬硫蛋白溶液，在35'C烘干，制備得到含金屬硫蛋白的香煙生物過濾嘴。3、香煙過濾嘴去除香煙氣相自由基的試驗(yàn)本發(fā)明通過以下對比試驗(yàn)對含有金屬硫蛋白的香煙生物過濾嘴的功能進(jìn)行說明，其中加入200ul500ulPBS溶液的香煙生物過濾嘴作為空白組，200ul500ul的GST_MT蛋白溶液的香煙生物過濾嘴作為陰性對照組，200ul500ul的血紅蛋白溶液的香煙生物過濾嘴作為陽性對照組。上述各組的香煙生物過濾嘴的制備方法采用上述第2點(diǎn)的方法制備。GST-MT蛋白溶液含有GST-MT蛋白，溶解于PBS緩沖液中，濃度為4000ug/ml。血紅蛋白溶液含有血紅蛋白，溶解于PBS緩沖液中，濃度為7750ug/ml。PBS緩沖液137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，2mMKH2P04。3.1吸煙機(jī)燃吸參數(shù)每口吸煙2.5秒，每30秒一個(gè)周期，吸煙壓力在2秒內(nèi)逐漸升高及降低。實(shí)際吸煙長度為85mm，吸煙1011口，收集煙氣。煙氣中氣相自由基由自由基捕獲劑PBN溶液進(jìn)行收集。3.2ESR實(shí)驗(yàn)參數(shù)中心磁場3470G，掃場寬度IOOG，掃描時(shí)間40S，時(shí)間常數(shù)0.08S，增益4X10M，調(diào)制頻率25KHz，調(diào)制幅度1G，功率10mW。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做10支香煙重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每支香煙煙氣經(jīng)過聚萘二酸丁醇酯(PBN)溶液捕獲煙氣中的氣相自由基，采用順磁共振測定香煙煙氣自由基的ESR圖譜，譜峰面積(計(jì)算機(jī)進(jìn)行自動積分)與自由基含量成正比，從而計(jì)算氣相自由基數(shù)量的變化。3.3結(jié)果及結(jié)論如表l所示的結(jié)果和圖l、圖2、圖3所示的三組實(shí)驗(yàn)組ESR的圖譜中，可見GST—MT蛋白溶液的實(shí)驗(yàn)組與PBS溶液空白組和血紅蛋白溶液陽性對照組相比明顯地降低了香煙煙氣中的氣相自由基的含量。表l:氣相自由基含量(X10"spin/支)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員按上述實(shí)施方式所述的方法制備含15mg的金屬硫蛋白的香煙濾嘴，均能達(dá)到清除香煙煙氣中的氣相自由基的效果。權(quán)利要求1、金屬硫蛋白在制備香煙過濾嘴中的應(yīng)用。2、一種香煙過濾嘴，其特征在于過濾嘴中含有金屬硫蛋白。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的香煙過濾嘴，其特征在于所述的香煙過濾嘴中含lmg5mg金屬硫蛋白。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的香煙過濾嘴，其特征在于所述的金屬硫蛋白采用GST—MT蛋白溶液方式添加。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的香煙過濾嘴，其特征在于通過構(gòu)建了含有金屬硫蛋白基因的BL21大腸桿菌，得到BL21—PET—GST—MT工程菌菌株，將得到的工程菌菌株進(jìn)行超聲破菌得到包涵體表達(dá)產(chǎn)物，再以脫氧膽酸鈉提純后進(jìn)行柱層析得到GST—MT蛋白溶液。全文摘要本發(fā)明公開了一種香煙過濾嘴，所述的香煙過濾嘴中含有金屬硫蛋白。該香煙過濾嘴可清除香煙煙氣中的氣相自由，避免香煙煙氣中的氣相自由基損傷細(xì)胞成份導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)減少刺激巨噬細(xì)胞在肺部聚集和活化，避免產(chǎn)生呼吸爆發(fā)和釋放活性氧自由基引起更嚴(yán)重的損傷。文檔編號A24D3/00GK101263934SQ20081002694公開日2008年9月17日申請日期2008年3月21日優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日發(fā)明者欣付,劉啟才,燕彭,曹曉敏,冰李,譚潔瑩,禎陳申請人:廣州醫(yī)學(xué)院