專利名稱：一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗血栓藥物，特別提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑。
背景技術(shù)：
隨著血栓栓塞性疾病患者的增加，抗血栓藥物的研制已成為熱點(diǎn)之一，人們一方面采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有藥物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，以期獲得更為優(yōu)良的溶栓藥物。另一方面，積極的尋找一些安全性好、療效好、副作用小的天然來(lái)源的溶栓藥物。蛇毒是含有多種生物活性蛋白和多肽的混合物，含有多種抗栓成分。自20世紀(jì)60 年代，人們陸續(xù)開(kāi)發(fā)了一些具有抗栓作用的蛇毒制劑1976年hnouf從馬來(lái)西亞紅口蝮蛇毒中純化出凝血酶樣酶或稱類凝血酶(Thrombin-likeEnzymes TLEs)，制成了第一個(gè)治療血栓病的蛇毒制劑Ancord。迄今為止，已從蛇毒中分離出多種溶栓物質(zhì)，部分已用于臨床。 如東菱克栓酶、降纖酶及蘄蛇酶等，獲得了較好的臨床療效。目前從蛇毒中分離的抗栓物質(zhì)根據(jù)其作用機(jī)制、分子結(jié)構(gòu)等的不同，分為類凝血酶、纖溶酶及纖溶酶原激活劑等幾大類。自1936年奧地利學(xué)者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，也就是所說(shuō)的巴曲酶。至今已發(fā)現(xiàn)30 多種蛇毒中含有類凝血酶組份，并有20多種先后得到分離和純化。我國(guó)目前臨床上應(yīng)用的蛇毒制劑大部分為類凝血酶，如東菱克栓酶、蘄蛇酶及降纖酶等。在臨床上有兩方面的用途。一為降纖作用，即巴曲克栓酶，如東菱迪芙(來(lái)自于Bothrops moojeni)，其作用是分解纖維蛋白原，抑制血栓形成；誘發(fā)組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-pa)的釋放， 減弱纖維蛋白溶解酶原激活劑的抑制因子的活性，促使纖維蛋白溶解；增加血液流動(dòng)性，防止血栓形成；降低血管阻力，加快血液流速，改善微循環(huán)。主要用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動(dòng)脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。目前，巴曲克栓酶注射液在臨床上已廣泛用于多種疾病的治療，包括缺血性腦血管病、急性心肌梗塞、突發(fā)性耳聾、急性腦梗塞、難治性腎病綜合癥、糖尿病性周圍神經(jīng)病、肺源性心臟病、不穩(wěn)定心絞痛、高粘血癥、心源性腦栓塞， 其療效確切，不良反應(yīng)輕微。二為止血作用，即巴曲止血酶，如立止血，也稱蛇毒血凝酶(來(lái)自于Bothrops atrox)，可用于多種原因引起的出血，特別是應(yīng)用于傳統(tǒng)止血藥無(wú)效的出血病人，療效確切，未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。類凝血酶對(duì)纖維蛋白原的作用較凝血酶更為專一，大部分蛇毒類凝血酶僅裂解纖維蛋白肽A，部分還同時(shí)裂解B肽。類凝血酶不會(huì)激活F X III，所產(chǎn)生的纖維蛋白聚合物分子間只在頭尾連接。因此，不能使纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)，不交聯(lián)的纖維蛋白對(duì)體內(nèi)的纖溶酶較敏感，易受其分解，降解為無(wú)活性的小肽，在體內(nèi)可迅速的被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)及腎臟清除， 從而使纖維蛋白原濃度下降，出現(xiàn)抗凝效果。在體內(nèi)，類凝血酶則可以消耗纖維蛋白原，降低血液粘度，從血流變學(xué)方面改善微循環(huán)，從而起到抗栓的作用。而多數(shù)的類凝血酶不激活血小板，也不激發(fā)血小板的釋放反應(yīng)，亦不引起血塊收縮，僅少數(shù)在高濃度下引起血小板的聚集，有的TLEs還可阻止凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集效應(yīng)，同時(shí)對(duì)由ADP-Na、膠原及腎上腺素等血小板聚集誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的血小板聚集有同樣的抑制效應(yīng)。這些可能是類凝血酶防治血栓癥的另一重要藥理學(xué)基礎(chǔ)。 蛇毒類凝血酶現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得明顯的臨床效果，但仍有很多問(wèn)題未解決一是蛇毒類凝血酶制劑作為一種生物制品，存在抗原性，偶有過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)，且多次應(yīng)用后易產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而降低制劑的療效；二是蛇毒的來(lái)源有限，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)價(jià)格較高，不利于其廣泛應(yīng)用；三是類凝血酶是從蛇毒中純化得到的，純度難以控制，從而增加了毒副作用。解決這些問(wèn)題的辦法是借助基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行表達(dá)，但這些必須在對(duì)蛇毒類凝血酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)作更深入的研究后方可進(jìn)行。成熟的巴曲酶分子是由231個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，其氨基畫？序列如下1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEffVLTAA41HCNRRFMRIHLGKHAGSVANYDEVVRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGffGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCG⑶SGG PLICNGQFQGILSffGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPffIQSIIAGNKTATCP其DNA序列如下1STCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT CATGTACTAC61rCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG AATGGGTGCT GACCGCTGCA121CACTGTAACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGAAGTGTAGCAAAT181TATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAAT241GTCATAACGGACAAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAACAGTGAA301CACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATT361ATGGGATGGGGCGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT421AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTACAATGGGTTGCCGGCGAAA481ACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGA541CCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC601GAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGC661ATTATTGCAGGAAATAAAACTGCGACTTGCCCG理論計(jì)算出其分子量為25. 5KD，等電點(diǎn)為7. 39,國(guó)夕卜從Bothrops atrox毒液中
提取的巴曲酶，其實(shí)際分子量為42KD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，其分子內(nèi)有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)=Asni46-Asn147-Thrx和 Asn225-Lys226-Thi^8。此外，Bothropsatrox的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過(guò)其分子量從四.IKD到42KD不等，這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個(gè)半胱氨酸，根據(jù)已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結(jié)果，推測(cè)這12個(gè)半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、 cys26-cys42、cys74-cys23°、cys118-cys184、cys15°-cys163、cysm-cys199 六個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的形成 (Itoh n.et al· The J. of BiologicalChemistry，262，3132，1987)。
考慮到進(jìn)口蛇毒原料成本較高，同時(shí)，巴西矛頭蝮蛇是稀有的保護(hù)蛇種，蛇毒產(chǎn)量有限。因此，我們采用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組巴曲酶，我們首先構(gòu)建了表達(dá)天然巴曲酶的基因工程菌種，但發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵表達(dá)時(shí)，目的蛋白有嚴(yán)重的降解現(xiàn)象，這就極大地影響了巴曲酶的產(chǎn)量。因此，我們對(duì)巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變，避免其對(duì)發(fā)酵液中所表達(dá)的巴曲酶的降解，同時(shí)還不影響巴曲酶的凝血活性， 這將極大地提高巴曲酶的產(chǎn)量，更好地滿足研究和臨床應(yīng)用的需要。巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是由于分子內(nèi)二硫鍵多，還有糖基化修飾等，所以采用基因工程手段生產(chǎn)這種蛋白有很大的技術(shù)難度。這也是一直沒(méi)有重組產(chǎn)品問(wèn)世的主要原因之一。雖然研究者對(duì)天然巴曲酶的性質(zhì)有比較多的了解，但是，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究一直進(jìn)展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對(duì)巴曲酶基因的cDNA和基因組 DNA 測(cè)序工作(Nobuyuki Itoh etalj. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 ;J. Biol. Chem.，263 :7628-7631,1988) Maeda M等采用基因重組方法，在Ε. coli中，采用融合表達(dá)系統(tǒng)，以包涵體(Inclusion Body)的形式表達(dá)出該成份，據(jù)報(bào)道得到了所謂有生物學(xué)活性巴曲酶(Maeda M. etal, J Biochem(Tokyo), 109(4) :632_637，1991)，而且還為此申請(qǐng)了專利(Pat, No. JP2124092，1990)。在E.coli中表達(dá)某些蛋白已經(jīng)是較為常規(guī)的生產(chǎn)藥用蛋白的基本手段，但是在對(duì)蛇毒類凝血酶實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在E. coli中表達(dá)蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用 RT-PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒類凝血酶基因I^allas，以表達(dá)載體pET-24a(+)構(gòu)建T-7啟動(dòng)子控制下的表達(dá)質(zhì)粒pET-Pallas，轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)， 并用0. 4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的 Pallas表達(dá)(潘華等，蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達(dá)研究，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)， 1999，31，79)。Fan等采用PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒類凝血酶基因 Acutin，克隆到表達(dá)載體pET-Ma，在E. coli BL21DE(3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(dá)(Fan C. Y.等，Biochemistry and Molecular Biology International, 1999，47，217)。但它們的表達(dá)效率普遍較低，沒(méi)有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。楊青等報(bào)道了用甲醇酵母表達(dá)Gussurobin，獲得每升發(fā)酵液產(chǎn)IOmg有活性的 Gussurobin (楊青等，Biotechnology Letters, 2002, 24,135) ；Weon-KyooYou 等報(bào)道了用甲醇酵母表達(dá)Batroxobin，獲得了每升發(fā)酵液產(chǎn)13. 16mg有活性的Batroxobin (Weon-Kyoo You 等，F(xiàn)EBS Letters，2004，571，67)。上海萬(wàn)興生物制藥有限公司申請(qǐng)了基因工程表達(dá)Batroxobin的專利(公開(kāi)號(hào)CN1534093A，2004)，在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達(dá)，但在大腸桿菌中表達(dá)的 Batroxobin均為無(wú)活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)每毫升發(fā)酵液20克氏單位(20KU/ml)，這一產(chǎn)量已初步具備生產(chǎn)意義。上述研究結(jié)果表明利用基因工程方法生產(chǎn)蛇毒類凝血酶是可行的，但要用真核表達(dá)系統(tǒng)。到目前為止，Batroxobin 的基因工程產(chǎn)品還沒(méi)有上市。采用基因工程的手段生產(chǎn)富含多對(duì)二硫鍵的蛋白一直是一個(gè)技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有六對(duì)二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因?yàn)槎蜴I配對(duì)錯(cuò)誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然對(duì)包涵體的變性復(fù)性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實(shí)際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲(chóng)細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率。另外，蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核細(xì)胞不能對(duì)所表達(dá)的外原蛋白進(jìn)行糖基化，而糖基對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和酶活性都起穩(wěn)定作用。因此空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。而真核表達(dá)系統(tǒng)除能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率外，還能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的糖基化，雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保證了表達(dá)產(chǎn)物的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，該凍干制劑活性穩(wěn)定，安全有效，節(jié)約成本，便于運(yùn)輸和保存。本發(fā)明具體提供了一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于該制劑含有重組定點(diǎn)突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護(hù)劑，其比例為，巴曲酶賦形劑保護(hù)劑 =IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg，優(yōu)選為巴曲酶賦形劑保護(hù)劑=IOBU 30 70mg 1 4mg。其中重組定點(diǎn)突變巴曲酶的氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45 位的Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys，具體為1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P該重組定點(diǎn)突變巴曲酶能夠通過(guò)以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)獲得，同時(shí)具有較高的生物活性。它可以通過(guò)將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得，優(yōu)選通過(guò)甲醇酵母菌以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。本發(fā)明提供的重組定點(diǎn)突變巴曲酶，在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，可以依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，再將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因重組到甲醇酵母菌表達(dá)載體
pPICZa中。
本發(fā)明人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列最好為
1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTITGGCTIT
51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTITGATTAACCAAG
101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAAAGTTTATGAGAATTCAT
151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA
201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG
251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA
301CATATTGCTCCATTGTCTITGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT
351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC
401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTITGT
451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTITT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTITITGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATTATTGCTG GTAACAAGAC TGCTACTTGT CCA在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，可以利用酵母菌的α-信號(hào)肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號(hào)肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入ΚΕΧ2蛋白酶識(shí)別序列AAAAGA。本發(fā)明對(duì)巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)改造。核酸序列按酵母菌喜好的遺傳密碼子，將編碼第 45位氨基酸的AGA (精氨酸)突變?yōu)锳AG (賴氨酸)，人工合成定點(diǎn)改造的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，除定點(diǎn)突變外均為同義突變，即并沒(méi)改變氨基酸種類。本發(fā)明定點(diǎn)突變的意義就在于，通過(guò)定點(diǎn)突變，使巴曲酶分子中的ΚΕΧ2酶切位點(diǎn) Arg-Arg突變?yōu)锳rg-Lys，使酵母菌產(chǎn)生的KEX2酶不能對(duì)酵母所表達(dá)的目的產(chǎn)物巴曲酶進(jìn)行酶解，從而大大地提高了巴曲酶的產(chǎn)量，并且這種突變并不影響巴曲酶的生物活性。目前，在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)對(duì)巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)改造的研究報(bào)道。將人工合成定點(diǎn)改造的巴曲酶的結(jié)構(gòu)基因重組到酵母菌表達(dá)載體pPICZ α中，在酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，確定了酵母菌最優(yōu)發(fā)酵表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了高活性的重組定點(diǎn)突變巴曲酶。結(jié)果表明，定點(diǎn)突變基因工程巴曲酶較從蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產(chǎn)率達(dá)90KU/ml發(fā)酵液。比沒(méi)有重組突變的巴曲酶的產(chǎn)量提高了近2. 5倍左右。通過(guò)對(duì)純化工藝的研究，可以采用不同的純化工藝路線，純化得到高純度重組定點(diǎn)突變巴曲酶，經(jīng)HPLC、電泳檢測(cè)純度，達(dá)到98. 0%以上。本發(fā)明抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，通過(guò)制劑處方篩選，制成注射用凍干粉針制劑，并進(jìn)行了凍干工藝的研究，得到了外觀、活性、含水量等均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的注射用粉針制劑，作為抗血栓藥物，可用于治療血管栓塞引起的多種疾病。本凍干制劑具有極好的穩(wěn)定性。通過(guò)60°C高溫影響因素試驗(yàn)，在同樣溫度下，注射液的酶活性已經(jīng)下降到原活性的0 對(duì)％。而凍干制劑活性只下降到原活性的84 100%，通過(guò)結(jié)果對(duì)比看出，凍干產(chǎn)品具有極高的穩(wěn)定性。并且經(jīng)過(guò)18個(gè)月的長(zhǎng)期試驗(yàn)，其活性基本沒(méi)有改變。且該凍干制劑便于運(yùn)輸和保存，可大幅降低儲(chǔ)運(yùn)的成本，減少?gòu)V大患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)，安全性也得到加強(qiáng)。而目前市場(chǎng)上抗血栓的巴曲酶只有注射液，其儲(chǔ)運(yùn)必須在低溫條件下才穩(wěn)定，要求避光、5°C以下保存(但應(yīng)避免凍結(jié))，其嚴(yán)格的溫度限制，說(shuō)明液體制劑對(duì)溫度極不穩(wěn)定，不僅極大地增加了儲(chǔ)運(yùn)成本，還需要嚴(yán)密監(jiān)視產(chǎn)品的變化，目前的保存期限也只暫定18 個(gè)月。此外，在液體制劑中還含有三氯叔丁醇抑菌劑，更加增加了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，注射用巴曲酶凍干制劑的生產(chǎn)極大地改善了巴曲酶注射液儲(chǔ)運(yùn)方式，不僅降低了儲(chǔ)運(yùn)成本， 也降低了由于儲(chǔ)運(yùn)不當(dāng)導(dǎo)致的活性損失，更保證了藥品的安全性。另外，本發(fā)明凍干制劑還避免了三氯叔丁醇抑菌劑的加入，進(jìn)一步降低了由此導(dǎo)致的安全隱患。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
根據(jù)美國(guó)Genebank中公開(kāi)的Bothrops atrox屬，moojeni venom種的巴曲酶 (X12747)的核酸序列(Itoh N, Tanaka N,Mihashi S, Yamashina L,Molecular Cloning and Sequence Analysis of cDNA for Batroxobin, aThrombin—like Snake Venom Enzyme, J Biol Chem. 1987 Mar5 ；262 (7) :3132-5)，選擇酵母菌喜好的遺傳密碼子，人工合成巴曲酶的定點(diǎn)改造的結(jié)構(gòu)基因序列，將編碼第45位的Arg的密碼AGA突變?yōu)榫幋aLys的AAG，將酵母菌內(nèi)源KEX2蛋白酶識(shí)別序列Arg-Arg突變?yōu)锳rg-Lys，因此KEX2蛋白酶就不會(huì)在此位點(diǎn)降解分泌到發(fā)酵液中的巴曲酶，從而使目的蛋白能夠大量積累。為使合成的目的基因重組到酵母菌分泌型表達(dá)載體pPICZa中，在基因的5'端添加Bio I酶切位點(diǎn)、基因的3'端添加終止密碼子TAATGA及hell酶切位點(diǎn)。另外，在Β ο I酶切位點(diǎn)與巴曲酶蛋白N-端第一個(gè)氨基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識(shí)別序列Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，這就確保了目的蛋白在分泌到發(fā)酵液中時(shí)能夠順利地切除α-信號(hào)肽。將合成的目的基因及pPICZ α載體經(jīng)Xho I和SacII雙酶切，電泳、回收，將目的基因重組到pPICZa中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplOF’中，進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化有pPICZ α的大腸桿菌 ToplOF’在LB+25ug/mg kocin的平板上的進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Xho I和SacII雙酶切檢測(cè)或進(jìn)行α -factor priming禾口 3，A0X1 priming PCR檢測(cè)，說(shuō)明pPICZa中含有目的基因，可以用來(lái)轉(zhuǎn)化Pichia pastoris X-33，KM71H或GS115 宿主菌。實(shí)施例2用DNA限制性內(nèi)切酶McI將pPICZ α -Bg線性化，按照hvitrogen公司 Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制備酵母宿主感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，30°C下放置3_4天可出現(xiàn)單菌落。挑選菌落大而飽滿的克隆進(jìn)行表達(dá)篩選。實(shí)施例3用在試管中篩選出的高表達(dá)的工程菌，接種到搖瓶中增殖作為種子液，再轉(zhuǎn)接至 30L發(fā)酵罐，按甲醇酵母發(fā)酵的常規(guī)方法進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵。誘導(dǎo)200小時(shí)以上。當(dāng)發(fā)酵液中蛋白活性不再增加時(shí)，將發(fā)酵液離心收集上清，蛋白活性達(dá)到84KU/ml。經(jīng)微濾除菌，采用疏水柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術(shù)，得到純度達(dá)97%以上的活性蛋白。采用同類產(chǎn)品活性的測(cè)定方法進(jìn)行體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為取人-枸櫞酸抗凝血漿0. anl，加入直徑Icm的試管中，置37°C水浴中保溫3分鐘，加入37°C預(yù)熱的樣品溶液0. anl，立即混勻計(jì)時(shí)，于40秒開(kāi)始，檢查血漿凝固情況，記錄初凝時(shí)間，同時(shí)測(cè)定3 管，3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄 60士20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0. 2ml人-枸櫞酸抗凝血漿在60 秒凝固的酶量，定義為一個(gè)KU。實(shí)施例4種子液在2L酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵M小時(shí)后，轉(zhuǎn)到30L發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基=H3PO4, 27ml/L ；CaSO4 · 2H20，0. 9g/L ；K2SO4 18g/L ；MgSO4 · 7H20，15g/ L ；Κ0Η，4· 13g/L ；甘油 40g/L ；4. 4ml/L 微量礦物質(zhì)溶液。在發(fā)酵過(guò)程中，用NH4OH調(diào)pH值，使其維持在6. O。30°C通氧劇烈攪拌(IOOOrpm)發(fā)酵，添加消泡劑。發(fā)酵M小時(shí)后，加入含12ml/L微量礦物質(zhì)的50%甘油，溶氧濃度為 30%，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。當(dāng)碳原饑餓30分鐘后，加入甲醇誘導(dǎo)。剛開(kāi)始的5小時(shí)加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母適應(yīng)甲醇，100%甲醇含12ml/L微量礦物質(zhì)溶液，其溶氧量在30%以上。繼續(xù)發(fā)酵活性不再增加，凝血活性達(dá)到20BU/ml發(fā)酵液。實(shí)施例5對(duì)天然重組巴曲酶進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，兩菌種除突變點(diǎn)外，其它遺傳背景完全相同，按照實(shí)施例4的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，凝血活性達(dá)到^KU/ml發(fā)酵液。實(shí)施例6發(fā)酵液離心，收集上清液，加入(NH4)2SO4使其濃度達(dá)至IJ 1.6mol/L，然后加到 phenyl-Sepharose層析柱上，用(NH4)2SO4從1. 6-0mol/L進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰，然后上親和柱benzamidine-S印haroseCL-6B，50mMTris/HCl，pH 8. 2，洗脫液含0· 5M NaCl，收集活性峰。接著上kphadexG-75，流動(dòng)相50mMTris/HCl，pH8. 2，含0. 5M NaCl，收集活性峰。 最后，S印hadex G-25脫鹽，收集活性峰。凍干，存于_20°C。SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)純度達(dá)98%以上。送樣品測(cè)定氨基酸序列，結(jié)果同理論設(shè)計(jì)的完全一致。見(jiàn)定點(diǎn)突變后的 batroxobin氨基酸序列。實(shí)施例7發(fā)酵液離心，收集上清液，用65 %固體(NH4) 2S04使活性蛋白鹽析低溫過(guò)夜，離心，收集沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCl, pH8. 2，并透析，離心，取上清上親和柱 benzamidine-kpharoseCL-4B，用含0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰。 用50mmol/L iTris-HCLpHS. 2緩沖液稀釋，上陰離子交換柱Mono Q，用含0. 5mol/L NaCl上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，最后，上用相同緩沖液平衡好的kphacryl S-200柱，收集活性峰。SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)純度達(dá)98%以上。凍干，存于_20°C。實(shí)施例8凍干制劑處方篩選。按照下述配方(如表1所示)，配制5BU巴曲酶凍干制劑。在相同條件下真空冷凍干燥樣品，比較凍干前后活力的變化，并進(jìn)行60°C高溫影響因素試驗(yàn) (結(jié)果見(jiàn)表2~)。在60°C溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣檢測(cè)。BU單位定義取人-枸櫞酸抗凝血漿OJml，加入直徑Icm的試管中，置37°C水浴中保溫3分鐘，加入37°C預(yù)熱的樣品溶液0. 1ml，立即混勻計(jì)時(shí)，于19. 2士0. 2秒血漿凝固為 2BU。表1凍干制劑處方
權(quán)利要求
1.一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于該制劑含有重組定點(diǎn)突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護(hù)劑，其比例為，巴曲酶賦形劑保護(hù)劑=IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg ；其中重組定點(diǎn)突變巴曲酶的氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的 Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys，具體為1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P
2.按照權(quán)利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于巴曲酶賦形劑保護(hù)劑=IOBU 30 70mg 1 4mg。
3.按照權(quán)利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于，所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，通過(guò)將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。
4.按照權(quán)利要求3所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于，所述酵母菌為甲醇酵母菌。
5.按照權(quán)利要求4所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列。
6.按照權(quán)利要求5所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體PPICZ α 中。
7.按照權(quán)利要求4所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，利用酵母菌的α-信號(hào)肽，將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號(hào)肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入ΚΕΧ2蛋白酶識(shí)別序列。
8.按照權(quán)利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于重組定點(diǎn)突變巴曲酶經(jīng)高密度發(fā)酵甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，親和、離子交換、疏水、凝膠等層析純化，制成凍干制劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑，其特征在于該制劑含有重組定點(diǎn)突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護(hù)劑，其比例為，巴曲酶∶賦形劑∶保護(hù)劑＝10BU∶10～100mg∶0.1～5mg，優(yōu)選為巴曲酶∶賦形劑∶保護(hù)劑＝10BU∶30～70mg∶1～4mg。該凍干制劑活性穩(wěn)定，安全有效，節(jié)約成本，便于運(yùn)輸和保存。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102258483SQ20101015778
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者姜大威, 孟威, 徐梅, 楊宇, 段威, 王宏英, 王建華, 薛百忠, 薛雁 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)守正生物技術(shù)有限公司