專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因鹽藻生產(chǎn)口服疫苗和抗菌肽等活性物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到海洋藻類基因工程領(lǐng)域，即將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，建立鹽藻轉(zhuǎn)基因體系，大量快速繁殖，生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物，或用于分離提純，或直接用于口服。
鹽藻為一種單細(xì)胞真核藻類，屬于杜氏藻科杜氏藻屬，球形或橢圓形，直徑7-18μm。具有2根等長的鞭毛，無細(xì)胞壁，僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜包裹，為天然原生質(zhì)體[參考Borowitzka MA等，Micro-algaebiotechnology，Cambridge Uni Press，27-51(1988)]。細(xì)胞核位于細(xì)胞前部，約占整個細(xì)胞體積的1/5，具有雙層核膜，核內(nèi)具有一典型的核仁。內(nèi)有一大型的杯狀葉綠體，約占整個細(xì)胞體積的1/2，葉綠體中部有一大型淀粉核。另外，還具有線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和高等動植物的相似。生長于海水中，能耐受外界鹽濃度的劇烈變化，具有很強(qiáng)的耐鹽性，可在含0.05-5mol/L NaCl的培養(yǎng)液中生存，在含NaCl 1-2mol/L的培養(yǎng)液中生長最快[參考Fisher M等，Plant Physiol，1061359-1365(1994)]。光合自養(yǎng)，易于培養(yǎng)，成本低廉。富含β-胡蘿卜素和甘油，具有重要的商業(yè)價值。可進(jìn)行無性和有性繁殖，無性繁殖時細(xì)胞縱裂為二，類似于原核細(xì)胞，有性繁殖為同配方式。
目前，藻類基因工程越來越受到重視，特別是海洋藻類的開發(fā)和利用。淡水藻類的資源開發(fā)已盡尾聲，下一個目標(biāo)不可避免的是海洋藻類。海洋中的藻類資源十分豐富，人們所能認(rèn)識并利用的并不多，許多未知的藻類需要人們?nèi)ラ_發(fā)。近年來藻類生物技術(shù)發(fā)展的主要趨勢之一就是海洋藻類基因工程，通過各種轉(zhuǎn)基因手段將外源目的基因轉(zhuǎn)入海洋藻類細(xì)胞中，表達(dá)出外源基因產(chǎn)物，作為新型的生物反應(yīng)器，生產(chǎn)緊俏價高的各種產(chǎn)品；同時也可以改良藻類蛋白及其他內(nèi)源產(chǎn)物的品質(zhì)，提高它們的含量。
疫苗一直是人類對付人和動物疾病的有力武器，隨著各種疫苗的出現(xiàn)，曾經(jīng)在地球上猖狂一時的流行性疾病已經(jīng)得到基本控制或消聲匿跡了。如在我國，乙肝一直就是一個沉重的負(fù)擔(dān)，不易治愈且易通過飲食傳染。不但使患者疾病纏身，甚至到后期發(fā)展成肝癌。近幾年，乙肝病毒疫苗的出現(xiàn)帶來了曙光，使易感人群得到免疫，降低了發(fā)病率。但通過傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)的疫苗價格昂貴且需復(fù)雜的醫(yī)療設(shè)備，限制了疫苗的推廣。特別對于比較貧窮的國家，更是沒有能力負(fù)擔(dān)如此高昂的開支。因此，生產(chǎn)價格低廉且不需要復(fù)雜醫(yī)療設(shè)備的口服疫苗是必要的。人和動物可直接生食轉(zhuǎn)疫苗基因的植物而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。美國政府已經(jīng)批準(zhǔn)了生產(chǎn)3種口服疫苗，分別為脊椎灰質(zhì)炎疫苗、傷寒疫苗和輪狀病毒疫苗。尚處于實(shí)驗(yàn)階段的有流感病毒疫苗、霍亂病毒疫苗、痢疾疫苗、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌疫苗和乙肝病毒疫苗等[參考Tacket CO等，MicrobesInfect，1777-783(1999)；Rennels MB，J Pediatr，131632-638(1997)]，特別是口服乙肝疫苗的研究與開發(fā)是個熱點(diǎn)[參考Mason HS等，Proc Natl Acad SciUSA，8911745-11749(1992)；Thanavala Y等，Proc Natl Acad Sci USA，923358-3361(1995)；Kapusta J等，F(xiàn)ASEB J，131796-1799(1999)；Richter LJ等，NatureBiotech，181167-1171(2000)]。
采用鹽藻為受體的轉(zhuǎn)基因體系具有許多的優(yōu)點(diǎn)，如鹽藻沒有細(xì)胞壁，有利于轉(zhuǎn)化，易于外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物的提取，干燥的鹽藻易被人及動物消化吸收；具有2根鞭毛，可游動，培養(yǎng)時不需要搖床搖動；培養(yǎng)時只需要無機(jī)鹽，不需要有機(jī)物，易于培養(yǎng)，成本低廉，且培養(yǎng)液含有高濃度的NaCl，不需要滅菌，不易污染微生物、其他雜藻和食藻動物；可進(jìn)行大量、快速地繁殖；飽和鹽水中，細(xì)胞逐漸變黃，最后形成休眠孢子，具有厚厚的細(xì)胞壁，有利于藻種的保存；單細(xì)胞，不存在不同組織基因的差別表達(dá)而導(dǎo)致的外源基因沉寂現(xiàn)象等。
本發(fā)明的目的是采用電激法和基因槍法等多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，通過抗生素或營養(yǎng)突變篩選，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因體系，表達(dá)來自動物、植物和微生物的有用基因，用于大量快速地、低廉地生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，分離提純或直接用于口服，同時也可以對鹽藻自身進(jìn)行品種改良。
本發(fā)明的特點(diǎn)在于一.采用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是很成熟的基因轉(zhuǎn)化法(電激法和基因槍法)，易于操作，轉(zhuǎn)化率高；二.轉(zhuǎn)化細(xì)胞為天然原生質(zhì)體，易于轉(zhuǎn)化。三.通過抗生素或營養(yǎng)突變進(jìn)行篩選。四.轉(zhuǎn)基因鹽藻可直接用于口服。
本發(fā)明主要包括以下五個方面的技術(shù)一.鹽藻的培養(yǎng)技術(shù)；二.將外源目的基因通過電激法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)；三.將外源目的基因通過基因槍法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)；
四.轉(zhuǎn)基因鹽藻的篩選與純化技術(shù)。
五.口服轉(zhuǎn)疫苗基因鹽藻表達(dá)載體的構(gòu)建。
實(shí)施例1鹽藻的培養(yǎng)技術(shù)[參考Borowitzka MA等，Micro-algae biotechnology，Cambridge Uni Press，27-51(1988)]鹽藻的培養(yǎng)基成份為Johnsons培養(yǎng)液NaCl 3.0-292.2g/L，MgCl2·6H2O1.5g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，KCl 0.2g/L，CaCl20.151g/L，KNO30.5g/L，NaHCO30.043g/L，KH2PO40.035g/L，鐵鹽溶液10.0ml/L，微量元素溶液10.0ml/L。鐵鹽溶液Na2EDTA·2H2O 209.0mg/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 244.0mg/L。微量元素溶液H3BO361.0mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 38.0mg/L，CuSO4·5H2O 6.0mg/L，CoCl26H2O5.1mg/L，ZnCl24.1mg/L，MnCl2·4H2O 4.1mg/L，用HCl調(diào)pH值到7.5。
固體培養(yǎng)Johnsons培養(yǎng)液加1.5％瓊脂，劃線培養(yǎng)，使鹽藻長成單藻落。
液體培養(yǎng)挑取固體培養(yǎng)基中1mm左右的單藻類于20ml液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20-25℃，光強(qiáng)度為4000Lux左右，光暗比為14hr10hr。
盡管在鹽藻高鹽度的培養(yǎng)基中絕大多數(shù)菌類無法存活，但鹽細(xì)菌可以生存并大量繁殖，因此，首先要將鹽藻在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，連續(xù)幾次，獲得無鹽細(xì)菌的純化藻落。
實(shí)施例2將外源目的基因通過電激法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)取培養(yǎng)第5天的鹽藻液體培養(yǎng)液，1500rpm離心8min，去上清液。用含0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇的培養(yǎng)液滲透處理1-2hr。1500rpm離心8min，去上清液，電激緩沖液
調(diào)鹽藻密度至1×106個/ml，再加入終濃度為10μg/ml的質(zhì)粒DNA[含CaMV35S或Ubil等啟動子，TMVΩ等增強(qiáng)子，外源目的基因，NOS(胭脂堿合成酶)終止子和篩選標(biāo)記基因]和25μg/ml的鮭精DNA，混合均勻，冰上放置5-10min。取0.4ml混合液放入電激小杯中，置于轟擊小室，用Baekon2000型電激儀電激，電壓為6.0KV，脈沖持續(xù)時間為0.05sec，脈沖次數(shù)為210，循環(huán)周期為100，電激高度為2mm。電激完，將0.4ml混合液吸入20ml液體培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)。整個電激過程在無菌下進(jìn)行。
實(shí)施例3將外源目的基因通過基因槍法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)受體細(xì)胞的準(zhǔn)備同實(shí)施例2，滲透處理后，1500rpm離心8min，去上清液，用Johnsons培養(yǎng)液調(diào)鹽藻細(xì)胞密度至1×106個/ml。取0.4ml鋪于含抗生素的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，范圍為直徑3cm的圓形，超凈臺下吹干。
微粒子彈的準(zhǔn)備稱60mg金粉于1ml70％酒精中，充分渦旋，靜置15min，1500rpm離心5min。去上清液，加1ml蒸餾水，充分渦旋，1500rpm離心5min，去上清液，重復(fù)三次。將金粉轉(zhuǎn)入1ml50％甘油中，制成60mg/ml的金粉懸浮液。取50μl懸浮液，按順序加入1μg/μl質(zhì)粒DNA 5μl、2.5mol/L CaCl250μl和0.1mol/L亞精胺20μl，渦旋10min，1500rpm離心5sec，去上清液。250μl100％乙醇洗一次，渦旋，1500rpm離心5min，去上清液，重復(fù)一次。最后，金粉懸浮于60μl 100％乙醇中。
取6μl包被DNA的金粉懸浮液，裝備基因槍(PDS-1000型，美國Bio-Rod公司制造)，每個培養(yǎng)皿轟擊一次，子彈與鹽藻細(xì)胞之間的距離為6cm。轟擊后，將培養(yǎng)皿于適宜條件下培養(yǎng)。整個轟擊過程在無菌下進(jìn)行。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因鹽藻的篩選與純化技術(shù)取0.4ml轉(zhuǎn)化過的鹽藻，鋪于含有60μg/ml氯霉素或0.5g/L KNO3的固體培養(yǎng)基中，適宜培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選。4周左右，若干藻落(即已轉(zhuǎn)化成功的藻落)出現(xiàn)，挑取藻落于20ml含60μg/ml氯霉素或0.5g/L KNO3的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因鹽藻。
實(shí)施例5口服轉(zhuǎn)乙肝疫苗基因鹽藻表達(dá)載體的構(gòu)建1.通過氯霉素篩選的HBsAg(乙肝表面抗原)表達(dá)載體的構(gòu)建。(1)根據(jù)HBsAg基因設(shè)計(jì)一對引物，從乙肝病毒DNA中擴(kuò)增出HBsAg基因，兩端分別具有限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI酶切位點(diǎn)，用這兩種酶進(jìn)行酶切，得到約681bp的片段。用SmaI和SacI雙酶切質(zhì)粒pUΩGUS[含Ubil啟動子，TMVΩ增強(qiáng)子，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，NOS終止子和Ampr基因，Ubil啟動子上游為限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)，TMVΩ增強(qiáng)子和GUS基因之間為SmaI酶切位點(diǎn)，GUS基因和NOS終止子之間為SacI酶切位點(diǎn)，NOS終止子下游為限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)]，去掉GUS基因片段，回收約5.0kb的片段。將681bp的片段和5.0kb的片段連接起來，構(gòu)建成質(zhì)粒pUΩ-HBsAg。(2)先用EcoRI酶切質(zhì)粒pUΩ-HBsAg，T4DNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)成平端，再用HindIII酶切，回收約2.981kb的片段(為HBsAg基因的表達(dá)框)。先用限制性內(nèi)切酶SphI酶切質(zhì)粒p35S-CAT[含CaMV35S啟動子，CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因，NOS終止子和Ampr基因，CaMV35S啟動子上游為HindIII和SphI酶切位點(diǎn)]，S1核酸酶將粘性末端切成平端，再用HindIII酶切，切出一個切口。將2.981kb的片段插入質(zhì)粒p35S-CAT中，連接酶連接，構(gòu)建成通過氯霉素篩選的HBsAg表達(dá)載體pUΩ-HBsAg-CAT。轉(zhuǎn)入野生型鹽藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行氯霉素篩選培養(yǎng)。
2.通過營養(yǎng)突變篩選的HBsAg表達(dá)載體的構(gòu)建。用EcoRI和HindIII雙酶切質(zhì)粒pUΩ-HBsAg，回收約2.981kb的片段。用SphI和HindIII雙酶切質(zhì)粒p35S-NAR[含CaMV35S啟動子，NAR(硝酸還原酶)基因，NOS終止子和Ampr基因，CaMV35S啟動子上游為HindIII和SphI酶切位點(diǎn)]，切出一個切口。將2.981kb的片段插入質(zhì)粒p35S-NAR中，連接酶連接，構(gòu)建成通過營養(yǎng)突變篩選的HBsAg表達(dá)載體pUΩ-HBsAg-NAR。轉(zhuǎn)入硝酸還原酶缺失突變的鹽藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行KNO3篩選培養(yǎng)。
本發(fā)明不受所述實(shí)施例5的限制，任何相類似的啟動子(如NOS、Patatin、Actin和pEmu等啟動子)在本發(fā)明之內(nèi)，任何相類似的增強(qiáng)子(如TL等增強(qiáng)子)在本發(fā)明之內(nèi)，任何相類似的篩選標(biāo)記基因(如NPTII基因和Bar基因等)在本發(fā)明之內(nèi)，任何疫苗基因(如CTB和LTB基因等)在本發(fā)明之內(nèi)，任何來自動物、植物和微生物的外源目的基因(如防御素基因和蜘蛛絲蛋白基因等)在本發(fā)明之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種鹽藻轉(zhuǎn)基因體系，含有外源目的基因和篩選標(biāo)記基因，能產(chǎn)生外源基因的產(chǎn)物。其特征在于將外源目的基因通過電激法和基因槍法等轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，通過抗生素或營養(yǎng)突變等篩選出含有外源目的基因的鹽藻品系，大量快速繁殖，生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物。對轉(zhuǎn)基因鹽藻內(nèi)的外源目的產(chǎn)物進(jìn)行分離提純或直接將轉(zhuǎn)基因鹽藻進(jìn)行口服，免疫人及動物，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于用電激法將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于用基因槍法將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于用PEG介導(dǎo)法等其他常用技術(shù)將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于將來自人及動物的基因，如防御素基因和抗菌肽基因等轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于將來自植物的基因，如種子貯藏蛋白基因等轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于將來自微生物的基因，如乙肝疫苗基因等轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi)，并得到表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于轉(zhuǎn)入外源目的基因后，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因作為轉(zhuǎn)基因鹽藻的篩選標(biāo)記，通過氯霉素篩選出轉(zhuǎn)基因鹽藻。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于將外源目的基因轉(zhuǎn)入硝酸還原酶缺失突變的鹽藻細(xì)胞內(nèi)，通過KNO3為氮源的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)基因鹽藻。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因體系，其特征在于直接將轉(zhuǎn)疫苗基因的鹽藻用于口服，如口服乙肝疫苗，以達(dá)到預(yù)防疾病的目的。
全文摘要
采用電激法和基因槍法等轉(zhuǎn)基因方法將外源目的基因轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞內(nèi),通過抗生素或營養(yǎng)突變等篩選,建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因鹽藻體系,表達(dá)來自動物、植物和微生物的有用基因,用于大量快速地生產(chǎn)口服疫苗和抗菌肽等活性物質(zhì),同時也可以對鹽藻自身進(jìn)行品種改良。
文檔編號A61K39/29GK1329169SQ0110999
公開日2002年1月2日 申請日期2001年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月29日
發(fā)明者孫勇如, 耿德貴, 李文彬, 王義琴, 張利明 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所