專利名稱：骨形成的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可調(diào)節(jié)過氧化物酶體增生劑所激活的受體(PPAR’s)的活性的藥劑在治療方面的用途，并且還涉及這種藥劑的檢測(cè)。
哺乳動(dòng)物的骨骼具有許多功能，例如提供支持、保護(hù)內(nèi)臟器官以及提供連接肌肉和腱的部位而使動(dòng)物移動(dòng)的操作功能。骨在生長和發(fā)育過程中是一直被再吸收、替換和重建的活性組織。在哺乳動(dòng)物的發(fā)育期骨架的生長是與哺乳動(dòng)物的各種器官系統(tǒng)的生長和發(fā)育相協(xié)調(diào)時(shí)，這是相當(dāng)普遍的。當(dāng)成人骨骼形成時(shí)，它需要不斷地維持以確保足夠地維持它的功能。
骨組織的沉積、再吸收和/或重建是由特殊的合成細(xì)胞稱之為成骨細(xì)胞(骨組織的沉積中所涉及)和分解細(xì)胞稱之為破骨細(xì)胞(骨組織的再吸收和/或重建所涉及)來完成。這些特殊細(xì)胞的活性在生長和發(fā)育中是變化的。在人的早期正常發(fā)育中，新的骨組織的形成快于老骨的吸收，造成骨變大、變重和變得更致密。在完全發(fā)育的成人中，在最近20歲達(dá)到最大骨密度。但是，在晚年生活中，破骨細(xì)胞的活性超過了成骨細(xì)胞，造成骨密度的下降，結(jié)果骨質(zhì)量下降。
在早期發(fā)育和/或晚年生活中會(huì)造成骨形成異常和嚴(yán)重后果的疾病有許多。這類型的疾病包括骨質(zhì)疏松、骨硬化癥、低磷酸酯酶癥、成骨不全、佩吉特疾病、聾癥和造成癌癥的高鈣血癥。
到目前為止最普通的骨疾病是骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松是特征為骨組織變得稀薄和結(jié)構(gòu)完整性損失會(huì)使骨骼變得容易骨折，尤其是脊柱、手腕或臀部的疾病。世界上有高達(dá)200百萬人患有骨質(zhì)疏松并且每年在歐洲、美國和日本有700,000人患有臀部骨折。其中20％在6個(gè)月內(nèi)死亡并且50％無法返回到完全獨(dú)立的生活狀態(tài)。
婦女更容易患骨質(zhì)疏松，但其他導(dǎo)致其的因素包括瘦和/或小、年齡、偶然性和遺傳因素。此外，激素水平異常(例如在女性中雌激素水平低、在雄性中睪酮水平低)和鈣和/或維生素D的缺乏也是導(dǎo)致其的因素。但這些無法控制，可控制的因素包括有習(xí)慣于久坐的生活方式、早期絕經(jīng)、神經(jīng)性厭食或貪食、閉經(jīng)、某些治療劑(例如皮質(zhì)類固醇、抗驚厥藥)、吸煙和酗酒。預(yù)防措施包括體育鍛煉、確保飲食中的鈣足夠和維生素D的補(bǔ)充。
其他物質(zhì)給成年動(dòng)物給藥時(shí)也顯示出促進(jìn)骨形成的作用，這些物質(zhì)包括甲狀旁腺激素(PTH)、前列腺素E2(PGE2)和1，25-(OH)2-維生素D3[1，25-(OH)2-D3]。但是，這些都伴有副作用而局限了它們的臨床應(yīng)用。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PGE2與自發(fā)性流產(chǎn)、腹瀉和循環(huán)性虛脫有關(guān)；而1，25-(OH)2-維生素D3會(huì)引起高鈣血癥造成腎鈣化；并且必須注射給藥的PTH會(huì)引起少量的高鈣血癥。Raloxifene和alendronate都是可以使用的，但是伴有副作用，包括臉紅、深度靜脈血栓、腹部或肌肉骨骼疼痛、惡心、胃灼熱或?qū)κ彻艿拇碳ぁ?br> 激素替代療法(HRT)已經(jīng)用來治療絕經(jīng)骨質(zhì)疏松，但是雌激素和降鈣素(HRT成分)二者都有風(fēng)險(xiǎn)和/或副作用。雌激素會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)，而降鈣素會(huì)引起臉手的潮紅、排尿增加、惡心和皮膚疹。
顯然，現(xiàn)有的治療骨質(zhì)疏松的療法盡管有效促進(jìn)骨沉積或抑制過量的骨再吸收，但是卻具有不可接受的副作用，限制了它們的臨床應(yīng)用。所以，仍然需要有效的療法。
造成骨形成異常的其他疾病有佩吉特疾病。這種疾病一般會(huì)造成骨變大和形不成骨，導(dǎo)致骨的變軟，骨折增加、骨疼痛和關(guān)節(jié)炎。佩吉特疾病的相關(guān)癥狀是聽力的喪失。佩吉特疾病的起因還沒有清楚地闡明。高達(dá)40％的患者都有該疾病的家族史，但是也有數(shù)據(jù)支持佩吉特疾病的病毒病因說。伴有骨質(zhì)疏松時(shí)，緩解佩吉特疾病癥狀的療法包括體育鍛煉和服用降鈣素或雙磷酸酯。
甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)是一種甲狀旁腺活動(dòng)過度并產(chǎn)生太多甲狀旁腺激素而導(dǎo)致骨損失的激素疾病。PTH可以促進(jìn)鈣從骨中釋放并調(diào)節(jié)鈣從食品中的吸收。與甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)有關(guān)的癥狀包括昏睡、疲勞、肌肉變?nèi)?、關(guān)節(jié)疼痛和便秘，并且鈣在血漿中的高濃度也會(huì)造成鈣在腎臟中的沉積，形成結(jié)石。該疾病的起因目前還不清楚。一般療法是摘除一個(gè)或多個(gè)甲狀旁腺，但這會(huì)造成不可逆的和無法治愈的甲狀旁腺功能減退。
成骨不全(OI)是一種特征為骨易碎的疾病，并且起因于骨組織產(chǎn)生膠原的能力異?；蚪档?。不同類型的嚴(yán)重程度和影響是不同的，最輕度類型的特征是容易骨折、脊柱有彎曲傾向、牙齒易碎和聽力喪失。目前還不能治愈，并且該療法是通過物理療法將癥狀降低到最小并減少骨折的可能性。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的有希望的結(jié)果是雙膦酸鹽，尤其是在生長中的兒童，但是這些試驗(yàn)還沒有進(jìn)行雙盲或安慰劑對(duì)照。
稱作為磷酸酯酶過少的相關(guān)基因遺傳疾病與OI有許多共同的癥狀。在這些疾病嚴(yán)重時(shí)，個(gè)體不能在子宮中形成骨骼而流產(chǎn)。在較輕時(shí)，例如牙齒磷酸酯酶過少癥，該疾病表現(xiàn)為牙齒過早脫落。對(duì)磷酸酯酶過少癥還沒有療法。
其他疾病也對(duì)骨形成有直接影響。特別重要的是癌癥，它能夠造成高鈣血癥，并且最后形成易碎的骨。
過氧化物酶體增生劑激活的受體(PPAR’s)是一組位于細(xì)胞核控制涉及脂質(zhì)體內(nèi)平衡的基因表達(dá)的激素受體。PPAR’s已顯示出對(duì)許多通過增加了的包含該酶表達(dá)在該過氧化物酶體內(nèi)促進(jìn)過氧化物酶體的復(fù)制和代謝脂肪酸能力的化合物有反應(yīng)。
PPARα是該族特征化的第一成員[Isseman & Green(1991)，Nature，347645-650]，它被許多刺激涉及過氧化物酶體β氧化的基因表達(dá)的中等和長鏈脂肪酸激活。PPARα通過DNA上游促進(jìn)劑成分對(duì)脂質(zhì)起作用并已經(jīng)顯示出可與視網(wǎng)膜樣的受體形成雜二聚糖[Kliewer等(1992)，Nature，358771-774]，該絡(luò)合物已經(jīng)顯示出與促進(jìn)劑結(jié)合并激活RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄。
因?yàn)樽R(shí)別出了PPARα，PPAR族的其他成分包括PPARγ(Kliewer等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，917355-7359)和PPARδ[Lim H.，等(1999)，環(huán)狀氧化酶-2-衍生的前列腺素通過PPARδ調(diào)節(jié)鼠的胚胎移植]也已經(jīng)被鑒別。這些PPAR相應(yīng)物的每一種都已經(jīng)顯示出結(jié)合許多能夠通過PPAR基因特殊轉(zhuǎn)錄誘發(fā)過氧化物酶體復(fù)制/活性的化合物。
顯示出結(jié)合PPAR相應(yīng)物的許多試劑已經(jīng)表現(xiàn)出有治療潛力。例如，WO 99/32465描述了能夠結(jié)合PPARα、δ和/或γ的芳基噻唑烷二酮衍生物并且它可以用于治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化癥或肥胖癥。
除了普通的PPAR激動(dòng)劑外，已經(jīng)識(shí)別出許多特殊試劑，被稱為特異性激活特殊PPAR轉(zhuǎn)錄因子。例如，WO97/36579公開了用于治療肥胖癥的PPARα拮抗藥。WO 97/28149公開了用于提高高密度的脂蛋白血漿濃度的PPARδ激動(dòng)劑的化合物，由此對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的心血管病的進(jìn)程。US-A-5925657公開了PPARγ激動(dòng)劑在抑制通常與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞素產(chǎn)生的用途。
WO 99/10532公開了識(shí)別PPAR激動(dòng)劑和PPAR拮抗藥兩種的方法從而識(shí)別可用于調(diào)節(jié)PPAR相應(yīng)物的活性的試劑。
EP-A-783888公開了troglitazone和相關(guān)噻唑烷二酮在生產(chǎn)治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物方面的用途，盡管沒有證實(shí)骨組織的合成代謝的活性。
WO 00/27832是中間文件并公開了可用于治療骨質(zhì)疏松的PPARγ拮抗藥。
WO 00/23451是中間文件并公開了用于治療和/或預(yù)防由PPAR’s調(diào)節(jié)的疾病尤其是血脂過少和糖尿病的取代的三環(huán)化合物。
JP-A-2022226公開了前列腺素D和J類似物用于治療骨疾病的用途，證實(shí)了對(duì)成骨細(xì)胞有積極作用。沒有提到對(duì)PPAR有任何作用。
WO 00/18234是中間文件并公開了噻唑烷二酮作為PPARγ激動(dòng)劑與治療劑組合治療腫瘤。腫瘤減少了但沒有顯示出骨合成代謝活性。
Okzazki等[Endocrinology，(1999)，140(11)5060-5]報(bào)導(dǎo)了涉及一組可體外抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC’s)形成成骨細(xì)胞的噻唑烷二酮化合物(PPARγ激動(dòng)劑)。暴露給噻唑烷二酮的BMSC’s可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的形成并抑制了成骨細(xì)胞的形成。
在損害成骨細(xì)胞形成的情況下，PPAR激動(dòng)劑涉及了脂肪細(xì)胞的分化，這些公開在Johnson等[Endocrinology(1999)，140(7)，第3245頁]。成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞二者都起源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，并促進(jìn)了一個(gè)生成抑制了其他生成。糖皮質(zhì)類固醇受體已經(jīng)顯示有預(yù)成骨細(xì)胞活性，在本文PPAR配體顯示了促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。
Johnson等描述了一種PPARγ激動(dòng)劑TZD，[5-(4-{[N-甲基-N(2-吡啶基)-氨基]乙氧基}芐基)噻唑烷-2，4-二酮]與地塞米松(糖皮質(zhì)激素)組合對(duì)一種成骨細(xì)胞細(xì)胞系MB-1.8細(xì)胞的作用。MB-1.8，當(dāng)暴露于TZD時(shí)，顯示出堿性磷酸酯酶活性和與成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)都下降，同時(shí)提高了脂肪細(xì)胞的脂肪酸蛋白的表達(dá)。地塞米松對(duì)抗TZD對(duì)堿性磷酸酯酶和成骨細(xì)胞基因標(biāo)記表達(dá)的作用，但是增加了脂肪細(xì)胞的脂肪酸蛋白的表達(dá)。這樣，再次顯示出PPAR激動(dòng)劑在損害成骨細(xì)胞分化的情況下可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。
所以，已經(jīng)確立了當(dāng)PPAR’s活性的主要區(qū)域是在脂質(zhì)體內(nèi)平衡時(shí)，它們也能夠?qū)谴x具有作用。這種作用似乎是通過影響骨中的干細(xì)胞的分化產(chǎn)生，并在激活的PPAR在損害成骨細(xì)胞的情況下利于脂肪細(xì)胞形成上只顯示出陰性。這根本不必驚訝，假定PPAR’s在脂質(zhì)體內(nèi)平衡具有活性時(shí)，肯定是PPARγ激動(dòng)劑例如已經(jīng)研究至今的proglitazone。
還顯示出降低成骨細(xì)胞數(shù)的可能性，由此減緩骨吸收，但是到診斷出骨質(zhì)疏松時(shí)，患者已經(jīng)喪失了50％的骨質(zhì)量，所以，對(duì)不是靜止療法的可能通過預(yù)防更多成骨細(xì)胞產(chǎn)生獲得治療的一種再生療法有一種需求。
出人意料地是，我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPARα和PPARδ不僅包括在脂質(zhì)體內(nèi)平衡中，而且也通過成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨形成，當(dāng)適當(dāng)激活時(shí)，實(shí)際上提高了成骨細(xì)胞的活性。
這樣，第一方面，本發(fā)明提供了除PPARγ以外的過氧化物酶體增生劑激活的受體的激活劑或配體或所述激活劑或配體的藥學(xué)上可接受的衍生物在制備治療或預(yù)防骨疾病的藥物中的用途。
在另外一方面，提供了至少一種可調(diào)節(jié)至少一種PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的試劑在制備治療至少一種骨疾病的藥物中的用途。
本文所用的術(shù)語“激活劑”是指可激活PPAR的物質(zhì)。這類物質(zhì)可以直接激活PPAR，或者可以在體內(nèi)代謝以形成配體通過與PPAR結(jié)合激活PPAR。
已知某些物質(zhì)是總-激活劑或總-激動(dòng)劑，可以激活全部PPAR’s，這些物質(zhì)本身不需要結(jié)合受體。這類物質(zhì)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是由激活的PPAR導(dǎo)致的成骨細(xì)胞活性大于正常，最好就象用本文以下所述的本發(fā)明試驗(yàn)所測(cè)定的。用于本發(fā)明的優(yōu)選總-激動(dòng)劑包括亞油酸、亞麻酸和花生酸。
已知本發(fā)明的激活劑或配體的藥學(xué)上可接受的衍生物可以在需要時(shí)使用。這類衍生物可以是藥物前體、配體或激活劑的鹽或酯的形式，并且在它們自身形式是有活性的。優(yōu)選的鹽是簡(jiǎn)單鹽類如鹽酸鹽、硫酸鹽或醋酸鹽。優(yōu)選的酯包括乙酯和甲酯，同時(shí)適當(dāng)?shù)乃幬锴绑w包括化合物的糖苷。
已知PPAR至少有三種類型即PPARα、PPARγ和PPARδ。在該族中還有其他受體，并且也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
已知用于本發(fā)明的化合物是可與PPAR’s結(jié)合的或激活PPAR’s的那些化合物，并且它們?nèi)堪ㄔ诒景l(fā)明中，只要它們能夠結(jié)合或激活不是或除了PPARγ以外的PPAR。
也已知本發(fā)明可以擴(kuò)大到本文所公開的新化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的化合物是PPAR拮抗劑并且可以用于治療佩吉特疾病。
盡管如此，還是特別優(yōu)選用于本發(fā)明的化合物是PPAR’s的激動(dòng)劑或激活劑。除PPARγ以外的PPAR’s激動(dòng)劑促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性并且是用于治療患者患有降低的或不足的骨質(zhì)量如骨質(zhì)疏松的疾病。以前的治療只是靜止的，但是本發(fā)明的該實(shí)施方案的化合物可以使骨再生。
優(yōu)選類的化合物是可激活PPARα或PPARδ的那些化合物。
還優(yōu)選的是fibrate。一些fibrate可以激活PPARγ，但是非諾貝特是PPARα的激動(dòng)劑，而苯札貝特是PPARδ的激動(dòng)劑。這些化合物的任何一種分別都是優(yōu)選的。
對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是術(shù)語激動(dòng)劑是指一般可促進(jìn)PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的一組藥劑。所以，使用術(shù)語拮抗藥是指任何可抑制PPAR轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性的藥劑。
在本發(fā)明另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，激動(dòng)劑是fibrate或N-(2-苯甲酰苯基)-L-酪氨酸衍生物。只作為PPARγ激動(dòng)劑的Glitazone不是本發(fā)明的一部分，并且只有當(dāng)glitazone作為其他PPAR’s的激動(dòng)劑或拮抗藥時(shí)它才是優(yōu)選的。
下列藥劑全部都是優(yōu)選的3-{4-[2-(2-苯并噁唑基甲基氨基)乙氧基]苯}-2-(2S)-(2，2，2-三氟乙氧基)丙酸；二十二碳六烯酸；LY171883；亞油酸；油酸；棕櫚酸；氯貝特；二十碳四烯酸；8(S)-羥基-6，8，11，14-二十碳四烯酸；棕櫚酸甲酯；Wy-14643([4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基硫代]醋酸)；萘苯丁酸{2-甲基-2[p-(1，2，3，4-四氫-1-萘基)苯氧基]丙酸}；祛酯酸[2-甲基-2([p]-氯苯氧基)-2-甲基丙酸]；MK-571((+-)-3-[({3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]-苯基}{[3-(二甲基氨基)-3-氧丙基]硫代}甲基)-(硫代)(丙酸)；PGJ(2)[前列腺素J2]；Δ(12)前列腺素J2]；15-脫氧-Δ(12，14)-PGJ(2)[15-脫氧-Δ(12，14)前列腺素J2]；PD19559；共軛亞油酸；carbaproscyclin；9-羥基十八碳二烯酸；KRP-297；伊洛前列素；L783483；巖芹酸；反油酸；芥酸；亞麻酸；L165461；L796449；L165041；GW2433；GW1929；GW2331；2-溴棕櫚酸鹽；庚-4-炔基-VPA(庚-4-炔基-丙戊酸)；己-4-炔基-VPA(己-4-炔基-丙戊酸)；棕櫚酸甲酯；4-[3-(2-丙基-3-羥基-4-乙?；窖趸?丙氧基]-苯氧乙酸；3-氯-4-{3-[2-丙基-3-羥基-4-(1-羥基亞氨基(hydroxlimino)丙基)-苯氧基]丙基硫代}苯基醋酸；3-氯-4-[3-(3-乙基-7-丙基-6-苯并[4，5]-異噁唑)丙基硫代]苯基醋酸；3-氯-4-[3-(2-丙基-3-三氟甲基-6-苯并[4，5]異噁唑)丙基硫代]苯基醋酸；4-(2-乙?；?6-羥基十一烷基)肉桂酸；3-氯-4-[3-(3-苯基-7-丙基苯并呋喃-6-基氧)丙基硫]苯基醋酸；和3-丙基-4-[3-(3-三氟甲基-7-丙基-6-苯并[4，5]-異噁唑氧基)丙基硫代]苯基醋酸。
治療優(yōu)選的目標(biāo)分別是骨質(zhì)疏松、佩吉特疾病、成骨不全、磷酸酯酶過少癥、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、耳聾、牙異常、或者導(dǎo)致高鈣血癥的癌癥尤其是骨髓瘤。
骨質(zhì)疏松目標(biāo)優(yōu)選是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、雄性骨質(zhì)疏松或激素所誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，特別是在用糖皮質(zhì)激素所誘發(fā)的時(shí)候。
本發(fā)明還設(shè)想治療易于或具有骨疾病的哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人的方法，它包括給予藥學(xué)上有效量的本發(fā)明激活劑或配體。
本發(fā)明還提供了本文所述配體和激活劑的藥物制劑，尤其是這種制劑以前沒有公開治療用途。
已知治療制劑可以制成任何適當(dāng)?shù)男问?，并且可以使用任何藥學(xué)上可接受的載體。這將取決于用于該制劑化合物的性質(zhì)，依次是該制劑是藥物前體、鹽或酯的形式。
適當(dāng)?shù)妮d體簡(jiǎn)單來說只是水或鹽水，但它一般優(yōu)選化合物全身給藥。例如這可以是通過注射、時(shí)間釋放膠囊/片或者經(jīng)皮貼劑。這些當(dāng)中的全部適當(dāng)?shù)闹苿┰诒绢I(lǐng)域中都是公知的，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物包括至少一種載體和/或賦型劑。理想的載體或賦型劑起調(diào)節(jié)穩(wěn)定性和/或使藥劑靶向到優(yōu)選的活性部位，一般是骨組織的作用。靶向的適當(dāng)載體和/或賦型劑是本領(lǐng)域所熟知的，包括對(duì)選擇性細(xì)胞類型所分別表達(dá)的多肽特異性的抗體；和脂質(zhì)體如稱之為STEALTH脂質(zhì)體。其他適當(dāng)?shù)陌邢蛭镔|(zhì)可以攙和到含有配體或激活劑的囊、脂質(zhì)體或膠粒，并且可以在通常接近需要激活相關(guān)PPAR的區(qū)域包括靶向的配體或抗體。
已知抗體可以是多克隆或單克隆，或者可以只含有其有效的或等量的部分(例如FAB片段)。人化的單克隆抗體或其片斷或等同物是特別優(yōu)選的。用于生產(chǎn)人化的單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
脂質(zhì)體是囊中包裹有導(dǎo)入給患者的選擇性藥劑的基于脂質(zhì)的囊。該脂質(zhì)體可以從純磷脂或磷脂的混合物和磷酸甘油酯中生產(chǎn)。一般來說，脂質(zhì)體可制成小于200nm的直徑，使其可以靜脈注射并通過肺毛細(xì)管床。而且脂質(zhì)體的生化性質(zhì)賦予穿過血管膜到達(dá)所選組織的滲透性。脂質(zhì)體具有相對(duì)短的半衰期。目前已經(jīng)開發(fā)出稱之為STEALTHR的脂質(zhì)體，它含有用聚乙二醇(PEG)包衣的脂質(zhì)體。用PEG處理的脂質(zhì)體在靜脈給予患者時(shí)有顯著增加了的半衰期。
當(dāng)需要時(shí)，可以給患者使用制劑。在任何情況下，有技術(shù)的醫(yī)生將很容易地開出有效劑量和給藥方案的處方。給藥劑量取決于受體的年齡、健康和體重、共用的療法的類型(如果有)，該療法的頻率和所需作用的性質(zhì)。例如全身每日劑量是大約0.1mg到大約500mg。正常地，在一個(gè)或多個(gè)每日劑量中大約10mg到100mg的激活劑或配體在獲得所需結(jié)果時(shí)是有效的。
對(duì)骨合成代謝藥物作用的細(xì)胞基礎(chǔ)缺乏理解的主要原因是目前沒有以適當(dāng)方式對(duì)這些藥物的反應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)體外測(cè)定。但是，我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出了許多測(cè)定法，當(dāng)與新生鼠的顱蓋器官培養(yǎng)物結(jié)合使用時(shí)，這些測(cè)定法能夠預(yù)測(cè)骨合成代謝藥劑。
這樣，按照本發(fā)明的又一方面，提供了用于篩選可調(diào)節(jié)PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的藥劑的方法，它包括i提供骨形成細(xì)胞的培養(yǎng)基；ii把骨形成細(xì)胞暴露給可調(diào)節(jié)至少一種PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的藥劑；并且iii監(jiān)控該藥劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基的骨形成能力的作用。
這種類型的篩選在本領(lǐng)域中是熟知的，但沒有用于篩選可調(diào)節(jié)PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的藥劑。例如，這些包括鈣化的成纖維細(xì)胞-集落形成單位測(cè)定法(Scutt A.Bertram P.骨髓細(xì)胞是前列腺素E2的合成代謝作用于骨的目標(biāo)物從非粘連向粘連成骨細(xì)胞前體轉(zhuǎn)移的誘導(dǎo)。J.Bone and MineralRes.10474-489，1995)；非粘連基質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基的篩選(Miao D，ScuttA.非粘連基質(zhì)前體細(xì)胞是骨合成代謝藥劑的目標(biāo)物，J Bone and Miner.Res.23S537，1998)和顱蓋膠原合成的篩選，用于監(jiān)控膠原的產(chǎn)生[ChyunY.S.，Raisz L.G.，(1984)前列腺素E2對(duì)骨形成的刺激，前列腺素2797-103]。
按照本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種由本發(fā)明篩選方法所導(dǎo)出的藥劑。
在附圖中，它們完全是詳細(xì)說明而不是限定本發(fā)明，某些化合物分別在堿性磷酸酶活性、鈣吸收和膠原合成上顯示出作用，其中最后的條柱顯示了累積的和測(cè)定的化合物對(duì)骨合成代謝的作用。


圖1是PGA1的條形圖；圖2是非諾貝特的條形圖；圖3是苯札貝特的條形圖；圖4是亞油酸的條形圖；圖5是PGA2的條形圖；圖6是油酸的條形圖；并且圖7是芝麻素的條形圖。
本發(fā)明現(xiàn)在用下列非限定型實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
預(yù)備實(shí)施例在測(cè)試化合物前，必須準(zhǔn)備該測(cè)試法。所用的物質(zhì)和測(cè)試法的準(zhǔn)備如下。全骨髓細(xì)胞的制備從125g雄性Wistar大鼠的脛骨和股骨中獲得全骨髓細(xì)胞(BMC’s)。在無菌條件下除去骨并除去所有粘連的軟組織。摘除每根骨的一端，在另一端用18號(hào)注射針頭作孔，并離心分離細(xì)胞[Dobson K.R.，等，Calcif.Tissue Int.，65411-413(1999)]。通過反復(fù)移液將細(xì)胞分散于10ml的DMEM中(含有12％FCS，1×10-8M地塞米松和50mg/ml抗壞血酸)，經(jīng)過用20號(hào)注射針頭用力排除細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸浮液。然后將細(xì)胞用于下述方法中。成骨細(xì)胞集落形成單位培養(yǎng)基為了分析在全BMC或高密度的非粘連基質(zhì)前體(NASP)細(xì)胞培養(yǎng)基中的成骨細(xì)胞-集落形成單位(CFU-f)的數(shù)量，將106有核的BMC或來自高密度NASP細(xì)胞培養(yǎng)基的非粘連細(xì)胞平板接種在含有12％FCS、1×10-8M地塞米松和50μg/ml抗壞血酸的DMEM的55cm2培養(yǎng)皿上。在全BMC的CFU-f分析中，一旦培養(yǎng)期開始就加入試驗(yàn)藥劑。在NASP細(xì)胞培養(yǎng)基中，在NASP細(xì)胞培養(yǎng)自身開始時(shí)加入試驗(yàn)藥劑并且CFU-f測(cè)定只用于測(cè)定在NASP細(xì)胞培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的CFU-f數(shù)量。5天后更換培養(yǎng)基，之后一周更換兩次。將培養(yǎng)基保持18天，之后將細(xì)胞用PBS洗滌并通過加入冷乙醇固定。
固定后，將培養(yǎng)基染色，堿性磷酸酶(Apase)為陽性、鈣為陽性、膠原為陽性并且總集落如Scutt & Bertram所述(J.Bone and Mineral Res.10474-489，1995)。然后使用數(shù)碼相機(jī)給培養(yǎng)基拍照用Bioimage“智能計(jì)數(shù)器”圖像分析軟件對(duì)APase陽性、鈣陽性、膠原陽性和總集落定量[DobsonK.，等，一種自動(dòng)定量分析含有潛在成骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞-集落形成單位的有效方法，Calcif.Tissue Int.65166-172(1999)]。高密度的NASP細(xì)胞的培養(yǎng)在含有12％FCS、10-8M地塞米松和50μg/ml抗壞血酸的DMEM的孔中以每2cm2有1.5×106個(gè)細(xì)胞數(shù)的密度培養(yǎng)BMC。將被測(cè)試藥劑的溶液加入到孔中，然后培養(yǎng)4天。接著按照上述CFU-f培養(yǎng)的方法給上清液中存在的NASP細(xì)胞數(shù)定量。為了這些操作，將培養(yǎng)基輕輕搖晃并將含有非粘連細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移到55cm2培養(yǎng)皿中。加入含有12％FCS、10-8M地塞米松和50μg/ml抗壞血酸的10ml的DMEM并如CFU-f培養(yǎng)所述進(jìn)一步維持該培養(yǎng)基。新生大鼠顱蓋的器官培養(yǎng)殺死一天齡的幼鼠并將顱蓋(頭骨)解剖。然后沿矢狀縫將顱蓋切成每胎兩半。每個(gè)骨都在2ml含有1mg/ml BSA、50μg/ml抗壞血酸、60μg/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素和1×10-8M的地塞米松的DMEM的35mm組織培養(yǎng)基孔中培養(yǎng)。24小時(shí)后，培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基取代，加入任何測(cè)試藥劑，并將組織再培養(yǎng)48小時(shí)。膠原合成的測(cè)定法在該測(cè)定方法中，在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)對(duì)每只骨都用10μCi的[3H]脯氨酸脈沖24小時(shí)。將這些骨用三氯乙酸(TCA)、丙酮和乙醚連續(xù)沖洗，然后干燥。用純化的細(xì)菌膠原酶通過Peterkofsky B.和Diegelmann R.的方法(Biochemistry，6988-994，1971)測(cè)定摻入到膠原酶消化的蛋白(CDP)中的[3H]脯氨酸并表示為dpm。
實(shí)施例PGE2可以通過非酶化轉(zhuǎn)化成A系列的前列腺素(由Negushi N.，等Lipid Mediators Cell Signalling 12，443-448，1995所綜述)，并且PGE2的合成代謝活性可以由這些代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)。所以，按照上述測(cè)定方法測(cè)定PGA1，并發(fā)現(xiàn)在所有測(cè)試法中的三種產(chǎn)生了陽性反應(yīng)。結(jié)果，如圖1所示，是相當(dāng)于PGE2所產(chǎn)生的數(shù)值，顯示出骨的合成代謝活性。
從對(duì)其他化合物的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，fibrate族的化合物都具有骨合成代謝活性，不管PPAR是否與它們相互作用。例如，非諾貝特(圖2)結(jié)合PPARα，而苯札貝特(圖3)結(jié)合PPARδ。二者都有優(yōu)于PGE2的活性。
如上所示，PGA1，已知是潛在的PPARδ激動(dòng)劑，會(huì)產(chǎn)生顯著的依賴劑量的集落數(shù)增加。棕櫚酸甲酯也產(chǎn)生刺激。其他PPARδ激動(dòng)劑，伊洛前列素也產(chǎn)生相當(dāng)于PGA1的刺激作用。
亞油酸(圖4)，已知可以結(jié)合所有的PPAR’s，也顯示出骨合成代謝活性。
其他顯示出有用活性的化合物是PGA2(圖5)、油酸(圖6)和芝麻素(圖7)。一般，顯示出有用活性的化合物被認(rèn)為是具有相當(dāng)于PGE2活性的那些化合物，盡管可以認(rèn)為具有超過不含化合物的對(duì)照活性的任何化合物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)來說也是較好的。
以前最有效的骨合成代謝藥劑是PGE2。但是，因?yàn)镻GE2受體是普遍存在的，使用它會(huì)產(chǎn)生許多嚴(yán)重的并發(fā)癥包括嘔吐、腹瀉、自發(fā)流產(chǎn)和最嚴(yán)重循環(huán)衰弱。但是，PGE2的代謝物PGA1具有至少如PGE2一樣好的活性水平。PGA1不會(huì)結(jié)合細(xì)胞膜受體，這樣不可能引起PGE2所見的副作用。
如上所述，還沒有能夠?qū)呛铣纱x活性進(jìn)行可信性報(bào)導(dǎo)的單一測(cè)定法。個(gè)別測(cè)定法能夠鑒別出某些假定的骨合成代謝劑，但是當(dāng)許多骨合成代謝劑有許多機(jī)理起作用時(shí)，大多數(shù)仍無法鑒別。使用CFU-f和NASP細(xì)胞測(cè)定法并結(jié)合新生大鼠顱蓋器官培養(yǎng)基，骨合成代謝劑就能夠可信地鑒別，把假陰性減少到最小值。
權(quán)利要求
1.一種化合物在制備治療或預(yù)防骨疾病的藥物的用途，其中所述化合物為除PPARγ以外的過氧化物酶體增生劑所激活的受體的激活劑或配體或所述激活劑或配體的藥學(xué)上可接受的衍生物。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中激活劑是總激活劑。
3.按照權(quán)利要求2所述的用途，其中該激活劑是亞油酸、亞麻酸或花生四烯酸。
4.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中配體是激動(dòng)劑。
5.按照權(quán)利要求4所述的用途，其中配體是PPARα或PPARδ的激動(dòng)劑。
6.按照前面任一權(quán)利要求所述的用途，其中該物質(zhì)具有等于或大于PGE2的骨組成代謝活性。
7.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中該物質(zhì)是拮抗劑。
8.按照權(quán)利要求7所述的用途，其中骨疾病是佩吉特疾病。
9.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中該物質(zhì)是fibrate。
10.按照權(quán)利要求9所述的用途，其中該物質(zhì)是非諾貝特或苯札貝特。
11.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中該物質(zhì)是N-(2-苯甲酰苯基)-L-酪氨酸衍生物。
12.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中該物質(zhì)是PGA1、PGA2或芝麻素。
13.按照權(quán)利要求1所述的用途，其中3-{4-[2-(2-苯并噁唑基甲基氨基)乙氧基]苯}-2-(2S)-(2，2，2-三氟乙氧基)丙酸；二十二碳六烯酸；LY171883；亞油酸；油酸；棕櫚酸；氯貝特；二十碳四烯酸；8(S)-羥基-6，8，11，14-二十碳四烯酸；棕櫚酸甲酯；Wy-14643([4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基硫代]醋酸)；萘苯丁酸{2-甲基-2-甲基-(1，2，3，4-四氫-1-萘基)苯氧基]丙酸}；祛酯酸[2-甲基-2([p]-氯苯氧基)-2-甲基丙酸]；MK-571((+-)-3-[({3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]-苯基}{[3-(二甲基氨基)-3-氧丙基]硫代}甲基)-(硫代)(丙酸)；PGJ(2)[前列腺素J2]；Δ(12)前列腺素J2]；15-脫氧-Δ(12，14)-PGJ(2)[15-脫氧-Δ(12，14)前列腺素J2]；PD19559；共軛亞油酸；carbaproscyclin；9-羥基十八碳二烯酸；KRP-297；伊洛前列素；L783483；巖芹酸；反油酸；芥酸；亞麻酸；L165461；L796449；L165041；GW2433；GW1929；GW2331；2-溴棕櫚酸鹽；庚-4-炔基-VPA(庚-4-炔基-丙戊酸)；己-4-炔基-VPA(己-4-炔基-丙戊酸)；棕櫚酸甲酯；4-[3-(2-丙基-3-羥基-4-乙酰基苯氧基)丙氧基]-苯氧乙酸；3-氯-4-{3-[2-丙基-3-羥基-4-(1-羥基亞氨基丙基)-苯氧基]丙基硫代}苯基醋酸；3-氯-4-[3-(3-乙基-7-丙基-6-苯并[4，5]-異噁唑)丙基硫代]苯基醋酸；3-氯-4-[3-(2-丙基-3-三氟甲基-6-苯并[4，5]異噁唑)丙基硫代]苯基醋酸；4-(2-乙?；?6-羥基十一烷基)肉桂酸；3-氯-4-[3-(3-苯基-7-丙基苯并呋喃-6-基氧)丙基硫]苯基醋酸；或者3-丙基-4-[3-(3-三氟甲基-7-丙基-6-苯并[4，5]-異噁唑氧基)丙基硫代]苯基醋酸。
14.按照前面任一權(quán)利要求所述的衍生物的用途，它是藥物前體、鹽或酯。
15.按照前面任一權(quán)利要求所述的用途，其中骨疾病是骨質(zhì)疏松癥、佩吉特疾病、成骨不全、低磷酸酯酶癥、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、聾癥、牙異常、或者導(dǎo)致高鈣血癥特別是骨髓瘤的癌癥。
16.一種用于篩選能調(diào)節(jié)PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的藥劑的方法，包括i提供成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基；ii把成骨細(xì)胞暴露于能調(diào)節(jié)至少一種PPAR轉(zhuǎn)錄因子活性的藥劑；并且iii監(jiān)控該藥劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基骨形成能力的作用。
全文摘要
過氧化物酶體增生劑所激活的受體(除PPARγ以外)的激活劑或配體或該激活劑或配體的藥學(xué)上可接受的衍生物在制備治療或預(yù)防骨疾病的藥物中的用途，該藥物首次使骨組成代謝在增加骨沉積有益的情況時(shí)促進(jìn)骨的沉積。相反，也容易抑制和/或阻滯骨沉積。
文檔編號(hào)A61K31/198GK1430512SQ0180791
公開日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月15日
發(fā)明者安德魯·斯庫特, 卡倫·斯蒂爾 申請(qǐng)人:設(shè)菲爾德大學(xué)