專利名稱：用il－18和il－18組合物治療病毒性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及使用IL-18也稱為干擾素-γ-誘導(dǎo)因子(IGIF)以及IL-18與本發(fā)明其它制劑的組合物預(yù)防和/或治療病毒性疾病。
背景技術(shù)：
IL-8是最近才發(fā)現(xiàn)的新的細胞因子，活性IL-18含有157個氨基酸殘基。它具有很強的生物活性，包括誘導(dǎo)T細胞和脾細胞生成γ-干擾素，增強NK細胞的殺傷活性，和促進幼稚的CD4+T細胞分化成Th1細胞。此外，人IL-18還增加GM-CSF的生成，并減少IL-10的生成。已經(jīng)表明IL-18的干擾素-γ誘導(dǎo)能力比IL-12強，并且似乎具有不同受體并利用不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
CD4+T細胞是所有免疫應(yīng)答的中樞調(diào)節(jié)元件，它們分為2個亞類，Th1和Th2。每一亞類是通過其分泌不同細胞因子的能力定義的。有趣的是，對分化最有效力的誘導(dǎo)物是細胞因子自身。從幼稚前體向Th2細胞的發(fā)育是由IL-4誘導(dǎo)的。在發(fā)現(xiàn)IL-18之前，IL-12被認為是主要的Th1誘導(dǎo)型細胞因子。IL-18也是Th1誘導(dǎo)型細胞因子，并且在刺激γ-干擾素生成方面，其效力比IL-12強。
Th1細胞分泌IL-2、γ-干擾素和TNF-β。標志性Th1細胞因子——γ-干擾素直接作用于巨噬細胞以增強它們殺微生物和吞噬細胞的活性。結(jié)果使得激活的巨噬細胞可有效地破壞細胞內(nèi)病原體和腫瘤細胞。Th2細胞生成IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，它們作用于B細胞使之發(fā)育成抗體生成細胞?？傮w來說，Th1細胞主要引起細胞介導(dǎo)的免疫，而Th2引起體液免疫。
IL-18，其編碼核苷酸序列，以及該純化蛋白的特定物理化學(xué)性質(zhì)是已知的。
在1996年1月17日出版的Kabushiki Kaisha Hayashibara SeibutsuKayaku Kenkyujo′s(″Hayashibara″)的US 5，912，324(對應(yīng)于EP 0 692 536)公開了一種誘導(dǎo)免疫活性細胞生成γ-干擾素的鼠蛋白，該蛋白被進一步鑒定為具有特定的物理化學(xué)性質(zhì)和確定的部分氨基酸序列。該文獻還公開了具有157個氨基酸的序列的蛋白、其兩個片段、編碼該蛋白的DNA(471bp)、雜交瘤、蛋白純化方法、以及檢測該蛋白的方法。
在1996年5月22日出版的Hayashibara的US 6,214,584(對應(yīng)于EP 0 712931)公開了157個氨基酸的人蛋白及其同系物、編碼該蛋白的DNA、轉(zhuǎn)化體、制備該蛋白的方法、抗該蛋白的單克隆抗體、雜交瘤、蛋白純化方法、以及檢測該蛋白的方法，和治療和/或預(yù)防惡性腫瘤、病毒性疾病、細菌性傳染病和免疫疾病的方法。
在1997年7月10日出版的Incyte Pharmaceuticals，Inc.′s的WO 97/24441中公開了對應(yīng)于IL-18前體的一種193個氨基酸的蛋白及其編碼DNA。
目前采用如抗病毒劑、免疫治療和疫苗來治療和/或預(yù)防病毒性疾病如HIV、HSV、HPV、HAV、HVB和HCV，但這些治療并不總是有效的，因此需要有一種更有效的對這種病毒性疾病的治療方法。
發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供了一種治療和預(yù)防病毒性疾病如HIV、HSV、HPV、HAV、HBV和HCV的方法，包括給予抑制病毒性疾病的量的多肽，其中所述多肽與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的全長氨基酸序列至少有70％的同一性，該多肽可以單獨施用，也可以與抗病毒劑以及與疫苗組合使用，所用抗病毒劑如但不局限于foscamet、阿昔洛韋(acyclovir，ACV)、ACV-磷酸鹽、brivudine(溴乙烯基脫氧尿苷止痛藥，BVDU)、cidofovir(HPMPC，GS504)、環(huán)狀HPMPC、famciclovir、更昔洛韋(ganciclovir，GCV)、GCV-磷酸鹽、lobucavir(雙羥甲基環(huán)丁基鳥嘌呤，BHCG)、penciclovir、三氮唑核苷(ribavirin)、愛得呋韋(adefovir)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、愛博開呋(abacavir)、去氫雙脫氧胸苷(stavudine)、瑞得呋啶(zidovudine)、tenovir，其它細胞因子如IL-2、IL-12、IFN，或免疫調(diào)節(jié)劑如但不限于三氮唑核苷(ribavirin)、胸腺素α、皮質(zhì)類固醇、鎮(zhèn)靜劑、imiquimod，所述疫苗如但不局限于Havrix、Engerix。


圖1顯示了人類IL-18的氨基酸序列(Sequence ID NO1)。
圖2顯示了人類IL-18的氨基酸序列(Sequence ID NO2)。
圖3圖示用不同量的鼠IL-18的緩沖鹽水溶液腹膜內(nèi)給藥小鼠后，IFN-γ蛋白的誘導(dǎo)。
圖4圖示不同量的鼠IL-18的緩沖鹽水溶液腹膜內(nèi)給藥小鼠后，IFN-γmRNA的誘導(dǎo)。
圖5圖示小鼠經(jīng)鼠IL-18腹膜內(nèi)給藥后，用致命劑量的HSV-1(SC-16)處理，其在-2小時、一天和兩天時相對于對照增加了存活。
圖6圖示施用IL-18導(dǎo)致流感引起的體重減少得到改善。
圖7圖示施用IL-18導(dǎo)致由脈沖血氧計測定的肺部機能的改善。
圖8表明了IL-18對HBV復(fù)制的效應(yīng)。
圖9(a)-9(d)用于圖解說明IL-18誘導(dǎo)的IL-8 14-倍(圖9(a))、新蝶呤7-倍(圖9(b))、GM-CSF 100-倍(圖9(c))和IFN-γ 8-倍(圖9(d))。
圖10(a)-10(c)用于圖解說明IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生了IFN-γ(圖10(a))、新蝶呤(圖10(b))和IL-8(圖10(c))。在本研究中，單獨用IL-2處理作為對照。
圖11表明了IL-12和IL-18對HBV復(fù)制的效應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明一般涉及預(yù)防和/或治療病毒性疾病如HIV、HSV、HPV、HAV、HBV和HCv的方法，包括給予抑制病毒性疾病的量的IL-18和含有IL-18的組合物。
提供下述定義以幫助理解在本申請中頻繁使用的一些術(shù)語和縮寫。
本領(lǐng)域已知的“同一性”是指通過比較序列確定的2個或2個以上多肽序列或2個或2個以上多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域內(nèi)，“同一性”還表示多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度，根據(jù)具體情況可通過這些序列的匹配程度來確定?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨赏ㄟ^已知方法輕易地計算出，包括但不局限于下述文獻中描述的方法(Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；andSequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。測定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計成在所測試序列之間給出最大匹配。測定同一性和相似性的方法被編輯在公眾可得到的計算機程序中。用于測定兩個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選的計算機程序方法包括但不限于GCC程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA(Atschul，S.F.et al.，J. Molec.Biol.215403-410(1990).The BLAST X program is publicly available from NCBI andother sources(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。也可使用眾所周知的Smith Waterman運算法則來測定同一性。
“分離的”表示“通過人工”將天然狀態(tài)改變。如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它們被改變或者從其最初的環(huán)境中移出或兼而有之，例如，如本文所用的此術(shù)語所表示的那樣，天然存在于活生物體中的多核苷酸或多肽是未“分離的”，但是從天然狀態(tài)的共存材料中分離出的相同多核苷酸或多肽是“分離”的。
“多肽”是指包含彼此通過肽鍵或修飾的肽鍵連接的2個或2個以上氨基酸的肽或蛋白，即，肽等排物。“多肽”既包括通常稱為的肽、寡肽或寡聚物的短鏈多肽，也包括通常稱為蛋白的長鏈多肽。多肽可含有不同于20-基因編碼氨基酸的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^天然方法例如翻譯后加工或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列?；诮炭茣透敿毜膶ｎ}論文以及很多研究文獻中清楚地描述了這些修飾。可在多肽的任意位置進行修飾，包括在肽骨架、氨基酸側(cè)鏈、以及氨基或羧基末端上修飾。應(yīng)當理解，在給定多肽中幾個位點上可存在相同或不同程度的相同類型修飾。給定多肽也可具有多種類型的修飾。多肽可以呈支鏈形式(這是遍在蛋白化的作用的結(jié)果)，也可以是具有或不具有支鏈的環(huán)狀形式。環(huán)狀、支鏈和具有支鏈的環(huán)狀多肽可以是通過翻譯后天然加工產(chǎn)生的，或者可通過合成方法制得。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、與黃素共價連接、與血紅素部分共價連接、與核苷酸或核苷酸衍生物共價連接、與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價連接、與磷酯酰肌醇共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、肉豆寇?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒代?；?、磺化、通過轉(zhuǎn)運-RNA介導(dǎo)向蛋白中加入氨基酸例如精氨?；捅樵诘鞍谆?參見，例如蛋白-結(jié)構(gòu)和分子特征，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，紐約，1993；世界，F(xiàn).，翻譯后蛋白的修飾前景和觀點，pgs.1-12，蛋白翻譯后的共價修飾，B.C.Johnson，Ed.，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1983；Semeret al.，“蛋白修飾和非蛋白輔因子的檢驗”，Meth Enzymol(1990)182626-646and Rattan et al.，“蛋白合成翻譯后修飾和老化”，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62)。
“變體”是指與參考多核苷酸或多肽不同、但是仍然保留其基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸變體在核苷酸序列方面與其他的參照多核苷酸不同。變體中核苷酸序列的改變可能改變或不改變由參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可在由參考序列編碼的多肽中導(dǎo)致氨基酸取代、插入、缺失、融合和截短。多肽的典型變體的氨基酸序列與另一參考多肽不同。這些差異通常是有限的，使得參考多肽與變體的序列總體上很類似，并且在許多區(qū)域是相同的。變體和參考多肽在氨基酸序列方面可能由于一個或多個取代、插入、缺失(以任意組合)而不同。取代或插入的氨基酸殘基可能是或不是由遺傳密碼編碼的。多核苷酸或多肽的變體有可能是天然產(chǎn)生的，例如等位變體，或者可以是自然界未知的變體。多核苷酸和多肽的非天然變體可通過誘變技術(shù)或通過直接合成而制得。
用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括1)算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.，48443-453(1970)比較模型Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919(1992)中的BLOSSUM62。
缺口罰分12缺口長度罰分4一個包含這些參數(shù)的有效程序是公眾可以從遺傳計算機組(GeneticsComputer Group，Madison WI)獲得的“缺口”程序。上述參數(shù)是用于比較肽的缺省參數(shù)(末端缺口沒有任何罰分)。
本發(fā)明的肽序列可以與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示參考序列相同，即100％相同，或者其相對于參考序列可包括一定整數(shù)數(shù)目的氨基酸變更，從而使同一性低于100％。這種變更選自至少一個氨基酸缺失、取代、包括保守取代和非保守取代、或插入，其中所述變更可在參考多肽序列的氨基或羧基末端發(fā)生，或者在這兩個末端之間的任意位置發(fā)生，單獨散布于參考序列的氨基酸上，或以一個或多個相連組散布于參考序列內(nèi)。具有給定的同一性百分數(shù)的氨基酸變更的數(shù)目是這樣確定的將SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)乘以各自的同一性百分比(除以100)，然后分別從SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸總數(shù)減去上面得到的乘積，或者na≤xa-(Xa·y)，其中na是氨基酸變更的數(shù)目，xa是SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)，y是例如0.70(對于70％)、0.80(對于80％)、0.85(對于85％)等，在從xa中減去之前，將xa和y的任一非整數(shù)乘積下舍入最接近的整數(shù)。
“融合蛋白”是指由2個通常無關(guān)的融合基因或其片斷編碼的蛋白。在一個實例中，EP-A-0 464公開了包含不同比例的免疫球蛋白恒定區(qū)與另一人類蛋白或其部分的融合蛋白。在許多情況下，在治療和診斷中應(yīng)用免疫球蛋白Fc區(qū)作為融合蛋白的一部分，有利于改善藥動學(xué)特征[參見例如EP0232262A]。另一方面，對于某些應(yīng)用，在融合蛋白表達、檢測和純化之后可能需要能夠刪除該Fc部分。
IL-18多肽IL-18多肽已經(jīng)在EP0692536A2、EP0712931A2、EP0767178A1和WO972441中公開了。所述多肽包括分離的多肽，其包含分別與SEQ IDNO1(人IL-18)和SEQ ID NO2(鼠IL-18)的全長氨基酸序列有至少70％的同一性、優(yōu)選有至少80％的同一性、更優(yōu)選有90％的同一性、還更優(yōu)選有至少95％的同一性、最優(yōu)選有至少97-99％的同一性的氨基酸序列。這種多肽包括分別包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示氨基酸的多肽。
本發(fā)明的多肽是誘導(dǎo)干擾素-γ的多肽，它們在誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫中起主要作用，包括誘導(dǎo)T細胞和脾細胞生成γ-干擾素，增強NK細胞的殺傷活性，和促進幼稚CD4+T細胞分化成Th1細胞。這些特性在下文稱為“IL-18活性”或“IL-18多肽活性”或“IL-18的生物活性”。這些活性還包括所述IL-18多肽的抗原和免疫原活性，尤其是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2多肽的抗原和免疫原活性。本發(fā)明多肽優(yōu)選表現(xiàn)出IL-18的至少一種生物活性。
本發(fā)明的多肽可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是較大蛋白例如融合蛋白的一部分。包含下述額外的氨基酸序列通常是有利的即含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列、有助于純化的序列例如多個組胺酸殘基、或用于在重組制備期間起穩(wěn)定作用的其它序列的氨基酸序列。
本發(fā)明還可包括上述多肽的變體、即由于保守氨基酸取代(氨基酸殘基被具有類似特性的另一氨基酸殘基取代)而與參考多肽不同的多肽。典型的這種取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間；在Asn和Gln之間；在堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香殘基Phe和Tyr之間取代。其中取代、缺失或插入(以任意組合)幾個、5-10個、1-5個、1-3個、1-2個、或1個氨基酸的變體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的多肽可通過任一適當方法制備。這些多肽包括分離的天然多肽、通過重組制得的多肽、通過合成制得的多肽、或通過聯(lián)合采用這些方法制得的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。
本發(fā)明的重組多肽可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法由包含表達系統(tǒng)的基因工程宿主細胞制得。因此，另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明多肽的一或多個多核苷酸的表達系統(tǒng)，具有所述表達系統(tǒng)的基因工程宿主細胞，和通過重組技術(shù)制備本發(fā)明多肽的方法。也可采用無細胞翻譯系統(tǒng)、使用源自本發(fā)明DNA構(gòu)建物的RNAs來制備本發(fā)明蛋白。
合適宿主細胞的代表性實例包括細菌細胞，例如鏈球菌(streptococcci)、葡萄球菌(staphylococci)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞；真菌細胞，例如酵母細胞和曲霉屬(Aspergillus)細胞；昆蟲細胞，例如果蠅S2(Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)細胞；動物細胞，例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和鴨黑素瘤細胞；和植物細胞。
可使用多種表達系統(tǒng)，例如染色體系統(tǒng)、附加體系統(tǒng)和病毒衍生系統(tǒng)，例如源自細菌質(zhì)粒的載體，源自噬菌體的載體，源自轉(zhuǎn)座子的載體，源自酵母附加體的載體，源自插入元件的載體，源自酵母染色體元件的載體，源自病毒例如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及源自它們的組合的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體如粘粒和噬菌粒。表達系統(tǒng)可包含調(diào)控以及引起表達的控制區(qū)域。通?？墒褂媚茉谒拗鲀?nèi)維持、繁殖或表達多核苷酸以生成多肽的任何系統(tǒng)或載體。可通過多種眾所周知的常規(guī)技術(shù)，例如在Sambrook等人所著的《分子克隆實驗室手冊》(第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)中描述的技術(shù)，將適當核苷酸序列插入表達系統(tǒng)中?？蓪⑦m當分泌信號摻入到所需的多肽中，以使得翻譯的蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)空間或細胞外環(huán)境中。這些信號可以是多肽的內(nèi)源性信號，或者可以是異源信號。
可通過眾所周知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明多肽，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、高效液相層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。更優(yōu)選使用親和層析來進行純化。當多肽在分離和純化過程中發(fā)生變性時可以采用公知的重折疊蛋白技術(shù)使之恢復(fù)活性。
已經(jīng)評估了IL-18在動物模型中預(yù)防/治療某些病毒性疾病的治療潛力，并證實了其保護效應(yīng)。給予正常小鼠、無胸腺小鼠或SCID小鼠IL-18后提高了在HSV-l感染中的存活率，這種保護至少一部分是由IFNγ介導(dǎo)的(Fujioka等，1999，J.Virology，732401)。另外，最近的數(shù)據(jù)表明IFNγ對于潛伏期之后再活化的HSV的快速抑制起了非常重要的作用(Cantin等，1999，J.Virology，735196；Cantin等，1999，J.Virology，733418)，這暗示了在抑制由于再活化導(dǎo)致的復(fù)發(fā)疾病中IL-18的治療潛力。通過IL-18的處理減少了痘苗病毒誘導(dǎo)的痘皰形成，該結(jié)果與IFNγ受體敲除小鼠中痘苗病毒復(fù)制的加強相一致。在皰疹病毒和痘苗病毒感染的模型中，IL-18可以是預(yù)防性給藥，和/或在感染后的早期給藥。
本發(fā)明的多肽可以單獨使用或與抗病毒劑、其它細胞因子、IFN、抗生素或抗病毒疫苗組合使用來治療和/或預(yù)防各種病毒性疾病。
HIV在HIV感染的例子中，本發(fā)明的多肽可以單獨使用或與其它制劑組合使用，例如蛋白酶抑制劑(PI)，核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)，HIV受體或共受體抑制劑，融合抑制劑，反義寡核苷酸抑制劑，葡糖苷酶抑制劑、其它細胞因子，IFN，抗生素或免疫調(diào)節(jié)劑。PI的例子包括但不局限于amprenavir、crixivan、DMP-323、DMP-450、英地那韋(indinavir)、KNI-272、1asinavir、lopinavir、viracept、PDl78390、利托那韋(ritonavir)、RPI 312、沙奎那韋(saquinavir)、SC-5215l、SDZ PRI 053、tipranavir、U-103017和A-77003。NRTI的例子包括但不局限于愛博開呋(abacavir)、阿特福韋(adefovir)、alovudine、AZdU、CS-92、DAPD、地達諾森(didanosine)、dOTC、coviracil、拉米呋啶(lamivudine)、lobucavir、iodenosine、司塔夫定(stavudine)、tenofovir、塞西太并(zalcitabine)和瑞得呋啶(zidovudine)。NNRTI的例子包括但不局限于atevirdine mesylate、calanolideA、capravirine、地拉夫定(delavirdine)、衣非韋倫(efavirenz)、emivirine、GW420867X、HBY 097、loviride、耐呋洛平(nevirapine)、PETT-5、tivirapine和trovirdine。受體、共受體、融合抑制劑的例子包括但不局限于AMD 3100、TAK 779、T-20和T-1249。這些例子和其它以各種機制對抗HIV的抗病毒劑的例子可以在周期性歸納的International Antiviral News中找到，例如2000年1月第8卷第一期中的實施例。細胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑的例子包括但不局限于IL-2、類固醇和鎮(zhèn)靜劑。本發(fā)明也可以給藥于被感染的個體，以單一治療的形式增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體能控制或清除感染。
HSV單純皰疹病毒(HSV)是能主要感染粘膜表面或皮膚的皰疹病毒科的一員。在感覺神經(jīng)元和自主神經(jīng)結(jié)中潛伏。在某些刺激如壓力、感冒、UV輻射或免疫抑制情況下，病毒可以在初始感染位置或任何通過神經(jīng)結(jié)神經(jīng)支配的位點復(fù)活。目前已有抗病毒劑并能高效抑制α-皰疹病毒的復(fù)制，然而，雖然它們使復(fù)原時間略有縮短，但對于病毒潛伏狀態(tài)的建立的療效有限的。最近的數(shù)據(jù)表明，IFN-γ對于潛伏期之后再活化的HSV的快速抑制起了非常重要的作用(Cantin等，Joumal of Virology，733418-3423，5196-5200)，暗示了IL-18治療在抑制由于再活化導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)中的潛力。
單純皰疹性腦炎(HSE)是一種嚴重的散發(fā)病，占到病毒性腦炎病例的10-20％。它是單純皰疹病毒(HSV)感染的最嚴重形式，導(dǎo)致病灶、病變壞死，從而在許多例子中導(dǎo)致了嚴重的神經(jīng)后遺癥(Whitley和Roizman，1998，Clin.Inf.Dis.，26541-547)。HSV-1和2伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的感染?？共《局委熆梢允古cHSE有關(guān)的死亡減少約30％，但是幸存者可能仍然留下了嚴重的神經(jīng)損傷(Skoldenberg，1996，Sc.J.Inf.Dis.，1008-13；Kimberlin等，1998，J.Neurovirology，4474-485)。
本發(fā)明的多肽可以單獨使用或與抗病毒劑如病毒聚合酶抑制劑(例子如阿昔洛韋、valacylcovir、penciclovir、famciclovir、更昔洛韋、vangancilcovir、foscamet、codofovir和其它核苷酸或核苷)組合使用。多肽也能與細胞因子例如IFN、IL-2、IL-12等、以及其它免疫調(diào)節(jié)劑組合使用。本發(fā)明也可以作為單獨性治療來給藥被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體能控制或清除感染。
HPV對于預(yù)防和/或治療HPV感染有著迫切(unmet)的需求。到今天已經(jīng)鑒定了約100種HPV型。感染可能是無癥狀的，可能產(chǎn)生疣或?qū)е赂鞣N良性或惡性生殖腫瘤包括宮頸癌(回顧于Koutsky，Am.J.Med.，1023-8，1997)。雖然不能獲得精確的數(shù)字，但據(jù)估計美國性生活活躍的成人中，有1％有肉眼可見的生殖器疣，而且至少有15％的人已經(jīng)由分子證據(jù)確認感染了HPV，其結(jié)果是每年有65,000例的宮預(yù)癌和生殖器癌發(fā)生。目前還沒有抗病毒藥物，HPV病的治療是通過化學(xué)或物理切除、細胞毒制劑或免疫治療(Miller、R.L.等，Int J Immunopharmacology，211-14，1999)。雖然目前大多數(shù)的療法最終可以清除大部分患者體內(nèi)的疣，但它們并不能阻止病毒的傳播或疾病的進展(Beumer和Ferenczy，Am.J.Med.，10228-37，1997)。有異常奶頭(pap)涂片和高風(fēng)險HPV血清型的婦女可被鑒別為，通過治療，具有誘導(dǎo)持久免疫和防止宮頸癌發(fā)生的前景。
本發(fā)明的多肽可以與抗病毒劑，如cidofovir(HPMPC，GS504)、BVDU、BVRU，以及其它核苷和核苷酸組合使用。本發(fā)明也能與其它免疫調(diào)節(jié)因子如干擾素或干擾素誘導(dǎo)物(imiquimod，Aldara，IL-12)組合使用。本發(fā)明也能與目前正在開發(fā)的(預(yù)防性或治療性)重組疫苗組合使用。本發(fā)明還可以作為單獨性治療來給藥被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體控制或清除感染。
最近的數(shù)據(jù)表明，IL-18在與皰疹病毒相關(guān)的腫瘤發(fā)生中潛在的保護作用。IL-18，也稱之為干擾素-γ，在EBV急性感染細胞中起正調(diào)節(jié)作用，在由EBV誘導(dǎo)的移植后淋巴增生性疾病中起負調(diào)節(jié)作用(Setsuda等，1999，American Journal ofPathology，155257-265)。這些數(shù)據(jù)表明，這些媒介物參與宿主對抗EBV致癌特性的防御作用。本發(fā)明可以與諸如針對HSV列出的那些試劑組合使用。本發(fā)明也能作為單獨性治療來給藥被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體控制或清除感染。
HAV甲型肝炎病毒(HAV)屬于小RNA病毒科。甲型肝炎是人與人之間高度接觸傳染的，它可以經(jīng)由糞-口途徑傳播，包括通過污染的食物、食物器皿、污染的水、食用來自于污染的水中的有殼水生動物以及其它從人到人的直接途徑。HAV在肝臟中復(fù)制和分泌于膽汁中。感染是急性的，通常有癥狀，包括從輕微和暫時性的癥狀到嚴重和長期性的癥狀，有發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、黃疸和肝大。治療通常是支持性的，僅在特別嚴重的病例中進行肝移植。預(yù)防可以是在暴露于病毒之前通過滅活病毒(Havrix)進行主動免疫或在暴露于病毒之后用集聚的免疫球蛋白進行被動免疫。
本發(fā)明的多肽可以與目前的疫苗組合使用以增強免疫力或獲得治療效果(一旦患者已經(jīng)被感染)。本發(fā)明也可以作為單獨性治療來給藥被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體控制或清除感染。
HBV乙型肝炎病毒(HBV)是DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科的一員。HBV是經(jīng)由血液或體液通過類似HIV傳染的途徑在人-人之間傳播的。HBV主要在肝臟中復(fù)制，該病毒被釋放進血流中，之后可以在身體分泌物包括精液和唾液中發(fā)現(xiàn)。在暴露于病毒和有臨床癥狀之間有60-180天的潛伏期，臨床癥狀包括無癥狀感染到黃疸性肝炎，偶有肝衰竭。在急性階段過后，大部分患者清除了病毒并產(chǎn)生免疫力。某些患者發(fā)展成慢性感染，并因此可能導(dǎo)致嚴重的肝臟疾病、纖維樣變性和肝細胞癌。
許多試劑可以用來治療HBV，但絕大多數(shù)僅僅對于部分慢性HBV感染有效?，F(xiàn)有已獲準銷售和正處在實驗階段的制劑包括抗病毒劑(拉米夫定[3TC]、famciclovir、lobucavir、Adefovir，和許多其它核苷和核苷酸制劑)，免疫調(diào)節(jié)因子(干擾素α、β、γ，皮質(zhì)類固醇，Levamisole，胸腺素α，IL-2，三氮唑核苷)和治療性疫苗或超免疫球蛋白。
本發(fā)明的多肽可以與任何一種現(xiàn)有治療或其它類似制劑組合使用。本發(fā)明還可以作為單獨性治療來給藥被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體控制或清除感染。
HCV丙型肝炎病毒(HCV)是單鏈RNA病毒，屬于Hepacivirus或黃病毒科(Flavivirus)的一員。HCV出現(xiàn)在血液和身體分泌物中，經(jīng)由與HIV和HBV相同的途徑在人-人之間傳播。HCV主要在肝臟中復(fù)制，雖然也發(fā)現(xiàn)病毒存在于其它類型的細胞如淋巴和樹狀細胞中。急性感染常常是無癥狀的，或是特征在于一種常常伴有更常見的病毒感染的輕度過程。在少量例子中，急性感染可能導(dǎo)致爆發(fā)性肝炎和死亡。大多數(shù)感染導(dǎo)致一種慢性的、常常是無癥狀的感染，該感染可能持續(xù)數(shù)十年，偶爾有肝酶的增多或肝硬變。某些病例會發(fā)展成嚴重的肝臟疾病包括肝衰和肝細胞癌。
一般通過干擾素-α、共有干擾素、或干擾素與三氮唑核苷的組合物來治療HCV。真正的抗病毒化合物現(xiàn)正處于早期臨床試驗中，包括病毒聚合酶的抑制劑、反義多核苷酸、或核酶。
本發(fā)明可以與任何一種現(xiàn)有治療或其它類似制劑組合使用。本發(fā)明還可以作為單獨性治療來給藥已被感染的個體，從而增強個體的天然免疫應(yīng)答，使個體能控制或清除感染。
相信在慢性HCV感染期間給予IL-18可以降低病毒水平，它是通過誘導(dǎo)非-細胞溶解的抗病毒細胞因子如IFNγ或TNFα的作用、或通過增強T-細胞對病毒抗原的反應(yīng)來提高和維持保護性免疫力。
本發(fā)明也提供了含有有效治療量的IL-18的藥用組合物，任選還含有其它制劑如上文所述的制劑。還可以使用可藥用載體或賦形劑。所用的可藥用載體可以是例如固體或液體。固體載體的實例包括但不局限于乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。液體載體的實例包括但不局限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇漿、花生油、橄欖油、和它們的混合物。同樣，載體或稀釋劑可包括本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的緩釋材料，例如單獨的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或它們與蠟、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、異丁烯酸甲酯等的混合物。
本發(fā)明還涉及包含填充有一種或多種上述本發(fā)明組合物組分的一個或多個容器的藥物包裝或藥盒。多肽可單獨使用，或者與其它化合物例如治療化合物聯(lián)合使用。
本發(fā)明組合物可適應(yīng)于給藥途徑，例如適于系統(tǒng)性給藥或口服給藥。優(yōu)選的系統(tǒng)性給藥形式包括注射，主要是靜脈注射?？墒褂闷渌⑸渫緩?，如皮下、肌內(nèi)注射、或腹膜內(nèi)注射。此外，如果可將本發(fā)明配制成腸溶或膠囊制劑，口服給藥也是可能的。其它系統(tǒng)性給藥手段包括使用滲透劑例如膽鹽或夫西地酸或其它去污劑透粘膜給藥和透皮給藥。這些組合物還可以以膏劑、糊劑、凝膠劑等劑型局部給藥和/或定位給藥。
IL-18所需的劑量取決于助劑的選擇，必要時，還取決于給藥途徑、制劑性質(zhì)、患者的狀態(tài)、以及臨床醫(yī)師的判斷。IL-18的適當劑量是1納克/Kg-1毫克/kg患者體重。然而，根據(jù)所用化合物的種類和不同給藥途徑的不同效力，所需劑量可有很大變化。例如，透皮給藥將比靜脈內(nèi)注射給藥需要更高的劑量。通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的用于最優(yōu)化的經(jīng)驗性常規(guī)手段可調(diào)節(jié)這些劑量水平中的變化。
本發(fā)明組合物的給藥方案取決于劑量、對助劑的選擇、給藥途徑、制劑性質(zhì)、患者的狀態(tài)、以及臨床醫(yī)師的判斷。合適的給藥方案是每日一次，每周一次或每月一次。但是根據(jù)所用其它制劑的種類和不同給藥途徑的不同效力，本發(fā)明組合物的給藥方案可有很大變化。例如，透皮給藥將比靜脈內(nèi)注射給藥需要更高的劑量。通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的用于最優(yōu)化的經(jīng)驗性常規(guī)手段可調(diào)節(jié)本發(fā)明組合物給藥方案中的變化。
本說明書中引用的所有出版物，包括但不局限于專利和專利申請都引入本發(fā)明以作參考，就象每一出版物都是具體和獨自指明引入全文以作參考。
據(jù)信，通過上文中描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最充分地應(yīng)用本發(fā)明。因此，下述實施例僅是為了舉例說明，并不是以任意方式對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1用鼠IL-18治療小鼠誘導(dǎo)了IFNγ和GM-CSF。
根據(jù)未感染小鼠的細胞因子信息傳遞的動力學(xué)和蛋白的誘導(dǎo)來評估鼠IL-18的活性。用10或100ug鼠IL-18對雌性Balb/C小鼠進行腹膜內(nèi)(IP)處理，在處理后的0、2.5、4或6小時時收集樣品。通過ELISA來評估處理2.5小時后收集的血清(n＝3)和單個脾組織的勻漿物(2ng/m1)中的TNF-α、IFN-γ和GM-CSF水平，與其活性對應(yīng)。檢測到了最小限度誘導(dǎo)的TNF-α(100pg/ml)，同時發(fā)現(xiàn)沒有誘導(dǎo)GM-CSF。與此形成對照，通過定量實時PCR反應(yīng)觀察到了GM-CSF、IFN-γ和TNF的mRNA誘導(dǎo)。在注射后2.5-6個小時，IFNγmRNA的誘導(dǎo)達到了載體的20倍(圖3)，GM-CSF的誘導(dǎo)為載體對照值的約6-10倍(沒有顯示)。這樣就證實了鼠IL-18誘導(dǎo)細胞因子的活性。
圖3表明了用溶于緩沖鹽水的不同量的鼠IL-18通過IP途徑給藥后小鼠中IFN-γ蛋白的誘導(dǎo)。利用ELISA試劑盒參照操作指導(dǎo)(R&D Systems)檢測了血清和脾組織勻漿中的蛋白水平。
圖4表明了用溶于緩沖鹽水的不同量的鼠IL-18通過IP途徑給藥后小鼠中IFN-γmRNA的誘導(dǎo)。從脾中提取出總RNA，使用實時PCR分析每份樣品的cDNA(使用Superscript，Life Technologies制備)中的持家基因GAPDH和IFN-γ(方法描述于R.J.Cohrs等，J.Virology，2000，2411464-11471)。
實施例2鼠I1-18保護小鼠免于致命的HSV-1攻擊幾項研究評估了在致命的全身性HSV感染模型中鼠IL-18的效果。在通過IP途徑感染HSV-1(SC-16)的-2小時、24小時和48小時時通過IP途徑給予鼠IL-18。在所有的研究中，僅用載體處理的動物沒有存活者，以10ug/鼠的IL-18處理后有40％的存活率(圖5)。在所有的研究中，IL-18處理導(dǎo)致死亡時間的滯后。在個別的研究中，兩個每日100ug/鼠劑量的IL-18得到70％的存活率(沒有顯示)。
圖5表明以IP途徑給予鼠IL-18后-2小時、1天和2天時給予致命劑量的HSV-1(SC-16)后，相對于對照，增加了小鼠的存活數(shù)。
實施例3IL-18改善流感誘導(dǎo)的致病性在鼠流感肺炎模型中，用IL-18處理臨床疾病能產(chǎn)生有益的效果。用一種亞致死量的適合于鼠的流感A/PR/8/34接種Balb/C小鼠鼻內(nèi)。如實施例2所述給予IL-18導(dǎo)致流感誘導(dǎo)的體重降低改善了(圖6)，用脈沖血氧計(圖7)和全身體積描計術(shù)測定肺功能也得到改善(Buxco Electronics，沒有給出)。
實施例4IL-18給藥后減少了HBV病毒的復(fù)制。
IL-18處理乙型肝炎病毒(HBV)轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致了病毒復(fù)制的劑量依賴性減少，表現(xiàn)為病毒DNA水平降低了(圖8)。對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Guidotti等，1995，J.Virol，696158-6169)進行連續(xù)三次每日劑量(第0、1、2天)的皮下注射，注射的是四種不同劑量(100、10、1和0.1微克)重組鼠IL-18，在第3天時通過Southern印跡分析肝臟中的HBV DNA。所有的IL-18劑量水平都產(chǎn)生了效應(yīng)，其中在最低劑量(0.1微克)時可見少許減少，而在較高劑量時減少得較多。
實施例5在黑猩猩和人類外周血單核細胞(PBMC)中IL-18與IL-2協(xié)同誘導(dǎo)IFN的生成。
分離黑猩猩或人類的PBMC并用對照培養(yǎng)基、100ng/ml的人IL-18或IL-18(100ng/ml)與3ng/ml IL-2的組合物處理。孵育24、48、72或96小時后冷凍析出上清液，通過ELISA分析媒介物水平。圖9和10中所示數(shù)據(jù)表明了人IL-18在黑猩猩PBMCs中產(chǎn)生了類似于在人PBMCs中的誘導(dǎo)細胞因子表達的動力學(xué)。而且IL-2和IL-18在誘導(dǎo)GM-CSF、IL-8、新蝶呤和IFN-γ(圖9和10)時具有協(xié)同作用。這些發(fā)現(xiàn)在多個黑猩猩和人供體中得到了證實。
圖9表明了人IL-18誘導(dǎo)的IL-8(14-倍)、新蝶呤(7-倍)、GM-CSF(100-倍)和IFN-γ(8-倍)。檢測處理后96小時時采集的樣品的最高蛋白水平，例外的是，IFN-γ是在24小時達到最高水平。用人IL-18和IL-2組合處理導(dǎo)致了顯著高的誘導(dǎo)。
圖10表明了上述發(fā)現(xiàn)在不同動物中的可重復(fù)性。在本研究中，單獨用IL-2進行的處理作為對照。IFN-γ顯示在圖10(a)中，新蝶呤顯示在圖10(b)中，IL-8顯示在圖10(c)中。
實施例6IL-18對HBV復(fù)制的抑制作用可用IL-12疊加或與之協(xié)同。
在與實施例4和圖8相似的研究中，IL-18與IL-12組合處理乙型肝炎病毒(HBV)轉(zhuǎn)基因小鼠，在減少病毒復(fù)制和病毒DNA轉(zhuǎn)錄方面比單獨使用任一種細胞因子的效果要好。在第0天用IL-18(10微克)和IL-12(1微克)一起皮下處理HBV轉(zhuǎn)基因小鼠一次后就能看到這種疊加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。當在第3天檢查這些小鼠的肝臟時，通過檢測病毒、對DNA進行Southem印跡(圖11)表明HBV的復(fù)制顯著減少了。而且，IL-18與IL-12的組合不僅減少了HBV DNA的產(chǎn)生而且顯著地減少了病毒RNA的產(chǎn)生，正如對這些相同肝臟樣品的Northern印跡的結(jié)果所示(圖11)。
序列表<110>克勞斯.M.埃瑟(Klaus M ESSER)馬丁.羅森伯格(Martin ROSENBERG)魯思.塔爾.辛格(Ruth TAL-SINGER)加里.伍德納森(Gary WOODNUTT)<120>用IL-18和IL-18組合物治療病毒性疾病的方法<130>P51144<140>unknown<141>2001-06-01<150>60/208,869<151>2000-06-02<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>157<212>PRT<213>人<400>1Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe lle Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>2<211>157<212>PRT<213>鼠<400>2Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met20 25 30Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile35 40 45Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser50 55 60Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile65 70 75 80Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser85 90 95Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu100 105 110Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu115 120 125Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp130 135 140Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser145 150 15權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物中由流感病毒、HIV、HSV、HPV、HAV、HBV或HCV所致疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括與全長SEQ ID NO1所示氨基酸序列至少有90％同一性的多肽。
2.一種治療哺乳動物中由流感病毒、HIV、HSV、HPV、HAV、HBV或HCV所致疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括與SEQ ID NO2所示全長氨基酸序列至少有90％同一性的多肽。
3.一種治療哺乳動物中由流感病毒、HIV、HSV、HPV、HAV、HBV或HCV所致疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1所述的多肽。
4.一種預(yù)防哺乳動物中由流感病毒HIV、HSV、HPV、HAV、HBV或HCV引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求2所述的多肽。
5.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種抗病毒劑。
6.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種免疫調(diào)節(jié)性細胞因子。
7.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種選自下組的制劑三啖唑核苷(ribavirin)、干擾素α或β、IL-2、IL-12、GM、CSF、TNF、拉米呋啶(lamivudine)、rebetron(三氮唑核苷和干擾素α)、cidofovir、acylovir、valacylovir、penciclovir、famciclovir、更昔洛韋或valganeciclovir。
8.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種來源于病毒蛋白或核苷酸序列的免疫原。
9.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種病毒疫苗。
10.一種治療由病毒引起的疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的組合物，其中所述組合物包括權(quán)利要求1或2所述的多肽和一種選自Havrix、Engerix B和Recombivax的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及使用含有IL－18也稱為干擾素－γ－誘導(dǎo)因子(IGIF)的組合物以及IL－18與其它制劑的組合物來預(yù)防和/或治療由HIV、HSV、HPV、HAV、HBV和HCV引起的病毒性疾病。
文檔編號A61P31/18GK1457258SQ01812880
公開日2003年11月19日 申請日期2001年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者克勞斯·M·埃瑟, 馬丁·羅森伯格, 魯思·塔爾－辛格, 加里·伍德納特, 弗朗西斯·V·奇薩里, 蘇珊·B·狄龍 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司