專利名稱：抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體其制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種具有抗體活性的卵黃抗體產(chǎn)品一抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體，并涉及其準(zhǔn)備工藝及在藥學(xué)上的應(yīng)用。
(二)、技術(shù)背景細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin)的主要成分是革蘭氏陰性菌(G-)細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(LPS)，它與宿主細(xì)胞相互作用，可表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性。從分子水平上看，該作用是通過內(nèi)毒素及其受體之間的特異性結(jié)合或者和細(xì)胞膜上的活性成分(如脂質(zhì)雙層)非特異結(jié)合來介導(dǎo)的。內(nèi)毒家與細(xì)胞膜結(jié)合之后，通過G蛋白的偶聯(lián)，完成信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，可導(dǎo)致宿主極其復(fù)雜的病理過程。
腸道為體內(nèi)最大的儲菌庫和內(nèi)毒素庫，當(dāng)各種原因?qū)е碌奈改c粘膜功能下降，腸粘膜通透性增加，細(xì)菌內(nèi)毒素可進入血循環(huán)，此時胃腸道已成為致病菌的貯源，內(nèi)毒素被認(rèn)為是膿毒癥休克病人死亡原因——失控性炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory responsesyndrome.SIRS)和代償行抗炎綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)的啟動子。
內(nèi)毒素是G-細(xì)菌感染時致病的主要毒力因素，腸黏膜屏障損害可造成內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素的作用包括(1)激活膜上腺苷酸環(huán)化酶，損傷溶酶體膜和線粒體膜，加重黏膜上皮細(xì)胞損害；(2)激活血管活性物質(zhì)，影響血管舒縮功能，引起腸道血液灌流不足，加重腸黏膜屏障功能損害；(3)激活補體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)及激肽系統(tǒng)，引起骨髓壞死及末梢血液中的細(xì)胞數(shù)量變化；(4)影響糖代謝過程；(5)激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，對內(nèi)毒素產(chǎn)生耐受性，激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體及干擾素，增強抗感染的非特異性免疫力以及誘生腫瘤壞死因子，使腫瘤細(xì)胞壞死引起發(fā)熱反應(yīng)，Shwartzman反應(yīng)、血小板減少等。內(nèi)毒素的生物活性，尤其在機體內(nèi)的表現(xiàn)錯綜復(fù)雜，各活性之間常相互聯(lián)系，相互促進或制約，在體內(nèi)或特定的體外條件下所表現(xiàn)的活性，有時為數(shù)種活性綜合作用的結(jié)果。
LPS是一種大分子復(fù)合物。結(jié)構(gòu)多樣，具有抗原性和毒素性質(zhì)，它是由O-特異性鏈、核心多糖和類脂A(LipidA)三部分組成。其中類脂A是LPS活性不可缺少的部分，可視作LPS的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存著LPS的各種生物學(xué)活性。
內(nèi)毒素的主要來源有1膿毒癥時血液中生長繁殖的細(xì)菌直接釋放。2在嚴(yán)重創(chuàng)傷，嚴(yán)重失血性休克，肝功衰竭，惡性腫瘤時內(nèi)毒素從腸道移位進入血液，而后者已成為血液內(nèi)毒素的主要來源。
內(nèi)毒素治療一直是人們關(guān)注的領(lǐng)域，目前目前國內(nèi)外主要采用防止內(nèi)毒素血癥的方法有①全身及腸道應(yīng)用大劑量抗生素抑制細(xì)菌的生長繁殖和殺死細(xì)菌，這雖然能阻止內(nèi)毒素的持久產(chǎn)生，但短期內(nèi)卻由于細(xì)菌被破壞而釋放出大量內(nèi)毒素入血，發(fā)生休克；②通過得到抗內(nèi)毒素抗體基因，再運用基因工程生產(chǎn)出了抗內(nèi)毒素抗體，但通過基因工程產(chǎn)生出的抗體不僅在量上遠(yuǎn)不能滿足臨床需要，而且基因工程抗體其抗內(nèi)毒素的活性遠(yuǎn)不如預(yù)期的高，且穩(wěn)定性差，離臨床應(yīng)用尚有一段距離；③通過在體內(nèi)細(xì)胞水平上特異地阻斷某個介質(zhì)級聯(lián)信號如(NF-KB)等從而防止介質(zhì)失控性產(chǎn)生以達到防治休克的目的，然而這對于一個復(fù)雜的介質(zhì)系統(tǒng)和免疫網(wǎng)絡(luò)而言確非易事，目前只處于基礎(chǔ)研究階段。
從理論上對于內(nèi)毒素這樣的毒素分子，應(yīng)用抗體治療是比較直接和有效的方法，這也在其它毒素引起的疾病治療中得到證實。因此如果能找到一種產(chǎn)量大，活性高，穩(wěn)定性好的抗內(nèi)毒素抗體直接口服，從腸道這一起始部位阻斷血液中內(nèi)毒素的來源，對于防止內(nèi)毒素移位和由此產(chǎn)生的休克與多器官衰竭將起到?jīng)Q定性作用。
雞卵黃抗體(IgY)是來自雞血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的結(jié)構(gòu)與IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。研究表明IgY具有高度的穩(wěn)定性，對熱、酸、堿環(huán)境中具有優(yōu)良的耐受性，同時IgY還具有成本低、易于形成規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點。目前國內(nèi)已有病毒、細(xì)菌等顆粒性抗原誘導(dǎo)雞卵黃表達特異性抗體的研究報告。
現(xiàn)有技術(shù)中未見有通過采用細(xì)菌內(nèi)毒素抗原，免疫健康母雞，收集其所產(chǎn)的卵，再從卵中提取抗-LPSIgY方法的報道。
(三)、發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種具有抗體活性的抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體(抗-LPSIgY)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供上述抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供上述抗細(xì)菌內(nèi)毒素卵黃抗體在制備用于因內(nèi)毒素感染而導(dǎo)致的相關(guān)疾病，如膿毒血癥、感染性休克等疾病的預(yù)防或治療的藥物制劑或保健品應(yīng)用，以及在制備用于內(nèi)毒素感染的臨床診斷或檢測的檢測試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題之一所提供的抗細(xì)菌內(nèi)毒素卵黃抗體即抗-LPSIgY，其特征在于所述抗-LPSIg按YSDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單—區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計進行雙波長測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題之二是通過采用這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的，即一種制備抗細(xì)菌內(nèi)毒素卵黃抗體的方法，其特征在于采用如下的步驟完成1、制備內(nèi)毒素抗原(1)制備J5大腸桿菌菌體抗原大腸桿菌J5株(大腸桿菌突變株，其LPS暴露于細(xì)胞外)，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
(2)制備內(nèi)毒素抗原大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36h，用滅菌生理鹽水洗下生長良好的菌苔，反復(fù)洗滌3次后用適量滅菌生理鹽水做成混懸液，放入-30℃冰箱及室溫中反復(fù)凍融5-6次后超聲波處理30min，按熱酚水法提取大腸桿菌內(nèi)毒素，用苯酚—氯仿—石油醚法(2∶5∶8，v/v)純化內(nèi)毒素精制品，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得內(nèi)毒素抗原。
(3)制備類脂A抗原大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)48h。收集菌體和培養(yǎng)上清，通過堿法抽提和親和層析分離得到類脂A，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得類脂A抗原。
2、將HP毒素抗原按以下的步驟制備抗體(1).對產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)。進行雞皮下多點注射，如五點，毒素蛋白量相當(dāng)于1010CFU/ml細(xì)菌所產(chǎn)生。以后每兩周加強免疫一次，共計免疫8次；于第一次免疫7天后開始收集雞蛋，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> (2).卵黃抗體的提?、?采用水溶法提取卵黃抗體。從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-LPSIgY。
或②采用膜過濾法提取卵黃抗體。分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-LPSIgY。
本發(fā)明所提供的上述抗-LPSIgY產(chǎn)品由細(xì)菌內(nèi)毒素免疫產(chǎn)卵母雞而得，具有特異性，對防治內(nèi)毒素感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病具有良好的效果。本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無毒，易于產(chǎn)業(yè)化。
(四)、附圖
的說明附圖給出了本發(fā)明制備方法的工藝流程圖。
實施例2大腸桿菌J5株(其細(xì)胞壁不完整，LPS暴露在外)，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
實施例3大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)48h。收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得內(nèi)毒素抗原。
實施例4大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)48h。收集菌體和培養(yǎng)上清，通過堿法抽提和親和層析分離得到類脂A，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得類脂A抗原。
實施例5采用如下方式分離提取抗-LPSIgY從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-LPSIgY。
實施例6分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-LPSIgY。
實施例7取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY純度檢查用PAGE電泳檢測純化的卵黃抗體的純度，電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶，即為提純的卵黃抗體。
實施例7取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY濃度檢查將提取的用PBS作5-10倍的稀釋，然后用紫外分光光度計進行測定以計算出蛋白濃度。
蛋白濃度(mg/ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)實施例8取實施例1、5、6中任何一種產(chǎn)品進行IgY效價測定采用奧氏雙擴散方法進行IgY效價測定，IgY效價為1∶640-1∶25600。
實施例9采集抗-LPSIgY免疫蛋50個，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-LPSIgY)8克。將異麥芽糖10克加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50ml超濾液混合均勻，冷凍干燥，無菌粉碎包裝成袋，每小袋內(nèi)含0.5克，用于治療因內(nèi)毒素感染引起的膿毒血癥。
實施例10采集抗-LPSIgY免疫蛋100個，得到1600ml蛋黃，加2倍PBS稀釋液，并加入3.5％PEG6000攪拌靜置2小時，離心得到清液3500ml，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細(xì)菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個普通膠囊裝200mg粗提抗-LPSIgY進行灌裝，所得產(chǎn)品用于預(yù)防內(nèi)毒素感染，人體服用方法每天2-3次，每次3粒膠囊。
實施例11抗-LPSIgY體外拮抗內(nèi)毒素生物活性實驗抗-LPSIgY(10ug～200ug/ml)與內(nèi)毒素(30～90ug/ml)在無菌條件下1∶1混合。37℃2h后，取0.1ml上清加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)IgY濃度在100～200ug/ml可完全阻斷內(nèi)毒素對Hela細(xì)胞的毒性作用，細(xì)胞LDH(乳酸脫氫酶)的活性不增加；其后的系列稀釋，其保護活性亦隨之減低，顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察亦獲得相同結(jié)果正常Hela細(xì)胞呈貼壁的多形性生長，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，且折光良好。HP毒素作用后，細(xì)胞球形變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)多顆粒，當(dāng)濃度＞50ug/ml時，Hela細(xì)胞多以裂解，殘余細(xì)胞體積明顯皺縮。拮抗毒素后，細(xì)胞的形態(tài)改變減輕。
實施例12抗-LPSIgY在體生物學(xué)活性觀察參照相關(guān)文獻建立嚙齒類動物內(nèi)毒素感染的模型，試驗分為治療組(低劑量(10mg/Kg)、中劑量(25mg/Kg)、高劑量(50mg/Kg)抗-HPTxIgY)，對照組；治療10、20、30天后，觀察動物的大體情況，血內(nèi)毒素水平，腸粘膜病理學(xué)檢查等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高劑量組在治療10天后，血內(nèi)毒素含量明顯下降，20天后動物的腸粘膜病理學(xué)檢查指標(biāo)有明顯改善，內(nèi)毒素含量降低。
實施例13抗-LPSIgY與抗生素聯(lián)合應(yīng)用生物學(xué)活性觀察參照相關(guān)文獻建立嚙齒類動物內(nèi)毒素感染的模型，試驗分為單純抗-LPSIgY治療組、單純抗生素(青、鏈霉素)治療組、聯(lián)合組。治療5、10、15天后，觀察動物的大體情況，血內(nèi)毒素水平，腸粘膜病理學(xué)檢查等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組較兩單純組在治療5天后，動物的腸粘膜病理學(xué)改善、腸粘膜內(nèi)毒素毒素含量和血內(nèi)毒素含量均有明顯下降；單純抗-LPSIgY治療組的腸粘膜內(nèi)毒素含量和血內(nèi)毒素含量均小于單純抗生素治療組。
權(quán)利要求
1.一種抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體(抗-LPSIgY)，其特征在于上述抗-LPSIgY按SDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計進行雙波長測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
2.一種制備抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體，即抗-LPSIgY的方法，其特征在于采用如下的工藝步驟(1)制備內(nèi)毒素抗原①制備J5大腸桿菌菌體抗原大腸桿菌J5株(其細(xì)胞壁不完整，LPS暴露在外)，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。②制備內(nèi)毒素抗原大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)48h。收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得內(nèi)毒素抗原。③制備類脂A抗原大腸桿菌J5株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)48h。收集菌體和培養(yǎng)上清，通過堿法抽提和親和層析分離得到類脂A，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得類脂A抗原。(2)再將所得的內(nèi)毒素抗原按以下的步驟制備抗體①.對產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)，進行雞皮下注射，使內(nèi)毒素量相當(dāng)于1010CFU/ml細(xì)菌所產(chǎn)生，以后每兩周加強免疫一次，共計免疫8次，4℃儲存?zhèn)溆?；?卵黃抗體的提取a.采用水溶法提取卵黃抗體；從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-LPSIgY；或b.采用膜過濾法提取卵黃抗體分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-LPSIgY。
3.抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體，即抗-LPSIgY在制備用于治療因內(nèi)毒素感染引起的相關(guān)疾病藥物或保健品中的應(yīng)用。
4.抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體，即抗-LPSIgY在制備用于檢測因內(nèi)毒素感染引起的相關(guān)疾病的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗體活性的抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體(抗－LPSIgY)、制備抗細(xì)菌內(nèi)毒素雞卵黃抗體的方法及抗－LPSIgY在制備用于治療因內(nèi)毒素感染引起的相關(guān)疾病藥物或保健品中和在制備用于檢測因內(nèi)毒素感染引起的相關(guān)疾病的制劑中的應(yīng)用。上述抗體經(jīng)IgY純度檢查用PAGE電泳檢測純化的卵黃抗體的純度，電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶；用紫外分光光度計進行測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD
文檔編號A61K39/395GK1473853SQ0212597
公開日2004年2月11日 申請日期2002年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月7日
發(fā)明者劉斯香 申請人:北京英萊特生物技術(shù)開發(fā)有限公司