專利名稱：增強(qiáng)的病毒介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)移的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)病毒提高細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，具體地說(shuō)，涉及用纖維結(jié)合素和/或纖維結(jié)合素片段來(lái)增強(qiáng)病毒介導(dǎo)的基因向細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法。
背景技術(shù)：
近來(lái)，隨著人們對(duì)許多人類(lèi)疾病分子基礎(chǔ)的了解以及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始嘗試建立對(duì)一些遺傳病的體基因療法(somatic genetherapy)方案。目前用基因療法有希望治愈的疾病有這樣一些在這些疾病中，一種酶或其他蛋白有缺陷或者丟失，而這些酶或蛋白的水平不需精確調(diào)節(jié)，尤其不需內(nèi)在的精確調(diào)節(jié)，而且那些酶或蛋白的缺陷是在患者骨髓中可發(fā)現(xiàn)的。
例如，一種可用基因療法來(lái)治療的疾病是腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥。這種病會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)免疫缺乏癥(SCID)。ADA缺乏的患者骨髓中有很少或沒(méi)有這種酶。然而，ADA缺乏已通過(guò)相配的骨髓移植得到治療。ADA正常的細(xì)胞對(duì)ADA缺乏的細(xì)胞有一種選擇優(yōu)勢(shì)，并且會(huì)再生出病人的骨髓。
骨髓細(xì)胞之所以是體基因療法的好的目標(biāo)，是因?yàn)楣撬杞M織易于體外操作并且包含可再生細(xì)胞。另外，人臍帶血中也包含大量的始祖細(xì)胞。把基因成功地轉(zhuǎn)入可長(zhǎng)期再生的造血干細(xì)胞中，這些細(xì)胞的后代的存在使得多種疾病得以終身治愈。
一些研究者已在鼠中將基因轉(zhuǎn)移至可再生干細(xì)胞中并在可再生干細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)。然而對(duì)于大型動(dòng)物，如狗和靈長(zhǎng)類(lèi)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還僅有極少的成功記錄。這很可能是由于初級(jí)造血干細(xì)胞的感染效率較低的緣故。當(dāng)應(yīng)用于人類(lèi)時(shí)，現(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的局限性就更加復(fù)雜了，這是由于以下因素的存在造成的成人骨髓(ABM)中干細(xì)胞較少；缺乏純化這些細(xì)胞的方法；并且這種原始細(xì)胞在細(xì)胞周期中所占的時(shí)間相對(duì)較少。
在鼠和大型動(dòng)物的骨髓細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，人們注意到，最成功的方案是把靶細(xì)胞與產(chǎn)生逆病毒的細(xì)胞系共同培養(yǎng)。另外，多數(shù)的FDA支持的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)依賴于重組的逆病毒載體來(lái)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于重組逆病毒載體轉(zhuǎn)移效率高并且可以精確而穩(wěn)定地把外源DNA整合到細(xì)胞DNA中，所以它成為基因療法很合適的載體。這些載體中包含所要轉(zhuǎn)移的外源DNA，并經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的修飾除去了病毒的病原性。由于這些修飾，病毒的產(chǎn)生就通過(guò)逆病毒包裝細(xì)胞而基本上完成了。然而，對(duì)于臨床基因療法，由于考慮到生物安全性和質(zhì)量控制，不依賴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)更為合適。不幸的是，如果不與產(chǎn)生病毒的細(xì)胞共同培養(yǎng)，一般很難把基因有效地轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞比如干細(xì)胞中。
最近，有人指出，在感染過(guò)程中，把靶細(xì)胞暴露于基質(zhì)細(xì)胞中，基因轉(zhuǎn)移效率會(huì)被提高?；|(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境(HM)的一種主要成分。HM由一種有組織的網(wǎng)絡(luò)組成，主要包括巨噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和一類(lèi)由多種特定粘附分子組成的復(fù)合胞外基質(zhì)(ECM)。一些ECM分子，如laminin，膠原，thrombospondin，蛋白多糖，葡糖胺多糖和纖維結(jié)合素，為造血細(xì)胞和生長(zhǎng)因子提供了錨定位點(diǎn)?；|(zhì)使逆病毒感染效率提高的機(jī)制還不清楚，但一段時(shí)間以來(lái)，人們已經(jīng)知道，當(dāng)造血細(xì)胞與HM的細(xì)胞直接接觸時(shí)，會(huì)對(duì)這些造血細(xì)胞增殖和分化有生理調(diào)節(jié)作用。
要把基因有效地轉(zhuǎn)入可長(zhǎng)期再生的造血干細(xì)胞及其他細(xì)胞之中還存在一些疑問(wèn)，這就使基因轉(zhuǎn)移法在對(duì)造血病或其他病的治療方面受到了限制。人們需要一種方法，它可以有效地把遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，并且不帶有過(guò)去方法所具有的危險(xiǎn)性和局限性。本發(fā)明中的方法滿足了這些需求。
發(fā)明概述簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種通過(guò)逆病毒載體來(lái)提高造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的方法。這種方法包括在可通過(guò)逆病毒來(lái)有效地提高細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的純的纖維結(jié)合素和/或纖維結(jié)合素片段存在的條件下，用一種缺乏復(fù)制能力的重組逆病毒載體來(lái)感染活的造血細(xì)胞。這些纖維結(jié)合素和/或纖維結(jié)合素片段可以從天然材料中獲得，或通過(guò)合成而得到(例如，用重組或化學(xué)合成基因工程技術(shù)進(jìn)行)，也可以通過(guò)天然與合成材料相結(jié)合而獲得。另外，應(yīng)該明白，本發(fā)明中所用的纖維結(jié)合素多肽可能包括對(duì)天然纖維結(jié)合素氨基酸序列的一些突變，從而為本發(fā)明提供了對(duì)提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有促進(jìn)作用的具有粘附的功能多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種制備被被轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞的方法。此方法包括用一種復(fù)制缺損型的帶有外源DNA的重組逆病毒來(lái)感染活的造血細(xì)胞。此方法中要有足夠的固定化的纖維結(jié)合素或其片段或者它們的固定化混合物，從而能夠有效地通過(guò)逆病毒來(lái)提高細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種細(xì)胞移植的改進(jìn)方法。這一方法包括從動(dòng)物供體中獲得活的造血細(xì)胞；在固定化的纖維結(jié)合素和/或它的片段存在并可有效地提高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的條件下，用重組的逆病毒載體感染造血細(xì)胞來(lái)制備被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活的造血細(xì)胞；并且把這種被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活的造血細(xì)胞作為細(xì)胞移植體導(dǎo)入到動(dòng)物受試者體內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選方式中，這些被感染的細(xì)胞能被導(dǎo)入到自身供體中。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種可獲得適合于細(xì)胞移植過(guò)程的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍帶血細(xì)胞的方法。這種方法包括在存在可通過(guò)逆病毒提高造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的有效固定化量的纖維結(jié)合素和/或纖維結(jié)合素片段的情況下，用復(fù)制缺損型的重組逆病毒載體來(lái)感染臍帶血中的造血細(xì)胞。本發(fā)明還包括用這種方法獲得的從臍帶血中得到的活的被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類(lèi)群；以及把被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)群作為移植體導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的移植方法。
根據(jù)上述各實(shí)施方案中更特殊的方面，所用的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段將包括提供了纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)逆病毒結(jié)合活性的第一氨基酸序列，也包括提供了纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)細(xì)胞結(jié)合活性的第二氨基酸序列。把纖維結(jié)合素的這兩個(gè)結(jié)合區(qū)同時(shí)使用被證明可以非常明顯地通過(guò)逆病毒提高靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種制備通過(guò)逆病毒載體來(lái)提高指定靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的構(gòu)建體的方法。本方法包括把靶細(xì)胞上結(jié)合的配體，與纖維結(jié)合素上提供了逆病毒結(jié)合活性的肝素II結(jié)合區(qū)序列的多肽共價(jià)偶聯(lián)的步驟。本發(fā)明還包括利用這些構(gòu)建體通過(guò)逆病毒來(lái)增加指定靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，以及用這些被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行移植的過(guò)程。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種定位多種病毒的方法。此方法包括，在足夠的固定化的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段存在下，溫育含有該病毒的培養(yǎng)基，其中纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段中具有肝素II結(jié)合區(qū)域的病毒結(jié)合活性，可用來(lái)定位多種病毒。
本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，它提供了被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活的造血細(xì)胞及含有基本上純的和/或固定化的纖維結(jié)合素或其片段的細(xì)胞培養(yǎng)物。同時(shí)還提供了逆病毒介導(dǎo)的DNA向細(xì)胞轉(zhuǎn)移的試劑盒。這將在后面進(jìn)一步說(shuō)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供利用逆病毒有效地感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用逆病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一些用于自體和/或異體細(xì)胞移植的改進(jìn)的移植方法和細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的這些及其他目的、優(yōu)點(diǎn)、特性經(jīng)過(guò)閱讀下面的說(shuō)明書(shū)之后，對(duì)那些熟悉本領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)將是非常明顯的。


圖1.給出了包括胰凝乳蛋白酶片段的纖維結(jié)合素分子的簡(jiǎn)圖。
圖2.顯示了存在纖維結(jié)合素片段時(shí)TKNEO載體使人的始祖細(xì)胞被感染的效率。在以后的實(shí)施例1中將進(jìn)一步描述。
圖3.比較了在纖維結(jié)合素片段存在時(shí)用TKNEO載體使各種人的造血始祖細(xì)胞被感染的效率。在以后的實(shí)施例1中將進(jìn)一步描述。
圖4.比較了用不同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)之后，hADA的存在情況。(i)泳道2-4用的是共同培養(yǎng)法，(ii)泳道5-7是在固定化的纖維結(jié)合素片段存在時(shí)的上清感染，(iii)泳道8～10是用BSA進(jìn)行的上清感染。這些將在以后的實(shí)施例7中詳細(xì)描述。hADA的對(duì)照實(shí)驗(yàn)分別為泳道1和12，鼠類(lèi)ADA的對(duì)照為泳道8。
圖5.表明結(jié)合在纖維結(jié)合素片段上的逆病毒，在以后的實(shí)施例8中將進(jìn)一步描述。
圖6.表明結(jié)合在纖維結(jié)合素片段上的逆病毒的劑量依賴性，在以后的實(shí)施例8中將進(jìn)一步描述。
圖7.給出了實(shí)施例9-11中所用的各種重組纖維結(jié)合素片段的簡(jiǎn)圖。
圖8.顯示了逆病毒與各種纖維結(jié)合素片段包括一些重組片段結(jié)合的情況。在以后的實(shí)施例9中將進(jìn)一步描述。
圖9.說(shuō)明了肝素阻礙逆病毒與纖維結(jié)合素片段結(jié)合的情況。在以后的實(shí)施例9中將進(jìn)一步描述。
圖10.顯示了鼠造血細(xì)胞在各種纖維結(jié)合素片段存在的條件下被逆病毒感染的效率。在后面的實(shí)施例10中進(jìn)一步說(shuō)明。
圖11.比較了用不同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)之后hADA的存在情況(i)共培養(yǎng)方法；(ii)用不同纖維結(jié)合素片段進(jìn)行上清感染；(iii)用BSA進(jìn)行上清感染。在以后的實(shí)施例11中將進(jìn)一步描述。
優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明為了進(jìn)一步加深對(duì)本發(fā)明原理的理解，這里對(duì)它的一些特定的實(shí)施方案作一定的解釋，并且用特定的語(yǔ)言來(lái)描述同一實(shí)施方案。不過(guò)還應(yīng)理解，此發(fā)明的范圍是沒(méi)有限制的。如把這里所述原理的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步的替換修飾，對(duì)于熟悉相關(guān)領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)是很容易的。
正如前面所指出的，本發(fā)明提供了用病毒，如逆病毒，來(lái)提高活細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法。本發(fā)明還提供了用重組逆病毒載體把基因有效地轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞中的方法，獲得被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的方法，以及得到的自體及其他細(xì)胞移植的方法和材料。
本發(fā)明的一個(gè)特征是發(fā)現(xiàn)了纖維結(jié)合素(FN)及包含F(xiàn)N CS-1細(xì)胞粘合區(qū)的纖維結(jié)合素片段可以明顯地提高逆病毒介導(dǎo)的基因向細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效率。例如，特定的前體及初級(jí)造血干細(xì)胞或長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LIC-IC)，帶有一個(gè)纖維結(jié)合素受治療者，因而表現(xiàn)出與纖維結(jié)合素及其片段相結(jié)合的能力。有利的是，這種效率提高使得不再需要與產(chǎn)生病毒的細(xì)胞共同培養(yǎng)。本發(fā)明的另外一些特征強(qiáng)調(diào)的是，位于肝素II結(jié)合區(qū)中的纖維結(jié)合素的病毒結(jié)合區(qū)的發(fā)現(xiàn)。這種病毒結(jié)合區(qū)可在多種應(yīng)用中用于定位病毒粒子。包括例如，用于把病毒釋放到靶細(xì)胞中的范圍很廣的構(gòu)建體。
與本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案相一致的重組病毒載體包含有外源DNA，并且是沒(méi)有病原性的，也就是復(fù)制缺損型的。這些載體有效地轉(zhuǎn)移外源DNA，并且精確而穩(wěn)定地把外源DNA整合到宿主細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA中。例如，在本發(fā)明中，包含我們感興趣序列的基因中一段堿基的核苷酸序列，可以在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子作用下被整合到重組的逆病毒載體中，這種啟動(dòng)子通常是外源的、可以啟動(dòng)該基因的啟動(dòng)子?？紤]到這一點(diǎn)，外源DNA可能包含天然或人工制備的DNA，也可能是從異源部分得到的異源DNA。這些DNA可能是天然的，也可能是化學(xué)合成的分子，它們已通過(guò)連接或本領(lǐng)域其他技術(shù)手段被連接起來(lái)。正象前面指出的，導(dǎo)入的核苷酸序列將處于啟動(dòng)子的控制之下，并一般位于啟動(dòng)子的下游。換一種說(shuō)法，就是啟動(dòng)子一般位于編碼序列的上游(即5’端)。由此可知，除了啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始密碼子之外，可能還有，也可能沒(méi)有其他調(diào)節(jié)因子(如增強(qiáng)子)來(lái)與它們配合，共同完成外源編碼序列的轉(zhuǎn)錄。另外，重組DNA中在引進(jìn)編碼序列的下游還應(yīng)優(yōu)先地包括一個(gè)終止序列。
包含外源DNA的逆病毒載體提供了一個(gè)選擇性標(biāo)記或其它可以利用的選擇優(yōu)勢(shì)。例如，這些載體可以包含一個(gè)或多個(gè)可抗多種選擇試劑的基因。選擇試劑包括一些抗生素，如新霉素。本發(fā)明使用的代表性載體包括N2/Zip TKNEO載體(TKNEO)(效價(jià)在NIH 3T3細(xì)胞上為1×105G418rcfu/ml)，ZipPGK-hADA載體，和ZipPGK-mADA載體。這些載體Moritz等人以前已經(jīng)報(bào)告過(guò)(1993)，醫(yī)學(xué)專家雜志178529。在TKNEO載體中，neo磷酸轉(zhuǎn)移酶序列通過(guò)皰疹單純胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子而進(jìn)行正向表達(dá)(相對(duì)于5’的長(zhǎng)末端重復(fù)LTR)。這一載體包含具有新霉素抗性的選擇性標(biāo)記基因，從而易于確定被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在ZipPGK-hADA載體中，人的ADA(hADA)cDNA經(jīng)過(guò)人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子作用而在相對(duì)于5’LTR的正方向上被表達(dá)。它只包含一個(gè)可表達(dá)的基因序列，而沒(méi)有明顯的選擇性標(biāo)記。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)載體與ZipPGK-hADA載體基本相同，只是由鼠的ADA取代了人的ADA cDNA。對(duì)于熟悉本發(fā)明領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)，這些和其他一些病毒載體及其制備技術(shù)將是很清楚的，并且本發(fā)明的應(yīng)用也是容易被掌握的。
本發(fā)明中使用的病毒載體表現(xiàn)出與纖維結(jié)合素，包括人的纖維結(jié)合素上的肝素II結(jié)合區(qū)中一個(gè)氨基酸序列相結(jié)合的能力。下面將會(huì)講到，雖然本發(fā)明不受任何理論的限制，但是人們相信，通過(guò)病毒與細(xì)胞上相應(yīng)的功能區(qū)相結(jié)合而同時(shí)定位病毒和靶細(xì)胞，會(huì)使由病毒介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有所提高?？紤]到這一點(diǎn)，病毒與肝素II結(jié)合區(qū)中氨基酸序列相結(jié)合的能力會(huì)使本發(fā)明得以有效地進(jìn)行，這些可用實(shí)施例8和實(shí)施例9中描述的常規(guī)方法進(jìn)行表征。一般地講，這些方法決定了病毒粒子與包含肝素II結(jié)合區(qū)的固定化多肽結(jié)合的程度，因此不會(huì)被從固定化的多肽基質(zhì)中洗掉。簡(jiǎn)單地，在一定程度上，包含病毒的上清可以培養(yǎng)在一個(gè)包含帶有纖維結(jié)合素的肝素結(jié)合區(qū)的固定化多肽的小孔中。然后用生理鹽水沖洗小孔，之后把此病毒的靶細(xì)胞培養(yǎng)在此小孔中，用來(lái)確定小孔中保留下來(lái)的感染活性。相對(duì)于初始病毒上清，感染活性或效價(jià)的減低得到評(píng)價(jià)并且與類(lèi)似的對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比較(例如用BSA涂覆的小孔)，與對(duì)照孔相比，包含肝素II結(jié)合區(qū)的小孔保留了相當(dāng)高的效價(jià)，證明了病毒很適合于本發(fā)明的要求，為了簡(jiǎn)化這一篩選過(guò)程，病毒載體可以帶有一個(gè)選擇性的標(biāo)記，這在前面已提到過(guò)。
本發(fā)明中使用的纖維結(jié)合素的片段可以是天然的或合成的，并且可以從天然材料中制備到較純的樣品，例如Ruoslahti等人(1981)已經(jīng)描述過(guò)，生物化學(xué)雜志2567277；Patel和Lodish(1986)細(xì)胞生物學(xué)雜志102449；Bernardi等人(1987)細(xì)胞生物學(xué)雜志105489?？紤]到這一點(diǎn)，相當(dāng)純的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段的存在可能意味著它們基本上不受與天然纖維結(jié)合素同時(shí)產(chǎn)生的其他蛋白的影響。本發(fā)明中所使用的基本上純的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段也可以通過(guò)重組細(xì)胞產(chǎn)生。例如Taguchi等人在1993年3月30日發(fā)表的美國(guó)專利No.5,198,423號(hào)上就描述了這樣的方法，此專利已轉(zhuǎn)讓給日本東京的Takara Shuzo有限公司。值得注意的是，在這個(gè)’423號(hào)專利中描述了與下面實(shí)施例子中H-271，H-296，CH-271，CH-296和C-CS1相一致的重組片段，這個(gè)專利中還描述了得到這些片段的方法。下面實(shí)施例子中使用的C274片段可用美國(guó)專利No.5,102,988中描述的方法來(lái)獲得。這些片段或那些可以通過(guò)常規(guī)方法而得到的片段可以在日本工業(yè)科學(xué)技術(shù)發(fā)酵研究院中通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌獲得，如FERM P-10721(H-295)，F(xiàn)ERM BP-2799(C-277通過(guò)蛋氨酸連接到H-296)和FERM BP-2264(H-271)，在美國(guó)專利No.5,198,423中也有所描述。另外，關(guān)于在這里使用的纖維結(jié)合素片段和這種片段起始材料的一些信息可以在Kimizuka等人的論文中找到J.Biochem.110，25，4936-4961(1986)，他們的論文報(bào)告了人的纖維結(jié)合素的肝素II結(jié)合區(qū)域的情況。同時(shí)，具有CS-1細(xì)胞粘附區(qū)和肝素II結(jié)合區(qū)的纖維結(jié)合素片段，被發(fā)現(xiàn)能有效地提高本工作中基因向造血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移效率，因此在本發(fā)明中被優(yōu)選地使用。這類(lèi)片段包括大約一種30kd或35kd的片段(30/35FN)和下面的實(shí)施例子中將要介紹的多種重組片段。這樣就可以明白，廣義地說(shuō)，與纖維結(jié)合素相關(guān)的多肽或本發(fā)明中所用的多肽將提供一個(gè)具有FN的CS-1細(xì)胞結(jié)合區(qū)細(xì)胞結(jié)合活性的氨基酸序列，同時(shí)也能提供一個(gè)能與病毒結(jié)合的FN上肝素II結(jié)合區(qū)氨基酸序列。熟悉本領(lǐng)域的人將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這里所需的細(xì)胞和病毒的結(jié)合活性一方面可以由天然的這些FN區(qū)域的氨基酸序列提供，另一方面也可以由那些在序列上與天然序列有所不同，但很相似的，可以表現(xiàn)出細(xì)胞結(jié)合及病毒結(jié)合活性的片段來(lái)提供。這些相似的氨基酸序列與天然序列基本同源，并且可能包括那些被刪除、被取代、被修飾了部分氨基酸，但仍提供了細(xì)胞結(jié)合或病毒結(jié)合特性所需的氨基酸序列的序列。
考慮到這一點(diǎn)，有關(guān)的生物技術(shù)人員已進(jìn)一步闡述了可用常規(guī)方法對(duì)主要功能區(qū)氨基酸的刪除、取代、增加或其他修飾。這樣，所得到的氨基酸序列可以通過(guò)常規(guī)篩選得到所需的細(xì)胞結(jié)合或病毒結(jié)合活性。例如，纖維結(jié)合素肝素II結(jié)合區(qū)的突變或修飾形式，就可以用上面一般性討論中所提到的方法篩選，更詳細(xì)的方法將在后面的實(shí)施例8和實(shí)施例9中討論，用病毒培養(yǎng)、洗滌、病毒效價(jià)分析來(lái)確定與對(duì)照相比保留下來(lái)的感染情況。按本文提供的精神，對(duì)工作于本領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)，這些結(jié)合僅代表的是一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞結(jié)合修飾或突變了的纖維結(jié)合素CS-1細(xì)胞結(jié)合區(qū)，或者結(jié)合其他細(xì)胞結(jié)合多肽，可能可以通過(guò)傳統(tǒng)的步驟進(jìn)行分析。例如，自然352438-441頁(yè)中所描述的步驟即可用于此分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，把細(xì)胞結(jié)合多肽涂在塑料小碟上，把要分析的細(xì)胞類(lèi)群涂布于其上，放置30分鐘至2小時(shí)，之后，把沒(méi)有與蛋白結(jié)合的細(xì)胞取出，計(jì)數(shù)，并且測(cè)試活性。與多肽結(jié)合的細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶或細(xì)胞解離緩沖液(如Gibco)作用而回收，計(jì)數(shù)并測(cè)試活性。在某些情況下，如對(duì)于造血集落形成細(xì)胞，這些細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12到14天直至證明這些細(xì)胞確實(shí)具有形成集落的特性。然后計(jì)算粘附細(xì)胞的比例并且與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可用涂于塑料碟上的牛血清白蛋白(BSA)。靶細(xì)胞基本上與所分析的多肽能夠結(jié)合，這說(shuō)明這種多肽與細(xì)胞的結(jié)合是適合于本發(fā)明的，而且這種多肽還可以被結(jié)合于纖維結(jié)合素的逆病毒結(jié)合片段之上，以生成本發(fā)明的構(gòu)建體來(lái)通過(guò)病毒載體有效地提高靶細(xì)胞的感染率。
依照本發(fā)明更特殊的一些方面，用于通過(guò)逆病毒來(lái)提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率這一過(guò)程中的病毒結(jié)合多肽將包括(i)與人纖維結(jié)合素肝素II結(jié)合區(qū)的Ala1690-Thr1960相對(duì)應(yīng)的第一氨基酸序列，此序列如下(Seq.I.D.#1)Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr SerLeu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg ValArg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu AlaPro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys TyrGlu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala GlnGly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg ValThr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr GluThr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr ProIle Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu GlnPro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala ArgSer Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser AsnLeu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln ProPro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev ProPro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu LysAsn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；或者與上述序列充分相似而且具有與逆病毒結(jié)合能力的氨基酸序列；(ii)與人纖維結(jié)合素III CS結(jié)合區(qū)的一部分(CS-1細(xì)胞結(jié)合區(qū))相對(duì)應(yīng)的第二氨基酸序列，此序列如下(Seq.I.D.#2)Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His GlyPro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr；或者與上述序列充分相似而且具有造血細(xì)胞結(jié)合能力的氨基酸序列。造血細(xì)胞可以是始祖細(xì)胞和/或長(zhǎng)期再生(干)細(xì)胞。
正如前面提到的，可以理解，所得氨基酸序列與天然序列充分相似而且表現(xiàn)出與病毒結(jié)合的能力(在肝素II結(jié)合區(qū)的情況)和與靶細(xì)胞結(jié)合能力(在CS-1區(qū)的情況)。在此情況下本發(fā)明應(yīng)用中對(duì)天然序列進(jìn)行修飾和誘變是完全可能的。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種體基因療法，此療法包括體外細(xì)胞療法和隨后的靶細(xì)胞向宿主的移植，也就是把被轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞“移植”到宿主中。造血細(xì)胞或其他細(xì)胞可以從人體或其他哺乳動(dòng)物中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法而獲得。例如，造血細(xì)胞可以從人的骨髓或外周血中或者胎兒的臍帶血中獲得。一旦得到，造血細(xì)胞就可以在干細(xì)胞和/或始祖細(xì)胞中用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)處理，擴(kuò)增。這樣造血細(xì)胞就可以培養(yǎng)了，例如可在組織培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)?？蛇x地，在這一階段中非粘附性、低密度、單核的細(xì)胞可以在逆病毒感染之前被預(yù)刺激。這里使用的和本領(lǐng)域中所用的“預(yù)刺激”指的是在暴露于逆病毒之前把細(xì)胞暴露在生長(zhǎng)刺激因子之中的過(guò)程。這種預(yù)刺激被證明對(duì)逆病毒介導(dǎo)的造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有促進(jìn)作用。
在預(yù)刺激之后，收集細(xì)胞并把它們與纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段一起培養(yǎng)，這里的FN片段是可以提高逆病毒介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的片段。優(yōu)選地，細(xì)胞是與純的和/或不溶的如被固定化的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段一起培養(yǎng)的。然后，可以用重組病毒感染這些細(xì)胞，此重組病毒包含有例如修復(fù)細(xì)胞中酶或其他蛋白缺乏或異常的基因。感染時(shí)存在足夠的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段使得逆病毒介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率被有效地提高。之后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞可內(nèi)源地引入到動(dòng)物細(xì)胞移植受治療者中。移植時(shí)優(yōu)選受治療者是自體供體，當(dāng)然也包括異體移植。后者，尤其是使用臍帶血細(xì)胞作移植體的情況將在后面討論。
本發(fā)明的方法可以用于基因標(biāo)記或多種疾病的基因療法。這些疾病包括骨髓病，如癌癥，白血病，蛋白缺失或異常。還可用于修飾細(xì)胞的療法，從而提高對(duì)其他療法，如化學(xué)療法的耐受性，用本發(fā)明治療的代表性疾病包括ADA缺乏癥，如ADA缺乏SCID，幼兒急性骨髓白血病(AML)、神經(jīng)分裂癥，和成人AML及淋巴白血癥。
本發(fā)明的一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于細(xì)胞移植的細(xì)胞是從人臍帶血中得到的。這樣，人臍帶血就可以被獲得并在活的造血祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞中擴(kuò)增富集，例如，通過(guò)獲得一種非粘附性、低密度、單核的細(xì)胞類(lèi)群而達(dá)到富集的目的。這一類(lèi)群緊接著被選擇預(yù)刺激，并在存在逆病毒和固定化或純的纖維結(jié)合素或其片段的條件下培養(yǎng)，從而提高載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率?？紤]到這一點(diǎn)，人們發(fā)現(xiàn)，在纖維結(jié)合素或其片段存在時(shí)，即使纖維結(jié)合素并不構(gòu)成臍帶因ECM的一部分，即使所用的臍帶血原始祖細(xì)胞和干細(xì)胞與骨髓中的并不相同，臍帶血中原始祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率仍然被大幅度提高了。特別指出的是，臍帶血中的干細(xì)胞被表征為CD34+，HLA-DR+；而骨髓中的干細(xì)胞被表征為CD34+，HLA-DR-。申請(qǐng)者這一發(fā)現(xiàn)，即在纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段存在下臍帶血中的原始祖細(xì)胞可被高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)象，使得人們能夠使用一種方便并且富含干細(xì)胞的造血細(xì)胞源。另外，用于富集原始祖細(xì)胞和干細(xì)胞的臍帶血通過(guò)異體移植而成功移植到無(wú)數(shù)病人體內(nèi)的事實(shí)，使得臍帶血成為造血細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)選的源泉。請(qǐng)參考科利-庫(kù)瑪爾等，Brit.Heaematol.85419-422(1993)；布魯科思梅爾等，血細(xì)胞17313-329(1991)；格魯克曼等，Br.J.Heaematol.45557(1980)；海德?tīng)柋pringer-Verlag pp.60-68(1989)；瓦格納等，血液791874-1881(1992)，瓦格納等，血液82-86a(摘要)如果需要，收獲的被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或其他細(xì)胞可以再測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)。例如，本發(fā)明提供的方法使逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率明顯提高，將在下面的特定實(shí)施例子中進(jìn)行闡述。其中就描述了一些測(cè)定方法，用于說(shuō)明在纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段存在下，逆病毒介導(dǎo)的感染和基因轉(zhuǎn)移的高效率。尤其指出，用PGK-hADA逆病毒感染的鼠造血細(xì)胞表達(dá)了很高水平的轉(zhuǎn)移來(lái)的ADA cDNA。類(lèi)似地，用單個(gè)PGK-mADA病毒感染的人前體克隆比內(nèi)源人ADA蛋白多表達(dá)了10倍以上。因此，為了嚴(yán)格地分析轉(zhuǎn)移效率，只有當(dāng)轉(zhuǎn)移的mADA表達(dá)量等于或高于內(nèi)源人的ADA水平時(shí)，才認(rèn)為前體克隆被轉(zhuǎn)導(dǎo)了。TKNEO載體的新霉素的高效表達(dá)可通過(guò)對(duì)G418藥物的抗性來(lái)檢測(cè)的，這可用來(lái)分析neo磷轉(zhuǎn)移酶(新霉素基因的產(chǎn)物)活性。
正如前面指出的那樣，本發(fā)明中的方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要與產(chǎn)生逆病毒的細(xì)胞共同培養(yǎng)。這樣，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以在沒(méi)有其他細(xì)胞而只有靶細(xì)胞的情況下完成，靶細(xì)胞可以是造血細(xì)胞或其他類(lèi)型細(xì)胞。例如，包含逆病毒載體質(zhì)粒的生產(chǎn)者細(xì)胞可以被培養(yǎng)并且從上清中收集到這種載體質(zhì)粒。然后包含逆病毒的上清可用來(lái)感染造血細(xì)胞。感染過(guò)程中有纖維結(jié)合素和/或纖維結(jié)合素片段存在，并且它們是優(yōu)選地處于固定化狀態(tài)的，例如涂在要進(jìn)行感染的基物之上或與感染用的介質(zhì)相接觸。這樣，任何制備高效價(jià)游離逆病毒的細(xì)胞都被認(rèn)為適用于本發(fā)明。這些細(xì)胞包括包裝細(xì)胞，如Psi-2，C2，PA 12，PA317和GptenvAM 12，和許多本領(lǐng)域中的其它包裝細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的其他一些性質(zhì)，與纖維結(jié)合素肝素II結(jié)合區(qū)上氨基酸相結(jié)合的病毒可以用于構(gòu)建多種類(lèi)型細(xì)胞病毒療法的構(gòu)建體。至此，一種帶有纖維結(jié)合素逆病毒結(jié)合區(qū)的多肽，可以與具有這種靶細(xì)胞構(gòu)建專一性的任何配體進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。這種方法將不再象以前那樣，需要對(duì)每一種靶細(xì)胞構(gòu)建一個(gè)特定的逆病毒生產(chǎn)者細(xì)胞系(Kasahara，N.A.MDozy，和Y.W.Kan.，科學(xué)，266卷，1373-1376頁(yè)(1994)，Valsesia-Wittmann，S.，A.Drynda，G.Deleage，M.Aumailley，J.M.Heard，O.Danos，G.Verdier，和F.L.Cosset，病毒學(xué)雜志，68卷，4609-4619頁(yè)(1994))。靶向構(gòu)建體的專一性可以通過(guò)使用不同的配基來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些配基包括1)細(xì)胞粘連蛋白，2)激素或細(xì)胞因子，3)靶細(xì)胞的單抗隆抗體，4)與靶細(xì)胞結(jié)合的碳水化合物(G.Ashwell等，生物化學(xué)研究年鑒，51卷，531-554頁(yè)(1982))，5)靶細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物，或者6)與靶細(xì)胞結(jié)合的功能多肽。這種基因傳遞構(gòu)建體的效率可以通過(guò)加入一些肝素II病毒結(jié)合區(qū)來(lái)改善，從而可以增加傳遞到靶細(xì)胞上病毒粒子的數(shù)目。例如，美國(guó)專利第5,198,423號(hào)中描述的與Pro1239-Ser1515片段相對(duì)應(yīng)的人類(lèi)纖維結(jié)合素細(xì)胞結(jié)合區(qū)，已被證明可以與包括BHK和B16-F10細(xì)胞在內(nèi)的幾種細(xì)胞相結(jié)合(Kimizuka等人，生物化學(xué)雜志110卷，285-291頁(yè)(1991))。另外，肝素II區(qū)本身也具有與纖維結(jié)合素，內(nèi)皮細(xì)胞及癌細(xì)胞結(jié)合的能力。這些多肽序列可以被偶聯(lián)到纖維結(jié)合素的逆病毒結(jié)合區(qū)上，從而用來(lái)定靶于將要用逆病毒感染的靶細(xì)胞。
造血系統(tǒng)的典型應(yīng)用還包括促紅細(xì)胞生成素構(gòu)建體或G-CSF與纖維結(jié)合素的逆病毒結(jié)合區(qū)偶聯(lián)，從而高度特異地分辨并分別定靶于類(lèi)紅細(xì)胞或粒狀前體細(xì)胞。本發(fā)明的另外一個(gè)常見(jiàn)的應(yīng)用將使逆病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)與專一或主要結(jié)合在惡性細(xì)胞上的配體相聯(lián)系。例如，已有人報(bào)道，在體外，甚至體內(nèi)，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)因?yàn)槭褂昧艘恍┙Y(jié)合在靶細(xì)胞受治療者上的物質(zhì)而受到影響。這些物質(zhì)包括促黃體生成素釋放的衍生物，(Emons，G.等人，人類(lèi)繁殖91364-1379，(1994))，雌激素(Tolcher，A.W.，Oncol，839-43(1994))，或抗雌激素(Howell，A.等，Lancet 34529-30(1995))，孕激素或抗孕激素(Klijn，F(xiàn).G.等，人類(lèi)繁殖，9 Suppl.1181-189(1994)；Griffiths，K.等人，Semin.Oncol.21672-687(1994))。這些物質(zhì)在本發(fā)明中充當(dāng)了包含一個(gè)或多個(gè)纖維結(jié)合素病毒結(jié)合區(qū)的構(gòu)建體中的配體。進(jìn)一步舉例說(shuō)明，甲狀腺(癌)細(xì)胞可以用帶有基質(zhì)的構(gòu)建物來(lái)高度特異地定靶，肝(癌)細(xì)胞可以用含有HDL或HDL的一部分的構(gòu)建物來(lái)定靶。最后，單克隆抗體的構(gòu)建物和纖維結(jié)合素逆病毒結(jié)合區(qū)將可以定靶單克隆抗體所適合的任何細(xì)胞和器官。這樣，通過(guò)利用纖維結(jié)合素逆病毒結(jié)合區(qū)結(jié)合并定位病毒載體的能力，很大范圍類(lèi)型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞都可以成為靶細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含了制備可用來(lái)制備靶細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的構(gòu)建體。纖維結(jié)合素肝素II結(jié)合區(qū)上的病毒結(jié)合氨基酸序列是被偶聯(lián)在與靶細(xì)胞相連的配體上的。正象上面討論的，配體可以包括纖維結(jié)合素或其他蛋白上的一段多肽(包括細(xì)胞粘連蛋白，如層蛋白，膠原蛋白，vitronectin，osteopontin或thrombospondin)，一種激素，一種代謝物，一種抗體(包括單克隆抗體)，或任何一種具有專一地與靶細(xì)胞相結(jié)合能力的其他配體。所得到的總的構(gòu)建物可以象纖維結(jié)合素那樣，以被固定化的形式來(lái)應(yīng)用，這將在以后的實(shí)施例中專門(mén)描述。
正象前面所述，這樣的構(gòu)建體和細(xì)胞定靶方法可以應(yīng)用在體外，考慮到構(gòu)建體的穩(wěn)定性和專一性及在生理?xiàng)l件下逆病毒構(gòu)建物的相互作用等因素，這種構(gòu)建體也可用于逆病毒的體內(nèi)定靶。通過(guò)修飾傳遞系統(tǒng)來(lái)定位構(gòu)建體向靶細(xì)胞的傳遞還可以進(jìn)一步提高特異性。例如，通過(guò)疏張門(mén)靜脈來(lái)定靶肝細(xì)胞。
使用為本發(fā)明的實(shí)用方法專門(mén)設(shè)計(jì)的試劑盒會(huì)使進(jìn)行逆病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移變得更為方便。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一些試劑盒，其中包括大量基本上純的多肽或可增強(qiáng)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的構(gòu)建體，和作為逆病毒感染基質(zhì)的人造基質(zhì)。多肽或其他構(gòu)建物可以分別提供或涂在人造基質(zhì)上。在人造血細(xì)胞的感染時(shí)，試劑盒中還包括用于細(xì)胞預(yù)刺激的造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子。另外，試劑盒中可包括上面討論過(guò)的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組逆病毒載體。一般地說(shuō)，試劑盒應(yīng)包括無(wú)菌包裝，從而保證試劑盒中各種成分在空間上分離，防止在使用試劑盒時(shí)成分被破壞。例如，在實(shí)踐中，常用帶多個(gè)分室或分區(qū)的密封塑料盒來(lái)分離試劑盒中的各種成分。
為了進(jìn)一步加深對(duì)本發(fā)明的理解和認(rèn)同，我們給出了以下實(shí)施例。應(yīng)該明白，這些實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的例證，實(shí)際上，本發(fā)明并不局限于此。
實(shí)施例1用TKNEO把基因轉(zhuǎn)移到骨髓細(xì)胞中1.1病毒上清的制備包含逆病毒質(zhì)粒TKNEO載體的GP+EnvAM 12生產(chǎn)者細(xì)胞(參閱Markowitz等人(1988)病毒學(xué)167400)培養(yǎng)在Iscove的改進(jìn)的Dulbeccos培養(yǎng)基(IMDM，Gibco公司，蓋斯伯里，MD)中。這種培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清(FCS，Hyclone公司，羅甘，UT)和100單位/毫升的青霉素及100毫克/毫升的鏈霉素(P/S，Gibco公司)包含病毒的上清通過(guò)加入10毫升含20％FCS的IMDM濃縮過(guò)夜而獲得。收集到的介質(zhì)通過(guò)0.45微米濾膜(Gelman科學(xué)，Ann Arbor，MI)過(guò)濾之后保存在-80℃冰箱中待用。
1.2纖維結(jié)合素片段的制備FN是利用Ruoslahti等人在酶學(xué)方法，82803-831(1982)中所描述的方法從人血漿(生命源，Glenview，IL)中純化的，只是在用4N脲洗脫之前，用1M脲來(lái)洗這個(gè)明膠瓊脂糖柱。純化了的FN在4℃，10mM3-(環(huán)己胺)-1-丙基-磺酸(CAPS)，150mM NaCl，2mM CaCl2pH 11.0的溶液中進(jìn)一步水解，并分裝保存在-80℃冰箱中。FN的胰凝蛋白酶細(xì)胞結(jié)合區(qū)(CBD)(CS-1)和肝素II結(jié)合片段用前面的方法進(jìn)行純化(Ruoslahti等人，(1982)，如上，Patel和Lodish，細(xì)胞生物學(xué)雜志102，449-456頁(yè)(1986)，以及Bernardi等人.，細(xì)胞生物學(xué)雜志105，489-498頁(yè)(1987)。三個(gè)主要的肝素結(jié)合片段(30kD，35kD和42kD)從肝素瓊脂糖層析柱的1M NaCl洗脫成分中得到。為進(jìn)一步純化這些肝素結(jié)合片段，這些1M NaCl洗脫成分在4℃10mM Tris-HCl pH 7.0溶液中水解過(guò)夜，并通過(guò)預(yù)先用10mM Tris-HCl pH 7.0平衡了的陽(yáng)離子交換柱(2ml DEAE Sepharose快流(Pharmacia精細(xì)化學(xué)，Uppsala，瑞典)/毫克蛋白)，30/35kD片段在沒(méi)結(jié)合的流份中被收集，而42kD片段則用10mM NaCl洗脫下來(lái)。從500mg FN中，大約可得到26mg的30/35kD片段和4mg 42kD片段。通過(guò)Wester印跡技術(shù)測(cè)定可知是42kD片段，而不30/35kD片段可被抗fibrin結(jié)合區(qū)的抗體所識(shí)別。同樣，42kD片段可以結(jié)合在fibrin-sepharose親和層析柱上。
為了用于感染方案中，纖維結(jié)合素片段被固定于35或100mm的培養(yǎng)皿中(Falcon公司，林肯公園，NJ)，濃度和Patel，Lodish所述一樣為75pmol/cm2，(1986)，如上。對(duì)照皿中以相似的方式涂上2％(不含F(xiàn)N)的牛血清清蛋白(BSA，伯寧漢姆，Mannheim，德國(guó))。
1.3逆病毒感染方法從健康成人中取來(lái)的骨髓樣品被收集在含無(wú)菌，無(wú)防腐劑的硫酸鈉肝素的試管中。這一方法是依據(jù)印第安那大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)認(rèn)可的方法來(lái)進(jìn)行的。在Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)離心機(jī)上，25℃離心45分鐘，制備出低密度的單核的細(xì)胞。通過(guò)在含2％FCS的IMDM組織培養(yǎng)皿上進(jìn)一步培養(yǎng)4-16小時(shí)除去低密度骨髓細(xì)胞中的塑料粘連細(xì)胞。培養(yǎng)溫度為37℃，在5％CO2環(huán)境中。
正象以前Luskey等人描述的那樣，非粘附性、低密度、單核的細(xì)胞在37℃下含5％CO2的IMDM的培養(yǎng)皿中，在用逆病毒感染之前，首先預(yù)刺激48小時(shí)。這種IMDM培養(yǎng)基含有20％FCS，100U/ml rhIL-6，100ng/ml rhSCF(Amgen，Thousomdoaks，CA)，和細(xì)胞密度為1×10細(xì)胞/ml的P/S。被預(yù)刺激了的細(xì)胞通過(guò)充分的吹洗除去與塑料結(jié)合不緊密的細(xì)胞。
預(yù)刺激了的細(xì)胞(5×105個(gè)細(xì)胞/ml)在涂有BSA(對(duì)照)或纖維結(jié)合素或其片段的平板上培養(yǎng)6小時(shí)(這些蛋白或多肽經(jīng)UV放射性檢測(cè)，已很好地粘附在塑料平板上)，然后，在生長(zhǎng)因子(如上)和7.5毫克/ml多(Aldrich化學(xué)公司，Milwankee，WI)存在下，用病毒上清進(jìn)行感染。兩小時(shí)后，除去病毒上清(包括生長(zhǎng)因子和5.0毫克/ml溴化己二甲銨)，并繼續(xù)培養(yǎng)12到24小時(shí)。每次交換介質(zhì)時(shí)都重新加入非粘的細(xì)胞。
感染步驟之后，非粘附細(xì)胞被棄掉，而粘附的造血細(xì)胞按照廠家的說(shuō)明用細(xì)胞裂解液(CDB)(以無(wú)酶/PBS為基礎(chǔ)，Gibco)從培養(yǎng)物中收集得到。粘附細(xì)胞中加入非粘附部分，洗兩次然后計(jì)數(shù)。收集到的細(xì)胞或接種在克隆化甲基纖維素前體化驗(yàn)平板上，或接種在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物的平板上。
1.4長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)LTC-IC(人干細(xì)胞)分析是按前面描述的方法進(jìn)行的，僅做了輕微的改動(dòng)，Sutherland等人，血液741563(1989)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，0.5-1×106被感染了的細(xì)胞被接種在含濃縮的被預(yù)照射的(如上)異源人骨髓成纖維細(xì)胞的5ml IMDM六個(gè)組織培養(yǎng)平板上的長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物(LTMC)中。IMDM含有10％FCS，10％馬血清(Sigma)和P/S，1×10-5M的氫化可的松(Upjohn，Kalamazoo，MI)和320毫mol NaCl(Costar，劍橋，MA)。LTMC被培養(yǎng)在33℃，5％CO2的條件下，并且每星期除去50％的介質(zhì)和非粘附細(xì)胞。五周后，LTC-IC培養(yǎng)物用CDB除去以從BMF中除去粘附細(xì)胞。非粘附和粘附細(xì)胞都結(jié)合并鋪在甲基纖維素平板上，從而從LTC-IC中獲得克隆。
1.5克隆化甲基纖維素分析甲基纖維素分析基本上按Toksoz等人在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，Vol.89，p7350(1992)中描述的方法進(jìn)行，只是做了輕微的改動(dòng)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，2-5×104個(gè)被感染的成骨髓細(xì)胞與5單位/ml促紅細(xì)胞生成素(Epo，Amgen)，100ng/ml rhSCF，10ng/ml rhIL-3(Genzyme，劍橋，MA)一起鋪在1ml 2.4％IMDM甲基纖維素平板上(Fluka，Ronkonkoma，NY)。這種平板含25％FCS，10％人血漿，10-5Mβ-巰基乙醇(Sigma)和P/S，培養(yǎng)物在37℃含5％CO2，95％空氣中培養(yǎng)，并用反相顯微鏡在第13天時(shí)觀察記錄克隆的情況，如CFU-GM(包含粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)CFU(包含類(lèi)骨髓細(xì)胞和類(lèi)紅細(xì)胞成分)，或BFU-E(只包含類(lèi)紅細(xì)胞成分)。
1.6逆病毒感染的分析用TKNEO病毒進(jìn)行感染的效率可通過(guò)測(cè)定在13天時(shí)甲基纖維素克隆在1.5mg/ml(干粉，Gibco)G418存在下的存活百分比來(lái)分析。模擬感染在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都通過(guò)不生產(chǎn)重組病毒的GP+EnvAM 12包裝系培養(yǎng)骨髓來(lái)進(jìn)行，這些模擬感染細(xì)胞培養(yǎng)物在用G418存在時(shí)顯示出低于1％的本底克隆。
1.7定型祖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率通過(guò)以感染鋪在30/35FN-或涂有BSA平板上的骨髓細(xì)胞為對(duì)照來(lái)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在感染后，未經(jīng)選擇前，在這些條件下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)目有什么區(qū)別。圖2說(shuō)明了感染后G418r克隆的百分比。在所有類(lèi)型的祖細(xì)胞中，30/35FN上得到了更高比例的G418r克隆。其中包括那些從單譜系(BFU-E和CFU-GM)和多譜系(CFU-Mix)祖細(xì)胞中得到的克隆。對(duì)BSA相比，在30/35FN上，所有定型祖細(xì)胞被感染數(shù)提高了九倍。
1.8長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率基因向LTC-IC的轉(zhuǎn)移用TKNEO載體來(lái)估計(jì)，向LTC-IC進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移得到的克隆僅在30/35FN上的感染之后才進(jìn)行檢測(cè)(30/35FN與BSA相比，分別為16％G418r和0％G418r克隆)。
1.9 30/35FN的專一性對(duì)造血細(xì)胞感染效率的影響為了確定在30/35FN上，提高基因轉(zhuǎn)移效率的專一性，在分別涂有BSA、30/35FN、天然纖維結(jié)合素、一種包含帶有RGDS四肽序列的中央細(xì)胞結(jié)合區(qū)(CBD)的115kD FN片段，一個(gè)42kd帶有肝素II結(jié)合區(qū)而無(wú)CS-1序列(圖1)的FN片段(42FN)，的平板上，用TKNEO進(jìn)行感染。在BSA上的感染產(chǎn)生3±1％的G418rBFU-E，1±1％的G418rCFU-GM和0±0％G418rCFU-MIX。在CBD上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)G418r克隆比例有明顯提高，而在42FN上BFU-E的感染有少量增加(6.0±-1％)。然而，天然的FN可以提高所有定型祖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。在所有譜系中，天然FN上感染后的G418r克隆比例都低于在30/35FN上的感染。包括BFU-E(16±-2對(duì)24±4％)，CFU-GM(5±2對(duì)20±4％)和CFU-MIX(6±1對(duì)9±1％)，以上是天然FN和30/35FN的比較，前者為天然FN，后者為30/35FN。
實(shí)施例2用PGK-mADA對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移2.1一般步驟用實(shí)施例1中制備TKNEO的方法來(lái)制備PGK-mADA病毒上清。纖維結(jié)合素的胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)用實(shí)施例1中介紹的方法進(jìn)行制備，之后按實(shí)施例1中的方法進(jìn)行逆病毒感染。LTC-IC(人類(lèi)干細(xì)胞)分析和甲基纖維素分析也按照實(shí)施例1進(jìn)行。
2.2逆病毒感染的分析用PGK-mADA進(jìn)行感染的效率可通過(guò)使用ADA同功酶電泳的蛋白分析來(lái)測(cè)定。對(duì)各種單個(gè)祖細(xì)胞克隆的分析可按以前Moritz(1993)和Lim等人(1989)在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，Vol.86，p8892中描述的方法進(jìn)行。為了精確分析轉(zhuǎn)移效率，只有當(dāng)克隆所表達(dá)的mADA與內(nèi)源人類(lèi)ADA水平相同或更高時(shí)，才認(rèn)為進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了分析收集到的克隆，把從甲基纖維素培養(yǎng)物中挑出的克隆放入1.5ml微量試管中，用溫的介質(zhì)和磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，離心后保存在-20℃冰箱中。為進(jìn)行ADA分析，在5μl裂解緩沖液中反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，同功酶電泳用前面介紹的方法進(jìn)行。
2.3定型祖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率把骨髓細(xì)胞接種在分別涂有30/35FN和BSA的平皿上進(jìn)行感染，來(lái)比較轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在未選擇時(shí)感染后得到的克隆數(shù)在這些條件之間沒(méi)什么區(qū)別。如表1所示，與在BSA上相比，在30/35FN上的所有定型祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯地提高。正如用高效價(jià)(～1×107病毒/ml)載體來(lái)預(yù)測(cè)的那樣，定型祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率非常高。根據(jù)表1，在兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中，用PGK-mADA在30/35FN上對(duì)骨髓進(jìn)行感染，幾乎100％的定型祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。
表1在纖維結(jié)合素30/35片段上用PGK-mADA載體對(duì)定型祖細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。

*mADA表達(dá)克隆的數(shù)目/所分析的總克隆數(shù)2.4基因向長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率在用PGK-mADA進(jìn)行的四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，5周齡的LTMC(即TLC-IC產(chǎn)生的克隆)中得到的祖細(xì)胞克隆中有很大比例都表達(dá)了轉(zhuǎn)移來(lái)的鼠ADA基因。所分析克隆的表達(dá)范圍為2/12(17％)到6/6(100％)(表2)在所有考慮到的陽(yáng)性克隆中，引入mADA基因的表達(dá)超過(guò)了或至少等于人內(nèi)源ADA的活性。PGK-mADA的感染效率高于TKNEO的效率。如表2所示，在兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中，用PGK-mADA在30/35FN對(duì)骨髓進(jìn)行感染幾乎100％的定型祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。
表2PGK-mADA載體對(duì)人長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的感染效率

*mADA陽(yáng)性克隆數(shù)/所分析的總克隆數(shù)N/A未分析。
2.5 30/35FN對(duì)造血細(xì)胞感染效率影響的專一性在30/35FN上基因向LTC-IC轉(zhuǎn)移的效率被提高了。由于再次得到的LTC-IC克隆相對(duì)較小，所以，用單個(gè)克隆進(jìn)行蛋白分析受到限制。在BSA，天然FN和42FN上感染后，分別得到了0/6，0/4，和0/3的LTC-IC獲得克隆，而用30/35FN感染時(shí)得到的LTC-IC獲得克隆3/5表達(dá)了mADA，說(shuō)明了鼠ADA的表達(dá)。另外，多種LTC-IC獲得克隆在分析前被均分后，進(jìn)行另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，感染之后在30/35FN上發(fā)現(xiàn)mADA表達(dá)，在天然FN上表達(dá)量要少一些，而在42FN或BSA上，沒(méi)有mADA被表達(dá)。
實(shí)施例3用PGK-hADA對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移3.1一般步驟用實(shí)施例1中制備TKNEO的方法來(lái)制備PGK-hADA病毒上清。纖維結(jié)合素的胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)用實(shí)施例1中介紹的方法進(jìn)行制備。之后按實(shí)施例1中的方法進(jìn)行逆病毒感染。LTC-IC分析和甲基纖維素分析也按照實(shí)施例1進(jìn)行。
3.2逆病毒感染的分析為了分析收集到的克隆，把從甲基纖維素培養(yǎng)物中挑出的克隆放入1.5ml微量試管中，用溫暖的介質(zhì)和PBS沖洗，離心后保存在-20℃冰箱中。為了進(jìn)行ADA分析，在5ml裂解緩沖液中反復(fù)凍融，裂解細(xì)胞，用前面介紹的方法進(jìn)行同功酶電泳。
實(shí)施例4用TKNEO對(duì)臍帶血細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移4.1一般步驟用前面實(shí)施例1中介紹的方法制備TKNEO病毒上清和胰凝乳蛋白酶原片段。實(shí)施例1中逆病毒感染過(guò)程基本上原樣進(jìn)行，只是不再用骨髓細(xì)胞，而代之以收集在試管中的，含有肝素的，正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據(jù)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)認(rèn)可的方法制備的LTC-IC(人干細(xì)胞)分析，甲基纖維素分析也按照實(shí)施例1進(jìn)行。
4.2向定型祖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的效率在三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中，與BSA相比，F(xiàn)N30/35上的感染要高四倍以上。(表3)表3用30/35FN片段和TKNEO載體對(duì)臍帶血祖細(xì)胞進(jìn)行感染的效率

實(shí)施例5用PGK-mADA對(duì)臍帶血細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移5.1一般步驟用前面實(shí)施例1中描述的方法制備PGK-mADA和胰凝乳蛋白酶原片段。實(shí)施例1中逆病毒感染過(guò)程基本上原樣進(jìn)行，只是不再用骨髓細(xì)胞，而代之以收集在試管中的正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據(jù)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)認(rèn)可的方法制備的。LTC-IC分析和甲基纖維素分析按實(shí)施例1進(jìn)行。
5.2基因向長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率利用高效價(jià)的PGK-mADA載體，分析LTC-IC獲得克隆，表明僅在FN30/35上用上清感染的臍帶血培養(yǎng)物高水平表達(dá)了引入的mADAcDNA，而在BSA對(duì)照平板上，LTC-IC獲得克隆中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到mADA的表達(dá)。
實(shí)施例4和實(shí)施例5的結(jié)果表明當(dāng)使用臍帶血祖細(xì)胞和干細(xì)胞時(shí)，用FN30/35也可以提高它們的感染效率。
實(shí)施例6用PGK-hADA向臍帶血細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移用實(shí)施例1中的方法制備PGK-hADA病毒和胰凝乳蛋白酶原片段(圖1)。實(shí)施例1中逆病毒感染過(guò)程基本上原樣進(jìn)行，只是不再用骨髓細(xì)胞，而代之以收集在試管中的正常足月新生兒的臍帶血。這種臍帶血是根據(jù)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)認(rèn)可的方法制備的。LTC-IC分析和甲基纖維素分析按實(shí)施例1進(jìn)行。
實(shí)施例7-11逆病毒載體和生產(chǎn)者細(xì)胞系關(guān)于實(shí)施例7-11在實(shí)施例7-11中使用了兩種逆病毒制備包裝細(xì)胞系分別是ecotropic GP+E86(Markowitz，D.，S.Goff，和A.Bank，病毒學(xué)雜志，62卷，1120-1124頁(yè)(1988))和amphotropic GP+envAM 12細(xì)胞系(Markowitz，D.，S.Goff，和A.Bank，病毒學(xué)，卷167，400-406頁(yè)(1988))。研究中所用的逆病毒載體和生產(chǎn)者克隆列于下列表4中表4

所有細(xì)胞系都在杜氏改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DME，Gibco公司，GrandIsland，紐約)中培養(yǎng)，除了EAL2a細(xì)胞是在含有10％FCS和P/S的DME-F12(Gibco)中生長(zhǎng)。DME培養(yǎng)基中包含10％的胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)和100單位/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。通過(guò)加入10ml鼠細(xì)胞α最低量基本培養(yǎng)基(αMEM，Gibco)或人細(xì)胞的Iscove’sDulbecco培養(yǎng)基(IMDM，Gibco)在10cm平板上濃縮過(guò)夜來(lái)收集包含病毒的上清。這兩種培養(yǎng)基中都含有10％的FCS和P/S。收集到的培養(yǎng)基質(zhì)通過(guò)0.45微米濾膜(Gelman科學(xué)，Ann Arbor，MI)來(lái)過(guò)濾。
實(shí)施例7初級(jí)鼠造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)7.1實(shí)驗(yàn)為了用鼠細(xì)胞來(lái)研究，在注射了150mg/kg 5-氟尿嘧啶兩天后，從6至8周齡C3H/HeJ小鼠股骨或脛骨中提取骨髓(Solopack實(shí)驗(yàn)室，福蘭克林公園，IL)(Lim，B.，J.F.Apperley，S.H.Orkin，和D.A.Williams，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86卷，8892-8896頁(yè)(1989))。在含有20％FCS和P/S及100ng/ml的重組干細(xì)胞因子，100單位/ml重組人白介素-6(rhIL-6；Pepro技術(shù)公司，洛克西爾，NJ)的IMDM培養(yǎng)基中，把濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞預(yù)刺激48小時(shí)(Luskey，B.D.，M.Rosenblant，K.Zsebo和D.A.Williams，血液，80卷，396-402頁(yè)(1992))。然后，用三種不同的方法比較EPHA-5細(xì)胞制備的PGK-hADA載體的基因轉(zhuǎn)移效率。這三種方法是1)上清感；2)用上清在FN 30/35上感染；3)與EPHA-5生產(chǎn)者細(xì)胞共同培養(yǎng)。這樣，在室溫下，把溶于磷酸鹽緩沖液中的FN 30/35以2.5μg/cm2(相當(dāng)于75pmol)的密度涂在10mm的細(xì)菌平皿中，開(kāi)蓋在紫外燈下照射1小時(shí)，蓋上蓋再照射1小時(shí)，用2％的小牛血清清蛋白在室溫下封閉30分鐘之后，用補(bǔ)充了25％(v/v)1M Hepes的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco)洗滌一次。對(duì)于上清感染，平皿只涂上BSA。5×106個(gè)預(yù)刺激了的供體細(xì)胞與10ml從EPHA-5細(xì)胞中用上述方法得到的病毒上清一起培養(yǎng)，其中加入100U/ml的rhIL-6，100ng/ml的hrSCF和7.5μg/ml的溴化己二甲銨。非粘附細(xì)胞被收集起來(lái)并與新鮮的病毒上清一起加入。對(duì)于共同培養(yǎng)，4ml培養(yǎng)基中的EPHA-5細(xì)胞與10μg/ml的絲裂霉素C一起培養(yǎng)2小時(shí)，沖洗，用胰蛋白酶消化并接種在100mm的含10ml αMEM/20％FCS和P/S的組織培養(yǎng)基上，接種濃度為3×106個(gè)細(xì)胞。第二天，5×106個(gè)預(yù)刺激了的骨髓細(xì)胞和100U/ml rhIL-6，100ng/ml rrSCF及4μg/ml的溴化己二甲銨一起加入到培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。在感染之后，扔掉非粘附細(xì)胞并用細(xì)胞解離緩沖液按廠家的指導(dǎo)從培養(yǎng)物中收集粘附造血細(xì)胞。這些粘附細(xì)胞加入到非粘附組分中，沖洗兩次，并懸浮在大約1ml的HBSS/Hepes溶液中。把從5×106預(yù)刺激了的細(xì)胞獲得了全部細(xì)胞從尾靜脈注射到三只被全身致死性照射過(guò)的小鼠體內(nèi)(用700+400cGy，137Cs-放射源照射)(Luskey，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo，和D.A.Williams，血液，80卷，396-402頁(yè)(1992))。造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況通過(guò)測(cè)定恢復(fù)健康的小鼠體內(nèi)引入的人ADA cDNA的表達(dá)來(lái)分析。這種ADA同功酶分析是在移植小鼠體內(nèi)通過(guò)用乙酸纖維素原位酶分析法檢測(cè)外周血細(xì)胞中hADA蛋白的存在來(lái)完成的(Lim，B.，D.A.Williams，和S.H.Orkin，分子細(xì)胞生物學(xué)，7卷，3459-3465頁(yè)(1987))。檢測(cè)從移植四個(gè)月后開(kāi)始，以后每月重復(fù)一次。
7.2結(jié)果用基因操作造血干細(xì)胞來(lái)完成的小鼠長(zhǎng)期骨髓的重新恢復(fù)已被廣泛接受，并被認(rèn)為可以充分確定移植四個(gè)月后干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。在7個(gè)月后，用同功酶分析法對(duì)受治療者轉(zhuǎn)入的骨髓進(jìn)行分析表明1)無(wú)論是用共同培養(yǎng)還是在FN 30/35上培養(yǎng)，人ADA cDNA都進(jìn)行了表達(dá)，而在無(wú)FN 30/35的感染之后，被移植的小鼠體內(nèi)沒(méi)有人ADA cDNA表達(dá)。2)在共同培養(yǎng)和FN 30/35培養(yǎng)后的移植小鼠體內(nèi)，ADA表達(dá)水平是可以進(jìn)行比較的。如圖4中泳道2-4所示，移植了用與EPHA-5共培養(yǎng)而轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓的三只小鼠顯示出很明顯的人的ADA帶，在三只移植了用FN 30/35上清感染而產(chǎn)生的造血細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，也有類(lèi)似水平的人ADA的表達(dá)(圖4，泳道5-7)。相反地，在移植了在BSA上轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的三只小鼠體內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人的ADA(圖4，泳道8-10)。圖4中泳道1和12作為對(duì)照定位了人的ADA，泳道11定位了鼠ADA。在泳道2-10中的鼠ADA帶表明上樣量是相同的。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明用FN30/35上的上清感染來(lái)對(duì)長(zhǎng)期重建造血干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)是與共同培養(yǎng)法等效的，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)地優(yōu)用沒(méi)有FN 30/35的上清感染。
實(shí)施例8用逆病毒載體結(jié)合到FN 30/35上來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制8.1實(shí)驗(yàn)為了測(cè)定增加轉(zhuǎn)導(dǎo)是否是同時(shí)定位病毒和造血細(xì)胞的結(jié)果，我們分析了重組逆病毒粒子是否是結(jié)合在FN 30/35上。這樣，把涂有FN 30/35的平板用含有TKNEO病毒的上清預(yù)先培養(yǎng)30分鐘，然后，分別沖洗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用NIH/3T3細(xì)胞測(cè)定上清的病毒效價(jià)(Markowitz，D.，S.Goff和A.Bank，病毒學(xué)雜志，62，pp 1120-1124(1988))。簡(jiǎn)單地說(shuō)，3T3細(xì)胞以1000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度被接種在6孔組織培養(yǎng)平板上并生長(zhǎng)過(guò)夜。一系列病毒上清稀釋液與7.5μg/ml溴化己二甲銨一起加入到每個(gè)孔之中，37℃下培養(yǎng)2.5小時(shí)之后再加入2ml培養(yǎng)基。24小時(shí)之后用含有G418(0.75mg/ml干粉，Gibco)的培養(yǎng)基取代原培養(yǎng)基。把這些平板培育10-12天。10-12天之后，把具有G418抗性的克隆(G418r)染色并計(jì)數(shù)。每孔中的克隆數(shù)與病毒上清稀釋倍數(shù)的乘積即作為每毫升上清的感染數(shù)(cfu)。我們估計(jì)(“定效價(jià)”)了用病毒上清預(yù)培養(yǎng)之后留在涂有FN 30/35或BSA的35mm平板上的逆病毒粒子數(shù)，并在每個(gè)平皿中加入1000個(gè)NIH/3T3細(xì)胞和溴化己二甲銨。24小時(shí)后，向培養(yǎng)物中加入含0.75mg/ml G418(干粉)的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)10-12天。在此之后，通過(guò)測(cè)出具G418抗性的克隆數(shù)來(lái)定量存在的粘附病毒。
為了了解病毒與FN 30/35的結(jié)合是否與劑量有關(guān)，增加涂在平皿上的FN 30/35的濃度，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。因此，在35mm細(xì)菌培養(yǎng)皿上分別涂上1、4、10和20μg/cm2的FN 30/35，如上所述。把一種預(yù)先測(cè)了效價(jià)的TKNEO病毒樣品以1∶50的稀釋倍數(shù)加到涂有FN 30/35的平板上，培養(yǎng)30分鐘。其中稀釋后病毒樣品效價(jià)為1×104感染粒子/mL。在充分沖洗之后，向每個(gè)孔中加入2000個(gè)NIH/3T3細(xì)胞。象上面介紹的那樣進(jìn)行挑選，挑選后培養(yǎng)10天，對(duì)具有G418抗性的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。
8.2結(jié)果圖5給出了三個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。利用TKNEO上清，用NIH/3T3細(xì)胞的G418r克隆數(shù)測(cè)出的逆病毒效價(jià)，在涂有BSA的平板上降低了三個(gè)量級(jí)以上(從4×103到0)，而在涂有30/35FN的平板上效價(jià)的減少僅為1個(gè)量級(jí)。這些結(jié)果表明逆病毒與FN 30/35定量地結(jié)合而不與涂有BSA的平板(對(duì)照平板)結(jié)合。圖6顯示了，當(dāng)含有病毒的上清培養(yǎng)在涂有濃度不斷增加的FN 30/35的平板上時(shí)，檢測(cè)到具有G418抗性的克隆數(shù)也增加的情況。因此病毒與FN 30/35結(jié)合是依賴于劑量的。
實(shí)施例9病毒與重組纖維結(jié)合素片段的結(jié)合9.1實(shí)驗(yàn)Kimizuka等人曾經(jīng)報(bào)告了克隆的FN DNA序列在大腸桿菌中的表達(dá)(Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，Y.Odate.Y.Kawase，T.Shimojo，D.Hashino.I.Kato，K.Sekiguchi，和K.Titani，生物化學(xué)雜志，110卷，284-291頁(yè)(1991))?？寺〉暮颓逗系亩嚯闹泻欣w維結(jié)合素中參與細(xì)胞粘連的一個(gè)或多個(gè)重要的序列，(包括RGDS，CS-1和肝素結(jié)合位點(diǎn))，參閱圖7。為了分析逆病毒是否能和這些重組FN片段相結(jié)合，在涂有各種重組片段的平板上反復(fù)進(jìn)行3T3細(xì)胞克隆形成測(cè)試，測(cè)試中使用了冰凍的，效價(jià)為1×104cfu/ml逆病毒樣品的兩種不同稀釋液(稀釋倍數(shù)分別為1∶10和1∶100)。而所測(cè)試的重組片段包括C-274，H-271，H-296，CH-271，CH-296和C-CS1以及做為陽(yáng)性對(duì)照的FN 30/35。FN片段的濃度為120-130pmol/ml(相當(dāng)于4μg/cm2的C-274，H-271，H-296，C-CS1，F(xiàn)N 30/35和8μg/cm2的CH-271和CH-296)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，涂平板，加入病毒，充分沖洗平板，加入NIH/3T3細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，最后把產(chǎn)生的克隆進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)。
9.2結(jié)果圖8指出在片段H-271，H-296，CH-271和CH-296中，G418抗性克隆的數(shù)目有所增加(因此有病毒被粘連)。另外，雖然在本實(shí)驗(yàn)中CH-271顯示出與病毒結(jié)合的最高水平，但總的來(lái)說(shuō)，這幾種片段與病毒結(jié)合的數(shù)目是與FN 30/35基本相同的。這5種FN片段的共同點(diǎn)是具有包含高親和性肝素結(jié)合位點(diǎn)的第III類(lèi)型重復(fù)序列12-14(Ruoslahti，E.，生物化學(xué)研究年鑒，57卷，375-413頁(yè)(1988)，Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，T.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani，生物化學(xué)雜志，110卷，284-291頁(yè)(1991))，可能位于重復(fù)序列13(Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，Y.Ohdat，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani，生物化學(xué)雜志，110卷，284-291頁(yè)(1991))。這指出病毒的結(jié)合是通過(guò)這些已知的位點(diǎn)進(jìn)行的。通過(guò)下列實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)。在涂有4μg/cm2的CH-271的平板上，用不同濃度(10-1000μg/ml)的肝素硫酸鹽來(lái)預(yù)培養(yǎng)。肝素硫酸鹽是可以抑制細(xì)胞與肝素結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的一種帶有強(qiáng)電荷的分子。如在圖9中所看到的那樣，在用不斷上升濃度的肝素硫酸鹽預(yù)培養(yǎng)以后，具有G418抗性的克隆減少了。這些數(shù)據(jù)表明，病毒與FN相結(jié)合是通過(guò)位于與FN的C-末端區(qū)CS-1位點(diǎn)相鄰的高親和性肝素結(jié)合位點(diǎn)參與而完成的。
實(shí)施例10在重組纖維結(jié)合素片段上轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞10.1實(shí)驗(yàn)為了分析前面介紹的FN 30/35對(duì)造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增強(qiáng)效應(yīng)是否會(huì)在重組FN片段上發(fā)生，我們利用高繁殖力潛在克隆形成細(xì)胞(HPP-CFC)法在體外測(cè)定了上清感染的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過(guò)使用EAL2a載體，我們以G418抗性克隆生長(zhǎng)狀況作為基因轉(zhuǎn)移的指示劑，比較了在BSA上，各種重組FN片段和FN 30/35上清感染對(duì)造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。另外，我們比較了與粘連在FN片段上的病毒粒子(與上清病毒)轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的能力。在35mm涂有FN片段的培養(yǎng)皿上1-2ml EAL2a包含病毒的上清中，用生長(zhǎng)因子和5μg/ml的溴化己二甲銨培養(yǎng)0.5-1×106預(yù)刺激了的骨髓細(xì)胞。為了用病毒與FN的結(jié)合來(lái)測(cè)定造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，用含病毒上清培育的涂有FN的35mm培養(yǎng)皿被沖洗三次，每次用2mlPBS。然后，向0.5-1×106被預(yù)刺激了的骨髓細(xì)胞中加入補(bǔ)充了生長(zhǎng)因子和溴化己二甲銨的2ml培養(yǎng)基。22小時(shí)以后，收獲細(xì)胞然后在有和沒(méi)有1.5mg/ml G418的條件下，進(jìn)行HPP-CFC分析(Bradley，T.R.和D.Metcalf，澳大利亞實(shí)驗(yàn)生物醫(yī)學(xué)雜志，44卷，287-293頁(yè)(1966))。培養(yǎng)物在33℃，7％CO2中培養(yǎng)14天，然后用G418抗性克隆的比例來(lái)計(jì)算基因的轉(zhuǎn)移效率。
10.2結(jié)果對(duì)于所有片段，通過(guò)上清感染的初級(jí)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖10)明顯地高于在BSA上進(jìn)行的上清感染。這里所述片段都包含肝素結(jié)合位點(diǎn)(HBS)和至少一個(gè)更活躍的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)(粗條)。重組片段CH-271，H-296，CH-296和C-CS1的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與FN 30/35的作用相似。所有這三個(gè)片段都同時(shí)具有肝素結(jié)合位點(diǎn)和CS-1位點(diǎn)。在所有的其他情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)都明顯地減弱。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，前面提到的在FN 30/35上初級(jí)造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)被增強(qiáng)的現(xiàn)象，在重組FN片段上也可以再現(xiàn)。這還進(jìn)一步說(shuō)明，病毒直接與FN相結(jié)合能夠造成造血細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。最后，還證明了CS-1和肝素結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)存在對(duì)初級(jí)造血前體(干)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用。
實(shí)施例11用在重組FN片段上鼠供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行的小鼠長(zhǎng)期骨髓重建11.1實(shí)驗(yàn)我們重復(fù)一下上述在體外對(duì)初級(jí)造血祖細(xì)胞的研究(實(shí)施例10)，如比較用骨髓移植比較在BSA、FN 30/35、重組FN片段以及共培養(yǎng)時(shí)上清感染，來(lái)分析對(duì)造血干細(xì)胞恢復(fù)的影響。簡(jiǎn)單地說(shuō)，被致命照射了的小鼠被注入供體細(xì)胞，這種供體細(xì)胞已被含有人ADA cDNA的EPHA-5載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。一個(gè)月后，通過(guò)外周血ADA同功酶分析來(lái)分析基因轉(zhuǎn)移的效率。
11.2結(jié)果圖11清楚地顯示了同時(shí)含有肝素結(jié)合位點(diǎn)和CS-1位點(diǎn)的纖維結(jié)合素片段H-296產(chǎn)生了與FN 30/35及共培養(yǎng)相似的結(jié)果。不同時(shí)含有這些位點(diǎn)的片段在轉(zhuǎn)導(dǎo)可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出較低的效率。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，結(jié)合在重組FN片段上的初級(jí)造血/干細(xì)胞和逆病毒的同時(shí)定位使可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞有效地被轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中重組FN片段中同時(shí)含有CS-1和肝素結(jié)合位點(diǎn)。
雖然在前面的描述中，本發(fā)明已被詳細(xì)地說(shuō)明和描述，但同樣應(yīng)認(rèn)為這些僅是作為例證或說(shuō)明，而不是嚴(yán)格的限定。應(yīng)該明白，這里僅描述了優(yōu)選的實(shí)施方案。因而，根據(jù)本發(fā)明的精神而進(jìn)行的所有改變和修飾都要求受到保護(hù)。
這里引用的所有文獻(xiàn)都被作為整體引入本文，就象它們是單獨(dú)地被引入和完整地列出一樣。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)復(fù)制缺陷型重組逆病毒載體提高活的造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的方法，此方法包括在存在纖維結(jié)合素片段的條件下，用復(fù)制缺陷型重組逆病毒載體來(lái)感染活的造血細(xì)胞，從而通過(guò)復(fù)制缺陷型逆病毒載體提高活的造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
2.權(quán)利要求1的方法，其中造血細(xì)胞中有一種蛋白缺失或異常，并且逆病毒載體包含編碼該蛋白的外源基因。
3.權(quán)利要求2的方法，其中外源基因是編碼腺苷脫氨酶的基因。
4.權(quán)利要求3的方法，其中外源基因是編碼人類(lèi)腺苷脫氨酶的基因。
5.權(quán)利要求1的方法，其中造血細(xì)胞包含人類(lèi)干細(xì)胞。
6.一種制備轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞的方法，其包括在存在纖維結(jié)合素片段的條件下用復(fù)制缺陷型重組逆病毒載體感染活的造血細(xì)胞，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
7.權(quán)利要求6的方法，其包括收獲轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6的方法，其中造血細(xì)胞中有一種蛋白缺失或異常，并且逆病毒載體中包含編碼此蛋白的外源基因。
9.權(quán)利要求8的方法，其中外源基因是編碼腺苷脫氨酶的基因。
10.權(quán)利要求9的方法，其中外源基因是編碼人類(lèi)腺苷脫氨酶的基因。
11.權(quán)利要求6的方法，其中造血細(xì)胞包含人類(lèi)干細(xì)胞。
12.一種適于接受逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞類(lèi)群，其包括在包含有固定化的纖維結(jié)合素片段的培養(yǎng)基中的活的造血細(xì)胞，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
13.一種可以維持活的造血細(xì)胞的培養(yǎng)基，其含有固定化的纖維結(jié)合素片段，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
14.一種包含通過(guò)逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移而被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活的造血細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)群，所述基因轉(zhuǎn)移是在存在固定化的纖維結(jié)合素片段的條件下進(jìn)行的，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞類(lèi)群，它是在造血干細(xì)胞中富集的。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞類(lèi)群，其中所述活的造血細(xì)胞是在造血干細(xì)胞中富集的人類(lèi)造血細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的細(xì)胞類(lèi)群，它被包含外源基因的重組逆病毒載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)，以修復(fù)細(xì)胞中蛋白缺失或異常。
18.一種用于改進(jìn)在活的造血細(xì)胞中進(jìn)行逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法，其包括在存在固定化的纖維結(jié)合素片段的條件下進(jìn)行逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
19.權(quán)利要求18的方法，其中造血細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。
20.一種獲得被轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍帶血細(xì)胞的方法，其包括在存在纖維結(jié)合素片段的條件下，用復(fù)制缺陷型重組逆病毒載體感染從臍帶血中獲得的活的造血細(xì)胞，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述造血細(xì)胞是在造血干細(xì)胞中富集的人類(lèi)臍帶血造血細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20的方法，其中造血細(xì)胞中有一種蛋白缺失或異常，并且逆病毒載體包含編碼該蛋白的外源基因。
23.權(quán)利要求22的方法，其中外源基因是編碼腺苷脫氨酶的基因。
24.權(quán)利要求23的方法，其中外源基因是編碼人類(lèi)腺苷脫氨酶的基因。
25.一種包含活的造血細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)群，所述活的造血細(xì)胞來(lái)自在存在固定化纖維結(jié)合素片段的條件下，通過(guò)逆病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍帶血細(xì)胞，所述纖維結(jié)合素片段由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成。
26.權(quán)利要求25的細(xì)胞類(lèi)群，它是在造血干細(xì)胞中富集的。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞類(lèi)群，其中所述活的造血細(xì)胞是在造血干細(xì)胞中富集的人類(lèi)造血細(xì)胞。
28.權(quán)利要求25的細(xì)胞類(lèi)群，其中所述造血細(xì)胞中有一種蛋白缺失或異常，并且逆病毒載體包含編碼該蛋白的外源基因。
29.一種用于通過(guò)逆病毒介導(dǎo)把基因轉(zhuǎn)移至造血細(xì)胞的試劑盒，其包括(a)纖維結(jié)合素片段，其由細(xì)胞結(jié)合區(qū)、肝素II結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)組成；(b)用于把逆病毒載體和造血細(xì)胞共同培養(yǎng)的人造基質(zhì)；(c)用于預(yù)刺激造血細(xì)胞的造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
30.權(quán)利要求29的試劑盒，其中所述纖維結(jié)合素片段被固定在所述人造基質(zhì)上。
31.權(quán)利要求29的試劑盒，其還包括(d)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的重組逆病毒載體。
全文摘要
一種通過(guò)逆病毒提高造血細(xì)胞和其它細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其包括在纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段存在的條件下感染細(xì)胞。如圖所示，纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段顯著地增強(qiáng)了逆病毒介導(dǎo)的向細(xì)胞(特別是造血細(xì)胞，包括定型祖細(xì)胞和初級(jí)造血干細(xì)胞)中進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還提供了利用增強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)移法、造血細(xì)胞類(lèi)群和新的用于增強(qiáng)向細(xì)胞中進(jìn)行逆病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移的構(gòu)建體而進(jìn)行的改進(jìn)的體基因療法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1632116SQ200410090568
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期1995年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月25日
發(fā)明者D·A·威廉斯, V·P·帕特爾 申請(qǐng)人:印第安納大學(xué)研究及科技有限公司, 西北大學(xué)