專利名稱：重組人成骨蛋白－1的復(fù)性及其制劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種成骨蛋白-1的復(fù)性及其制劑制備方法，尤其涉及一種重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)的復(fù)性及其制劑制備方法。是利用基因工程手段，利用大腸桿菌表達(dá)及大量生產(chǎn)重組人成骨蛋白-1成熟肽的方法，對(duì)重組人成骨蛋白-1進(jìn)行復(fù)性及其制劑制備。本發(fā)明制備的制劑滅菌后臨床上可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等。屬生物技術(shù)制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越多地通過(guò)蛋白質(zhì)的異源表達(dá)為臨床和工業(yè)生產(chǎn)提供一些蛋白質(zhì)多肽產(chǎn)品。迄今為止，E.coli以其易于操作、遺傳背景清楚、發(fā)酵成本低和蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，依然是生產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。但是在E.coli中表達(dá)的蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無(wú)活性的不溶性聚集物，如何高效地復(fù)性蛋白是基因工程蛋白生產(chǎn)過(guò)程中最關(guān)鍵和最困難的一步，已成為產(chǎn)業(yè)化的瓶頸之一成骨蛋白-1(Osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形成蛋白-7(Bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)，是TGF-β超家族中的一員。OP-1是一種多用途的蛋白治療骨及軟骨的缺損及在矯形和整形外科的應(yīng)用；在骨折方面的治療作用已被大量的臨床試驗(yàn)所證明是非常有效的，它能治愈現(xiàn)有的所有技術(shù)無(wú)法治愈的骨不連和骨缺損；在治療牙周病方面rhOP-1還能促進(jìn)牙周重建、牙槽嵴骨密度增高，促進(jìn)牙本質(zhì)的形成和牙骨質(zhì)的形成，這對(duì)義牙的種植具有重大的應(yīng)用前景(Giannobile WV et al.，J Periodontol.，1998，69129；)。研究還發(fā)現(xiàn)，OP-1在骨質(zhì)疏松癥、腎衰和神經(jīng)組織的再生等疑難疾病的治療中也有廣闊的應(yīng)用前景。
研究表明，天然提取的BMP具有誘骨及修復(fù)軟骨的活性，但有成本高、獲得量低(1μg/kg)、活性難以保持等缺點(diǎn)；利用基因工程技術(shù)制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白克服了天然來(lái)源的BMP提取和純化的局限性，其臨床應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受到關(guān)注。目前用于基因工程藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要有真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)，前者雖有活性高的優(yōu)點(diǎn)，但其表達(dá)載體構(gòu)建復(fù)雜、細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低、細(xì)胞克隆挑選繁瑣、蛋白表達(dá)量極低且純化較困難。上述不足限制了臨床上的推廣應(yīng)用。原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、基因穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。OP-1成熟肽有三個(gè)糖基化位點(diǎn)，BMP-3有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，有作者報(bào)道成功用大腸桿菌表達(dá)BMP-2、BMP-3成熟肽，經(jīng)復(fù)性后具有良好的誘骨活性。
利用基因工程技術(shù)在原核表達(dá)生物體系可以獲得大量的目的蛋白，但是，原核表達(dá)OP-1的復(fù)性卻一直是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題。原核基因工程產(chǎn)品有生產(chǎn)成本低，表達(dá)量高，包涵體蛋白易于純化等優(yōu)點(diǎn)。但包涵體的復(fù)性工作卻是一個(gè)難點(diǎn)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果這一問(wèn)題得不到很好解決，所復(fù)性的蛋白質(zhì)活性不好、復(fù)性率不高，那么原核基因工程產(chǎn)品就談不上經(jīng)濟(jì)有效，即使表達(dá)量再高也毫無(wú)意義。
克隆到OP-1的成熟蛋白基因并在宿主菌建立rhOP-1高效表達(dá)體系為目前的常規(guī)技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外BMP-2、BMP-3已經(jīng)在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)成功。OP-1是一種比較特別的蛋白質(zhì)，曾在真核細(xì)胞CHO中成功表達(dá)復(fù)性，但產(chǎn)量低，成本高。利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人OP-1的產(chǎn)品，雖然有大量的評(píng)價(jià)文章，但是均因?yàn)槠淞钊松返膹?fù)性(David CRueger，Biochenistry of bone morphogeneti proteins，in Bone MorphogeneticProteins From Laboratory To Clinical Practice/Slobodan Vukicevic，KuberT.Sampath ed Basel.Bosdton.BerlinBirkhauser.2002，1-18)而使其使用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種rhOP-1的復(fù)性及其制劑制備方法。此方法可以在可以獲得具有臨床應(yīng)用價(jià)值的rhOP-1。復(fù)性后的rhOP-1經(jīng)過(guò)純化后直接與載體復(fù)合，能夠制備成的可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等制劑應(yīng)用于臨床。
本發(fā)明利用基因工程常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)引物，從人胚胎組織中獲得了目的基因；利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)宿主菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)篩選、建立了rhOP-1高效表達(dá)體系，構(gòu)建了含有目的蛋白OP-1成熟肽基因(即人OP-1成熟肽基因序列，其核苷酸序列為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，公開(kāi)的SEQ ID NO.1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db＝nucleotide&val＝4502426公開(kāi)序列mat_peptide999---1415/gene＝″BMP7″；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1表達(dá)的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO.2(139氨基酸，其序列為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝4502427&itemID＝7&view＝gpwithparts公開(kāi)序列)表達(dá)系統(tǒng)；宿主菌為常規(guī)技術(shù)使用的BL21系列、DH5α大腸桿菌(①李邦印；莊玉輝人成骨蛋白-1成熟肽基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)生物技術(shù)通訊1999.03.30；10(1)17-19；②陳文；史俊南；付士紅；孫葉芳；梁國(guó)棟；侯云德人成骨蛋白-1成熟肽基因5’端的修飾及其在大腸桿菌中的表達(dá)牙體牙髓牙周病學(xué)雜志1998.03.30；8(1)3-6，)。
本發(fā)明利用熱誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了目的蛋白質(zhì)的高表達(dá)，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的30％左右。rhOP-1在大腸桿菌中以包涵體的形式存在，經(jīng)過(guò)裂菌、洗滌、離心獲得包涵體，8摩爾l/L尿素或6摩爾/升的鹽酸胍溶解包涵體，離心收集上清后首先對(duì)變性蛋白溶液純化。rhOP-1的復(fù)性是在通過(guò)柱層析獲得高純度的rhOP-1單體蛋白后(95％以上)再進(jìn)行復(fù)性，并且rhOP-1的復(fù)性可在6M尿素或者4M鹽酸胍緩沖液中進(jìn)行，復(fù)性溫度室溫或者4度，并且rhOP-1復(fù)性緩沖液的pH值是在8.0～10之間。本方法的優(yōu)點(diǎn)是復(fù)性蛋白質(zhì)濃度可以是較高蛋白質(zhì)濃度，100～1000ug/ml。此可以大大提高復(fù)性效率，方便后續(xù)純化。
rhOP-1的復(fù)性也可在2M尿素或者1M鹽酸胍緩沖液中進(jìn)行，但是此時(shí)rhOP-1的復(fù)性緩沖液必須添加L-精氨酸，并且要將rhOP-1的濃度稀釋至10～100μg/ml，其pH值是在8.0～10之間，否則復(fù)性效果不佳，甚至出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集沉淀。
本發(fā)明涉及的rhOP-1的復(fù)性及其制劑制備方法，其特征在于通過(guò)層析獲得95％以上純度的rhOP-1單體蛋白，在2M～6M尿素或/和1M～4M鹽酸胍緩沖液中透析進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性溫度室溫或者4度，復(fù)性緩沖液的pH值是8.0～10，并間隔6～12小時(shí)取樣，用非還原性的SDS-PAGE檢測(cè)二聚體形成的情況，復(fù)性時(shí)間24～96小時(shí)；之后再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化使目的蛋白二聚體的純度達(dá)到90％以上，以常規(guī)方式經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干份或以常規(guī)方式將目的蛋白與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料或合成高分子骨組織工程材料復(fù)合，滅菌，制得rhOP-1的應(yīng)用制劑。
上述層析是離子交換層析或/和疏水層析、反相層析、親和層析、分子排阻層析。
上述復(fù)性步驟中，可加入表面活性劑，氧化還原體系，復(fù)性添加劑。
在上述的方法中，所述表面活性劑是Triton100、Triton114、吐溫20、吐溫80、十二烷基肌氨酸鈉、十六烷基溴化銨、NP40之一，其用量濃度是體積百分比0.05％～1％。
在上述的方法中，所述氧化還原體系是0.1微摩爾/升～0.1毫摩爾/升的銅離子或/和比例為摩爾比從10∶1到1∶2的還原劑/氧化劑體系，其中還原劑的濃度范圍是0.05～10毫摩爾/升。
其中，所述還原劑是還原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其鹽酸鹽、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇之一。
其中，所述氧化劑是氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫蘇糖醇和二硫赤癬糖醇、胱氨酸及其鹽酸鹽之一。
在上述的方法中，所述復(fù)性添加劑是0.05～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000；0.02～1.0摩爾/升的精氨酸或其鹽酸鹽或其它堿性氨基酸或其鹽酸鹽或三(羥甲基)氨基甲烷，體積百分比為1％～30％的甘油。
其中，所述復(fù)性添加劑優(yōu)選的是0.05～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000，0.4～1.0摩爾/升的精氨酸，或三(羥甲基)氨基甲烷，及體積百分比為1％～20％的甘油。
在上述的方法中，所述復(fù)性采用在低濃度變性劑2M尿素或/和1M鹽酸胍緩沖液中透析進(jìn)行復(fù)性時(shí)，0.2～1.0摩爾/升的精氨酸是必須的。
在上述的方法中，所述制的rhOP-1的復(fù)性制劑是臨床上用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)的rhOP-1的復(fù)性制劑。
下面就上述內(nèi)容展開(kāi)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明在工程菌經(jīng)過(guò)常規(guī)發(fā)酵、裂菌、洗滌后獲得以包涵體形式表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物，包涵體經(jīng)過(guò)7～8摩爾/升的尿素或5～6摩爾/升的鹽酸胍變性溶解；再離子交換層析(或/和疏水層析、反相層析)純化達(dá)到95％以上的純度后，在含有相對(duì)低濃度變性劑4～6摩爾/升的尿素或/和2～4摩爾/升鹽酸胍，或加入低濃度(體積百分比0.05-1％)的表面活性劑(如Triton100、Triton114、吐溫20、吐溫80、十二烷基肌氨酸鈉、十六烷基溴化銨、NP40之一)、合適的氧化還原體系(如0.1微摩爾/升～0.1毫摩爾/升的銅離子或/和還原劑/氧化劑比例為摩爾比從10∶1到1∶2，其中還原劑的濃度范圍在0.05～10毫摩爾/升，所使用的還原劑可以是還原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其鹽酸鹽、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇之一，所使用的氧化劑可以是氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫蘇糖醇和二硫赤癬糖醇、胱氨酸及其鹽酸鹽之一)；以及其它復(fù)性添加劑(如0.05-10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.02～1.0摩爾/升的精氨酸及其鹽酸鹽或其它堿性氨基酸及其鹽酸鹽或三(羥甲基)氨基甲烷，1～30％的甘油及一定量的肝素)的偏堿性(pH8.0～10.0)復(fù)性液中，復(fù)性溫度室溫或者4度，復(fù)性24～96小時(shí)(間隔6～12小時(shí)用非還原性的SDS-PAGE檢測(cè)二聚體形成的情況)，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化(離子交換、反相、疏水、非特異親和及分子排阻)使目的蛋白的純度達(dá)到90％以上，然后①經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干份。②目的蛋白與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料、其他人工工程材料復(fù)合，可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等。
或者將經(jīng)過(guò)離子交換層析(或/和疏水層析、反相層析)純化達(dá)到95％以上純度的rhOP-1單體，將其用2摩爾/升的尿素或1摩爾/升鹽酸胍稀釋至10～100μg/ml，并在其中添加0.2～1.0摩爾/升的精氨酸，優(yōu)選0.3～0.8摩爾/升精氨酸，且其pH值應(yīng)是在8.0～10之間，復(fù)性24～60小時(shí)(見(jiàn)圖3)，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化(離子交換、反相、疏水、非特異親和及分子排阻)使目的蛋白二聚體的純度達(dá)到90％以上，然后①經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干份。②目的蛋白與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料、脫鈣骨基質(zhì)及其他人工組織工程材料復(fù)合，可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等。
本發(fā)明提供了一種rhOP-1的復(fù)性方法，此方法可以在可以獲得具有臨床應(yīng)用價(jià)值的rhOP-1。復(fù)性后的rhOP-1經(jīng)過(guò)純化后直接與載體復(fù)合，本發(fā)明制備的制品滅菌后在臨床上可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等，也可以制備成為其他制劑用于中風(fēng)、腎臟疾病等的治療。
本實(shí)驗(yàn)的純化、復(fù)性工藝簡(jiǎn)便易行，獲得了實(shí)驗(yàn)室水平的rhOP-1分離純化、復(fù)性工藝方案，為rhOP-1的大規(guī)模生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究及rhOP-1早日應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。


圖1為rhOP-1復(fù)性前的SDS-PAGE圖。
復(fù)性前樣品，均為單體，其中2泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker(分子量標(biāo)準(zhǔn)從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)。
圖2為rhOP-1不同復(fù)性條件下的復(fù)性效果的還原性SDS-PAGE圖。
其中1-7泳道為相同樣品的不同條件復(fù)性，3泳道為本發(fā)明最優(yōu)方法，復(fù)性率約有40％。10泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，分子量標(biāo)準(zhǔn)從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd。
圖3低濃度變性劑不同條件下的復(fù)性結(jié)果。
其中1-6泳道為pH＜8時(shí)的復(fù)性結(jié)果；7泳道.pH8.0復(fù)性 8泳道.pH8.0復(fù)性(含L-Arg) 9泳道.pH9.0復(fù)性 10泳道.pH9.0復(fù)性(含L-Arg)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1rhOP-1工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵，離心收集菌體、裂菌、洗滌獲得包涵體，包涵體經(jīng)過(guò)8摩爾/升的尿素變性溶解，再離子交換(或/和疏水、親和及分子排阻)層析收集純化達(dá)到95％以上的純度后，將其稀釋至200～600μg/ml。后裝入經(jīng)過(guò)常規(guī)處理的透析袋(截留分子量為10000)中，在6摩爾/升的尿素、0.05克/升的聚乙二醇4000、0.4～0.6摩爾/升的精氨酸、20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液的復(fù)性液中(pH8.0～9.5)室溫空氣氧化復(fù)性24～96小時(shí)，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步離子交換層析、分子排阻純化使目的蛋白的二聚體純度達(dá)到90％以上。再5摩爾/升的尿素、4摩爾/升的尿素、2摩爾/升的尿素、1摩爾/升的尿素透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液，冷凍干燥獲得rhOP-1凍干粉。環(huán)氧乙烷滅菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 或者(一)將二聚體純度達(dá)到90％以上的目的蛋白(6摩爾/升的尿素)以1mg5～20mg的比例，直接與一定量的吸收性明膠海綿材料復(fù)合。復(fù)合時(shí)在真空系統(tǒng)中反復(fù)抽、放氣，至幾乎完全驅(qū)除明膠海綿材料內(nèi)的氣泡，復(fù)合完成。再經(jīng)5摩爾/升的尿素、4摩爾/升的尿素、2摩爾/升的尿素、1摩爾/升的尿素透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液。冷凍干燥后分裝于聚乙烯袋或者其他合適的容器中，環(huán)氧乙烷滅菌，即得可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等的制劑。
(二)、將上述冷凍干燥后的rhOP-1凍干粉，6摩爾/升的尿素溶解，以1mg1～20mg的比例，與用打孔器制備成為直徑5mm左右的市售吸收性明膠海綿材料復(fù)合。反復(fù)抽、放氣，至幾乎完全驅(qū)除明膠海綿材料氣泡，復(fù)合完成。再逐級(jí)尿素透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液。冷凍干燥后分裝于適宜容器中，環(huán)氧乙烷滅菌50分鐘后的制劑可用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等。
實(shí)施例2rhOP-1工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵，離心收集菌體、裂菌、洗滌獲得包涵體，包涵體經(jīng)過(guò)6摩爾/升的鹽酸胍變性溶解；再離子交換(或/和疏水、親和及分子排阻)層析收集純化達(dá)到95％以上的純度后，在4摩爾/升的鹽酸胍、以及0.2～0.5摩爾/升的精氨酸、0.1微摩爾/升～0.1毫摩爾/升的銅離子(氯化銅或硫酸銅)；20毫摩爾/升磷酸鹽的復(fù)性液(pH8.0～9.0)中室溫復(fù)性24～96小時(shí)，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步離子交換層析純化(或/和反相、疏水、非特異親和及分子排阻)使目的蛋白的純度達(dá)到90％以上。獲得的樣品直接與載體材料(膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類、合成高分子骨組織工程材料之一)復(fù)合，復(fù)合時(shí)反復(fù)真空抽、放氣，然后再透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液，置于冷凍干燥機(jī)中凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3將包涵體經(jīng)過(guò)8摩爾/升的尿素變性溶解，再離子交換層析收集純化達(dá)到95％以上的純度后，將其稀釋至100～600μg/ml。后裝入經(jīng)過(guò)常規(guī)處理的透析袋(截留分子量為10000)中，直接在6摩爾/升的尿素、20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液的復(fù)性液中(pH9.0～9.5)室溫空氣氧化復(fù)性24～96小時(shí)，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步離子交換層析、分子排阻純化使目的蛋白的二聚體純度達(dá)到90％以上。再5摩爾/升的尿素、4摩爾/升的尿素、2摩爾/升的尿素、1摩爾/升的尿素透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液，冷凍干燥獲得rhOP-1凍干粉。環(huán)氧乙烷滅菌后-20℃保存?zhèn)溆??；蛘邔⒍垠w純度達(dá)到90％以上的目的蛋白以1mg5～10mg的比例，直接與一定量的吸收性明膠海綿材料復(fù)合。復(fù)合時(shí)在真空系統(tǒng)中反復(fù)抽、放氣，至幾乎完全驅(qū)除明膠海綿材料內(nèi)的氣泡，復(fù)合完成。再經(jīng)梯度尿素透析至蒸餾水。冷凍干燥后分裝于聚乙烯袋或者其他合適的容器中，環(huán)氧乙烷滅菌，即得可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等的制劑。
實(shí)施例4將包涵體經(jīng)過(guò)8摩爾/升的尿素變性溶解，再離子交換層析收集純化達(dá)到95％以上的純度后，將其稀釋至200～600μg/m1。后裝入經(jīng)過(guò)常規(guī)處理的透析袋(截留分子量為10000)中，在6摩爾/升的尿素、加入低濃度(體積百分比0.1-1％)的表面活性劑吐溫20、氧化還原體系(如0.1微摩爾/升～0.1毫摩爾/升的銅離子或/和還原劑/氧化劑比例為摩爾比從10∶1到1∶2，其中還原劑的濃度范圍在1～10毫摩爾/升，所使用的還原劑可以是還原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其鹽酸鹽、巰基乙醇、半胱氨、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇，所使用的氧化劑可以是氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫蘇糖醇和二硫赤癬糖醇、胱氨酸及其鹽酸鹽)；以及其它復(fù)性添加劑(如0.5～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.2～1.0摩爾/升的精氨酸及其鹽酸鹽或其它堿性氨基酸及其鹽酸鹽或三(羥甲基)氨基甲烷，1～20％的甘油及一定量的肝素)的偏堿性(pH8.0～9.5)復(fù)性液中復(fù)性，還原性SDS-PAGE檢測(cè)復(fù)性效果。再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步離子交換層析、分子排阻純化使目的蛋白的二聚體純度達(dá)到90％以上。再5摩爾/升的尿素、4摩爾/升的尿素、2摩爾/升的尿素、1摩爾/升的尿素透析至20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液，冷凍干燥獲得rhOP-1凍干粉。環(huán)氧乙烷滅菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例5將經(jīng)過(guò)離子交換層析(或/和疏水層析、反相層析)純化達(dá)到95％以上純度的rhOP-1單體，將其用2摩爾/升的尿素或1摩爾/升鹽酸胍稀釋至50～100μg/ml，并在其中添加0.4～0.6摩爾/升精氨酸，調(diào)其pH值在8.0～10之間，室溫下復(fù)性24～60小時(shí)(還原性SDS-PAGE檢測(cè)復(fù)性效果，圖3)。復(fù)性樣品再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化(離子交換、反相、疏水、非特異親和及分子排阻)使二聚體純度的純度達(dá)到90％以上，然后①經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干份。②目的蛋白與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料、其他人工工程材料復(fù)合，可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等。
權(quán)利要求
1.一種重組人成骨蛋白-1的復(fù)性及其制劑制備方法，其特征在于通過(guò)層析獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白-1單體蛋白，在含2M～6M尿素或/和1M～4M鹽酸胍變性劑緩沖液中透析進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液的pH值是8.0～10，復(fù)性溫度室溫或者4度，復(fù)性時(shí)間24～96小時(shí)；之后再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化使目的蛋白二聚體的純度達(dá)到90％以上，以常規(guī)方式經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干粉或以常規(guī)方式將層析純化的目的蛋白液體直接與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料或合成高分子骨組織工程材料復(fù)合，滅菌，制得重組人成骨蛋白-1的復(fù)性制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述層析是離子交換層析或/和疏水層析、反相層析、親和層析、分子排阻層析。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述復(fù)性步驟中，可加入表面活性劑，氧化還原體系，復(fù)性添加劑。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述表面活性劑是Triton 100、Triton114、吐溫20、吐溫80、十二烷基肌氨酸鈉、十六烷基溴化銨、NP40之一，其用量濃度是體積百分比0.05％-1％。
5.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述氧化還原體系是0.1微摩爾/升～0.1毫摩爾/升的銅離子或/和比例為摩爾比從10∶1到1∶2的還原劑/氧化劑體系，其中還原劑的濃度范圍是0.05～10毫摩爾/升。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述還原劑是還原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其鹽酸鹽、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇之一。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述氧化劑是氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫蘇糖醇和二硫赤癬糖醇、胱氨酸及其鹽酸鹽之一。
8.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述復(fù)性添加劑是0.05～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.02～1.0摩爾/升的精氨酸或其鹽酸鹽或其它堿性氨基酸或其鹽酸鹽或三(羥甲基)氨基甲烷，體積百分比為1％～30％的甘油。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述復(fù)性采用在低濃度變性劑2M尿素或1M鹽酸胍緩沖液中透析進(jìn)行復(fù)性時(shí)，0.2～1.0摩爾/升的精氨酸是必須的。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述制的重組人成骨蛋白-1的復(fù)性制劑是臨床上用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)的重組人成骨蛋白-1的制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人成骨蛋白－1的復(fù)性及其制劑制備方法，是通過(guò)層析獲得95％以上純度的rhOP－1單體蛋白，在2M－6M尿素或1M－4M鹽酸胍緩沖液中透析進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液的pH值是8.0－10，復(fù)性溫度室溫或者4度，復(fù)性時(shí)間24－96小時(shí)；之后再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步層析純化使目的蛋白二聚體的純度達(dá)到90％以上，以常規(guī)方式經(jīng)透析、除菌、分裝和冷凍干燥后得到rhOP－1成熟肽的基因工程產(chǎn)物的凍干粉或?qū)游黾兓哪康牡鞍滓后w直接與膠原蛋白、吸收性明膠海綿、殼聚糖或珊瑚粉類材料或合成高分子骨組織工程材料復(fù)合，滅菌，制得重組人成骨蛋白－1的復(fù)性制劑。所述制劑可用于骨缺損的修復(fù)、矯形及用于口腔拔牙創(chuàng)齒槽骨的維持和恢復(fù)等，也可以用于中風(fēng)、腎臟疾病等的治療。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1786017SQ200510045600
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者王世立, 韓金祥, 李俊玲, 車婧 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心