專利名稱：蝗蟲的酶解多肽及其生理活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在申請?zhí)枮?00310101645的專利基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究蝗蟲(Huang Chong，縮寫為HC)粉抗疲勞的機理及發(fā)揮作用的吸收快的原理。本發(fā)明從酶水解蝗蟲蛋白入手，生成蝗蟲多肽(Huang Chong Peptide，縮寫號HCP)，再從HCP出發(fā)檢測其生理功能?，F(xiàn)將蝗蟲多肽的制備及其生理功能敘述如下。
圖面說明附

圖1為實驗室酶解工藝；附圖2為工業(yè)化酶解工藝。
1.酶解條件1.1 復(fù)合酶的配制木瓜蛋白酶80萬u/g，中性蛋白酶20萬u/g，堿性蛋白酶20萬u/g，多肽酶1萬u/g由廣西南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)。
1.1.1 實施例1.復(fù)合酶的組成比例木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶∶多肽酶＝5∶3∶21.1.2 實施例2.復(fù)合酶的活化取上述比例的復(fù)合酶100mg加入10ml 1％NaCl，37℃保溫1h，即可。
1.2 實驗室酶解工藝1.2.1 鮮蝗蟲的含水量100g×0.667＝66.7g1.2.2 100g鮮蝗蟲的干重100g×(1-0.667)＝33.3g1.2.3 蝗蟲干粉的蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法70.0％1.2.4 酶解工藝實施例3取4gHC粉在150ml燒杯中40℃保溫1h，加入已活化的121mg復(fù)合酶升至50℃，總體積為150ml，PH＝7，酶底比3％，不停地攪拌，保溫4h。90℃滅酶10分鐘，離心，過濾濾渣用40ml，50℃熱水洗滌兩次，合并濾液。90℃滅菌10分鐘，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，水浴溫度為70℃，蒸干，淺紅黃色晶體1.68g收率1.68g/(4×0.7g)＝60％。(見圖1所示)1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析HCP含量相對分子量2000-6000，含量72％。
1.3 工業(yè)化酶解工藝
實施例4在1噸帶夾套不銹鋼罐中加入43Kg干HC粉攪拌，加水600升，在40℃預(yù)熱1h后加入已活化好的1.512Kg復(fù)合酶，將反應(yīng)罐中水補加至980升。升溫至50℃，邊攪拌保溫4h，PH＝7，酶底比為5％，90℃滅酶，離心過濾，用400升50℃水洗滌濾渣兩次，合并濾液。90℃滅菌10分鐘，濾液比重為1.0-1.05，噴霧干燥，入口溫度140℃，出口溫度70℃，產(chǎn)品為淺褐色蓬松固體15.12Kg，收率為15.12/30.24＝50％(見圖2所示)。
1.4 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析HCP含量1相對分子量在2000-6000的含量為72％。
1.4.2 產(chǎn)品含水量3％1.4.3 菌檢陰性1.5 HCP的復(fù)合配方1.5.1 實施例5.HCP1700mg/片，HCP 420mg(60％)、東北人參提取物210mg(30％)、西洋參提取物70mg(10％)。
1.5.2 實施例6.HCP2700mg/片，HCP 420mg(60％)、東北人參提取物175mg(25％)、西洋參提取物70mg(10％)、白蒺藜提取物35mg(5％)。
1.5.3 實施例7.HCP純蝗蟲多肽含多肽72％2.HCP及其復(fù)方HCP(HCP1、HCP2)的生理功能現(xiàn)將HCP及其衍生配方，就其抗疲勞、改善性功能及耐缺氧等功能闡述如下2.1 動物試驗測定HCP1、HCP2、HCP的生理活性2.1.1 實驗分組對照組、陽性對照組(HC粉蛋白含量與試驗組HCP1組相等)、HCP1、HCP2、HCP組。每組12只，ICR小鼠雌雄各半，共300只小鼠，體重在18-22g，平均體重約20g。
2.1.2 灌胃劑量按蝗蟲蛋白或HCP為870mg/Kg，HC粉為1242.9mg/Kg，HCP均為17.4mg/0.3ml/只。
2.1.3 折合臨床推薦量(17.4mg×50)/(20g×50)×55Kg(男女平均體重)÷1400mg＝34倍因此，臨床推薦劑量700mg/片×2片＝1400mg2.2 小鼠體力性疲勞模型的制備2.2.1 游泳試驗2末次給予受試物30min后，給小鼠負(fù)體重5％重量，將小鼠放于水深不少于30cm，水溫25±1℃的游泳箱中。記錄自有用開始至頭部全部沉入水中8s不能浮出水面的時間作為小鼠游泳時間。
2.2.2 爬桿試驗2末次給予受試物30min后，將小鼠放在爬桿架的有機玻璃棒上，使其肌肉處于緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從有機玻璃上跌落下來的時間。第三次跌落時終止試驗，累計三次的時間作為爬桿時間。
2.2.3 血尿素的測定3末次給予受試物30min后，將小鼠放于水溫25±1℃的游泳箱中游泳90min，休息60min后摘眼球取血，取血清用試劑盒(二乙酰一肟法)測定。
2.2.4 血乳酸的測定3末次給予受試物30min后，將小鼠放于水溫30±1℃的水中負(fù)重4％游泳10min停止，分別從游泳前、游泳之后0、15、60min的小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血。于5ml離心管中加入1％NaF溶液0.48ml，準(zhǔn)確吸取全血20μl加入試管底部，用試管上清液沖洗微量吸管數(shù)次，再加入蛋白質(zhì)沉淀劑1.5ml，振蕩混勻，3000r/min離心10min，取上清液測定。
2.2.5 肝糖原的測定3末次給予受試物30min后，將小鼠放于水溫30±1℃的游泳箱中游泳60min后停止，立即處死小鼠取出肝臟，精確稱取200mg，加入TCA4ml，每管勻漿1min，3000r/min離心15min，取上清夜轉(zhuǎn)移至另一試管內(nèi)。在沉淀中加入TCA4ml，勻漿1min，再次離心15min，取上清夜與第一次離心的上清液合并，充分混均。取1ml上清液，每管加入95％的乙醇4ml，充分混均至兩種液體間不留有界面。室溫放置過夜。沉淀完全后將試管于3000r/min離心15min。小心到掉上清液并使試管放置10min，用1ml蒸餾水振蕩溶解后測定。
2.2.6 肌糖原的測定3末次給予受試物30min后，將小鼠放于水溫30±1℃的游泳箱中游泳60min后停止，立即處死小鼠取出肌肉，以0.9％NaCl溶液清洗后，用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取肌肉1g，放入3ml30％KOH的試管中，置沸水浴煮20min，取出冷卻后，將其轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用水多次洗滌試管，一并收入容量瓶，加水至刻度，搖均待用。置沸水浴中10min，冷卻后在620nm波長出測量光吸收值，空白管調(diào)零點。
2.2.7 HCP、HCP1、HCP2對小鼠游泳時間、爬桿時間、血清尿素氮、肝糖原、和肌糖原含量的影響試驗組與對照組相比，HCP組游泳時間提高了92％(p＜0.01)，HCP1組游泳時間提高了72％(p＜0.05)。試驗組與對照組相比，HC組爬桿時間提高了132％，HCP1提高了203％(p＜0.001)，HCP2組爬桿時間提高了325％(p＜0.001)，HCP組爬桿時間提高了291％(p＜0.01)。試驗組與對照組相比，HCP組尿素氮含量降低了16％(p＜0.01)，HCP1降低了13％(p＜0.05)。HCP2組肝糖原含量為對照組的2.4倍(p＜0.01)，HCP組肝糖原含量為對照組的3.6倍(p＜0.001)，結(jié)果見表1。
表1 HCP對小鼠游泳時間、爬桿時間、血清尿素氮、肝糖原、和肌糖原含量的影響(x±SD n＝12)
注與對照組相比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
2.2.8 HCP、HCP1、HCP2對小鼠血乳酸含量的影響HCP組游泳后0min和15min試驗組與對照組相比，血乳酸含量分別降低了24％(p＜0.01)和24％(p＜0.05)，并且趨于游泳前的乳酸含量，結(jié)果見表2。
表2 HCP、HCP1、HCP2對小鼠血乳酸含量的影響(x±SD n＝12)
注與對照組相比較*p＜0.05，**p＜0.01。
3.HCP、HCP1、HCP2對正常雄性小鼠交配的影響3.1 對正常雄性小鼠交配試驗的影響3.1.1 試驗動物ICR小鼠，雄性48只，雌性144只，平均體重約30g。
3.1.2 灌胃數(shù)量生理鹽水灌對照組，HCP、HCP1、HCP2均為17.4mg/0.3ml/只。
3.1.3 雌雄比3∶13.1.4 試驗結(jié)果見表3、表4。
表3 HCP、HCP1、HCP2對正常雄性小鼠交配的影響(x±SD n＝12)
注與對照組相比較*p＜0.05，**p＜0.01。
表4 HCP、HCP1、HCP2對慢性懸吊應(yīng)激性功能紊亂模型交配試驗的影響(x±SD n＝12)
注1與對照組相比較*p＜0.05，**p＜0.01；注2交配潛伏期時間越短，性功能改善越顯著。
4.ICR小鼠耐缺氧試驗4.1 試驗動物85日齡的ICR小鼠60只，分成5組，每組12只，雌雄各半，體重28-32g，平均體重約30g。
4.2 實驗條件4瓶中真空度為0.07MPa，相當(dāng)于26300m高空，或相當(dāng)于3個珠穆朗瑪峰的高度。
表5 HC、HCP1、HCP2、HCP對小鼠耐缺氧試驗的影響(x±SD n＝12)
注與對照組相比較*p＜0.05，**p＜0.01；5.實驗結(jié)果討論HCP、HCP1、HCP2對小鼠游泳時間、爬桿時間、血乳酸、血中尿素氮、肝糖原和肌糖原含量等均有明顯的效果，并能改善小鼠的性功能，對小鼠的耐缺氧能力有較大的提高。
參考文獻(xiàn)1汪謙主編現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法1997年版 人民為生出版社 p4102衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司 保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法1997頒布3首都醫(yī)學(xué)院，醫(yī)用生物化學(xué)實驗[M]天津天津科學(xué)技術(shù)出版社1987.133-134.96-984丁鑑申請?zhí)?00310101645中國專利局
權(quán)利要求
1.本發(fā)明的蝗蟲粉(HC粉)通過自制的復(fù)合酶和發(fā)現(xiàn)的酶解條件將蝗蟲粉水解成活性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，復(fù)合酶的配比如下木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶∶多肽酶∶堿性蛋白酶＝4∶2∶2∶2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其最佳酶解條件為PH＝6.5-7，溫度為50-55℃，保溫時間為3-4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)HCP具有抗疲勞、耐缺氧和改善性功能的用途。
全文摘要
本發(fā)明將蝗蟲蛋白通過復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶∶多肽酶∶堿性蛋白酶＝2∶1∶1∶1)，酶底比在2.5－5％之間，pH＝7，50℃，保溫3－4h，水解成蝗蟲多肽(HCP)，其純度70－72％。HCP富含活性多肽，具有營養(yǎng)豐富，吸收快等特點。經(jīng)動物試驗表明HCP具有抗疲勞、極優(yōu)的耐缺氧能力及其顯著改善性功能的作用。本發(fā)明的產(chǎn)品隸屬于生物制品、保健食品、醫(yī)藥品的領(lǐng)域，適合于健康產(chǎn)業(yè)、保健食品、醫(yī)藥品生產(chǎn)廠家及其相關(guān)企業(yè)。
文檔編號A61P15/00GK1875992SQ20051007507
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者丁鑑 申請人:丁鑑