專利名稱：抗ctla－4抗體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含抗CTLA-4抗體的組合物和其在癌癥的治療以及與干細(xì)胞移植相組合的用途，該抗體具有來源于人基因的氨基酸序列。
背景CTLA-4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4)是免疫球蛋白(Ig)超家族的成員，其發(fā)揮下調(diào)T細(xì)胞活化作用和保持免疫穩(wěn)定的作用。特別地，據(jù)認(rèn)為CD28和CTLA-4傳遞相反的信號，T細(xì)胞對這樣的信號進(jìn)行整合以確定對抗原的應(yīng)答。CD28共刺激信號和來源于CTLA-4的抑制信號調(diào)控通過抗原產(chǎn)生的T細(xì)胞受體刺激作用的結(jié)果。其由T細(xì)胞上的CD28或CTLA-4與在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的B7分子之間的相互作用來確定。
Kwon等人PNAS USA 948099-103(1997)證明了體內(nèi)抗體介導(dǎo)的CTLA-4的阻斷增強了抗前列腺癌的免疫應(yīng)答?；隗w外和體內(nèi)的結(jié)果，Yang等人Cancer Res 574036-41(1997)發(fā)現(xiàn)荷瘤動物中CTLA-4的阻斷增強了其產(chǎn)生抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的能力；在該模型中，增強效應(yīng)限制在腫瘤生長的早期階段。Hurwitz等人Proc Natl Acad Sci USA 9510067-71(1998)使用CTLA-4阻斷和疫苗(由表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的SM1細(xì)胞組成)的組合來誘導(dǎo)親本SM1腫瘤的消退，但這兩種處理單獨應(yīng)用時都不起作用。
Allison等人的美國專利5,811,097涉及施用CTLA-4阻斷劑以減少腫瘤細(xì)胞的生長。WO00/37504(2000年6月29日公開)涉及人抗CTLA-4抗體和這些抗體在癌癥治療中的用途。WO01/14424(2001年3月1日出公開)涉及其他的人抗CTLA-4抗體和這些抗體在治療癌癥中的用途。WO93/00431(1993年1月7日公開)涉及用和CTLA4Ig融合蛋白有反應(yīng)性的單克隆抗體調(diào)節(jié)細(xì)胞相互作用。WO00/32231(2000年6月8日公開的)涉及用腫瘤疫苗和CTLA-4阻斷劑的組合來刺激T細(xì)胞。WO03/086459涉及使用CTLA-4抗體提高記憶應(yīng)答的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用抗CTLA-4抗體來治療癌癥的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過以單劑或多劑的形式施用超過10mg/kg的抗CTLA-4抗體來治療哺乳動物中的癌癥的方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于在已接受干細(xì)胞移植的哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括給所述哺乳動物施用有效量的人抗CTLA-4抗體。
在另一方面，本發(fā)明涉及在哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括步驟(i)在哺乳動物中進(jìn)行干細(xì)胞移植，和(ii)施用有效量的人抗CTLA-4抗體。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。干細(xì)胞移植可以是異源干細(xì)胞移植(allogeneic stem cell transplantation)或自體干細(xì)胞移植。
在其他方面，本發(fā)明涉及用于在哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括步驟(i)給哺乳動物實施化學(xué)療法；(ii)進(jìn)行干細(xì)胞移植，和(iii)施用有效量的人抗TLA-4抗體。干細(xì)胞移植可以是異源干細(xì)胞移植或自體干細(xì)胞移植，化學(xué)療法可以是高劑量的化學(xué)療法。
附圖簡述

圖1A-W顯示抗CTLA-4抗體4.1.1、4.8.1、4.13.1、6.1.1和11.2.1的全長核苷酸和氨基酸序列。
圖2A-C顯示預(yù)測的重鏈克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1和12.9.1.1與生殖系(germline)DP-50(3-33)氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化以粗體表示。
圖3顯示克隆2.1.3的經(jīng)預(yù)測的重鏈序列和生殖系DP-65(4-31)氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖4 A-B顯示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2和4.13.1的經(jīng)預(yù)測的κ輕鏈序列與生殖系A(chǔ)27氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖5顯示克隆3.1.1、11.2.1、11.6.1和11.7.1的經(jīng)預(yù)測的κ輕鏈序列與生殖系012氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖6顯示克隆2.1.3的經(jīng)預(yù)測的κ輕鏈序列與生殖系A(chǔ)10/A26氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖7顯示克隆1 2.3.1的經(jīng)預(yù)測的κ輕鏈序列與生殖系A(chǔ)17氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖8顯示克隆12.9.1的經(jīng)預(yù)測的κ輕鏈序列與生殖系A(chǔ)3/A19氨基酸序列之間的氨基酸序列比對。和生殖系相比產(chǎn)生的變化用粗體表示，CDRs用下劃線標(biāo)示。
圖9A-L顯示抗CTLA-4的抗體4.1.1(圖9A)、4.8.1(圖9B)、4.14.3(圖9C)、6.1.1(圖9D)、3.1.1(圖9E)、4.10.2(圖9F)、2.1.3(圖9G)、4.13.1(圖9H)、11.6.1(圖9I)、11.7.1(圖9J)、12.3.1.1(圖9K)和12.9.1.1(圖9L)的全長核苷酸和氨基酸序列。
發(fā)明詳述此處引用的所有專利、專利申請、出版物和其他參考文獻(xiàn)在此以其全文引用作為參考。
在一個方面，本發(fā)明涉及在哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括給哺乳動物施用超過10mg/kg的人抗CTLA-4抗體。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。被治療的癌癥的例子是乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部的癌、黑色素瘤(包括皮膚惡性黑色素瘤或眼內(nèi)惡性黑色素瘤(intraocularmalignant melanoma))、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)的癌、胃癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道的癌瘤、女陰部分的癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病，包括急性粒細(xì)胞樣白血病、慢性粒細(xì)胞樣白血病(chronic myeloidleukemia)、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、兒童期實體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、spinal axis tumor、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴癌、環(huán)境誘導(dǎo)的癌(包括由石棉誘導(dǎo)的癌)、骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、兒童期肉瘤和所述癌癥的組合。在某些實施方案中，治療實體瘤，例如乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和兒童期肉瘤。在另一具實施方案中，所述癌癥是黑色素瘤，所述哺乳動物是人。在另外的實施方案中，所述癌癥是前列腺癌，所述哺乳動物是人。
如此處所使用的，術(shù)語“治療(treatment)”，除非另外指出，是指逆轉(zhuǎn)、減緩、抑制該術(shù)語所稱的疾病或病癥的進(jìn)程，或抑制這些疾病或病癥的一個或多個癥狀。除非另外指出，術(shù)語“治療(treating)”，如此所用的，是指如上面剛定義的“治療(treatment)”那樣進(jìn)行治療的行為?？赏ㄟ^觀察疾病終點(endpoints)例如長期存活、無疾病存活(disease-free survival)(無復(fù)發(fā)的時間)、反應(yīng)速度、反應(yīng)持續(xù)時間和/或發(fā)展時間來監(jiān)控癌癥治療的效果。
為了治療癌癥，可如下面所描述的那樣施用此處描述的抗體，例如以超過10mg/kg的量施用抗體。在一些實施方案中，抗體量可以從多于10mg/kg至21mg/kg，例如10.5mg/kg至21mg/kg或11mg/kg至21mg/kg，或者例如多于10mg/kg至18mg/kg，例如10.5mg/kg至18mg/kg或11mg/kg至18mg/kg。在其他實施方案中，抗體量至少是15mg/kg，例如15mg/kg。在另外的實施方案中，抗體的量大約是20mg/kg?？墒┯脝蝿┗蚨鄤┑目贵w。例如，可施用至少1劑，或至少3劑、6劑或12劑?？梢岳缑?周1次、每月1次、每3個月1次、每6個月1次或每年1次地施用所述劑量。
本發(fā)明的方法也涉及已接受干細(xì)胞移植的哺乳動物中的癌癥治療，該方法包括給哺乳動物施用如下用量的人抗CTLA-4抗體，該量的抗體和干細(xì)胞移植相組合對治療癌癥具有效果。被治療的癌癥的例子是乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌、肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部的癌、黑色素瘤，包括皮膚惡性黑色素瘤或眼內(nèi)惡性黑色素瘤(intraocular malignant melanoma)、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)的癌、胃癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、女陰部分的癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病，包括急性粒細(xì)胞樣白血病、慢性粒細(xì)胞樣白血病(chronic myeloid leukemia)、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、兒童期實體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、spinal axis tumor、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴癌、環(huán)境誘導(dǎo)的癌(包括由石棉誘導(dǎo)的癌)、骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、兒童期肉瘤和所述癌癥的組合。優(yōu)選地，治療實體瘤，例如乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和兒童期肉瘤。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
在組合治療中，如下面進(jìn)一步描述的，可以例如至少1mg/kg的量、以至少5mg/kg、至少10mg/kg或至少15mg/kg的量施用此處描述的抗體。可施用單劑或多劑的抗體。例如，可施用至少1劑、或至少3、6或12劑?？梢岳缑?周1次、每月1次、每3個月1次、每6個月1次或每年1次地施用所述劑量?？稍诓溉閯游锏拿庖呦到y(tǒng)已從移植中恢復(fù)后，例如在移植后1至12個月的時間內(nèi)，施用第一劑。在某些實施方案中，在移植后的1至3個月、或1至4個月的時間內(nèi)施用第一劑。患者可接受干細(xì)胞移植和如下所述的預(yù)備治療(preparatory treatment)。
本發(fā)明也涉及哺乳動物中的癌癥的治療方法，其包括步驟(i)在哺乳動物中進(jìn)行干細(xì)胞移植，和(ii)施用有效量的人抗CTLA-4抗體。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。干細(xì)胞移植可以是異源干細(xì)胞移植或自體干細(xì)胞移植。
此處所用的術(shù)語“干細(xì)胞移植”是指將造血干細(xì)胞輸注入哺乳動物，所述干細(xì)胞可來源于身體內(nèi)的任何合適的干細(xì)胞來源。因此，干細(xì)胞可來源于例如骨髓、骨髓動員后的外周循環(huán)(例如血液)、或胎兒來源例如胎兒組織、胎兒循環(huán)和臍帶血。
此處所用的“骨髓移植”是干細(xì)胞移植的一種形式。
“異源干細(xì)胞移植”涉及免疫上并不相同的供體和接受體。
“自體干細(xì)胞移植”涉及取出和保存患者自身的干細(xì)胞，然后用其重新輸注。該方法一般在高劑量的骨髓根除治療(myeloablativetherapy)之后進(jìn)行。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行干細(xì)胞移植。在F.R.Appelbaum，Bone Marrow and Stem Cell Transplantation，第14章，Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，Eugene Braunwald等人，編著(McGraw-Hill Professional；第15版，F(xiàn)ebruary 16，2001)(其在此引用作為參考)中描述了一些這樣的方法。
因此，可在供體在全身麻醉或脊髓麻醉的情況下從供體的髂后嵴、有時從髂前嵴中收集骨髓。一般地，抽吸10至15mL/kg骨髓，置于肝素化的介質(zhì)中，通過0.3-和0.2-mm的篩子過濾以除去脂肪和小骨片。例如，為進(jìn)行異源移植，可收集每千克大約1.5至5×108個有核骨髓細(xì)胞。依賴于臨床狀況可進(jìn)一步處理收集的骨髓，例如去除紅細(xì)胞以防止ABO不相容移植體的溶血，除去供體T細(xì)胞以防止移植物抗宿主病(GVHD)、或通過試圖在自體移植中除去可能的污染性腫瘤細(xì)胞來處理收集的骨髓。
在一個實施方案中，可通過用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或其他因子例如IL-8處理供體來從骨髓動員干細(xì)胞，所述因子可誘導(dǎo)干細(xì)胞從骨髓運動至外周循環(huán)中。在一些實施方案中，在用造血生長因子處理供體后，或在自體移植的情形中，有時在用化療劑和生長因子的組合治療后，收集外周血干細(xì)胞。
在動員后，可通過任何合適的細(xì)胞分離技術(shù)(白細(xì)胞去除法(leukopheresis))，例如使用商購可獲得的血液收集設(shè)備如CS3000血細(xì)胞分離器(Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)從外周血收集干細(xì)胞。在Williamset等人，Bone MarrowTransplantation 5129-33(1990)和Hillyer等人，Transfusion 33316-21(1993)(兩者在此引用作為參考)中描述了用CS3000血細(xì)胞分離器進(jìn)行血漿析離術(shù)(apheresis)的方法。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如通過靜脈內(nèi)注射，施用干細(xì)胞移植體。可通過大管徑中央靜脈導(dǎo)管輸注用于移植的干細(xì)胞。
在某些實施方案中，在干細(xì)胞移植之前進(jìn)行預(yù)備療法。在移植之前給哺乳動物實施的預(yù)備治療方案可設(shè)計用來根除哺乳動物的潛伏疾病，或者，在異源移植的建立中，充分地免疫抑制哺乳動物以防止被移植的干細(xì)胞的排斥。因此，合適的方案依賴于疾病狀況和骨髓的來源。這些方案可包括給哺乳動物提供化療和/或全身照射。
因此，本發(fā)明也涉及用于治療哺乳動物中的癌癥的方法，其包括步驟(i)給哺乳動物提供化療；(ii)進(jìn)行干細(xì)胞移植，和(iii)施用有效量的人抗CTLA-4的抗體。優(yōu)選地，哺乳動物是人。干細(xì)胞移植可以是異源干細(xì)胞移植或自體干細(xì)胞移植。
化療劑可以是，例如，任何細(xì)胞毒性藥物，例如，阿霉素、博來霉素、白消安、卡培他濱、碳鉑、卡莫司汀、順鉑、環(huán)磷酰胺、多西他賽、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、依立替康、美法倉、甲氨喋呤、紫杉醇、替尼泊苷、托泊替康、塞替派，或其組合。一般地，化療劑選自有有絲分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝藥、嵌入型抗生素、細(xì)胞周期抑制劑、酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。有絲分抑制劑，例如多西他賽、紫杉醇和長春堿；烷化劑，例如，白消安、碳鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺和塞替派；抗代謝藥，例如，5-氟尿嘧啶、卡培他濱、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、吉西他擯、甲氨喋呤和羥脲，或，例如歐洲專利申請239362中公開的優(yōu)選抗代謝藥中的一種，例如N-(5-[N-(3，4-二羥-2-甲基-4-氧喹唑啉基-6-基甲基)-N-甲氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸；嵌入型抗生素，例如阿霉素、博來霉素和表柔比星。
化學(xué)療法可以是高劑量化學(xué)療法；例如，可施用高劑量的任何上述化療劑。優(yōu)選地，可施用高劑量的白消安、環(huán)磷酰胺、美法侖、塞替派、卡莫司汀、依托泊苷、順鉑、表柔比星、氟達(dá)拉濱或其組合。
化學(xué)療法的例子可以是Childs R，等人，Regression ofmetastatic renal-cell carcinoma after nonmyeloablativeallogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation，N EnglJ Med.2000 Sep 14；343(11)750-8；Basser RL，等人，Multicyclehigh-dose chemotherapy and filgrastim-mobilizedperipheral-blood progenitor cells in women with high-risk stage11 or III breast cancerfive-year follow-up，J Clin Oncol.1999Jan；17(1)82-92；Socie G，等人，Busulfan pluscyclophosphamide compared with total-body irradiation pluscyclophosphamide before marrow transplantation for myeloidleukemialong-term follow-up of 4 randomized studies，Blood2001 Dec 15；98(13)3569-74中公開的化學(xué)療法，其各在此引用作為參考。
因此，化學(xué)療法可包括環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱的組合，然后進(jìn)行干細(xì)胞移植。例如，在移植前的第7天和第6天以每千克體重60mg環(huán)磷酰胺進(jìn)行靜脈內(nèi)輸注之后，可在移植前的最后5天中，每天按每平方米體表面積靜脈內(nèi)輸注25mg氟達(dá)拉濱。這樣的方案可和例如非骨髓清除性異基因外周血干細(xì)胞移植結(jié)合應(yīng)用。
在其他實施方案中，高劑量的化學(xué)療法可包括施用表柔比星、環(huán)磷酰胺、和任選地泌尿系統(tǒng)保護(hù)劑(uroprotective agent)美司鈉(2-巰基乙磺酸鈉)，然后進(jìn)行干細(xì)胞移植。例如，在移植前第4天(第-4天)歷經(jīng)12小時經(jīng)靜脈內(nèi)施用200mg/m2表柔比星(Pharmacia-Upjohn，Milan，Italy)后，在移植前第3天(第-3天)，以分開的4劑歷經(jīng)30分鐘經(jīng)靜脈內(nèi)施用1g/m2的給藥方式，經(jīng)靜脈內(nèi)施用4g/m2環(huán)磷酰胺(Pharmacia-Upjohn)。在施用第一劑環(huán)磷酰胺之前，可按靜脈內(nèi)大劑量輸注法(0.8g/m2)施用泌尿系統(tǒng)保護(hù)劑美司鈉(2-巰基乙磺酸鈉)，然后在第-3天(4g/m2)和第-2天(2.4g/m2)進(jìn)行連續(xù)輸注。這樣的方案可與例如自體外周血干細(xì)胞移植結(jié)合。
在本發(fā)明的其他實施方案中，化學(xué)療法和干細(xì)胞移植可與放射性療法結(jié)合。實施低或高劑量的放射性療法的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，這些技術(shù)可用于此處描述的組合療法中。例如，患者可接受連續(xù)2天每天60mg/kg、總共120mg/kg環(huán)磷酰胺。任選地可以例如16mg/kg(例如在連續(xù)4天內(nèi)每6小時1次口服每劑1mg/kg)施用白消安。全身照射方案可能十分依賴于患者的狀況，例如，患者在分組方案中可接受12Gy。這些方案可與例如異源骨髓移植結(jié)合。
抗體在2000年6月29日公開的國際申請?zhí)朠CT/US99/30895和2002年4月12日公開的歐洲專利申請?zhí)朎P 1262193 A1(兩者在此引用作為參考)中描述了可用于本發(fā)明的抗體和其制備方法。盡管此處提供了序列信息，但其他信息可在WO00/37504和EP 1262193中找到；這些申請的序列在此引用作為參考。
結(jié)合CTLA-4的抗體可用于實踐此處描述的方法。這些抗體的例子包括在WO00/37504中描述的抗體，其被命名為2.1.3、3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1。也包括在國際專利公開號WO01/14424和WO03/086459及美國專利公開號2002/0086014中描述的抗體，這些抗體包括，但不限于，抗體MDX-010(以前稱作抗體“10D1”)。這些抗體一般是具有人κ輕鏈的全長人IgG2或IgG4重鏈。特別地，本發(fā)明涉及具有這些抗體的氨基酸序列的抗體的用途。本發(fā)明也涉及具有這些抗體的重鏈和輕鏈CDRs的氨基酸序列的抗體，以及在CDR區(qū)域中具有變化的抗體，如此處描述的。本發(fā)明也涉及具有這些抗體的重鏈輕鏈可變區(qū)的抗體。在其他實施方案中，所述抗體選自具有抗體4.1.1、11.2.1、4.13.1、4.14.3或6.1.1重鏈和輕鏈的全長氨基酸序列、可變區(qū)或CDR的氨基酸序列的抗體。
在某些實施方案中，用于本發(fā)明的抗體具有圖1-9中所示的氨基酸序列。若圖之間存在任何序列差異，則以圖1-8的公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
在2003年4月29日將下列亞克隆保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209克隆亞克隆 ATCC保藏編號4.1.1 4.1.1.1 PTA-516611.2.1 11.2.1.4 PTA-5169可以領(lǐng)會的是，本發(fā)明的抗體可來源于雜交瘤，但也可在除了雜交瘤外的細(xì)胞系中表達(dá)。編碼特定抗體的cDNAs或基因組克隆的序列可用于合適的哺乳動物或非哺乳動物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?？赏ㄟ^將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何已知的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其包括例如將多核苷酸包裝入病毒(或?qū)氩《据d體)并用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞、或通過本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染方法，例如美國專利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455中例舉的方法轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。用于將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是已知的，其包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀法、聚陽離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(polybrenemediated transfection)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍法、多核苷酸在脂質(zhì)體中的封裝、肽綴合物法(peptide conjugates)、樹枝狀聚合物法(dendrimers)和DNA向細(xì)胞核內(nèi)的直接顯微注射法。
可獲得的用作表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系在本領(lǐng)域是已知的，其包括可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的許多永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)。也可使用非哺乳動物細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、昆蟲和植物的細(xì)胞。為了防止由于非人糖基化導(dǎo)致的免疫原性、藥物動力學(xué)和/或效應(yīng)器功能上的改變，優(yōu)選對抗體CH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定點誘變以除去糖基化。歐洲專利216 846、256 055和323 997以及歐洲專利申請89303964.4全部或部分地描述了谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)。此外，二氫葉酸還原酶(DHFR)表達(dá)系統(tǒng)，包括本領(lǐng)域已知的表達(dá)系統(tǒng)，可用于產(chǎn)生所述抗體。
也可通過轉(zhuǎn)基因的方法，通過產(chǎn)生轉(zhuǎn)有目的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列的哺乳動物或植物并由其生產(chǎn)可回收形式的抗體來生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗體。可從山羊、母?；蚱渌溉閯游锏哪讨猩a(chǎn)和回收轉(zhuǎn)基因抗體。參見，例如，美國專利5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
用于本發(fā)明的抗體優(yōu)選地具有非常高的親和力，當(dāng)通過固相或液相測量時，一般具有從大約10-9至大約10-11M的Kd。
在一個實施方案中，結(jié)合CTLA-4的抗體具有下列特性對CTLA-4的結(jié)合親和力大約為10-9或更高；對CTLA-4和B7-1之間結(jié)合的抑制具有大約100nM或更低的IC50；和對CTLA-4和B7-2之間結(jié)合的抑制具有大約100nM或更低的IC50。
優(yōu)選地，所述抗體包含這樣的重鏈氨基酸序列，該序列含有來源于VH3-30或3-33基因的人CDR氨基酸序列或包含在其上的保守替代或體細(xì)胞突變。所述抗體也可在其輕鏈上包含來源于A27或012基因的CDR區(qū)。
在本發(fā)明的其他實施方案中，所述抗體抑制CTLA-4和B7-1之間的結(jié)合，其具有大約10nM或更低的IC50，例如大約5nM或更低，或例如大約1nM的IC50。
可選擇地，抗CTLA-4抗體和具有選自4.1.1、6.1.1、11.2.1、4.13.1和4.14.3之中的抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體競爭結(jié)合。在另一個實施方案中，該抗體和具有這樣的重鏈和輕鏈序列的抗體或者被保藏的抗體4.1.1或11.2.1交叉競爭。例如，所述抗體可和具有選自4.1.1、6.1.1、11.2.1、4.13.1和4.14.3之中的抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列的抗體結(jié)合的表位結(jié)合。
在另一個實施方案中，通過使用這樣的抗體實踐本發(fā)明，所述抗體包含這樣的重鏈和輕鏈，所述重鏈包含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1之中的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列或者和所述CDR序列相比具有保守性變化、保守性取代、添加或缺失的變化的序列，所述輕鏈包含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1之中的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列，或者和所述CDR序列相比具有保守性變化、保守性取代、添加或缺失的變化的序列，其中所述保守變化選自用其他非極性殘基對非極性殘基的替代、用其他極性不帶電荷殘基對極性帶電荷殘基的替代、用其他極性帶電荷殘基對極性帶電荷殘基的替代和結(jié)構(gòu)相似殘基的替代；其中所述非保守替代選自極性帶電荷殘基對極性不帶電荷殘基的替代以及非極性殘基對極性殘基的替代。在本發(fā)明的其他實施方案中，和生殖系序列相比，抗體在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)含有少于10、7、5或3個氨基酸的變化。在另一個實施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)含有少于5個氨基酸的變化，在CDR區(qū)含有少于10個氨基酸的變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)含有少于3個氨基酸的變化，在CDR區(qū)含有少于7個氨基酸的變化。在優(yōu)選的實施方案中，構(gòu)架區(qū)中的變化是保守的，CDR區(qū)中的變化是體細(xì)胞突變。
下表顯示和生殖系相比本發(fā)明某些抗體的H和L鏈FR以及CDR區(qū)域中的氨基酸變化的數(shù)目。
在另一個實施方案中，抗體包含含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1之中的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重鏈和含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1之中的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的輕鏈。在另一個實施方案中，抗體具有和選自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1之中的抗體相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。在其他實施方案中，抗體包含人基因3-33的重鏈氨基酸序列和人基因A27或012的輕鏈序列。
如此處所用的，術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子中具有化學(xué)活性的表面定組例如氨基酸或糖的側(cè)鏈組成，并且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性的電荷特征。
當(dāng)解離常數(shù)≤1M，優(yōu)選地≤100nM，最優(yōu)選地≤10nM時，抗體被認(rèn)為特異性與抗原結(jié)合。
此處所使用的術(shù)語“抗體”是指完整的抗體，或其和所述完整抗體競爭特異性結(jié)合的結(jié)合片段。通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生結(jié)合片段。結(jié)合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和單鏈抗體。要理解，除了“雙特異性”或“雙功能”抗體外的抗體，其各結(jié)合位點都是完全相同的。當(dāng)過量的抗體將與反受體結(jié)合的受體的量減少至少大約20％、40％、60％或80％以及更一般地多于大約80％(如在體外競爭結(jié)合檢測中測量的)時，抗體基本上抑制了受體與反受體的結(jié)合。
已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單位由四聚體組成。每一四聚體由兩對完全相同的多肽鏈構(gòu)成，各對具有一個“輕”鏈(大約25kDs)和一個“重”鏈(大約50-70kDa)。各鏈的氨基端部分包含大約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原的識別。各鏈的羧基端部分確定了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)。人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε，并將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈也包含大約10多個氨基酸的“D”區(qū)。一般參見，F(xiàn)undamental Immunology Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))。各輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成了抗體結(jié)合位點。
因此，完整的IgG抗體具有兩個結(jié)合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，所述兩個結(jié)合位點是相同的。所有鏈都展示相同的總體結(jié)構(gòu)，即相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)通過三個高變區(qū)(也稱作互補決定區(qū)或CDRs)相連。來自各對的兩條鏈的CDRs通過構(gòu)架區(qū)比對，從而能夠結(jié)合特異性的表位。從N端至C端，輕鏈和重鏈都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在各結(jié)構(gòu)域上的分配和Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等人Nature 342878-883(1989)中的定義一致。
術(shù)語“人抗體”是指具有衍生自人基因的氨基酸序列的抗體，所述人基因包括存在于轉(zhuǎn)基因小鼠中或其他地方的人基因，也包括由于體細(xì)胞突變或在由人基因生成抗體序列時產(chǎn)生的其他變化產(chǎn)生的序列。本發(fā)明包括氨基酸序列中下面描述的類型的變化。
用于本發(fā)明的抗體優(yōu)選地來源于表達(dá)人免疫球蛋白基因的細(xì)胞。已知在本領(lǐng)域中轉(zhuǎn)基因小鼠的用途是產(chǎn)生這些“人”抗體。在Mendez等人Nature Genetics 15146-156(1997)，Greent Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)和美國專利申請系列08/759,620(1996年12月3日提交)中描述了一個這樣的方法。在美國專利申請07/466,008(1990年1月12日提交)、07/610,515(1990年11月8日提交)、07/919,297(1992年7月24日提交)、07/922,649(1992年7月30日提交)、提交08/031,801(1993年3月15日提交)、08/112,848(1993年8月27日提交)、08/234,145(1994年4月28日提交)、08/376,279(1995年1月20日提交)、08/430,938(1995年4月27日提交)、08/464,584(1995年6月5日提交)、08/464,582(1995年6月5日提交)、08/463,191(1995年6月5日提交)、08/462,837(1995年6月5日提交)、08/486,853(1995年6月5日提交)、08/486,857(f1995年6月5日提交)、08/486,859(1995年6月5日提交)、08/462,513(f1995年6月5日提交)、08/724,752(1996年10月2日提交)和08/759,620(1996年12月3日提交)也描述了使用這樣的小鼠獲得人抗體。也參見Mendez等人NatureGenetics 15146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。也參見歐洲專利EP 0 463 151(1996年6月12日授權(quán)公開)、國際專利申請WO 94/02602(1994年2月3日公開)、國際專利申請WO 96/34096(1996年10月31日公開)和WO 98/24893(1998年6月11日公開)。
制備產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的可選擇方法是“微小基因座”方法，其中通過包含來自Ig基因座的片段(單個基因)來模仿外源Ig基因座。將一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、μ恒定區(qū)和第二恒定區(qū)(優(yōu)選地γ恒定區(qū))形成用于插入至動物中的構(gòu)建體。參見屬于Surani等人的美國專利5,545,807和每件都屬于Lonberg和Kay的美國專利5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和5,814,318、屬于Krimpenfort和Berns的美國專利5,591,669、屬于Berns等人的美國專利5,612,205、5,721,367、5,789,215和屬于Choi和Dunn的美國專利5,643,763,以及GenPharm國際美國專利申請07/574,748(1990年8月29提交)、07/575,962(1990年8月31日提交)、07/810,279(1991年12月17日提交)、07/853,408(1992年3月18日提交)、07/904,068(1992年6月23日提交)、07/990,860(1992年12月16日提交)、08/053,131(1993年4月26日提交)、08/096,762(1993年7月22日提交)、08/155,301(1993年11月18日提交)、08/161,739(1993年12月3日提交)、08/165,699(1993年12月10日提交)、08/209,741(1994年3月9日提交)。也參見歐洲專利546 073B1、國際專利申請WO 92/03918、WO92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884。
和此處示例的特定抗體相比在氨基酸序列上具有變化的抗體可用于本發(fā)明的方法中。例如，所述序列可具有“基本一致性”，即表示當(dāng)通過例如程序GAP或BESTFIT，使用默認(rèn)缺口得分(gap weights)進(jìn)行最優(yōu)比對時，原始序列和被改變的序列在完整的抗體、可變區(qū)、構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)的序列上具有至少80％的序列同一性，優(yōu)選地具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選地具有至少95％的序列同一性，最優(yōu)選地具有至少99％的序列同一性。優(yōu)選地，非同一的殘基位點由于保守的氨基酸替代而相異。保守的氨基酸替代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含有酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸替代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地預(yù)期用異亮氨酸或纈氨酸對亮氨酸、用谷氨酸對天冬氨酸、用絲氨酸對蘇氨酸的孤立取代或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸對氨基酸的類似取代對所得分子的結(jié)合或特性沒有重大的影響，特別是當(dāng)取代不包括構(gòu)架位點范圍內(nèi)的氨基酸時。通過測定多肽衍生物的比活性可容易地確定氨基酸的變化是否產(chǎn)生功能肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優(yōu)選的片段或類似物氨基和羧基端發(fā)生在功能性結(jié)構(gòu)域的邊界附近。通過將核苷酸和/或氨基酸序列與公共或私人序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可鑒定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，使用計算機化的比較方法鑒定在已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其他蛋白中存在的序列基序或預(yù)測的蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。鑒定折疊成已知的三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253164(1991)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可識別可用于確定本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和功能性結(jié)構(gòu)域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
優(yōu)選的氨基酸替代是這樣的替代，其(1)減少對蛋白水解的易感性，(2)減少對氧化的易感性，(3)改變與形成蛋白復(fù)合物有關(guān)的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親合力，和(4)提供或修飾這些類似物的其他物理化學(xué)或功能特性。類似物可包括各種除了天然發(fā)生的肽序列外的序列突變蛋白。例如，可在天然發(fā)生的序列(優(yōu)選地在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分)中產(chǎn)生單個或多個氨基酸替代(優(yōu)選地保守的氨基酸替代)。保守的氨基酸替代不應(yīng)當(dāng)顯著地改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，取代氨基酸不應(yīng)當(dāng)打斷在親本序列中存在的螺旋，或破壞表征該親本序列的其他類型二級結(jié)構(gòu))。在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to ProteinStructure(C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991)；以及Thornton等人Nature 354105(1991))中描述了本領(lǐng)域認(rèn)可的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子。
可標(biāo)記用于本發(fā)明方法的抗體。可通過將可檢測標(biāo)記物摻入至，例如將放射性標(biāo)記的氨基酸摻入至或附著至生物素化部分的多肽來實現(xiàn)標(biāo)記，所述生物素化的部分可通過被標(biāo)記的抗生物素蛋白(例如，含有可被光學(xué)的方法或比色法檢測的熒光標(biāo)記物或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白)檢測。在某些情況下，標(biāo)記物或標(biāo)志物也可以是治療性的。標(biāo)記多肽和糖蛋白的各種方法在本領(lǐng)域是已知的并且可被使用。多肽標(biāo)記物的例子包括，但不限于下面放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、熒光標(biāo)記物(例如，F(xiàn)ITC、羅丹明、鑭系磷光劑(lanthanide phosphors))、酶標(biāo)記物(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光劑、生物素化的基團(tuán)、由另一報道物識別的預(yù)先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)。在一些實施方案中，通過各種長度的間隔臂連接標(biāo)記物以減少潛在的空間位阻。
在另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的抗體不完全是人的，而是“人源化的”。特別地，通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可將鼠類抗體或來自其他物種的抗體人源化或靈長類化(primatized)。參見，例如，Winter和Harris Immunol Today 1443-46(1993)以及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992)?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)對抗體進(jìn)行基因工程改造，以用相應(yīng)的人序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和/或構(gòu)架結(jié)構(gòu)域(參見，WO 92/02190和美國專利5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。此外，使用Ig cDNA構(gòu)建嵌合型免疫球蛋白基因在本領(lǐng)域是已知的(Liu等人P.N.A.S.843439(1987)和J.Immunol.1393521(1987))。從雜交瘤或生產(chǎn)抗體的其他細(xì)胞中分離出mRNA并將其用于產(chǎn)生cDNA。可使用特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增目的cDNA(美國專利4,683,195和4,683,202)?；蛘?，可制備文庫并對其篩選以分離感興趣序列。然后將編碼抗體可變區(qū)的DNA序列與人恒定區(qū)序列相融合?？稍贙abat等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，N.I.H.publication no.91-3242中找到人恒定區(qū)基因的序列。可從已知的克隆中容易地獲得人C區(qū)基因?？筛鶕?jù)想要的效器物功能例如補體結(jié)合或抗體依賴型細(xì)胞細(xì)胞毒性中的活性來選擇同種型。優(yōu)選的同種型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本發(fā)明抗體的特別優(yōu)選的同種型是IgG2和IgG4?？墒褂萌溯p鏈(κ或λ)的恒定區(qū)。通過常規(guī)的方法可表達(dá)嵌合的、人源化的抗體。
如上面所提到的，本發(fā)明包括抗體片段(此處包含于“抗體”的定義內(nèi))的用途?？赏ㄟ^完整蛋白的斷裂，例如通過蛋白酶或化學(xué)切割制備抗體片段，例如Fv、F(ab′)2和Fab。可選擇地，設(shè)計截短的基因。例如，編碼F(ab′)2片段的部分的嵌合基因可包含編碼H鏈CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的DNA序列，之后跟隨翻譯終止密碼子，以產(chǎn)生被截短的分子。
在一個方法中，編碼重鏈和輕鏈J區(qū)的共有序列可用于設(shè)計用來將有用的限制性位點導(dǎo)入J區(qū)以便隨后將V區(qū)片段連接至人C區(qū)片段上的引物的寡核苷酸可通過定點誘變來修飾C區(qū)的cDNA，從而將限制性位點置于人序列中的類似位點。
用于獲得在本發(fā)明中使用的抗體的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YACs、來源于EBV的附加體等。方便的載體一般是這樣的載體，即其編碼功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列，具有通過基因工程產(chǎn)生的合適的限制性位點，以使任何VH或VL序列可容易地插入和表達(dá)。在這些載體中，剪接通常發(fā)生在所插入的J區(qū)中的剪接供體位點和人C區(qū)之前的剪接受體位點之間，也發(fā)生在在人CH外顯子內(nèi)存在的剪接區(qū)域。聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼區(qū)下游的天然染色質(zhì)位點上?？蓪⑺玫那逗峡贵w連接任何強啟動子，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs，例如SV-40早期啟動子，(Okayama等人Mol.Cell.Bio.3280(1983))、勞氏肉瘤病毒LTR(Gorman等人P.N.A.S.796777(1982))和鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人Cell 41885(1985))、天然的Ig啟動子等。
也可通過展示型技術(shù)和其他本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生用于實踐本發(fā)明的人抗體或來自其他物種的抗體，所述展示型技術(shù)包括但不限于噬菌體展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示?？墒顾玫姆肿咏邮苓M(jìn)一步的成熟，例如親和力成熟，所述技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。Wright和Harris，Immunol Today 1443-46(1993)，Hanes和Plucthau PNASUSA 944937-4942(1997)(核糖體展示)，Parmley和Smith Gene 73305-318(1988)(噬菌體展示)，Scott TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等人PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等人Nucl.Acids Research 211081-1085(1993)，Hoganboom等人Immunol.Reviews 13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)和美國專利5,733,743。如果將展示技術(shù)用于生產(chǎn)非人的抗體，那么可如上所述人源化這些抗體。
通過使用這些技術(shù)，可產(chǎn)生針對表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞、CTLA-4自身、CTLA-4的各種形式其表位或肽和其表達(dá)文庫(參見，美國專利5,703,057)的抗體，然后可就上述的活性對其進(jìn)行篩選。
經(jīng)制備供本發(fā)明應(yīng)用的抗體一開始不需要具有明確的想要的同種型。當(dāng)然，所述產(chǎn)生的抗體可具有任何同種型，并用可以是此后使用常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)換而來的同種型。這些技術(shù)包括定向重組技術(shù)(參見例如，美國專利4,816,397)和細(xì)胞-細(xì)胞融合技術(shù)(參見例如，美國專利申請08/730,639(1996年10月11日提交)。
通過同種型轉(zhuǎn)換可將本發(fā)明抗體的效應(yīng)器功能改變成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM以便進(jìn)行各種治療用途。此外，例如通過使用雙特異性、免疫毒素或放射性標(biāo)記物可避免對細(xì)胞殺傷的補體的依賴性。
可產(chǎn)生雙特異性抗體，其包含(i)兩個抗體一個抗體具有對于CTLA-4的特異性，而另一個抗體具有對于第二種分子的特異性，(ii)單個抗體，其具有對于CTLA-4有特異性的一條鏈和對于第二種分子有特異性的第二條鏈，或(iii)單鏈抗體，其具有對于CTLA-4和另一種分子的特異性。可使用熟知的技術(shù)(例如，F(xiàn)anger等人ImmunolMethods 472-81(1994)，Wright和Harris，同上和Traunecker等人Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992))產(chǎn)生這些雙特異性抗體。
用于本發(fā)明的抗體也包括“kappabodies”(III等人″Design andconstruction of a hybrid immunoglobulin domain with propertiesof both heavy and light chainvariable regions″Protein Eng 10949-57(1997))、“minibodies”(Martin等人″Theaffinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor ofhumaninterleukin-6″EMBO J 135303-9(1994))、“diabodies”(Holliger等人″′Diabodies′small bivalent and bispecificantibody fragments″PNAS USA 906444-6448(1993))和“janusins”(Traunecker等人″Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells″EMBO J 103655-3659(1991)和Traunecker等人″Janusinnew moleculardesign for bispecific reagents″Int J CancerSuppl 751-52(1992))，也可制備其。
可通過常規(guī)的方法修飾所使用的抗體以使其用作免疫毒素。參見例如，Vitetta Immunol Today 14252(1993)。也參見美國專利5,194,594。也可使用熟知的技術(shù)制備放射性標(biāo)記的抗體。參見例如，Junghans等人Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版，Chafner和Longo，eds.，Lippincott Raven(1996))。也參見美國專利4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE35,500)、5,648,471和5,697,902。
藥物組合物和施用可將用于本發(fā)明的抗體摻入適合給受試者施用的藥物組合物中。一般地，該藥物組合物包含抗體和藥物可接受的媒介物。如此處所用的，“藥物可接受媒介物”包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物可接受媒介物的例子包括水、鹽水、經(jīng)磷酸緩沖的鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中包含等滲劑，例如，糖類、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇或氯化鈉。藥物可接受物質(zhì)例如潤濕劑或少量輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其增加抗體或抗體部分的保質(zhì)期或效力。
所述抗體可以各種形式存在。這些形式包括，例如，液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射和可輸注的溶液)、分散體或懸浮物、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式依賴于想要的施用和治療應(yīng)用模式。一般優(yōu)選的組合物以可注射的或可輸注的溶液的形式存在，例如和用于利用其他抗體進(jìn)行的人被動免疫的組合物相似的組合物。優(yōu)選的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))模式。在優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈內(nèi)輸注或注射施用抗體。在其他優(yōu)選的實施方案中，通過肌內(nèi)或皮下注射施用抗體。
在生產(chǎn)和貯存條件下，治療性組合物一般必須是無菌的和穩(wěn)定的?？蓪⒔M合物配制為溶液、微乳、分散體、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^將抗體以所需要的量摻入具有上面例舉的成分之一或其組合的合適溶劑中，如所要求的，然后進(jìn)行過濾滅菌來制備無菌的可注射溶液。一般地，通過將活性化合物摻入無菌載體中來制備分散體，所述載體包含基本的分散介質(zhì)和所需要的來自上述成分的其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，由事先無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何額外的所需成分的粉末?？赏ㄟ^例如使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過保持所要求的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來保持溶液的合適的流動性?？赏ㄟ^將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽或明膠摻入組合物中來產(chǎn)生可注射組合物的延長吸收。
可通過各種本領(lǐng)域已知的方法施用抗體，所述方法包括，但不限于，口服、經(jīng)腸胃外、經(jīng)粘膜、經(jīng)吸入、經(jīng)局部、經(jīng)口腔、經(jīng)鼻和經(jīng)直腸。對于許多治療性應(yīng)用，優(yōu)選的施用途徑/模式是經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或輸注。如果想要的話，可使用免針注射(Non-needleinjection)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識到的，施用的途徑和/或模式將依所想要的結(jié)果而發(fā)生變化。
在某些實施方案中，可用這樣的媒介物來制備抗體，該媒介物可防止化合物快速釋放，例如受控釋放的制劑，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)(microencapsulated delivery systems)?？墒褂每缮锝到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚羥基乙酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這些制劑的許多方法已取得專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可調(diào)整給藥方案以提供最適合的想要的反應(yīng)。例如，可施用單一大劑量，在一段時間可施用幾份分開的劑量，或可根據(jù)治療狀況的緊急按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配制腸胃外施用的組合物以方便施用和統(tǒng)一劑量是特別有利的。此處使用的劑量單位形式是指物理上分開的單位，其適合作為用于被治療的哺乳動物受試者的單位劑量；每一個單位含有經(jīng)計算可產(chǎn)生想要的治療效果的預(yù)先確定量的活性化合物以及所需的藥物媒介物。本發(fā)明的劑量單位的規(guī)格受制于并直接依賴于(a)抗體的獨特性質(zhì)和要達(dá)到的特定治療性或預(yù)防性效果，和(b)配制這種活性化合物用于治療個體內(nèi)的敏感性領(lǐng)域內(nèi)內(nèi)在的限制。
根據(jù)本發(fā)明，以組合形式施用的抗體的治療性有效量的示例性、非限定性范圍是至少1mg/kg、至少5mg/kg、至少10mg/kg、超過10mg/kg或至少15mg/kg，例如1-21mg/kg，或例如5-21mg/kg，或例如5-18mg/kg，或例如10-18mg/kg，或例如15mg/kg。本發(fā)明的高劑量實施方案涉及超過10mg/kg的劑量。要指出的是，劑量值可隨有待減輕的病癥的類型和嚴(yán)重度的變化而變化，其可包括單劑或多劑。要進(jìn)一步理解的是，對于特定的受試者，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個體的需要和管理或監(jiān)控組合物施用的人的職業(yè)判斷來在一段時間內(nèi)調(diào)整特定的劑量方案，此處提供的劑量范圍僅是示例性的，其并不限定所述組合物的范圍或?qū)嵺`。
在一個實施方案中，以作為無菌水性溶液的靜脈內(nèi)制劑的形式施用抗體，所述水性溶液含有5或10mg/ml的抗體，20mM醋酸鈉、0.2mg/ml聚山梨酸酯80和140mM氯化鈉，pH5.5。
在一個實施方案中，以靜脈內(nèi)大劑量的形式施用劑量的部分并通過抗體制劑的輸注來施用剩余部分。例如，可以大劑量的形式進(jìn)行0.01mg/kg的抗體靜脈內(nèi)注射，預(yù)定抗體劑量的剩余部分可通過靜脈內(nèi)注射施用。例如，可在一個半至兩小時到兩個半小時的時間內(nèi)施用預(yù)先確定劑量的抗體。
本發(fā)明也涉及制品(例如適合經(jīng)靜脈內(nèi)施用的劑型)，其包“對治療癌癥有效的量(例如，超過10mg/kg、至少15mg/kg、或15mg/kg、或20mg/kg)的人抗CTLA-4抗體。在某些實施方案中，制品包含裝載人抗CTLA-4抗體的容器和標(biāo)簽和/或用于治療癌癥的說明書。
其他治療方案上述治療方案可進(jìn)一步和其他癌癥治療劑和/或方案(例如其他化學(xué)療法、癌癥疫苗、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、可用于治療異常細(xì)胞生長或癌癥的試劑、通過結(jié)合IGF-1R來抑制腫瘤生長的抗體或其他配體、和細(xì)胞因子)組合。
當(dāng)哺乳動物接受其他化學(xué)治療時，可使用上述化療劑。此外，可使用生長因子抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biological responsemodifiers)、抗激素治療劑、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)、血管生成抑制劑和抗雄激素藥。例如，可使用抗激素藥，例如抗雌激素如NolvadexTM(它莫西芬)或抗雌激素藥例如CasodexTM(4′-氰基-3-(4-氟苯磺?；?-2-羥基-2-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺)。
在某些本發(fā)明的實施方案中，可將上述方法和癌癥疫苗組合。有用的疫苗可以是，但不限于，由癌癥相關(guān)抗原(例如BAGE、癌胚抗原(CEA)、EBV、GAGE、gp100(包括gp100209-217和gp100280-288等)、HBV、HER-2/neu、HPV、HCV、MAGE、乳腺球蛋白(mammaglobin)、MART-1/Melan-A、Mucin-1、NY-ESO-1、蛋白酶-3、PSA、RAGE、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶(例如，酪氨酸酶368-376)、WT-1)、GM-CSF DNA和基于細(xì)胞的疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗、重組病毒(例如，牛痘病毒)疫苗和熱激蛋白(HSP)疫苗組成的疫苗。有用的疫苗也包括腫瘤疫苗，例如由黑素瘤細(xì)胞形成的疫苗，其可以是自體的或異源的。所述疫苗可以是，例如基于肽、DNA和細(xì)胞的疫苗。可以這樣組合這些不同的試劑，以使包含gp100肽、酪氨酸酶和MART-1的組合能夠和抗體一起施用。
可以在干細(xì)胞移植之前或之后施用疫苗，當(dāng)化學(xué)療法是治療方案的部分時，可在化學(xué)治療之前施用疫苗。在某些實施方案中，也可在化學(xué)治療之前施用本發(fā)明的抗體。也可在干細(xì)胞移植之后施用疫苗，在某些實施方案中，疫苗可以和抗體一起施用。
可將上述療法和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑一起使用，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是例如可抑制EGFR(表皮生長因子受體)應(yīng)答的試劑，例如EGFR抗體、EGF抗體，和作為EGFR抑制劑的分子；VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)抑制劑，例如VEGF受體和可抑制VEGF的分子；和erbB2受體抑制劑，例如可結(jié)合erbB2受體的有機分子或抗體，例如Herceptin(Genentech，Inc.of South San Francisco，California)。
在例如WO 95/19970(1995年7月27日公開)、WO 98/14451(1998年4月9日公開)、WO 98/02434(1998年1月22日公開)和美國專利5,747,498(1998年5月5日授權(quán))中描述了EGFR抑制劑，如此處所描述的，這些物質(zhì)可用于本發(fā)明。EGFR抑制劑包括，但不限于，單克隆抗體ERBITUX(ImClone Systems Incorporated of New York，NewYork)、和ABX-EGF(Abgenix Inc.of Fremont，California)、化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.of Annandale，New Jersey)、和OLX-103(Merck & Co.of Whitehouse Station，New Jersey)、VRCTC-310(Ventech Research)和EGF融合毒素(Seragen Inc.of Hopkinton，Massachusetts)。這些EGFR抑制劑和其他EGFR抑制劑可用于本發(fā)明。
VEGF抑制劑，例如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South SanFrancisco，California)，也可和抗體一起使用。VEGF抑制劑描述于例如WO 99/24440(1999年5月4日公開)、PCT國際申請PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)、WO 95/21613(1995年8月17日公開)、WO 99/61422(1999年12月2日公開)、美國專利5,834,504(1998年11月10授權(quán))、WO 98/50356(1998年12月12日公開)、美國專利5,883,113(1999年3月16日授權(quán))、美國專利5,886,020(1999年3月23日授權(quán))、美國專利5,792,783(1998年8月11日授權(quán))、WO 99/10349(1999年3月4日公開)、WO 97/32856(1997年9月12日公開)、WO 97/22596(1997年6月26日公開)、WO 98/54093(1998年12月3日公開)、WO 98/02438(1998年1月22日公開)、WO 99/16755(1999年4月8日公開)和WO 98/02437(1998年1月22日公開)?？捎糜诒景l(fā)明的一些特定的VEGF抑制劑的其他例子是IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Washington)、IMC-1 C11Imclone抗體、AVASTIN(Genentech，Inc.，San Francisco，CA)；和angiozyme，來自Ribozyme(Boulder，CO)和Chiron(Emeryville，CA)的合成核酶。
ErbB2受體抑制劑，例如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)，和單克隆抗體AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of TheWoodlands，Texas)以及2B-1(Chiron)，可進(jìn)一步和抗體一起使用，所述抗體是例如在WO 98/02434(1998年1月22日公開)、WO 99/35146(1999年7月15日公開)、WO 99/35132(1999年7月15日公開)、WO 98/02437(1998年1月22日公開)、WO 97/13760(1997年4月17公開)、WO 95/19970(1995年7月27日公開)、美國專利5,587,458(1996年12月24日授權(quán))和美國專利5,877,305(1999年3月2日授權(quán))中指出的抗體。在EP1029853(2000年8月23日公開)和WO 00/44728(2000年8月3日公開)中也描述了可用于本發(fā)明的ErbB2受體抑制劑。在前述PCT申請、美國專利和美國臨時申請中描述的ErbB2受體抑制劑化合物和物質(zhì)，以及抑制erbB2受體的其他化合物和物質(zhì)，可和本發(fā)明的抗體一起使用。
本發(fā)明的治療法也可和其他用于治療非正常細(xì)胞生長或癌癥的藥物一起使用，所述其他藥劑包括，但不限于，能夠增強抗腫瘤免疫應(yīng)答的其他藥劑，例如其他的不同的CTLA4抗體，以及也能夠阻斷CTLA4的其他藥劑；抗增殖藥例如法呢基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑和ανβ3抑制劑，例如ανβ3抗體Vitaxin、ανβ35抑制劑、p53抑制劑等。
當(dāng)將本發(fā)明的抗體和其他的免疫調(diào)節(jié)劑一起使用時，所述免疫調(diào)節(jié)劑可選自例如樹突狀細(xì)胞激活劑例如CD40配體和抗CD40激動劑抗體以及抗原呈遞的增強劑、T細(xì)胞向性增強劑、腫瘤相關(guān)免疫抑制因子的抑制劑例如TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)和IL-10。
本治療方案也可和抗體或其他配體組合，所述抗體或其他配體通過結(jié)合IGF-1R(胰島素樣生長因子1受體)來抑制腫瘤生長。可用于本發(fā)明的特異性抗IGF-1R抗體包括在2001年12月20日提交、以WO02/053596公開的PCT申請PCT/US01/51113中描述的抗體。
本發(fā)明的抗體也可和細(xì)胞因子例如IL-2、IFN-g、GM-CSF、IL-12、IL-18和FLT-3L一起施用。
此處描述的治療方案可和抗血管生成劑例如MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)抑制劑和COX-II(環(huán)加氧酶II)抑制劑組合，在本發(fā)明的方法中可和抗體一起使用。有用的COX-II抑制劑的例子包括CELEBREXTM(塞來考昔)、伐地考昔和羅非考昔。有用的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的例子描述于WO 96/33172(1996年10月24日公開)、WO 96/27583(1996年3月7日公開)、歐洲專利申請97304971.1(1997年7月8日提交)、歐洲專利申請99308617.2(1999年10月29日提交)、WO 98/07697(1998年2月26日公開)、WO 98/03516(1998年1月29日公開)、WO 98/34918(1998年8月13日公開)、WO 98/34915(1998年8月13日公開)、WO 98/33768(1998年8月6日公開)、WO 98/30566(1998年7月16日公開)、歐洲專利公開號606046(1994年7月13日公開)、歐洲專利申請931788(1999年7月28日公開)、WO 90/05719(1990年5月31日公開)、WO 99/52910(1999年10月21日公開)、WO 99/52889(1999年1021日公開)、WO99/29667(1999年6月17日公開)、PCT國際申請PCT/IB98/01113(1998年7月21日提交)、歐洲專利申請99302232.1(1999年3月25日提交)、大不列顛專利申請?zhí)?912961.1(1999年6月3日提交)、美國臨時申請60/148,464(1999年8月12日提交)、美國專利5,863,949(1999年1月26日授權(quán))、美國專利5,861,510(1999年1月19日授權(quán))和歐洲專利公開號780386(1997年6月25日公開)。優(yōu)選的MMP-2和MMP-9抑制劑是具有很少和/或沒有抑制MMP-1的活性的抑制劑。更優(yōu)選的是相對于其他基質(zhì)金屬蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)而言選擇性抑制MMP-2和/或MMP-9的抑制劑。
用于本發(fā)明的MMP抑制劑的一些明確的例子是AG-3340、RO32-3555、RS13-0830和下面列表中引用的化合物3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨基甲酰基-環(huán)戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；被鵠-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-芐氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氫-吡喃-4-羧酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨基甲?；?環(huán)丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氫-吡喃-4-羧酸羥基酰胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺?；被鵠-四氫-吡喃-3-羧酸羥基酰胺；
(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-芐氧基)-苯磺酰基]-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯碘?；鵠-(1-羥基氨基甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(4-羥基氨基甲?；?四氫-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；3-內(nèi)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基酰胺；和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；被鵠-四氫-呋喃-3-羧酸羥基酰胺；和所述化合物的藥物可接受鹽和溶劑化物。
在下列非限制性實施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實施例實施例1使用命名為11.2.1的人抗CTLA-4抗體進(jìn)行研究。以大丸劑(0.01和0.1mg/kg劑量水平)或在一小時內(nèi)(1至10mg/kg劑量水平)或在二個半小時內(nèi)(15mg/kg劑量水平)以無菌水性溶液經(jīng)靜脈內(nèi)途徑施用單劑抗體，所述無菌水性溶液含有5或10mg/ml抗體、20mM醋酸鈉、0.2mg/ml聚山梨酸酯80和140mM氯化鈉，pH 5.5。觀察目的腫瘤反應(yīng)。
施用下列劑量(以mg/kg為單位)0.01、0.1、1.0、3.0、6.0、10.0和15.0。大部分患者患有黑素瘤、高度發(fā)展的轉(zhuǎn)移性疾病；兩位患者患有第三期黑素瘤；四位患者患有腎細(xì)胞癌，一位患者患有結(jié)腸癌。三位患者接受0.01mg/kg；三位患者接受0.1mg/kg；三位患者接受1mg/kg；八位患者接受3mg/kg；五位患者接受6mg/kg；十一位患者接受10mg/kg；六位患者接受15mg/kg。
抗體在15mg/kg時驚人地有效。在該劑量上，觀察到三個目的腫瘤反應(yīng)(兩個完全反應(yīng)，一個部分反應(yīng))。
在下列表中提供了表現(xiàn)已獲得一定臨床有益方面的患者的結(jié)果，其中使用下列縮寫AWD帶瘤生存組(alive with disease)；CR完全反應(yīng)；docet多西他賽(docetaxel)；LN淋巴結(jié)；NE不可測量；NED無疾病證據(jù)(not evidence of disease)；PD疾病的進(jìn)展；post-Tx治療后；PR；部分反應(yīng)；RFA射頻消融術(shù)；SC皮下；SD疾病穩(wěn)定；SX手術(shù)；tem替莫唑胺(temozolamide)；thal沙利度胺；XRT放射性治療。
實施例2
用化學(xué)療法、干細(xì)胞移植和人抗CTLA-4抗體11.2.1的組合治療患實體瘤的患者，所述實體瘤是例如乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和兒童時期肉瘤(pediatric sarcomas)。
患者在移植前第7天和第6天每天接受每千克體重60mg環(huán)磷酰胺的靜脈內(nèi)輸注，然后在移植前最后5天每天接受每平方米體表面積25mg氟達(dá)拉濱的靜脈內(nèi)輸注。
通過用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)處理供體、動員來自骨髓的干細(xì)胞，由此制備干細(xì)胞移植體。在動員之后，如Williams等人，BoneMarrow Transplantation 5129-33(1990)和Hillyer等人，Transfusion 33316-21(1993)中所描述的，使用CS 3000血細(xì)胞分離器(Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)從供體外周血中收集干細(xì)胞。通過大管徑中央靜脈導(dǎo)管輸注施用干細(xì)胞移植體。
可選擇地，在供體處于全身或脊髓麻醉的情況下，從供體的髂后嵴或髂前嵴中收集骨髓。抽吸大約10至15mL/kg骨髓，置于肝素化的介質(zhì)中，通過0.3和0.2mm的篩子過濾以除去脂肪和小骨質(zhì)。依賴于臨床狀況，可進(jìn)一步處理所收集的骨髓，即通過除去紅細(xì)胞以防止ABO血型不相容的移植體中的溶血，或除去供體T細(xì)胞以防止移植物抗宿主病(GVHD)。
移植后30天，在兩個半小時的時間內(nèi)通過輸注給患者施用15mg/kg的抗體11.2.1。被指定用多份抗體劑量治療的患者組在移植后3或6個月時接受額外的15mg/kg劑量。
通過觀察疾病終點如長期存活、無疾病存活(復(fù)發(fā)時間)、反應(yīng)速度、反應(yīng)持續(xù)時間和/或進(jìn)展時間來監(jiān)控治療效果。
盡管本發(fā)明通過特定的實施方案被公開，但很明顯，其他本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計本發(fā)明的其他實施方案和變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。所附的權(quán)利要求應(yīng)當(dāng)理解為包括所有這些實施方案和等同的變化。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.
Gomez-Navarro，JesusHanson，Douglas C.
Eileen，Mueller ElliottNoe，Dennis A.
<120>抗CTLA-4抗體的用途<130>PC32177A<150>US 60/556，801<151>2004-03-26<160>91<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1392<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
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1.治療哺乳動物中的癌癥的方法，其包括給所述哺乳動物施用超過10mg/kg的人抗CTLA-4抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其包括給所述哺乳動物施用至少15mg/kg的人抗CTLA-4抗體。
3.權(quán)利要求1的方法，其包括給所述哺乳動物施用15mg/kg的人抗CTLA-4抗體。
4.用于在哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括給已接受干細(xì)胞移植的哺乳動物施用有效量的人抗CTLA-4抗體。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述哺乳動物是人。
6.權(quán)利要求4-5的方法，其中所述干細(xì)胞移植選自骨髓移植、外周血干細(xì)胞移植、異源干細(xì)胞移植和自體干細(xì)胞移植。
7.權(quán)利要求4-5的方法，其中所述哺乳動物在干細(xì)胞移植之前授受高劑量化學(xué)治療。
8.權(quán)利要求7的方法，其中用于所述化學(xué)治療的藥劑是選自下述的至少一種藥劑白消安、環(huán)磷酰胺、美法倉、塞替派、卡莫司汀、表柔比星、氟達(dá)拉濱和依托泊苷。
9.權(quán)利要求4-5的方法，其中所述哺乳動物在干細(xì)胞移植之前接受全身輻射。
10.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌，肺癌、包括小細(xì)胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮膚癌，頭部或頸部的癌，黑色素瘤、包括皮膚惡性黑色素瘤或眼內(nèi)惡性黑色素瘤，子宮癌，卵巢癌，直腸癌，肛門區(qū)的癌，胃癌，結(jié)腸癌，睪丸癌，子宮癌，輸卵管癌，子宮內(nèi)膜癌，子宮頸癌，陰道癌，女陰部分的癌，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，食管癌，小腸癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，陰莖癌，前列腺癌，慢性或急性白血病、包括急性粒細(xì)胞樣白血病、慢性粒細(xì)胞樣白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病，兒童期實體瘤，淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，表皮T細(xì)胞淋巴瘤，膀胱癌，腎或輸尿管癌，腎細(xì)胞癌，腎盂癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，腫瘤血管發(fā)生，spinal axis tumor，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，垂體腺瘤，卡波西肉瘤、表皮樣癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌，T淋巴細(xì)胞淋巴癌，環(huán)境誘導(dǎo)的癌、包括由石棉誘導(dǎo)的癌，骨髓瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和兒童期肉瘤。
11.權(quán)利要求1-10的方法，其中所述人抗CTLA-4抗體是選自具有抗體4.1.1、抗體4.13.1、抗體4.14.3、抗體6.1.1和抗體11.2.1之氨基酸序列的抗體的抗體。
12.權(quán)利要求1-10的方法，其中所述人抗CTLA-4抗體具有抗體10D1的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1-10的方法，其中所述人抗CTLA-4抗體具有選自抗體4.1.1、抗體4.13.1、抗體4.14.3、抗體6.1.1和抗體11.2.1之中的抗體的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-10的方法，其中所述人抗CTLA-4抗體具有選自抗體4.1.1、抗體4.13.1、抗體4.14.3、抗體6.1.1和抗體11.2.1之中的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1-10的方法，其中所述人抗CTLA-4抗體和選自抗體4.1.1、抗體4.13.1、抗體4.14.3、抗體6.1.1和抗體11.2.1的抗體交叉競爭。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給哺乳動物施用有效量的人抗CTLA－4抗體而在已接受干細(xì)胞移植的哺乳動物中治療癌癥。干細(xì)胞移植可以是異源干細(xì)胞移植或自體干細(xì)胞移植，并且可在之前進(jìn)行預(yù)備治療例如化學(xué)治療。本發(fā)明的方法可與其他癌癥療法結(jié)合。此外，本發(fā)明涉及使用至少10mg/kg的人抗CTLA－4抗體、更優(yōu)選地大約15－20mg/kg抗體治療癌癥。
文檔編號A61K45/00GK1964739SQ200580009828
公開日2007年5月16日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者J·戈麥斯-納瓦羅, D·C·漢森, E·E·米勒, D·A·諾埃 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司