專利名稱：與腹部疾病有關(guān)的表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腹部疾病的診斷和治療中有用的表位，包括診斷劑、治療劑、試劑盒和使用前述的方法。
腹部疾病由免疫介導(dǎo)的對飲食谷蛋白的超敏反應(yīng)造成。小麥、黑麥、大麥和有些情況下燕麥中的谷蛋白，在腹部疾病中是毒性的。谷蛋白由小麥中的α/β、γ和ω麥醇溶蛋白和低和高分子量(LMW和HMW)麥谷蛋白，大麥中的大麥醇溶蛋白，黑麥中的黑麥醇溶蛋白，和燕麥中的燕麥蛋白組成。大麥醇溶蛋白和黑麥醇溶蛋白與小麥中的γ和ω麥醇溶蛋白和低和高分子量麥谷蛋白是同源的。燕麥蛋白在種系發(fā)生上比大麥醇溶蛋白和黑麥醇溶蛋白離小麥谷蛋白更遠。
研究腹部疾病的目的是，通過定義刺激谷蛋白-特異性的T-細胞的肽來定義谷蛋白的有毒組分。谷蛋白表位的準(zhǔn)確定義，允許開發(fā)新的診斷、治療、食物中的谷蛋白污染的測試和保留傳統(tǒng)谷蛋白的烹飪/烘烤質(zhì)量的無毒谷物。許多這樣的應(yīng)用，需要全面理解谷蛋白中的全部而不是最常見的有毒肽。
與大約35％一般高加索人口相比，編碼HLA-DQ2和/或HLA-DQ8的基因存在于超過99％患有腹部疾病的個體中。谷蛋白-衍生的結(jié)合HLA-DQ2或HLA-DQ8的肽(表位)刺激特定的T-細胞。HLA-DQ2和DQ8-限制的表位包括“核心”9氨基酸序列，其直接與HLA-DQ2或DQ8的肽結(jié)合溝和同源的T-細胞受體相互作用。通常，含有抗原中的所有獨特的10或12聚體肽的重疊肽(通常15-20聚體)文庫，已經(jīng)用于繪制HLA II類-限制的T-細胞表位的圖譜。
已知一系列的谷蛋白肽在腹部疾病中激活谷蛋白特異性的T-細胞。以前的研究已經(jīng)從選擇的谷蛋白或谷蛋白消化物中鑒別出了谷蛋白肽。從腸活組織檢查分離的T-細胞克隆和系，已經(jīng)用于篩選這些谷蛋白組分。
酶(存在于腸組織中的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG))對谷蛋白的修飾相當(dāng)大地增加谷蛋白對谷蛋白特異性的T-細胞的刺激能力。谷蛋白-特異性的T-細胞的大多數(shù)已知表位，對應(yīng)著tTG-脫酰胺的谷蛋白肽。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)谷蛋白中的特定谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用(生成谷氨酸)。對tTG的脫酰胺作用易感的含有谷氨酰胺的序列通常符合基序QXPX或QXX(FYMILVW)，(見Vader W.等2002J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem27734109-16)。結(jié)合HLA-DQ2且對tTG的脫酰胺作用易感的肽的基序，已經(jīng)用于預(yù)測某些谷蛋白表位(Vader等J Exp Med 2002 J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079)。
但是，其它組已經(jīng)使用一系列11種重組α/β(11)和5種γ麥醇溶蛋白(Arentz-Hansen H.2000.J.Exp.Med.191603-612，Arentz-Hansen H.2002.Gastroenterology 123803-809，PCT WO 02/083722)和純化的谷蛋白蛋白的裂解物(Sjostrom H.等1998.Scand.J.Immunol.48，111-115；van de Wal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)1585-1588；van de Wal，Y.等1999.Eur.J.Immunol.293133-3139；Vader W.等2002.Gastroenterology 1221729-1737.)，鑒別出了谷蛋白-特異性的腸T-細胞克隆和系的表位。
我們的工作已利用了下述發(fā)現(xiàn)，即谷蛋白體內(nèi)攻擊誘導(dǎo)外周血中表達腸-歸巢的整聯(lián)蛋白(α4β7)的HLA-DQ2限制的CD4+谷蛋白-特異性的T-細胞。該技術(shù)允許對A-麥醇溶蛋白(57-73QE65)中的優(yōu)勢表位繪制圖譜(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6337-342.，WO 01/25793)。A-麥醇溶蛋白57-73QE65對應(yīng)著使用腸T-細胞克隆鑒別出的2種重疊表位(Arentz-Hansen H.等2000.J.Exp.Med.191603-612，Arentz-Hansen H.等2002.Gastroenterology 123803-809)。體內(nèi)谷蛋白攻擊誘導(dǎo)谷蛋白特異性的T-細胞的優(yōu)點是，可以消耗任意的食物，且得到的在血液中誘導(dǎo)的T-細胞(使用簡單的過夜干擾素γELISPOT測定，在外周血中定量的)，會受到內(nèi)源地存在的表位的體內(nèi)刺激，而不是由合成的或純化的抗原體外預(yù)處理。新鮮的多克隆的外周血T-細胞的過夜測定，也會避免與T-細胞克隆的非常長的純化有關(guān)的假象的可能性。
有趣地，對幾種γ-麥醇溶蛋白表位特異性的T-細胞克隆和系(Arentz-Hansen H.2002.Gastroenterology 123803-809，PCT WO02/083722)與最初定義的A-麥醇溶蛋白表位57-73QE65交叉反應(yīng)。
盡管在α/β麥醇溶蛋白中存在相當(dāng)大的同源性，但早期的工作(見WO 03/104273)已經(jīng)表明，在HLA-DQ2-相關(guān)的腹部疾病中識別出的優(yōu)勢表位“A-麥醇溶蛋白57-73QE65”，是由Genbank中存在的少數(shù)α/β麥醇溶蛋白編碼的。
發(fā)明概述本研究的目的是開發(fā)一種方法，其允許對谷蛋白中的所有T-細胞表位繪制圖譜。使用小麥面包(每天200g，持續(xù)3天)或燕麥(每天100g，持續(xù)3天)的消耗，誘導(dǎo)外周血中的谷蛋白或燕麥蛋白-特異性的T-細胞(在開始攻擊后6天收集)。使用谷蛋白和燕麥蛋白肽文庫，包括在小麥谷蛋白和/或燕麥的燕麥蛋白的每個Genbank登記項中包含的所有獨特的12聚體序列，在過夜干擾素γELISPOT測定中評價外周血單核細胞(PBMC)。通過確立一種算法，以設(shè)計跨過Genbank中的谷蛋白的所有潛在表位的肽(2922個20聚體包括所有14964獨特的9聚體-潛在的T-細胞表位)，將干擾素-γELISPOT測定修改成能用單一個體血液篩選超過1000種肽的高通量測定，并開發(fā)用于分析和解釋產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)工具，可以實現(xiàn)該目的。
將小麥谷蛋白肽的一系列的41個“超家族”鑒別為推定的T-細胞表位。超家族共有基序，其中允許有限水平的冗余。許多最有效的家族包括已知的T-細胞表位，其中包括以前描述的優(yōu)勢表位A-麥醇溶蛋白57-73。
通過使用谷蛋白攻擊后的PBMC，對谷蛋白表位詳盡地繪制圖譜，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與HLA-DQ2和HLA-DQ8有關(guān)的腹部疾病的一系列新的麥醇溶蛋白、LMW和HMW麥谷蛋白和燕麥蛋白表位。為HLA-DQ2和HLA-DQ8-相關(guān)的腹部疾病，鑒別了新表位。在識別的T-細胞表位的范圍方面，HLA-DQ2和HLA-DQ8相關(guān)的腹部疾病在遺傳上和功能上是不同的。另外，在HLA-DQ2+腹部疾病受試者中進行燕麥攻擊后，存在于燕麥的燕麥蛋白中的3種肽也會激活外周血單核細胞(PBMC)，首次定義了燕麥表位。體內(nèi)燕麥攻擊后由T-細胞識別的燕麥蛋白肽的鑒別，提供了觀察到的燕麥暴露后腹部疾病的偶然復(fù)發(fā)的分子基礎(chǔ)(Lundin KEA等2003Gut 521649-52)，并可以提供燕麥的預(yù)測性診斷或遺傳解毒作用的基礎(chǔ)。
這里顯示的數(shù)據(jù)會提供詳盡的基礎(chǔ)，用于定義腹部疾病中常見的“優(yōu)勢的”和偶然的“較弱的”T-細胞表位。該信息是諸如診斷、食品測試、免疫治療和預(yù)防的功能應(yīng)用的平臺，和用于設(shè)計在改良的谷物中有用的無毒的谷蛋白的平臺。
具體地，通過谷蛋白T細胞表位的詳盡繪圖，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有類似的核心序列(例如，SEQ ID NO1-199)和類似的延伸序列(例如，SEQ ID NO200-1554、1555-1655、1656-1671和1830-1903)的小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了下述物質(zhì)中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位具有類似的核心序列(例如，SEQ ID NO1684-1695)和類似的延伸序列(例如，SEQ ID NO1672-1683、1696-1698和1764-1768)的燕麥的燕麥蛋白；黑麥的黑麥醇溶蛋白(SEQ ID NO1769-1786)；和大麥的大麥醇溶蛋白(SEQID NO1787-1829)。另外，在具有類似的核心序列(例如，SEQ ID NO1699-1721)和類似的延伸序列(例如，SEQ ID NO1722-1763和1908-1927)的小麥麥醇溶蛋白中已經(jīng)鑒別出了在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。因而，該詳盡的繪圖提供了腹部疾病患者中由T細胞識別的優(yōu)勢表位。因而使用這些鑒別出的表位、其類似物和等價物中的任一種，可以實現(xiàn)本文所述的本發(fā)明的方法。也就是說，本發(fā)明的試劑包括這些表位。另外，已經(jīng)表明，表位的組合即“combitope”或包含2個或更多個表位的單個肽誘導(dǎo)與單獨的表位等價的反應(yīng)，從而表明幾個表位可以用于本發(fā)明的治療、診斷和其它用途。這樣的combitope可以是例如SEQ ID NO1906的形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑包括一個或多個具有在SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中列出的序列的表位，如本文定義的其類似物和等價物。
優(yōu)選的在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的試劑在序列中具有谷氨酰胺，其指示著對脫酰胺作用的易感性，其與也對脫酰胺作用易感的第二個谷氨酰胺由7個殘基隔開(例如，如在QGSFQPSQQ中發(fā)現(xiàn)的)，其中在tTG的脫酰胺作用后，脫酰胺的序列是HLA-DQ8的高親和力結(jié)合劑(HLA-DQ8的結(jié)合基序偏好在位置1和9處的谷氨酸)。在一個次優(yōu)選的實施方案中，試劑具有對脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，但是與對tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的第二個谷氨酰胺之間沒有被7個殘基隔開。
因而，本發(fā)明提供了診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含下述步驟(a)使來自宿主的樣品接觸選自下述的試劑(i)表位，其包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選選自SEQ IDNO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的氨基酸序列，或來自天然產(chǎn)生的谷蛋白的等價序列，(ii)(i)的類似物，其能被識別(i)的T細胞受體識別，在肽類似物的情況下，它的長度不超過50個氨基酸，或(iii)產(chǎn)物，其包含兩種或更多種如(i)或(ii)中所定義的試劑；和(b)體外測定樣品中的T細胞是否識別該試劑，其中T細胞的識別指示著該個體患有或易感腹部疾病。
術(shù)語“谷蛋白”包括小麥中的α/β、γ和ω麥醇溶蛋白，和低和高分子量(LMW和HMW)麥谷蛋白，大麥中的大麥醇溶蛋白，黑麥中的黑麥醇溶蛋白，和燕麥中的燕麥蛋白。本發(fā)明特別地涉及麥醇溶蛋白和燕麥蛋白。
本發(fā)明也提供了試劑在制備用于診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒ㄖ械脑\斷工具中的用途，所述方法包含，測定個體的T細胞是否識別該試劑，其中T細胞的識別指示著該個體患有或易感腹部疾病。
被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾的表位的發(fā)現(xiàn)，也允許基于測定是否存在針對這些表位的其它類型的免疫反應(yīng)來診斷腹部疾病。因而，本發(fā)明也提供了診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含測定來自個體的樣品中能結(jié)合表位的抗體的存在，其中抗體的存在指示著該個體患有或易感腹部疾病。
本發(fā)明提供了測定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成如上定義的寡肽序列的蛋白，其中所述蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
本發(fā)明也提供了突變的谷蛋白，其野生型序列可被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含表位的序列，所述表位包含如上定義的序列，但是該突變的谷蛋白已經(jīng)被修飾，該修飾方式使它不含有可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含這樣的包含所述序列的表位的序列的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長度為至少7個氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸長)，且其包含已經(jīng)以所述方式修飾的序列。
本發(fā)明也提供了蛋白，其包含能結(jié)合T細胞受體的序列，該T細胞受體識別試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細胞受體的T細胞的拮抗作用。
另外，本發(fā)明提供了包含如上定義的蛋白的食物。
另外，本發(fā)明提供了試劑，其任選地與載體相結(jié)合，用于通過使識別試劑的T細胞耐受來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。還提供了具有識別(i)的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，用于通過拮抗這樣的T細胞來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。另外，提供了結(jié)合抗體(其結(jié)合試劑)的試劑或類似物，其用于通過使個體耐受以預(yù)防這樣的抗體的生成來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用至少一種選自下述的試劑a)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價物；和b)a)的類似物，其能被識別a)的肽的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸。在有些實施方案中，試劑是HLA-DQ2-限制的、HLA-DQ8-限制的，或一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。在有些實施方案中，試劑包含小麥表位、燕麥表位、黑麥表位、大麥表位或其任意組合，或者是作為單一試劑或者是作為復(fù)合試劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用藥物組合物，所述組合物包含如上定義的試劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用藥物組合物，所述組合物包含具有如上定義的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用組合物，以用于使個體耐受谷蛋白，以抑制生成對如上定義的試劑的T細胞或抗體反應(yīng)，該組合物包含如上定義的試劑。
本發(fā)明也提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，這通過下述來實現(xiàn)1)診斷個體的腹部疾病，這通過下述來實現(xiàn)a)使來自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價物；和ii)i)的類似物，其能被識別i)的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸；和體外測定樣品中的T細胞是否識別該試劑；T細胞的識別指示著個體患有或易感腹部疾?。换騜)施用如上定義的試劑，和體內(nèi)測定個體中的T細胞是否識別該試劑，其中試劑的識別指示著個體患有或易感腹部疾??；和2)給診斷為患有或易感腹部疾病的個體，施用用于預(yù)防或治療腹部疾病的治療劑。
本發(fā)明也提供了如上定義的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過使識別試劑的T細胞耐受來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了具有如上定義的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過拮抗這樣的T細胞來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
本發(fā)明也提供了蛋白，其包含能結(jié)合T細胞受體的序列，該T細胞受體識別如上定義的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細胞受體的T細胞的拮抗作用。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含如上定義的試劑或拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明也提供了組合物，其用于使個體耐受谷蛋白，以抑制生成對如上定義的試劑的T細胞或抗體反應(yīng)，該組合物包含如上定義的試劑。
本發(fā)明也提供了組合物，其用于拮抗對如上定義的試劑的T細胞反應(yīng)，該組合物包含如上定義的拮抗劑。
本發(fā)明也提供了突變的谷蛋白，其野生型序列可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如上定義的試劑的序列，該突變的谷蛋白包含一個突變，所述突變可以預(yù)防它被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如上定義的試劑的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長度為至少7個氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸長)，且其包含該突變。
本發(fā)明也提供了多核苷酸，其包含編碼如上定義的蛋白或片段的編碼序列。
本發(fā)明也提供了細胞，其包含如上定義的多核苷酸，或其已經(jīng)被這樣的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明也提供了哺乳動物，其表達如上定義的T細胞受體。
本發(fā)明也提供了診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含a)使來自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927，優(yōu)選地選自SEQ ID NOSEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等價物；和ii)i)的類似物，其能被識別i)的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸；和b)體外測定樣品中的T細胞是否識別該試劑；T細胞的識別指示著該個體患有或易感腹部疾病。
本發(fā)明也提供了測定該組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成寡肽序列的蛋白，其中蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
本發(fā)明也提供了鑒別T細胞的拮抗劑的方法，該T細胞識別如上定義的試劑，所述方法包含使候選物質(zhì)接觸T細胞，和檢測該物質(zhì)是否造成T細胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測，指示著所述物質(zhì)是拮抗劑。
本發(fā)明也提供了用于實施上述的任一種方法的試劑盒，其包含如上定義的試劑和用于檢測T細胞對肽的識別的工具。
本發(fā)明也提供了鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含給如上定義的患有或易感腹部疾病的哺乳動物施用候選物質(zhì)，并測定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)由如上定義的編碼序列編碼的蛋白的方法，該方法包含a)在允許表達蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的細胞；和任選地b)回收表達的蛋白。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因的植物細胞的方法，其包含用如上所述的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細胞。
本發(fā)明也提供了得到第一代轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含再生用如上所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的植物細胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因植物種子的方法，其包含從可如上得到的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子。
本發(fā)明也提供了得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從可由如上所述的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，并任選地從由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了可由任一種上述的方法得到的轉(zhuǎn)基因的植物細胞、植物、植物種子或后代植物。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，其包含如上所述的植物細胞。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因的植物細胞愈傷組織，其包含如上所述的可從如上定義的轉(zhuǎn)基因的植物細胞、第一代植物、植物種子或后代得到的植物細胞。
本發(fā)明也提供了得到作物產(chǎn)物的方法，其包含從根據(jù)任一種上述的方法的植物收獲作物產(chǎn)物，和任選地進一步加工收獲的產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供了食物，其包含如上定義的蛋白。
附圖簡述

圖1顯示了從一組蛋白產(chǎn)生所有可能的肽表位的方法。
圖2顯示了在2003年6月16日的Genbank數(shù)據(jù)庫中存在的谷蛋白基因產(chǎn)物的Genbank登記號。
圖3A顯示了分析來自ELISpot的數(shù)據(jù)的期望最大化(EM)算法。
圖3B顯示了對腹部疾病患者的數(shù)據(jù)集的測試。
圖4顯示了發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性表位的最小集的迭代過程。
圖5顯示了麥醇溶蛋白和麥谷蛋白序列(SEQ ID NO1-1554)。在“一致”列中，小寫字母使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸代碼，但是大寫字母具有不同的含義E＝[e或q]，F(xiàn)＝[f或y或w]，I＝[i或l或v]，S＝[s或t]，R＝[r或k或h]?！靶蛄小绷惺褂脴?biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸代碼。
圖6顯示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻擊后6天收集的PBMC中，刺激γ干擾素的谷蛋白肽(SEQ ID NO1555-1655)。標(biāo)示的9聚體是200組生物活性的“結(jié)構(gòu)上”有關(guān)的20聚體肽共有的。根據(jù)受試者反應(yīng)的生物活性X比例，排列谷蛋白序列。
圖7顯示了小麥攻擊實驗的結(jié)果(SEQ ID NO1656-1671)。在小麥攻擊后，這些肽在10位受試者(A-J)中產(chǎn)生高質(zhì)量反應(yīng)(標(biāo)示‘Y’)。
圖8顯示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻擊后6天收集的PBMC中，刺激干擾素-γ的燕麥蛋白肽(+/-tTG的脫酰胺作用)(SEQ ID NO1672-1698)。標(biāo)有*的那些是燕麥攻擊后誘導(dǎo)IFN-γ的最佳的獨特的20聚體。
圖9顯示了在2位根據(jù)共有的核心序列分組的HLA-DQ8(不是HLA-DQ2)受試者中最有效的40種20聚體(SEQ ID NO1699-1763)。組6的核心序列(QGSFQPSQQ)對應(yīng)著van de Wal等(J.Immunol.1998，161(4)1585-1588)所述的α-麥醇溶蛋白表位。受試者A中的最大反應(yīng)是271SFC(單獨的介質(zhì)，沒有肽反應(yīng)4SFC)，且在B中，是26SFC(單獨的介質(zhì)，沒有肽反應(yīng)1SFC)。
圖10顯示了基于氨基酸測序的A-麥醇溶蛋白(SEQ ID NO1928)的氨基酸序列。
發(fā)明詳述術(shù)語“腹部疾病”包括通過改變谷蛋白敏感度的程度造成的多種狀況，其包括特征在于扁平小腸粘膜(增生性絨毛萎縮)的嚴(yán)重形式和特征在于輕癥狀的其它形式。
上面(在診斷或治療的上下文中)提及的個體是人。他們可能患有或被懷疑患有腹部疾病(有癥狀的或無癥狀的)。他們可能采用無谷蛋白的飲食。他們可能是在急性期反應(yīng)中(例如，他們可能患有腹部疾病，但是在最近的24小時，僅僅攝入谷蛋白，然后他們采用無谷蛋白的飲食14-28天)。
個體可能易感腹部疾病，例如遺傳易感性(例如通過有患有腹部疾病的親戚或具有會造成對腹部疾病的素因的基因的個體來確定)。
試劑試劑一般地是肽，例如長為7-50個氨基酸，例如長為10-40、12-35或15-30個氨基酸。
試劑可以是由SEQ ID NO1-1927中的任一個代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO1-1927中的任一個，其是分離的源自谷蛋白蛋白的寡肽；或來自天然產(chǎn)生的谷蛋白蛋白的這些序列的等價物。在本發(fā)明的另一組實施方案中，試劑是燕麥谷蛋白的任意肽表位(例如，燕麥蛋白的任意T細胞表位)。
優(yōu)選地，試劑是由SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個，其是分離的源自谷蛋白的寡肽；或來自天然產(chǎn)生的谷蛋白的這些序列的等價物。
因而，表位可以是天然產(chǎn)生的谷蛋白的衍生物，尤其是來自小麥或燕麥谷蛋白。這樣的衍生物一般地是谷蛋白的片段，或整個蛋白或片段的突變的衍生物。因此，本發(fā)明的表位不包括天然產(chǎn)生的整個谷蛋白，且不包括其它的整個的天然產(chǎn)生的谷蛋白。
一般地，這樣的片段長為至少7個氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸長)。
一般地，在本文所述的使用來自腹部疾病患者的樣品的任意測定中，T細胞會以至少與識別片段所來源的試劑相同的程度識別這樣的片段。
試劑可以是由SEQ ID NO1-1927中的任一個代表的肽，優(yōu)選地由SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個代表的肽，或蛋白，所述蛋白包含與SEQ ID NO1-1927中的任一個相對應(yīng)的序列，優(yōu)選地包含與SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個相對應(yīng)的序列(例如包含SEQ ID NO1-1927中的任一個，優(yōu)選地包含SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個的谷蛋白片段，例如，在已經(jīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理谷蛋白后)。這樣的序列的生物活性的片段，也是本發(fā)明的試劑。一般地，這樣的片段長為至少7個氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸長)。與SEQ ID NO1-1927中的任一個等價的序列或這些序列的類似物，也是本發(fā)明的試劑。
在表位包含與來自另一種谷蛋白(例如，任一種本文提及的谷蛋白或任一種會造成腹部疾病的谷蛋白)的上述表位(包括片段)等價的序列的情況下，這樣的等價序列對應(yīng)著一般地用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(部分地或完全地)處理的谷蛋白的片段。通過比對其它谷蛋白和原始表位所來源的谷蛋白的序列(例如，使用任一種本文提及的程序)，可以確定這樣的等價肽。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是可商業(yè)上得到的(例如，SigmaT-5398)。
作為類似物的試劑能被識別(i)的TCR識別。因此，通常當(dāng)在存在(i)的情況下，且一般地，也在抗原呈遞細胞(APC)(例如本文提及的APC中的任一種)存在的情況下，將類似物添加給T細胞時，類似物抑制(i)的識別，即類似物能在這樣的系統(tǒng)中與(i)競爭。
類似物可以是能結(jié)合識別(i)的TCR的一種類似物。通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，可以檢測這樣的結(jié)合。從已經(jīng)表明能識別(i)的T細胞，可以分離這樣的TCR(例如，使用本發(fā)明的方法)。然后，通過測定TCR是否抑制類似物與結(jié)合類似物的物質(zhì)(例如，類似物的抗體)的結(jié)合，可以證實類似物與TCR的結(jié)合，一般地，在這樣的結(jié)合測定的抑制中，類似物結(jié)合于II類MHC分子(例如HLA-DQ2)。
一般地，類似物抑制(i)與TCR的結(jié)合。在該情況下，在有類似物存在下，可以結(jié)合TCR的(i)的量會減少。這是因為，類似物能結(jié)合TCR，并因此與(i)競爭結(jié)合TCR。
從腹部疾病患者中，可以分離出在上面的結(jié)合實驗中使用的T細胞，例如，在本發(fā)明的方法的輔助下。類似物的其它結(jié)合特征也可以與(i)相同，并且因而一般地，類似物結(jié)合與肽結(jié)合的相同的MHC II類分子(HLA-DQ2或-DQ8)。一般地，類似物結(jié)合對(i)特異性的抗體，并從而抑制(i)與這樣的抗體的結(jié)合。
一般地，類似物是肽。它可以與(i)具有同源性，一般地，與(i)具有至少70％同源性，優(yōu)選地至少80、90％、95％、97％或99％同源性，例如，在至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個鄰接氨基酸的區(qū)域內(nèi)(例如類似物和/或(i)的整個長度，或跨過接觸TCR或結(jié)合MHC分子的區(qū)域)。測量蛋白同源性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，在上下文中，在氨基酸同一性(有時稱作“硬同源性(hard homology)”)的基礎(chǔ)上，計算同源性。
例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可以用于計算同源性(例如，在它的缺省設(shè)置下使用)(Devereux等(1984)Nucleic AcidsResearch 12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于計算同源性或比對序列(一般地，在它的缺省設(shè)置下)，例如，如AltschulS.F.(1993)J Mol Evol 36290-300；Altschul，S，F(xiàn)等(1990)J Mol Biol215403-10所述。
在環(huán)球網(wǎng)上，通過因特網(wǎng)在例如“www.ncbi.nlm.nih.gov/”，可以從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公開地得到進行BLAST分析的軟件。該算法包含，首先通過鑒別查詢序列中長為W的短字，其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，會匹配或滿足一些正值閾分?jǐn)?shù)T，來鑒別高分序列對(HSP)。T被稱作相鄰字分?jǐn)?shù)閾(Altschul等，同上)。這些初步的相鄰字命中值(hit)作為開始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)含有它們的HSP。字命中值沿著每個序列向兩方盡可能遠地延伸，只要可以增加累積比對分?jǐn)?shù)。在下述情況下，終止字命中值在每個方向的延伸累積比對分?jǐn)?shù)從它達到的最大值下降量X；由于一個或多個負(fù)分?jǐn)?shù)殘基比對的積累，累積分?jǐn)?shù)達到0或以下；或達到任一個序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定著比對的敏感度和速度。BLAST程序使用下述缺省值字長度(W)為11，BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)比對(B)為50，期望(E)為10，M＝5，N＝4，且對比兩條鏈。
BLAST算法進行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計學(xué)分析；見例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787。BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N))，其指示著兩個核苷酸或氨基酸序列偶然發(fā)生匹配的概率。例如，如果在將第一個序列與另一個序列相比較時，最小總和概率小于約1，優(yōu)選地小于約0.1，更優(yōu)選地小于約0.01，且最優(yōu)選地小于約0.001，則認(rèn)為序列與另一個序列類似。
一般地，同源的肽類似物與(i)的差異在于1、2、3、4、5、6、7、8或更多個突變(其可以是取代、缺失或插入)。關(guān)于計算同源性，可以跨過上述區(qū)域中的任一個，測量這些突變。取代優(yōu)選地是“保守的”。根據(jù)下表，定義它們。在第二列的相同單元中的氨基酸，且優(yōu)選地在第三列的相同行中的氨基酸，可以彼此取代。
一般地，在與(i)中的氨基酸等價位置處的類似物中的氨基酸，是相同的或保守的，其有助于結(jié)合MHC分子或負(fù)責(zé)被TCR識別。
一般地，類似物肽包含一個或多個修飾，其可以是天然的翻譯后修飾或人工修飾。修飾可以提供化學(xué)部分(一般地，通過氫、例如C-H鍵中的氫的取代)，例如氨基、乙酰基、羥基或鹵素(例如，氟)基團或碳水化合物基團。一般地，修飾存在于N或C末端。
類似物可以包含一個或多個非天然的氨基酸，例如具有與天然氨基酸不同的側(cè)鏈的氨基酸。通常，非天然的氨基酸具有N末端和/或C末端。非天然的氨基酸可以是L-或D-氨基酸。
一般地，類似物具有與(i)基本上類似的形狀、大小、柔性或電子構(gòu)型。一般地，它是(i)的衍生物。在一個實施方案中，類似物是融合蛋白，其包含SEQ ID NO1-1927中的任一個的序列和非-谷蛋白序列。優(yōu)選地，根據(jù)該實施方案的類似物是融合蛋白，其包含SEQ IDNO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一個的序列和非-谷蛋白序列。
在一個實施方案中，類似物是或模仿結(jié)合MHC II類分子的(i)。2、3、4或更多個這樣的復(fù)合物可以彼此締合或結(jié)合，例如，使用基于生物素/鏈霉抗生物素蛋白的系統(tǒng)，一般地，其中2、3或4個生物素標(biāo)記的MHC分子結(jié)合一個鏈霉抗生物素蛋白部分。一般地，該類似物抑制(i)/MHC II類復(fù)合物與對該復(fù)合物特異性的TCR或抗體的結(jié)合。
一般地，類似物是抗體或抗體的片段，例如Fab或F(ab′)2片段?？梢詫㈩愃莆锕潭ɑ焦腆w支持物上，尤其是模仿結(jié)合MHC分子的肽的類似物。
一般地，通過計算機方法設(shè)計類似物，并然后使用本領(lǐng)域已知的方法合成。或者，可以從化合物文庫中選擇類似物。該文庫可以是組合文庫或展示文庫，例如噬菌體展示文庫。化合物文庫可以以結(jié)合到MHC II類分子(例如HLA-DQ2或-DQ8)上的形式，在展示文庫中表達。通常，基于它們模仿(i)的結(jié)合特征的能力，從文庫中選擇類似物。因而，可以基于結(jié)合能識別(i)的TCR或抗體的能力，來選擇它們。
一般地，類似物將以與試劑(i)中的任一種相同的程度被T細胞識別，例如，以至少與在本文所述的任一種測定中等價表位被識別的程度相同的程度，其中一般使用來自腹部疾病患者的T細胞。類似物可以在體內(nèi)被識別至這樣的程度，并從而能誘導(dǎo)腹部疾病癥狀至至少與本文提及的試劑中的任一種相同的程度(例如，在人患者或動物模型中)。
可以在包含下述步驟的方法中鑒別類似物測定候選物質(zhì)是否能被識別本發(fā)明的表位的T細胞受體識別，其中該物質(zhì)的識別指示著該物質(zhì)是類似物。這樣的TCR可以是本文提及的TCR中的任一種，且可以存在于T細胞上?？梢允褂帽疚奶峒暗娜我环N合適的測定來鑒別類似物。在一個實施方案中，體內(nèi)地實施該方法。如上所述，優(yōu)選的類似物被以至少與等價表位相同的程度識別，所以該方法可以用于鑒別以該程度被識別的類似物。
在一個實施方案中，該方法包含，測定候選物質(zhì)是否能抑制本發(fā)明的表位的識別，其中識別的抑制指示著該物質(zhì)是類似物。
試劑可以是包含至少2、5、10或20種由(i)或(ii)定義的試劑的產(chǎn)物。一般地，組合物包含來自不同谷蛋白的本發(fā)明的表位(或等價類似物)，例如本文提及的任何物種或種類或類型的谷蛋白。優(yōu)選的組合物包含至少一種本發(fā)明的表位，或等價類似物，其來自存在于本文提及的任何物種或種類中的所有谷蛋白，或來自本文提及的物種中的2、3、4或更多種(例如來自由小麥、黑麥、大麥、燕麥和黑小麥組成的物種系列)。因而，試劑可以是單價的或多價的。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，試劑不具有或不是基于WO02/083722和/或WO 01/25793和/或WO 03/104273中公開的序列，和/或SEQ ID NO1555-1577、1580-1581、1584-1586、1594-1599、1621-1622中的任一個所述的序列，和/或不是源自其序列如圖10所示的A-麥醇溶蛋白的試劑。
在SEQ ID NO1-1927中，優(yōu)選的子集是SEQ ID NO1-1763。在SEQ ID NO1764-1927中，優(yōu)選的子集是(a)燕麥序列1764-1768，(b)黑麥序列1769-1786，(c)大麥序列1787-1829，(d)小麥序列1895-1903，(e)小麥DQ8序列1908-1927，和(f)combitope序列1906。其它優(yōu)選的子集是(a)1764-1768，(b)1769-1773，(c)1774-1786，(d)1787-1792，(e)1793-1829，(f)1830-1894，(g)1895-1903，(h)1830-1903，(i)1904-1906，(j)1908-1916，(k)1917-1927，和(l)1908-1913、1915-1923和1925-1927。
在SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763和1764-1927中，特別優(yōu)選的小麥表位是SEQ ID NO1656-1671、1830-1903和1907-1927。
在SEQ ID NO1830-1894(表1)中，一些序列具有N-末端和C-末端甘氨酸。本發(fā)明擴展至省略C-末端甘氨酸和/或N-末端甘氨酸的這些序列。優(yōu)選地，省略C-末端甘氨酸和N-末端甘氨酸兩者。
診斷如上所述，本發(fā)明的診斷方法可以基于能結(jié)合試劑的T細胞的檢測，或能識別試劑的抗體的檢測。
能在本方法(其包括上述的用途)中識別試劑的T細胞通常是已經(jīng)體內(nèi)地對一種或多種谷蛋白預(yù)敏化的T細胞。如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的抗原-處理的(antigen-experienced)T細胞存在于外周血中。
在本方法中，T細胞可以體外或體內(nèi)地接觸試劑，并可以體外或體內(nèi)地測定T細胞是否識別試劑。因而，本發(fā)明提供了在人體上實踐的診斷方法中使用的試劑。提供了不同的試劑，用于在這樣的方法中同時、分開或先后地使用。
一般地，在加入了試劑的水溶液中實施體外方法。溶液也可以包含T細胞(以及在某些實施方案中，下面討論的APC)。如本文使用的術(shù)語“接觸”包括向溶液中加入特定的物質(zhì)。
通常，通過檢測在有試劑存在下T細胞狀態(tài)的變化，或測定T細胞是否結(jié)合試劑，來完成T細胞是否能識別試劑的測定。通常，狀態(tài)的變化是由TCR結(jié)合試劑后T細胞的抗原特異性的功能活性造成的?？梢栽赥細胞內(nèi)(例如，蛋白的細胞內(nèi)表達的變化)或外(例如，檢測分泌的物質(zhì))測量狀態(tài)的變化。
T細胞狀態(tài)的變化，可能是T細胞分泌物質(zhì)的開始或增加，例如細胞因子，尤其是IFN-γ、IL-2或TNF-α。IFN-γ分泌的測定是特別優(yōu)選的。一般地，通過允許它結(jié)合特異性的結(jié)合劑，然后測量特異性的結(jié)合劑/物質(zhì)復(fù)合物的存在，可以檢測物質(zhì)。一般地，特異性的結(jié)合劑是抗體，例如多克隆或單克隆抗體。細胞因子的抗體是商業(yè)上可得到的，或可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
一般地，將特異性的結(jié)合劑固定化到固體支持物上。允許物質(zhì)結(jié)合后，固體支持物可以任選地被洗滌，以去除未特異性地結(jié)合試劑的物質(zhì)。使用結(jié)合復(fù)合物的第二種結(jié)合劑，可以檢測試劑/物質(zhì)復(fù)合物。一般地，第二種試劑在與結(jié)合第一種試劑的位點不同的位點結(jié)合該物質(zhì)。第二種試劑優(yōu)選地是抗體，且用檢測標(biāo)記直接或間接地進行標(biāo)記。
因而，第二種試劑可以被第三種試劑檢測到，所述第三種試劑一般地用檢測標(biāo)記直接或間接地標(biāo)記。例如，第二種試劑可以包含生物素部分，從而允許被包含鏈霉抗生物素蛋白部分的第三種試劑檢測到，且一般地，堿性磷酸酶作為檢測標(biāo)記。
在一個實施方案中，使用的檢測系統(tǒng)是WO 98/23960所述的離體(ex-vivo)ELISPOT測定。在該測定中，T細胞分泌的IFN-γ被固定化到固體支持物上的第一種IFN-γ特異性的抗體結(jié)合。然后，使用用檢測標(biāo)記標(biāo)記的第二種IFN-γ特異性的抗體，檢測結(jié)合的IFN-γ。這樣的標(biāo)記的抗體可以從MABTECH(斯德哥爾摩，瑞典)得到。下面討論了可以使用的其它檢測標(biāo)記。
可以測量的T細胞狀態(tài)的變化可以是，T細胞對物質(zhì)的攝入的增加，例如胸苷的攝入。狀態(tài)的變化可以是，T細胞大小的增加，或T細胞的增殖，或T細胞上的細胞表面標(biāo)記的變化。
在一個實施方案中，通過測量蛋白的細胞內(nèi)表達中的變化，例如，任一種上述的細胞因子的細胞內(nèi)表達的增加，來檢測狀態(tài)的變化。通過使T細胞的內(nèi)部接觸能以特異性的方式結(jié)合表達的蛋白，且其允許通過流式細胞儀分選T細胞的部分，可以檢測這樣的細胞內(nèi)的變化。
在一個實施方案中，當(dāng)結(jié)合TCR時，試劑結(jié)合MHC II類分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)，所述分子一般地存在于抗原呈遞細胞(APC)的表面上。但是，如本文所述，其它試劑可以結(jié)合TCR，而不需要也結(jié)合MHC分子。
通常，在本方法中接觸的T細胞取自個體的血液樣品，盡管可以使用含有T細胞的其它類型的樣品?？梢詫悠分苯蛹尤霚y定中，或可以首先進行處理。一般地，處理可以包含，例如用水或緩沖液稀釋樣品。一般地，將樣品稀釋1.5-100倍，例如，2-50或5-10倍。
處理可以包含樣品組分的分離。一般地，從樣品分離單核的細胞(MC)。MC包含T細胞和APC。因而，在本方法中，存在于分離的MC中的APC，可以將肽呈遞給T細胞。在另一個實施方案中，從樣品中僅僅純化T細胞，例如僅僅CD4T細胞。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如Lalvani等(1997)J.Exp.Med.186，p859-865中所述的那些，可以從樣品分離PBMC、MC和T細胞。
在一個實施方案中，在測定中使用的T細胞是未處理的或稀釋的樣品的形式，或是新分離的T細胞(例如新分離的MC或PBMC的形式)，其可以直接離體使用，即它們在用于本方法之前未經(jīng)培養(yǎng)。因而，沒有以抗原特異性的方式，體外重新刺激T細胞。但是，可以在使用前培養(yǎng)T細胞，例如，在有一種或多種試劑存在下，且通常也存在外源的生長促進細胞因子。在培養(yǎng)過程中，試劑一般地存在于APC表面上，例如在本方法中使用的APC。T細胞的預(yù)培養(yǎng)，可能導(dǎo)致本方法的敏感度的增加。因而，可以將T細胞轉(zhuǎn)化成細胞系，例如短期細胞系(例如，如Ota等(1990)Nature 346，p183-187所述)。
一般地存在于本方法中的APC，可以來自與T細胞相同的個體或來自不同的宿主。APC可以是天然產(chǎn)生的APC或人造的APC。APC是能將肽呈遞給T細胞的細胞。一般地，它是B細胞、樹突細胞或巨噬細胞。一般地，它和T細胞分離自相同的樣品，且一般地，與T細胞共同純化。因而，APC可能存在于MC或PBMC中。一般地，APC是新分離的離體細胞或培養(yǎng)的細胞。它可以是細胞系的形式，例如短期或無限增殖化的細胞系。APC可以在它的表面表達空的MHC II類分子。
在本方法中，可以使用一種或多種(不同的)試劑。一般地，可以將源自樣品的T細胞與所有待測試劑一起置于測定中，或者可以分開T細胞，并置于各自含有一種或多種試劑的分開的測定中。
本發(fā)明也提供了試劑，例如上述試劑中的任一種的兩種或更多種(例如存在于上面討論的組合物試劑中的試劑的組合)，其用于同時的分開的或先后的用途(例如，體內(nèi)用途)。
在一個實施方案中，將試劑本身直接加入包含T細胞和APC的測定中。如上面所討論的，這樣的測定中的T細胞和APC可以是MC的形式。當(dāng)使用能被T細胞識別、且不需要由APC呈遞的試劑時，則不需要APC。模仿結(jié)合到MHC分子上的原始(i)的類似物，是這樣的試劑的實例。
在一個實施方案中，在沒有T細胞存在下，將試劑提供給APC。然后，將APC提供給T細胞，一般地，在允許將試劑呈遞到它的表面之后。肽可能已經(jīng)被攝入到APC的內(nèi)部，且被呈遞，或被簡單地攝取到表面上，而沒有進入APC的內(nèi)部。
試劑接觸T細胞的持續(xù)時間依賴于用于測定肽的識別的方法而變化。一般地，向每個測定中，加入105-107，優(yōu)選地5×105-106PBMC。在將試劑直接加入測定的情況下，它的濃度是10-1-103μg/ml，優(yōu)選地0.5-50μg/ml或1-10μg/ml。
一般地，將T細胞與試劑一起溫育的時間長度是4-24小時，優(yōu)選地6-16小時。當(dāng)使用離體PBMC時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在37℃將0.3×106PBMC在10μg/ml的肽中溫育12小時。
通過測量試劑與T細胞的結(jié)合(這可以使用本文討論的任何合適的結(jié)合測定格式來實現(xiàn))，可以測定T細胞對試劑的識別。一般地，可以基于該結(jié)合，例如，使用FACS機器，來分選結(jié)合試劑的T細胞。如果使用試劑分選的細胞的頻率在“對照”值之上，則認(rèn)為存在能識別試劑的T細胞?？乖?處理的T細胞的頻率通常是1/106至1/103，且因此，可以確定分選的細胞是否是抗原-處理的T細胞。
可以體內(nèi)測定T細胞對試劑的識別。一般地，將試劑施用給宿主，且然后可以測量指示著試劑的識別的反應(yīng)。一般地，皮內(nèi)地或表皮地施用試劑。一般地，通過接觸皮膚的外面來施用試劑，或者可以在藥膏或敷料的輔助下，保留在該部位?；蛘?，可以通過針，例如通過注射，來施用試劑，但是也可以通過其它方法例如沖擊(ballistics)(例如，已經(jīng)用于送遞核酸的沖擊技術(shù))來施用。EP-A-0693119描述了可以一般地用于施用試劑的技術(shù)。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg試劑。
在一個實施方案中，可以施用能體內(nèi)提供試劑的產(chǎn)物。因而，可以施用能表達試劑的多核苷酸，一般地，以上述的施用試劑的任意一種方式。多核苷酸一般地具有下面討論的本發(fā)明提供的多核苷酸的特征的任一種。試劑由多核苷酸體內(nèi)地表達。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg多核苷酸。
一般地，通過在施用部位發(fā)生炎癥(例如，硬結(jié)、紅斑或水腫)，指示著施用給皮膚的試劑的識別。這通常通過該部位的視覺檢查來測量。
一般地，通過使來自個體的樣品(例如本文提及的任何樣品，其任選地以本文提及的任何方式處理過)接觸試劑，并測定樣品中的抗體是否結(jié)合試劑，這樣的結(jié)合指示著個體患有或易感腹部疾病，來實現(xiàn)基于檢測能結(jié)合試劑的抗體的診斷方法。可以使用任何合適的結(jié)合測定格式，例如，本文提及的任何這樣的格式。
治療優(yōu)勢免疫表位和本文描述的其它表位的鑒別，允許制備治療產(chǎn)物，其靶向識別該表位的T細胞(這樣的T細胞是參與針對谷蛋白的免疫反應(yīng)的細胞)。這些發(fā)現(xiàn)也允許通過抑制(通過耐受)針對表位的抗體或T細胞反應(yīng)，來預(yù)防或治療腹部疾病。
本發(fā)明的某些試劑結(jié)合識別本發(fā)明的表位(如使用上面討論的任一種結(jié)合測定所測量的)的TCR，并造成攜帶TCR的T細胞的耐受。這樣的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，因此可以用于預(yù)防或治療腹部疾病。
通常，耐受可以由相同的肽造成，所述肽可以(在被TCR識別后)造成T細胞的抗原特異性的功能活性(例如本文提及的任何這樣的活性，例如細胞因子的分泌)。當(dāng)在“耐受”上下文中，它們被呈遞給免疫系統(tǒng)時，這樣的試劑會造成耐受。
耐受導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對T細胞或抗體表位的識別的降低。在T細胞表位的情況下，這是由識別表位的T細胞的缺失或無反應(yīng)造成的。因此，降低由表位引起的T細胞活性(例如，如在本文提及的合適的測定中所測量的)?？贵w反應(yīng)的耐受，意味著當(dāng)施用表位時，產(chǎn)生減少量的針對表位的特異性的抗體。
在這樣的上下文中，將抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的方法是已知的，且記載在例如Yoshida等Clin.Immunol.Immunopathol.82，207-215(1997)，Thurau等Clin.Exp.Immunol.109，370-6(1997)和Weiner等Res.Immunol.148，528-33(1997)。在特定的某些施用途徑中，可以造成耐受，例如經(jīng)口的、經(jīng)鼻的或腹膜內(nèi)的。也可以通過呈遞肽的樹突細胞和四聚體來實現(xiàn)耐受?？梢越o個體施用造成耐受的特定產(chǎn)物(例如，在也包含試劑的組合物中)。這樣的產(chǎn)物包括細胞因子，例如偏好Th2反應(yīng)的細胞因子(例如，IL-4、TGF-β或IL-10)?？梢砸栽斐赡褪艿膭┝?，施用產(chǎn)物或試劑。
本發(fā)明提供了蛋白，其包含能作為T細胞(該T細胞識別試劑)的拮抗劑的序列。這樣的蛋白和這樣的拮抗劑也可以用于預(yù)防或治療腹部疾病。拮抗劑會造成T細胞反應(yīng)的降低。在一個實施方案中，拮抗劑結(jié)合T細胞的TCR(通常以與HLA-DQ2或-DQ8的復(fù)合物的形式)，但是不會造成正常的功能激活，所述功能激活會使正常的信號通過TCR細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)級聯(lián)進行傳遞，這會使T細胞具有降低的功能活性(例如，對表位的識別的響應(yīng)，一般地，如通過本文所述的任何合適的測定所測量的)。
在一個實施方案中，拮抗劑與表位競爭結(jié)合MHC加工和呈遞途徑的組分，例如MHC分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)。因而，拮抗劑可以結(jié)合HLA-DQ2或-DQ8(且因而是由該MHC分子呈遞的肽)或其同源物。
造成拮抗作用的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，拮抗劑是上面提及的表位的同源物，且可以具有試劑(尤其是類似物)的任一種序列、結(jié)合或其它性質(zhì)。一般地，拮抗劑與任一種上述表位(其能在T細胞中造成正常的抗原特異性的功能)的區(qū)別在于1、2、3、4或更多個突變(其中的每一個可以是取代、插入或缺失)。這樣的拮抗劑在本領(lǐng)域中稱作“改變的肽配體”或“APL”。一般地，突變是在接觸TCR的氨基酸位置。
例如，拮抗劑與表位的區(qū)別可以在于序列中的取代，所述序列與A-麥醇溶蛋白的氨基酸64-67代表的序列(圖10所示的A-麥醇溶蛋白的序列)等價。因而優(yōu)選地，拮抗劑具有在位置64、65或67的等價物處的取代。優(yōu)選地，取代是64W、67W、67M或65T。
由于個體中針對本發(fā)明的表位的T細胞免疫反應(yīng)是多克隆的，所以可能需要施用超過一種拮抗劑，來造成具有不同TCR的反應(yīng)的T細胞的拮抗作用。因此，可以在組合物中施用拮抗劑，所述組合物包含至少2、4、6或更多種不同的拮抗劑，所述拮抗劑各自拮抗不同的T細胞。
本發(fā)明也提供了鑒別T細胞(其能識別試劑)的拮抗劑的方法，其包含使候選物質(zhì)接觸T細胞，和檢測該物質(zhì)是否造成T細胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低(例如，使用本文提及的任何合適的測定)，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測，指示著物質(zhì)是拮抗劑。
在一個實施方案中，組合物中存在拮抗劑(包括特定表位的拮抗劑的組合)或耐受(T細胞和抗體耐受)試劑，所述組合物包含至少2、4、6或更多種拮抗劑或拮抗或耐受本發(fā)明的不同表位(例如，上面關(guān)于試劑討論的表位的組合，所述試劑是包含超過一種物質(zhì)的產(chǎn)物)的試劑。
測試組合物是否能造成腹部疾病如上所述，本發(fā)明提供了測定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含檢測是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成包含本發(fā)明的試劑或表位的序列的蛋白序列(這樣的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性可以是人腸轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性)。一般地，這通過如下實現(xiàn)使用結(jié)合測定，其中使以特異性的方式結(jié)合序列的部分接觸組合物，并檢測序列/部分復(fù)合物的形成，并將所述復(fù)合物用于確定試劑的存在。這樣的部分可以是本文提及的任何合適的物質(zhì)(或物質(zhì)類型)，且一般地，是特異性的抗體?？梢允褂萌魏魏线m格式的結(jié)合測定(例如本文提及的那些)。
在一個實施方案中，使組合物接觸至少2、5、10或更多種抗體，所述抗體對來自不同谷蛋白的本發(fā)明的表位是特異性的，例如，一系列抗體，其能識別關(guān)于本發(fā)明的試劑在上面討論的表位的組合，所述試劑是包含超過一種物質(zhì)的產(chǎn)物。
一般地，組合物包含來自表達能造成腹部疾病的谷蛋白的植物的材料(例如，本文提及的任一種谷蛋白或植物)。這樣的材料可以是植物部分，例如收獲的產(chǎn)物(例如，種子)。該材料可以是植物材料的加工產(chǎn)物(例如任何本文提及的這樣的產(chǎn)物)，例如包含谷蛋白的面粉或食物。食物材料的加工和在合適的結(jié)合測定中的測試是常規(guī)的，例如，如Kricka LJ，J.Biolumin.Chemilumin.13，189-93(1998)中所提及的。
結(jié)合測定通過測量結(jié)合后改變的一種或兩種物質(zhì)的特征，例如光譜變化，可以測定本文提及的任意兩種物質(zhì)的結(jié)合。
結(jié)合測定格式可以是“條帶位移(band shift)”系統(tǒng)。這包含測定一種物質(zhì)(例如候選物質(zhì))的存在是否會促進或延遲凝膠電泳過程中其它物質(zhì)的前進。
格式可以是競爭結(jié)合方法，其測定一種物質(zhì)是否能抑制其它物質(zhì)與試劑的結(jié)合，已知所述試劑結(jié)合其它物質(zhì)，例如特異性的抗體。
突變的谷蛋白本發(fā)明提供了谷蛋白，其中已經(jīng)突變了本發(fā)明的表位序列，或可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾以提供這樣的序列的序列，從而使它不再造成能識別該表位的T細胞反應(yīng)，或被其識別。在上下文中，術(shù)語識別指TCR以發(fā)生T細胞的正常的(非拮抗的)抗原-特異性的功能活性的方式結(jié)合表位。
上面討論了鑒別其它谷蛋白中的等價表位的方法。突變的谷蛋白的野生型是會造成腹部疾病的蛋白。這樣的突變的谷蛋白可以在它的整個序列或它的序列的15、30、60、100或200個鄰接氨基酸內(nèi)與突變的谷蛋白的野生型具有同源性，例如，達到上述的程度(關(guān)于類似物)。其它天然谷蛋白的序列是本領(lǐng)域已知的。
突變的谷蛋白不會造成腹部疾病，或會造成減輕的腹部疾病的癥狀。一般地，突變減少表位誘導(dǎo)T細胞反應(yīng)的能力。突變的表位可以具有減小的與HLA-DQ2或-DQ8的結(jié)合，減小的被APC呈遞的能力，或減小的結(jié)合識別試劑的T細胞或被其識別的能力(即造成抗原-特異性的功能活性)。因此，關(guān)于本發(fā)明的診斷方面，突變的谷蛋白或表位會在本文提及的任何測定中不表現(xiàn)或表現(xiàn)出減少的識別。
突變可以是表位中的一個或多個長為1-3、4-6、6-10、11-15或更多的缺失、添加或取代，例如，在SEQ ID NO1-1927中的任一個中；或在其等價物中。優(yōu)選地，突變的谷蛋白在SEQ ID NO1-1927中的任一個序列中具有至少一個突變。優(yōu)選的突變是在與A-麥醇溶蛋白的位置65等價的位置處(見圖10)。優(yōu)選地，天然產(chǎn)生的谷氨酰胺被取代為組氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、脯氨酸或精氨酸。
本發(fā)明從而也提供了谷蛋白的表位中的突變(例如本文討論的任意序列中的任意突變)減少谷蛋白的造成腹部疾病的能力的用途，該表位是本發(fā)明的表位。
在一個實施方案中，突變的序列能起拮抗劑的作用。因而，本發(fā)明提供了包含能結(jié)合T細胞受體的序列的蛋白，該T細胞受體識別本發(fā)明的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細胞受體的T細胞的拮抗作用。
本發(fā)明也提供了蛋白，其是上面的突變的谷蛋白的片段，所述蛋白是至少7個氨基酸長(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、30、60、100、150、200或250個氨基酸長)，且其包含上面討論的減少谷蛋白被識別的能力的突變。本文提及的任一種突變蛋白(包括片段)也可以以與例如其它谷蛋白或非-谷蛋白的融合蛋白的形式存在。
與突變的谷蛋白等價的野生型蛋白一般地來自禾本科單子葉植物，例如選自下列屬的植物小麥屬(Triticum)、黑麥屬(Secale)、大麥屬(Hordeum)、黑小麥(Triticale)或燕麥屬(Avena)(例如，小麥、黑麥、大麥、燕麥或黑小麥)。例如，蛋白可以是α、αβ、β、γ或ω麥醇溶蛋白或燕麥蛋白。
試劑盒本發(fā)明也提供了用于實現(xiàn)本方法的試劑盒，其包含一種或多種試劑，和任選的檢測T細胞對試劑的識別的工具。一般地，為同時的、分開的或先后的應(yīng)用，提供不同的試劑。一般地，檢測識別的工具允許或輔助基于上面討論的技術(shù)的檢測。
因而，工具可能允許檢測T細胞在識別后分泌的物質(zhì)。試劑盒因而可以另外包含物質(zhì)的特異性的結(jié)合部分，例如抗體。一般地，部分是對IFN-γ特異性的。一般地，將部分固定化到固體支持物上。這意味著，在結(jié)合部分后，物質(zhì)會保留在分泌它的T細胞的附近。因而，在支持物上形成物質(zhì)/部分復(fù)合物的“斑點”，每個斑點代表著一個分泌物質(zhì)的T細胞。對斑點定量，并一般地，與對照相對比，允許測定試劑的識別。
試劑盒也可以包含檢測物質(zhì)/部分復(fù)合物的工具。在結(jié)合物質(zhì)后，可能在部分自身發(fā)生可檢測的變化，例如顏色變化。或者，可以允許直接或間接標(biāo)記的用于檢測的第二種部分結(jié)合物質(zhì)/部分復(fù)合物，以允許斑點的測定。如上面所討論的，第二種部分可以是對物質(zhì)特異性的，但是結(jié)合物質(zhì)上與第一種部分不同的位置。
固定化的支持物可以是有孔的平板，例如微量滴定板。因此，可以在平板的分開的孔中，進行每個測定。
試劑盒可以另外包含T細胞的培養(yǎng)基，要在檢測步驟中使用的檢測部分或洗滌緩沖液。試劑盒可以另外包含適用于從樣品分離的試劑，例如從樣品分離PBMC或T細胞?？梢詫⒃噭┖性O(shè)計成允許在樣品中直接檢測T細胞，而不需要分離樣品中的任何組分。
試劑盒可以包含允許施用試劑的工具，例如皮內(nèi)的或表皮的施用。一般地，這樣的工具包含藥膏、敷料或一種或多種針。工具可以允許試劑的沖擊送遞。試劑盒中的試劑可以是藥物組合物的形式。
試劑盒也可以包含對照，例如陽性或陰性對照。陽性對照可以允許測試檢測系統(tǒng)。因而，陽性對照一般地在任一種上述的方法中模仿試劑的識別。一般地，在設(shè)計用于體外測定識別的試劑盒中，陽性對照是細胞因子。在設(shè)計用于體內(nèi)檢測試劑的識別的試劑盒中，陽性對照可以是大多數(shù)個體會起反應(yīng)的抗原。
試劑盒也可以包含采集樣品的工具，所述樣品含有來自宿主的T細胞，例如血液樣品。試劑盒可以包含從來自宿主的樣品分離單核的細胞或T細胞的工具。
多核苷酸、細胞、轉(zhuǎn)基因哺乳動物和抗體本發(fā)明也提供了多核苷酸，其能表達，以提供試劑或突變的谷蛋白。一般地，多核苷酸是DNA或RNA，且是單鏈的或雙鏈的。多核苷酸優(yōu)選地包含至少50個堿基或堿基對，例如，50-100、100-500、500-1000或1000-2000或更多個堿基或堿基對。因此，多核苷酸包含編碼SEQ ID NO1-1927中的任一個序列或本文提及的任一種其它試劑的序列。在該編碼序列的5′和3′，本發(fā)明的多核苷酸具有與在對應(yīng)的谷蛋白基因中的這些序列的5′和3′處的序列或密碼子不同的序列或密碼子。
在編碼肽的序列的5′和/或3′，多核苷酸具有編碼或非編碼序列。編碼序列的5′和/或3′序列可以包含能輔助編碼試劑的序列的表達(例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的序列。多核苷酸可以能在原核或真核細胞中表達試劑。在一個實施方案中，多核苷酸能在哺乳動物細胞中表達試劑，例如人、靈長類動物或嚙齒類動物(例如，小鼠或大鼠)細胞。
本發(fā)明的多核苷酸可以以顯著高于背景的水平，選擇性地與編碼試劑所來源的谷蛋白的多核苷酸雜交。一般地，使用中等至高嚴(yán)格性的條件(例如，0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約50℃至約60℃)，進行選擇性的雜交。但是，可以在本領(lǐng)域已知的任何合適的條件下(見Sambrook等(1989)，Molecular CloningA LaboratoryManual)，進行這樣的雜交。例如，如果需要高嚴(yán)格性，則合適的條件包括0.2×SSC，在60℃。如果需要更低的嚴(yán)格性，則合適的條件包括2×SSC，在60℃。
本發(fā)明的試劑或蛋白可以由本文所述的多核苷酸編碼。
多核苷酸可以形成或整合進可復(fù)制的載體中。這樣的載體能在合適的細胞中復(fù)制。載體可以是表達載體。在這樣的載體中，本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接到控制序列，所述控制序列能提供多核苷酸的表達。載體可以含有選擇標(biāo)記，例如氨芐青霉素抗性基因。
多核苷酸或載體可以存在于細胞中。這樣的細胞可能已經(jīng)用多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化。細胞可以表達試劑。選擇細胞，以使其與所述載體相容，且可以是例如原核的(細菌的)、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。使用常規(guī)技術(shù)，包括磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染或電穿孔，可以將多核苷酸或載體導(dǎo)入宿主細胞中。
本發(fā)明提供了通過重組方式生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法。這可以包含(a)在允許表達蛋白的條件下，培養(yǎng)如上定義的轉(zhuǎn)化的細胞；和優(yōu)選地(b)回收表達的多肽。任選地，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以分離和/或純化多肽。
本發(fā)明也提供了TCR，其識別(或結(jié)合)試劑或它的能實現(xiàn)這樣的識別(或結(jié)合)的片段。它們可以以本文關(guān)于本發(fā)明的蛋白所討論的在本文提及的任何形式(例如，純度)存在。本發(fā)明也提供了表達這樣的TCR的T細胞，其可以本文中關(guān)于本發(fā)明的細胞所討論的任何形式(例如，純度)存在。
本發(fā)明也提供了單克隆的或多克隆的抗體，其能特異性地識別試劑(例如本發(fā)明的任一種表位)，且其能識別本發(fā)明的突變的谷蛋白(且一般地，其不能識別等價的野生型谷蛋白)，和制備這樣的抗體的方法。本發(fā)明的抗體能特異性地結(jié)合本發(fā)明的這些物質(zhì)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“抗體”包括抗體片段，例如Fv、F(ab)和F(ab′)2片段以及單鏈抗體。
生產(chǎn)多克隆抗體的方法包含，用免疫原免疫合適的宿主動物，例如，實驗動物，并從血清分離免疫球蛋白。因此，可以給動物接種免疫原，隨后從動物取出血液，并純化IgG級分。生產(chǎn)單克隆抗體的方法包含，使生產(chǎn)需要的抗體的細胞無限增殖化。通過將來自接種的實驗動物的脾細胞與腫瘤細胞相融合，可以生成雜交瘤細胞(Kohler和Milstein(1975)Nature 256，495-497)。
通過常規(guī)操作，可以選擇生產(chǎn)需要的抗體的無限增殖化的細胞。可以在培養(yǎng)物中培養(yǎng)雜交瘤，或?qū)⑵涓鼓?nèi)地注射，以便形成腹水，或注射進異源宿主或無免疫應(yīng)答的宿主的血流中。通過人淋巴細胞的體外免疫，隨后用EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細胞，可以制備出人抗體。
為了生產(chǎn)單克隆的和多克隆的抗體，合適的實驗動物是山羊、兔、大鼠或小鼠。如果需要，可以將免疫原作為綴合物施用，其中免疫原偶聯(lián)到合適的載體上，例如，通過氨基酸殘基之一的側(cè)鏈。一般地，載體分子是生理上可接受的載體?？梢苑蛛x得到的抗體，且如果需要，進行純化。
本發(fā)明的多核苷酸、試劑、蛋白或抗體可以攜帶檢測標(biāo)記。允許通過視覺檢查檢測分泌的物質(zhì)的檢測標(biāo)記，任選地在光學(xué)放大裝置的輔助下，是優(yōu)選的。一般地，這樣的系統(tǒng)基于造成底物的顏色變化的酶標(biāo)記，例如，造成底物的顏色變化的堿性磷酸酶。這樣的底物是市場上可得到的，例如從BioRad。其它合適的標(biāo)記包括其它酶，例如過氧化物酶，或蛋白標(biāo)記，例如生物素；或放射性同位元素，例如32P或35S。使用已知的技術(shù)，可以檢測上面的標(biāo)記。
本發(fā)明的多核苷酸、試劑、蛋白、抗體或細胞可以是基本上純化的形式。它們可以是基本上分離的形式，在該情況下，它們通常在制劑中包含至少80％(例如，至少90、95、97或99％)多核苷酸、肽、抗體、細胞或干物質(zhì)。一般地，多核苷酸、試劑、蛋白或抗體基本上不含有其它細胞組分。在本方法中，可以以這樣的基本上分離的、純化的或游離的形式，使用多核苷酸、試劑、蛋白或抗體，或其以這樣的形式存在于試劑盒中。
本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因的非-人哺乳動物，其表達本發(fā)明的TCR。這可以是本文討論的任意的哺乳動物(例如，關(guān)于抗體的生產(chǎn))。優(yōu)選地，哺乳動物患有或易感腹部疾病。哺乳動物也可以表達HLA-DQ2或-DQ8或HLA-DR3-DQ2，和/或可以給它飼喂包含造成腹部疾病的谷蛋白(例如，本文提及的任一種谷蛋白)的飲食。因而，該哺乳動物可以作為腹部疾病的動物模型。
本發(fā)明也提供了鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含將候選物質(zhì)施用給本發(fā)明的患有或易感腹部疾病的哺乳動物，并測定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。這樣的產(chǎn)物可以用于治療或預(yù)防腹部疾病。
本發(fā)明提供了治療(包括預(yù)防性的)試劑或診斷物質(zhì)(本發(fā)明的試劑、蛋白和多核苷酸)。通過將它們與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合，可以配制這些物質(zhì)，用于臨床施用。例如，可以配制它們，用于局部的、腸胃外的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、眼內(nèi)的、皮內(nèi)的、表皮的或經(jīng)皮的施用?？梢詫⑽镔|(zhì)與藥學(xué)上可接受的且適用于所需施用途徑的載體相混合。藥學(xué)上注射用的載體或稀釋劑可以是例如無菌的或等滲的溶液，例如注射用水或生理鹽水，或用于沖擊送遞的載體顆粒。
根據(jù)各種參數(shù)，尤其是根據(jù)使用的試劑，要治療的患者的年齡、體重和狀況，使用的施用模式，要治療的狀況的嚴(yán)重性，和需要的臨床方案，可以調(diào)節(jié)物質(zhì)的劑量。作為指導(dǎo)，通過注射施用的物質(zhì)的量，合適地為0.01mg/kg-30mg/kg，優(yōu)選地為0.1mg/kg-10mg/kg。
所述的施用途徑和劑量僅僅作為指導(dǎo)，因為熟練的執(zhí)業(yè)醫(yī)生能容易地確定任何特定患者和狀況的最佳施用途徑和劑量。
因而，本發(fā)明的物質(zhì)可以用在治療人或動物身體的方法中，或在人體上實現(xiàn)的診斷方法中。具體地，它們可以用在治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。本發(fā)明也提供了試劑，其用在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防腹部疾病的藥物的方法中。因而，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給需要它的人施用本發(fā)明的物質(zhì)(一般地，其無毒的有效量的)。
使用標(biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)，例如通過使用自動合成儀，可以制備本發(fā)明的試劑?？梢詮母L的多肽例如融合蛋白制備試劑，該多肽一般地包含該肽的序列。通過例如水解多肽，例如使用蛋白酶；或通過物理地斷裂多肽，可以從多肽衍生出肽。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如通過使用合成儀，可以制備本發(fā)明的多核苷酸。
表達突變的谷蛋白或表達包含可以作為拮抗劑的序列的蛋白的植物細胞和植物本發(fā)明的細胞可以是植物細胞，例如禾本科單子葉植物物種的細胞。該物種可以是其野生型形式表達谷蛋白的物種，例如本文提及的任一種谷蛋白。這樣的谷蛋白可以造成人的腹部疾病。細胞可以是小麥、玉米、燕麥、黑麥、稻、大麥、黑小麥、高梁或甘蔗的。一般地，細胞是小麥屬的，例如普通小麥(aestivum)、斯佩爾特小麥(spelta)、波蘭小麥(polonicum)或一粒小麥(monococcum)。
一般地，本發(fā)明的植物細胞是這樣的，其不表達一種或多種野生型谷蛋白(例如可以造成腹部疾病的本文提及的任一種谷蛋白)，或不表達一種或多種包含可以被識別試劑的T細胞識別的序列的谷蛋白。因而，如果野生型植物細胞不表達這樣的谷蛋白，則可以改造它，來預(yù)防或減少這樣的谷蛋白的表達，或改變谷蛋白的氨基酸序列，從而使它不再造成腹部疾病(一般地，通過不再表達本發(fā)明的表位)。
這可以如下實現(xiàn)，例如，通過將突變導(dǎo)入細胞中的1、2、3或更多個或所有這樣的谷蛋白基因，例如，導(dǎo)入編碼或非編碼(例如，啟動子)區(qū)域。這樣的突變可以是本文(例如，關(guān)于同源蛋白)討論的任意類型或長度的突變?？梢砸远ㄏ虻姆绞?例如，使用定點誘變或同源重組技術(shù))或隨機的方式(例如，使用誘變劑，然后一般地，選擇誘變的不再表達谷蛋白(或會造成腹部疾病的谷蛋白序列)的細胞)，來導(dǎo)入突變。
在表達包含能作為拮抗劑的序列的蛋白的植物或植物細胞的情況下，這樣的植物或植物細胞可以表達野生型谷蛋白(例如會造成腹部疾病的那些)。優(yōu)選地，通過拮抗劑序列的存在，會在攝入包含來自植物或植物細胞的蛋白的食物的個體中，造成減少的腹部疾病癥狀(例如無癥狀)。
存在于(或轉(zhuǎn)化進)植物細胞中的多核苷酸通常包含能在植物細胞中表達突變的谷蛋白的啟動子。依賴于所需的表達模式，啟動子可以是組成型的、組織-或階段-特異性的和/或誘導(dǎo)型的。例如，用CAMV35S、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)ssu或組蛋白啟動子，可以在植物中得到強組成型表達。同樣，組織-特異性的或階段-特異性的啟動子，可以用于將本發(fā)明的蛋白的表達靶向轉(zhuǎn)基因植物中的特定組織或它發(fā)育中的特定階段。因而，例如，可以使用種子-特異性的、根-特異性的、葉-特異性的、花-特異性的等啟動子。種子-特異性的啟動子包括Dalta等(Biotechnology Ann.Rev.(1997)，3，pp.269-296)所述的那些。種子-特異性的啟動子的特定實例是napin啟動子(EP-A-0 255,378)、菜豆蛋白啟動子、麥谷蛋白啟動子、helianthenine啟動子(WO 92/17580)、清蛋白啟動子(WO 98/45460)、油質(zhì)蛋白啟動子(WO 98/45461)和ATS1和ATS3啟動子(WO 99/20775)。
細胞可以是任意形式。例如，它可以是分離的細胞，例如原生質(zhì)體，或它可以是植物組織的一部分，例如，愈傷組織，或從植物切離的組織，或它可以是整個植物的一部分。細胞可以是任意類型(例如，任意類型的植物部分)。例如，未分化的細胞，例如愈傷組織細胞；或分化的細胞，例如在胚、花粉、根、莖干或葉中發(fā)現(xiàn)的細胞類型。植物部分包括根；芽；葉；和參與生殖的部分，例如花粉、卵、雄蕊、花藥、花瓣、萼片和其它花部分。
本發(fā)明提供了得到轉(zhuǎn)基因的植物細胞的方法，其包含用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物細胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細胞?？梢允褂萌魏魏线m的轉(zhuǎn)化方法(在小麥的情況下，可以使用Vasil V等，Biotechnology 10，667-674(1992)公開的技術(shù))。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括植物原生質(zhì)體的電穿孔和粒子轟擊。轉(zhuǎn)化從而可以產(chǎn)生嵌合的組織或植物，其中一些細胞是轉(zhuǎn)基因的，而一些不是。
通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以將本發(fā)明的細胞或由此得到的細胞再生成轉(zhuǎn)基因植物。這包括使用植物生長物質(zhì)例如生長素、赤霉素(giberellins)和/或細胞分裂素，以刺激轉(zhuǎn)基因細胞的生長和/或分裂。類似地，可以使用諸如體細胞胚胎發(fā)生和分生組織培養(yǎng)的技術(shù)。再生技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，且實例見例如，US 4,459,355、US4,536,475、US 5,464,763、US 5,177,010、US 5,187,073、EP 267,159、EP 604,662、EP 672,752、US 4,945,050、US 5,036,006、US 5,100,792、US 5,371,014、US 5,478,744、US 5,179,022、US 5,565,346、US5,484,956、US 5,508,468、US 5,538,877、US 5,554,798、US 5,489,520、US 5,510,318、US 5,204,253、US 5,405,765、EP 442,174、EP 486,233、EP 486,234、EP 539,563、EP 674,725、WO 91/02071和WO 95/06128。
在許多這樣的技術(shù)中，一個步驟是形成愈傷組織，即包括擴增和/或分裂細胞的植物組織。這樣的愈傷組織是本發(fā)明的另一個方面，其它類型的植物細胞培養(yǎng)物和植物部分也如此。因而，例如，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物組織和部分，包括胚、分生組織、種子、莖干、根、莖、葉和花部分。它們可以是嵌合的，即它們的細胞中的一些是本發(fā)明的細胞，且一些不是。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物部分和組織、植物和種子，可以是本文提及的任何植物物種。
一般地，再生操作包含借助于標(biāo)記基因，選擇轉(zhuǎn)化的細胞。
再生步驟會產(chǎn)生第一代轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也提供了從該第一代植物得到其它代的轉(zhuǎn)基因植物的方法。它們稱作后代轉(zhuǎn)基因植物。通過本領(lǐng)域已知的任何方式，可以從第一代轉(zhuǎn)基因植物得到第二代、第三代、第四代、第五代、第六代和其它代的后代植物。
因而，本發(fā)明提供了得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從本發(fā)明的第一代轉(zhuǎn)基因植物得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，并任選地從這樣得到的第二代后代植物得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
通過任何已知的技術(shù)，可以從它們的前代祖先生成后代植物。具體地，可以如下生成后代植物(a)從屬于前代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子，然后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因種子，得到屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(b)克隆繁殖屬于前代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，以生產(chǎn)屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(c)使屬于前代的本發(fā)明的第一代轉(zhuǎn)基因植物與另一種相容的植物雜交，以生產(chǎn)屬于新代的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因后代植物；和任選地(d)從這樣得到的后代植物得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因后代植物。
可以以任意的組合使用這些技術(shù)。例如，可以在生成適于培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物的過程中的不同點使用克隆繁殖和有性繁殖。具體地，可以重復(fù)回交具有農(nóng)藝學(xué)上需要的特征的植物分類單位。也可以采取從植物取出細胞并從其再生新植物的其它步驟。
另外，通過在上述過程中的任何合適的階段，轉(zhuǎn)化細胞、植物組織、植物或種子，以導(dǎo)入需要的除本發(fā)明的多核苷酸以外的編碼序列，可以導(dǎo)入其它需要的特征。這可以通過本文所述的導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸的技術(shù)來實現(xiàn)。
例如，可以從編碼其它除草劑抗性性狀的轉(zhuǎn)基因中，選擇其它轉(zhuǎn)基因，例如對下述物質(zhì)的耐受性草甘磷(例如，使用EPSP合酶基因(例如，EP-A-0,293,358)或草甘磷氧化還原酶(WO 92/00377)基因)；或?qū)osametin的耐受性；二鹵芐腈；草銨磷，例如，使用膦絲菌素(phosphinothrycin)乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)或谷氨酰胺合酶基因(參見EP-A-0,242,236)；黃草靈，例如使用二氫蝶酸(dihydropteroate)合酶基因(EP-A-0,369,367)；或磺酰脲(sulphonylurea)，例如，使用ALS基因)；二苯醚例如氟鎖草醚或氟硝草醚，例如，使用protoporphyrogen氧化酶基因)；二唑例如惡草靈；環(huán)狀亞胺例如chlorophthalim；苯基吡唑例如TNP，或其phenopylate或氨基甲酸酯類似物。
類似地，可以導(dǎo)入除草劑耐受性以外的有益性質(zhì)的基因。例如，可以導(dǎo)入昆蟲抗性基因，特別地，編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)毒素的基因。同樣地，可以導(dǎo)入疾病抗性基因，例如如WO 91/02701或WO 95/06128所述。
一般地，在本發(fā)明的植物中表達本發(fā)明的蛋白。依賴于使用的啟動子，該表達可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。類似地，它可以是組織-或階段-特異性的，即指向植物發(fā)育中的特定植物組織(例如本文提及的任一種組織)或階段。
本發(fā)明也提供了通過收獲本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，并任選地進一步加工，來得到作物產(chǎn)物的方法。作物產(chǎn)物指任何可從作物植物得到的有用的產(chǎn)物。
含有突變的谷蛋白或包含能作為拮抗劑的序列的蛋白的產(chǎn)物本發(fā)明提供了產(chǎn)物，其包含突變的谷蛋白或包含能作為拮抗劑的序列的蛋白。一般地，它源自或包含來自本文提及的表達這樣的蛋白的植物的植物部分。這樣的產(chǎn)物可以通過收獲本發(fā)明的植物來直接得到，或通過收獲并進一步加工本發(fā)明的植物來間接得到。可直接得到的產(chǎn)物包括谷物?；蛘撸@樣的產(chǎn)物可以通過收獲并進一步加工來間接得到。可通過進一步加工得到的產(chǎn)物的實例是面粉或蒸餾的酒精飲料；用直接得到的或進一步加工的材料制作的食物產(chǎn)物，例如，用面粉制作的烘烤產(chǎn)物(例如，面包)。一般地，這樣的食物產(chǎn)物是人個體可攝入的和可消化的(即無毒且有營養(yǎng)價值)。
在包含蛋白(其包含拮抗劑序列)的食物產(chǎn)物的情況下，食物產(chǎn)物也可以包含野生型谷蛋白，但是優(yōu)選地，拮抗劑能在攝入這樣的食物后，減少(例如，完全地)腹部疾病癥狀。
脫酰胺作用當(dāng)本文所述的序列包括Gln殘基時，本發(fā)明也提供了這樣的序列，其中Gln殘基已經(jīng)被脫酰胺成Glu殘基?？梢悦擋０芬粋€或多個(例如，1、2、3、4、5等)Gln殘基/序列，但是當(dāng)存在超過一個Gln殘基時，不是必須將它們?nèi)棵擋０贰?yōu)選地，被脫酰胺的Gln殘基是對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的脫酰胺作用易感的那些。
在序列表中，給出了其中可以脫酰胺Gln的實例。例如，SEQ IDNO1的殘基4可以是Gln殘基或Glu殘基，SEQ ID NO2的殘基6可以是Gln殘基或Glu殘基，SEQ ID NO6的殘基4和7可以彼此獨立地是Gln或Glu殘基，等。對脫酰胺作用易感的Gln殘基，和它們的脫酰胺的Glu副本，稱作“Glx”殘基。
當(dāng)試劑包含超過一個Glx殘基時，它們可以以任意的構(gòu)型排列。例如，Glx殘基可以是連續(xù)的殘基，和/或可以被一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)其它殘基隔開。如上所述，對于HLA-DQ8表位，試劑優(yōu)選地包含Glx殘基，其與另一個Glx殘基由7個殘基隔開。
優(yōu)選的本發(fā)明的試劑是脫酰胺的試劑，即試劑包含一個或多個Glu形式的Glx殘基。這可以通過各種方式來實現(xiàn)，例如通過在生產(chǎn)過程中包含Glu殘基，或通過脫酰胺作用將Gln殘基轉(zhuǎn)變成Glu。通過用脫酰胺試劑處理含有對脫酰胺作用易感的Gln殘基的試劑，可以實現(xiàn)Gln向Glu的轉(zhuǎn)變。一個或多個Gln殘基優(yōu)選地被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶脫酰胺成Glu，例如，如實施例中所述。
熟練的技術(shù)人員能確定試劑中的哪個特定Gln殘基是對脫酰胺作用易感的，從而能確定哪個殘基是由Gln殘基的脫酰胺作用生成的Glu殘基。例如，對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的脫酰胺作用易感的含有Gln的序列通常符合基序例如，QXPX、QXPF(Y)、QXX(FYMILVW)、QXPF、QXX(FY)、PQ(QL)P(FY)P。例如，序列PQ(QL)P(FY)P促進轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對位置2處的標(biāo)有下劃線的Q的脫酰胺作用。
具體地，包含SEQ ID NO1-1927的脫酰胺的形式的試劑是優(yōu)選的(其中這樣的序列不是已經(jīng)脫酰胺的)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑包含SEQ ID NO1-1927的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-脫酰胺的形式(同樣，不是已經(jīng)脫酰胺的)。如本文所定義的，這些試劑的類似物和等價物，也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例下面的非限制性的實施例解釋了本發(fā)明初步的麥醇溶蛋白表位篩選文庫在初步的包含長期無谷蛋白飲食的患有腹部疾病的29個HLA-DQ2+個體的實驗中，使用干擾素-γELISPOT測定來初步篩選以前的Pepset(如WO 03/104273所述，其在本文中引作參考)，作為肽庫，且然后在15位受試者中，作為含有和沒有tTG的脫酰胺作用的單個肽。該Pepset文庫由652種20聚體麥醇溶蛋白肽組成，所述肽跨過在2001年9月發(fā)現(xiàn)的描述為小麥麥醇溶蛋白的所有Genbank條目中包含的所有獨特的12聚體。從使用ClustalW軟件(MegAlign)比對的排列成種系發(fā)生分組的基因-衍生的蛋白序列，“手工”設(shè)計該Pepset文庫。
提供了大約0.6微摩爾652種之一的20聚體。將2種標(biāo)記20聚體肽包含在每個96個的組(VLQQHNIAHGSSQVLQESTY-肽161和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通過反相-HPLC和氨基酸序列分析進行表征。這些標(biāo)記肽的平均純度分別是19％和50％。最初，將肽在乙腈(10％)和Hepes 100mM中溶解至10mg/ml。在IFNγELISpot測定中與PBMC一起溫育的單個肽的終濃度是20mcg/ml。通過以100∶32mcg/ml的比率，與豚鼠組織tTG(Sigma T5398)一起在37℃溫育2小時，將這些肽脫酰胺。在-20℃保藏肽溶液，并在使用前新解凍。在英國Oxford進行這些研究。如關(guān)于在澳大利亞Melbourne進行的實驗(本文所述的所有其它研究)所述的，進行ELIspot測定。用“Melbourne”數(shù)據(jù)匯集關(guān)于受試者對單個肽的反應(yīng)的“Oxford”數(shù)據(jù)，以用于隨后的“EM算法”中的“最小”表位分析(見下面)。
第2輪麥醇溶蛋白表位篩選文庫根據(jù)從652種20聚體的初步的麥醇溶蛋白表位篩選文庫中鑒別出的生物活性的序列，設(shè)計第2輪麥醇溶蛋白表位文庫。定義了在用所有652種脫酰胺的20聚體評價的15位HLA-DQ2+受試者中，具有相當(dāng)于大于最有效的麥醇溶蛋白20聚體(91PQPFPPQLPYPQPQLPYPQP)的5％的平均生物活性的麥醇溶蛋白20聚體。由于早期的研究(見WO 03/104273)表明，該Pepset的脫酰胺的庫比沒有脫酰胺作用更有效，所以根據(jù)基序QXPX、QXZ(FYWILVM)，其中X是脯氨酸以外的任意氨基酸，且P是脯氨酸，Z是任意的氨基酸，且FYWILVM代表著疏水氨基酸(與Vader W.等J Exp Med 2002 J.Exp.Med.195643-649，PCT WO 03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem 27734109-16公開的tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用的基序一致)，鑒別出了在潛在地被tTG脫酰胺的生物活性的20聚體內(nèi)的谷氨酰胺殘基。
然后鑒別了12聚體肽，其中每個潛在的脫酰胺作用位點可能在位于HLA-DQ2結(jié)合溝中的9聚體的位置4、6或7(HLA-DQ2錨在這些位置，證實了對谷氨酸的偏好)。然后，用甘氨酸側(cè)接候選物12聚體核心表位序列，隨后是存在于親本麥醇溶蛋白多肽中的N-末端殘基，且在C-末端，是存在于親本麥醇溶蛋白多肽中的C-末端殘基，隨后是甘氨酸(即GXXXXXXXQXXXXXXG)。
合成在位置9為谷氨酰胺或谷氨酸的肽。然后，使用來自谷蛋白攻擊后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干擾素γELISPOT測定中評價肽(100mcg/ml)(+/-tTG的脫酰胺作用)。根據(jù)EM算法(見下面)，分析這些測定的結(jié)果。另外，合成了最有效的獨特的肽，并純化至＞80％(Mimotopes)，并使用來自小麥谷蛋白攻擊后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干擾素γELISPOT測定中評價。
完全的谷蛋白表位篩選文庫為了使跨過所有小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白、黑麥、大麥和燕麥谷蛋白-樣蛋白(谷醇溶蛋白)的基本上更大的肽文庫的設(shè)計可行，且為了證實來自以前的麥醇溶蛋白肽文庫的數(shù)據(jù)，開發(fā)了迭代算法，以自動設(shè)計20聚體的最小集，其包括谷蛋白中的所有獨特的12聚體(除信號肽序列以外)。圖1顯示了ScanSet算法。
該方法測試來自一組蛋白的所有可能的肽表位是否是一定范圍的患者的潛在抗原。T-細胞表位的大小為9至15AA。為了測試一組蛋白中所有可能的12聚體，由于大數(shù)目迅速變得不可行。
在這里，我們使用下述事實，例如，20聚體肽可以覆蓋最高達9種不同的12聚體。因此，我們開發(fā)了組合方案，以覆蓋在一個蛋白家族中代表的所有可能的12聚體。
產(chǎn)生了20個氨基酸(20聚體)長的肽，將它們作為抗原進行測試，且其覆蓋存在于蛋白組中的所有12聚體肽序列。我們將要產(chǎn)生的肽的長度定義為L(例如，20)，將要覆蓋的表位的長度定義為S。我們開發(fā)了計算機程序，其能從一組蛋白產(chǎn)生所有獨特地發(fā)生的L聚體。而且，我們從該組蛋白生產(chǎn)了所有獨特地發(fā)生的S聚體。接著，我們選擇了一組N個L聚體，其含有L聚體的所有序列。圖1描繪了該算法如何工作。
在2003年6月16日，Genbank包含了下述物質(zhì)的登記號來自普通小麥(T.aestivum)的53α/β、53γ和2ω麥醇溶蛋白，和77LMW和55HMW麥谷蛋白，59大麥醇溶蛋白，14黑麥醇溶蛋白，和20燕麥蛋白(見圖2)。共計，ScanSet鑒別了在225種谷蛋白基因產(chǎn)物中含有的18117種獨特的12聚體。
所有獨特的谷蛋白12聚體都可以被包含在2922種20聚體中。在Pepset肽文庫(Mimotopes Inc.，Melbourne，澳大利亞)中合成了這些20聚體。在96個的批中(Mimotopes Inc.，Melbourne，澳大利亞)，合成了Pepset肽。提供了大約0.7-1.3微摩爾2922種中的每一種20聚體。在每個96個的組中，包含2種標(biāo)記20聚體肽(來自每個特定平板上的94種其它肽的一種代表性的肽，和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通過反相-HPLC和質(zhì)譜法進行表征。這些標(biāo)記肽的平均純度分別是36％(范圍5-68％)和64％(范圍55-71％)。
最初，將肽溶解在含水的乙腈(50％)中。將溶于含水的乙腈中的肽轉(zhuǎn)移到無菌的96-孔平板，并在含有1mM鈣(250mcg/ml)的無菌PBS中稀釋，且然后與tTG(25mcg/ml)(Sigma T5398)一起在37℃溫育6小時，再冷凍保藏(-20℃)備用。
受試者都具有活組織檢查-證實的腹部疾病，且已經(jīng)接受了至少6個月嚴(yán)格的無谷蛋白的飲食。所有受試者都具有單獨的HLA-DQB01*02(HLA-DQ2)(n＝100)或單獨的HLA-DQA1*03和HLA-DQB1*0302(HLA-DQ8)(n＝5)。在所有情況下，在谷蛋白攻擊前評價tTG-IgA，且其在正常范圍內(nèi)(發(fā)現(xiàn)30％最初的志愿者具有升高的tTG-IgA，且將其排除，因為慢性的谷蛋白暴露與不能通過短期谷蛋白攻擊誘導(dǎo)外周血谷蛋白-特異性的T-細胞有關(guān))。志愿者消耗Baker′sDelight“白面包塊(white bread block loaf)”(每天200g，持續(xù)3天)或Uncle Toby′s燕麥(每天100g，持續(xù)3天)。除了3位受試者以外的所有人都完成了3天攻擊(一位在吃了一口面包后退出，另兩位在吃了最初的兩片面包后嘔吐。來自后兩位的數(shù)據(jù)包含在隨后的分析中)。在開始谷蛋白攻擊后6天，抽取血液(300ml)。在我們以前的研究中，沒有發(fā)現(xiàn)谷蛋白肽-特異性的IFNγELISpot反應(yīng)，所以在該組實驗中沒有評價“攻擊前(pre-challenge)”血液(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6337-342.，WO01/25793，WO 03/104273)。
在96-孔平板(MAIP S-45，Millipore)中，進行IFNγELISpot測定(Mabtech，瑞典)，其中每個孔含有25mcl肽溶液和100mcl PBMC(2-8×105/孔)，所述PBMC溶于含有10％熱滅活的人AB血清的RPMI中。顯色并干燥后，使用MAIP自動化的ELISpot平板計數(shù)器，評價IFNγELISpot平板。然后，根據(jù)新的算法(期望最大化EM)分析數(shù)據(jù)，以定義和定量對包含在肽文庫中的9聚體序列的干擾素-γ反應(yīng)(見圖3和下面)。然后，根據(jù)假定T-細胞識別冗余的算法，“迭代串(Iterative Cluster)”算法(見圖4和下面)，通過允許在9聚體中的任意一個位置處有具有類似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸組，或允許谷氨酸替代在任何位置處的谷氨酰胺(假定已經(jīng)發(fā)生了脫酰胺作用)，合理解釋9聚體肽。
由于存在來自僅僅兩個HLA-DQ8+個體(其也不是HLA-DQ2+)的數(shù)據(jù)集，且它們僅僅利用來自“完全的谷蛋白表位篩選文庫”的721種小麥麥醇溶蛋白20聚體，所以通過2位受試者的肽-特異性的IFNγELISPOT反應(yīng)的平均排列，鑒別了生物活性的肽。對于預(yù)測可能的HLA-DQ8-限制的麥醇溶蛋白表位，假定對tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，占據(jù)表位的潛在9聚體核心區(qū)的位置1或9，這與HLA-DQ8結(jié)合基序和van de Wal等(van de Wal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)1585-1588)的發(fā)現(xiàn)一致。
分析來自ELISpot的數(shù)據(jù)的期望最大化(EM)算法
圖3顯示了分析來自使用ELISpot的測定的數(shù)據(jù)的算法。使用T-細胞測定，在96孔平板中測量了對不同肽的T-細胞反應(yīng)。使用許多不同的肽抗原，在許多患者上進行測定?？梢詫-細胞測定的結(jié)果總結(jié)在表中，其中行代表著肽，且列代表著患者，且單個測量值(計數(shù))在表中(例如，見圖 3B)。EM算法的目的是，區(qū)分患者對肽的反應(yīng)和不反應(yīng)，以及估計反應(yīng)的平均速度和對每種肽反應(yīng)的人的比例。
對于許多不同的患者(i用于指患者)和許多不同的肽(j用于指肽)，測量了反應(yīng)。每個測量值(yij)代表著來自對肽j起反應(yīng)的患者i的T-細胞的計數(shù)。為了估計患者中對某種肽的測量值是否可以稱作反應(yīng)，或它是否更可能來自背景分布，我們?yōu)椴煌耆珨?shù)據(jù)問題提出了模型，其中yij是觀察到的斑點計數(shù)，zij是未觀察到的指示符，無論人i是否對肽j起反應(yīng)。
將觀察到的計數(shù)yij的數(shù)目建模，以符合獨立的泊松分布泊松(αi，λj)，如果患者i對肽j起反應(yīng)，即zij＝1，且泊松(αi，λ0)，如果患者i對肽j無反應(yīng)，即zij＝0。
·完全的數(shù)據(jù)yij(觀察到的計數(shù))，zij(反應(yīng)指示符，未觀察到)。
·參數(shù)θ＝(αi，λj，λ0，pj)·αi患者總體反應(yīng)性·λj肽誘導(dǎo)的反應(yīng)速度·λ0背景反應(yīng)速度·pj對肽j起反應(yīng)的人的比例EM算法·最初將變量設(shè)定為隨機值·E-步驟計算似然·M-步驟最大化似然函數(shù)·迭代E-和M-步驟發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性表位的最小集的迭代過程開發(fā)了基于在EM算法中估計的T-細胞反應(yīng)計算用于疫苗中的肽的最小集的程序。我們測量了對來自一組蛋白的L聚體的T-細胞反應(yīng)。產(chǎn)生了覆蓋所有可能的S聚體的肽。通過EM算法，我們?yōu)榉磻?yīng)估計了下面的參數(shù)反應(yīng)速度、起反應(yīng)的人數(shù)、起反應(yīng)的人的比例。將起反應(yīng)的人的比例乘以估計的反應(yīng)速度，用作定義是好抗原的表位的標(biāo)準(zhǔn)。許多測量的L聚體含有相同的S聚體表位。為了發(fā)現(xiàn)可以解釋L聚體中的所有反應(yīng)的表位(S聚體)，我們選擇包含在具有最高平均反應(yīng)的L聚體中的S聚體。然后，我們從我們的測量中，去除含有該S聚體的所有L聚體。接著，我們在剩余的L聚體中，選擇具有最高反應(yīng)的S聚體。我們迭代該過程，直到不存在具有高于特定截止值的反應(yīng)的S聚體。我們使用幾種具有不同截止值的迭代。圖4概述了該方法。可以使用這樣定義的成串的L聚體的列表作為基礎(chǔ)，以定義最佳表位，并選擇起好抗原作用的肽。
小麥谷蛋白中的HLA-DQ2表位使用在共76位HLA-DQ2+個體中在γ-干擾素ELISPOT測定中開始谷蛋白攻擊后第6天收集的PBMC，鑒別小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中的HLA-DQ2表位(初步的麥醇溶蛋白表位文庫n＝15，第2輪麥醇溶蛋白表位篩選文庫n＝15，完全的谷蛋白表位篩選文庫n＝46)。匯集與腹部疾病患者中的單個肽反應(yīng)有關(guān)的所有數(shù)據(jù)，并通過EM算法進行分析。
根據(jù)γ-干擾素反應(yīng)的強度和起反應(yīng)的個體的比例，鑒別了一系列的9聚體序列，并整理(見圖5)?？梢詫⒃S多鑒別的序列歸入“超家族”，從而允許具有類似化學(xué)性質(zhì)的幾種不同的氨基酸存在于推定的表位中的任意一個位置處(見圖6)。例如，在圖6的“序列1”(SEQID NO1555)P(QR)P(QE)LP(FY)PQ中，谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)都可在位置2，只是除了Q產(chǎn)生實質(zhì)上更有生物活性的表位以外。
通過檢查通過EM算法鑒別出的110種最“有活性的”9聚體序列，可以將9聚體基序的“列表”精簡成41種9聚體，其中的許多是重疊的(例如，“序列1”和“2”(分別是SEQ ID NO1555和1558)重疊了7個殘基，且都存在于A-麥醇溶蛋白57-73QE65中)。在選擇的情況下，合成了高級肽，并證實了通過EM算法鑒別的肽的生物活性(見圖7)。
燕麥的燕麥蛋白中的HLA-DQ2表位用燕麥(n＝30受試者)或小麥面包(n＝8)在HLA-DQ2+腹部疾病患者中攻擊后，評價了燕麥蛋白肽。圖8給出了發(fā)現(xiàn)的對肽的ELISPOT反應(yīng)。一種反應(yīng)性的燕麥蛋白肽與小麥谷蛋白的序列(SEQID NO1590)是同源的。
燕麥(燕麥蛋白)高質(zhì)量肽研究結(jié)束用純的無小麥的燕麥進行的燕麥攻擊(100g/d，3天)后3天，評價高級燕麥蛋白肽(“第6天”PBMC干擾素γELISPOT反應(yīng))。根據(jù)以前使用篩選級(“第1輪”)燕麥蛋白肽文庫定義的肽和潛在的脫酰胺位點，設(shè)計這些肽。存在25種肽(作為16聚體)，通過HPLC證實其純度＞80％，并通過質(zhì)譜法證實其序列。
在患有DQ2+腹部疾病的18位受試者中，對比了tTG的脫酰胺作用后對高級燕麥蛋白肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)。
燕麥攻擊后優(yōu)勢的(＞70％最大反應(yīng))肽包括EQQFGQNIFSGFSVQL(SEQ ID NO1764)(11/18受試者)、QLRCPAIHSVVQAIIL(SEQ ID NO1765)(4/18受試者)和QYQPYPEQEQPILQQQ(SEQ ID NO1766)(3/18受試者)。2/18受試者不具有燕麥蛋白特異性的反應(yīng)(通過SFU(斑點形成單位)＞3X空白來定義)，且6/18受試者的平均最大SFU小于10。兩種另外的肽引起了陽性反應(yīng)QIPEQLRCPAIHSVVQ(SEQ ID NO1767)(3/18受試者)和EQYQPEQQPFMQPL(SEQ ID NO1768)(5/18受試者＞40％最大肽反應(yīng))。25種肽的系列包括幾種與Arentz-Hansen，PLoSMedicine(Oct.2004，vol.1，issue 1(84-92)中報道的肽1490(SEQYQPYPEQQEPFVQ)類似的肽，但是，該肽僅僅在1位受試者中誘導(dǎo)強陽性反應(yīng)，而在5位受試者中是遠遠更弱的反應(yīng)。
對高級燕麥蛋白肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)，在谷蛋白攻擊之前不存在，且會受到含有抗-HLA DQ而不是抗-HLA DR抗體的PBMC的預(yù)處理的封閉。
黑麥和大麥篩選肽文庫結(jié)束黑麥(面包，100g/d，3天)或大麥(煮沸的，100g/d，3天)攻擊后3天，評價黑麥醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白20聚體第1輪肽文庫(“第6天”PBMC干擾素γELISPOT反應(yīng))。盡管尚未進行使用定義表位的第2輪和第3輪肽文庫的迭代分析，但發(fā)現(xiàn)用tTG預(yù)處理的20聚體誘導(dǎo)“有效的”反應(yīng)，所述20聚體與小麥攻擊后鑒別的生物活性肽具有相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)相似性。但是，黑麥或大麥攻擊后優(yōu)勢的肽序列不包括具有PQPQLPY序列(在小麥攻擊后，發(fā)現(xiàn)其是優(yōu)勢的)的肽。在黑麥攻擊后優(yōu)勢的(＞70％最大反應(yīng))20聚體通常是PQQLFPLPQQPFPQPQQPFP(SEQ ID NO1769)(8/14受試者)，或偶爾的QPFPQPQQPTPIQPQQPFPQ(SEQ ID NO1770)(4/14)、QQPQQLFPQTQQSSPQQPQQ(SEQ ID NO1771)(1/14)、PQTQQPQQPFPQPQQPQQLF(SEQ ID NO1772)(1/14)和/或QEQREGVQILLPQSHQQLVG(SEQ ID NO1773)(1/14)。在至少1位受試者中觀察到的大于40％最大反應(yīng)的其它肽包括FPQQPQQPFPQPQQQLPLQP(SEQ ID NO1774)(3/14，2＞70％)PQQPFPQQPEQIIPQQPQQP(SEQ ID NO1775)(5/14，3＞70％)QQLPLQPQQPFPQPQQPIPQ(SEQ ID NO1776)(6/14，2＞70％)QQPQQPFPLQPQQPVPQQPQ(SEQ ID NO1777)(3/14，1＞70％)SIPQPQQPFPQPQQPFPQSQ(SEQ ID NO1778)(4/14，1＞70％)QTQQSIPQPQQPFPQPQQPF(SEQ ID NO1779)(3/14，1＞70％)NMQVGPSGQVEWPQQQPLPQ(SEQ ID NO1780)(2/14，1＞70％)VGPSGQVSWPQQQPLPQPQQ(SEQ ID NO1781)(2/14，2＞70％)QQPFLLQPQQPFSQPQQPFL(SEQ ID NO1782)(1/14，1＞70％)FPLQPQQPFPQQPEQIISQQ(SEQ ID NO1783)(5/14，1＞70％)PQQPQRPFAQQPEQIISQQP(SEQ ID NO1784)(3/14，1＞70％)SPQQPQLPFPQPQQPFVVVV(SEQ ID NO1785)(4/14，1＞70％)QQPSIQLSLQQQLNPCKNVL(SEQ ID NO1786)(1/14，1＞70％)一般地，大麥攻擊后優(yōu)勢的肽包括6個肽基序之一，或是在大麥攻擊后僅僅在17位受試者之一中是“優(yōu)勢的”的8種其它的單個的20聚體之一。鑒別的6個基序是
QQPIPQQPQPY(SEQ ID NO1787)PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO1788)LQPQQPFPQ(SEQ ID NO1789)PQPQQASPL(SEQ ID NO1790)IIPQQPQQPF(SEQ ID NO1791)YPEQPQQPF(SEQ ID NO1792)在至少1位受試者中表現(xiàn)出至少40％最大肽反應(yīng)的大麥的大麥醇溶蛋白肽包括下面的，其中星號指示著在單個個體中表現(xiàn)出最大反應(yīng)的8種單個的肽QQQPFPQQPIPQQPQPYPQQ(SEQ ID NO1793)(8/17，2＞70％)QQPQPFSQQPIPQQPQPYPQ(SEQ ID NO1794)(9/17，8＞70％)PQQPVPQQPQPYPQQPQPFP(SEQ ID NO1795)(5/17，1＞70％)PQPFPQQPIPQQPQPYPQQP(8EQ ID NO1796)(6/17，2＞70％)YPQQPQPFPQQPIPQQPQPY(SEQ ID NO1797)(6/17，2＞70％)QPQPYPQQPQPYPQQPFQPQ(SEQ ID NO1798)(7/17，2＞70％)QPQQPQPFPQQPVPQQPQPY(SEQ ID NO1799)(5/17，2＞70％)PQPYPQQPQPFPQQPPFCQQ(SEQ ID NO1800)(1/17，1＞70％)*QPFPQPQQPFPWQPQQPFPQ(SEQ ID NO1801)(10/17，2＞70％)PFPQQPQQPFPQPQQPFRQQ(SEQ ID NO1802)(6/17，3＞70％)WQPQQPFPQPQQPFPLQPQQ(SEQ ID NO1803)(9/17，5＞70％)*PWQPQQPFPQPQEPIPQQPQ(SEQ ID NO1804)(1/17，1＞70％)QQPFPQPQQPIPYQPQQPFN(SEQ ID NO1805)(5/17，1＞70％)PQQPQQPFPQPQQPFSWQPQ(SEQ ID NO1806)(6/17，2＞70％)*QPQQPFPQPQQPIPYQPQQP(SEQ ID NO1807)(4/17，1＞70％)*QSQQQFPQPQQPFPQQPQQP(SEQ ID NO1808)(1/17，0＞70％)PFPQPQQPFSWQPQQPFLQP(SEQ ID NO1809)(1/17，0＞70％)FPQPQEPFPQQPQQPFPLQP(SEQ ID NO1810)(1/17，0＞70％)PFPQPQQPFPWQPQQPFPQP(SEQ ID NO1811)(6/17，0＞70％)FPQYQIPTPLQPQQPFPQQP(SEQ ID NO1812)(2/17，1＞70％)FPLQPQQPFPQQPQQPFPQQ(SEQ ID NO1813)(1/17，0＞70％)QQPFPLQPQQPFPQPQPFPQ(SEQ ID NO1814)(1/17，0＞70％)SPLQPQQPFPQGSEQIIPQQ(SEQ ID NO1815)(1/17，0＞70％)
PQQASPLQPQPQQASPLQPQ(SEQ ID NO1816)(1/17，1＞70％)PQQPPFWPQQPFPQQPPFGL(SEQ ID NO1817)(1/17，1＞70％)*PVLSQQQPCTQDQTPLLQEQ(SEQ ID NO1818)(1/17，1＞70％)RQLPKYIIPQQPQQPFLLQP(SEQ ID NO1819)(1/17，1＞70％)QGSEQIIPQQPQQPFPLQPH(SEQ ID NO1820)(7/17，3＞70％)*PQGSEQIIPQQPFPLQPQPF(SEQ ID NO1821)(2/17，1＞70％)QPFPTPQQFFPYLPQQTFPP(SEQ ID NO1822)(4/17，1＞70％)PFPQPPQQKYPEQPQQPFPW(SEQ ID NO1823)(1/17，1＞70％)QKYPEQPQQPFPWQQPTIQL(SEQ ID NO1824)(1/17，1＞70％)FQQPQQSYPVQPQQPFPQPQ(SEQ ID NO1825)(3/17，1＞70％)QIPYVHPSILQQLNPCKVFL(SEQ ID NO1826)(1/17，1＞70％)LAAQLPAMCRLEGGGGLLAS(SEQ ID NO1827)(1/17，1＞70％)PYLPEELSPQYQIPTPLQPQ(SEQ ID NO1828)(1/17，1＞70％)*VSPHPGQQTTVSPHQGQQTT(SEQ ID NO1829)(1/17，1＞70％)*第2輪和第3輪小麥麥谷蛋白和麥醇溶蛋白肽文庫根據(jù)在任何受試者中誘導(dǎo)至少5％反應(yīng)(干擾素γELISPOT)的20聚體小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白肽的序列，所述反應(yīng)由最有活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)預(yù)處理的(酶促脫酰胺的)20聚體肽刺激，設(shè)計第2輪小麥麥醇溶蛋白和麥谷蛋白庫。在至少18位受試者中，評價所有第2輪16聚體肽。已經(jīng)在10位受試者中評價了從“Oxford”麥醇溶蛋白20聚體文庫產(chǎn)生的第2輪文庫，將該數(shù)據(jù)與從用于評價新的第2輪(擴展的)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白文庫的18位受試者產(chǎn)生的數(shù)據(jù)合并。因此，在18位(基于“Melbourne”20聚體文庫的新麥醇溶蛋白/麥谷蛋白序列)或28位受試者(基于“Oxford”20聚體文庫的麥醇溶蛋白序列)中，評價了用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶預(yù)處理的單個16聚體肽。從第2輪Oxford文庫鑒別的所有16聚體，也都滿足Melbourne第2輪文庫的選擇標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)各位受試者的干擾素γELISPOT中的肽反應(yīng)的“優(yōu)勢”，即針對個體的最大肽誘導(dǎo)的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化的個體的PBMC對特定肽的反應(yīng)百分比，分析第2輪肽文庫數(shù)據(jù)。下面的表1中顯示了在至少1位受試者中刺激至少40％的最大肽-特異性的反應(yīng)的肽的序列。該數(shù)據(jù)集支持了與用第1輪20聚體肽文庫(其使用上述的期望最大化(EM)算法)鑒別的序列一致的肽的一致性和“優(yōu)勢”。
表1在第2輪文庫中證實的、在任何一位受試者中具有最大活性的肽的至少40％活性的肽根據(jù)肽家族的效力排列
由74種肽組成的第3輪肽文庫，基于第2輪文庫中發(fā)現(xiàn)在任意的受試者中誘導(dǎo)對任意肽的最大反應(yīng)的至少10％結(jié)構(gòu)上不同的序列。這些肽對應(yīng)著野生型(未脫酰胺的)序列，后者實際上與在第2輪文庫中使用的那些相同。該文庫的獨特的特征是，它由通過HPLC證實純度＞80％、并通過質(zhì)譜法證實了序列的肽組成。
在14位受試者中，對比了對tTG的脫酰胺作用后第3輪文庫肽的干擾素γELSIPOT反應(yīng)。再次，在9/14位受試者中，包含PQPQLPY基序的序列是“優(yōu)勢的”。但是，PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO1895)在1/14受試者中，PFPQQPQQPFPQ(SEQ ID NO1896)在1/14中，PQPFLPQLPYPQP(SEQ ID NO1897)在1/14中，QPFPQPQQPQQP(SEQ ID NO1898)在4/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的3位受試者)SGQGVSQSQQQSQQQ(SEQ ID NO1899)在2/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的一位)，QYEVIRSLVLRTLPNM(SEQ ID NO1900)和GLARSQMLQQSICHVG(SEQ ID NO1901)各自在PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的一位(相同的)受試者中，RTTTSVPFGVGTGVGA(SEQ ID NO1902)在1/14受試者中，且AIHTVIHSIIMQQEQQ(SEQ ID NO1903)在1/14受試者中，刺激＞70％的最大反應(yīng)。
許多在第3輪中測試的序列在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，且根據(jù)某些序列的“相關(guān)性”，存在或不存在單個受試者的反應(yīng)，暗示著由體內(nèi)谷蛋白攻擊誘導(dǎo)的谷蛋白特異性的T細胞識別的肽的冗余。
對第3輪肽的干擾素γELISPOT反應(yīng)，在谷蛋白攻擊之前不存在，且受到含有抗-HLA DQ而不是HLA DR抗體的PBMC的預(yù)處理的封閉。
Combitopes通過對比小麥(n＝16HLA DQ2腹部疾病受試者)、黑麥(n＝17)或大麥(n＝13)攻擊后對下述序列的干擾素γELISPOT反應(yīng)，解決了表位冗余的問題和在設(shè)計用于結(jié)合“獨特的”優(yōu)勢表位的肽的診斷和治療中的潛在應(yīng)用QLQPFPQPELPYPQPQL(SEQ ID NO1904)(“P04724E”)、QPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO1905)(“626fEE”)和QLQPFPQPELPYPQPFPQQPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO1906)(“Combitope”)。黑麥和大麥攻擊后，對P04724E和626fEE的中值ELISPOT反應(yīng)(斑點形成單位)的總和，幾乎與對類似的(最佳的)濃度的Combitope的反應(yīng)相同(分別是99％和102％)。但是，小麥攻擊(n＝16受試者)后，中值P04724E反應(yīng)是對Combitope的反應(yīng)的89％，且中值626fEE反應(yīng)是對Combitope的反應(yīng)的70％。這些發(fā)現(xiàn)與小麥攻擊后而不是黑麥或大麥攻擊后這些有關(guān)的表位序列P04724E和626fEE的相當(dāng)大冗余相一致，且結(jié)合更長的肽中的優(yōu)勢表位序列，不會減少它們的生物利用度。因此，源自選擇的有效表位的combitope，可以是基于T細胞表位的腹部疾病的治療劑和診斷劑的有效送遞裝置。
與HLA-DQ8+腹部疾病有關(guān)的小麥谷蛋白中的表位使用谷蛋白攻擊后2個個體(一個是HLA-DQ8純合的，而一個是HLA-DQ8雜合子)的PBMC，鑒別了小麥麥醇溶蛋白中的表位。其它HLA-DQ8(不是DQ2)腹部疾病個體中誘導(dǎo)的T-細胞反應(yīng)，對谷蛋白攻擊較弱地反應(yīng)，且它們的數(shù)據(jù)不允許詳細的分析。
包含核心序列QGSFQPSQQ(SEQ ID NO1907)的脫酰胺的20聚體，其與已知的HLA-DQ8-限制的α-麥醇溶蛋白表位(其中為了最佳的活性，Q1和Q9是由tTG脫酰胺的)相對應(yīng)，適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)強肽反應(yīng)。但是，一系列的“核心”肽與源自γ和ω麥醇溶蛋白的20聚體中的更有效的反應(yīng)有關(guān)(見圖9)。最有效的肽在序列中具有暗示著對脫酰胺作用的易感性的谷氨酰胺，其與也對脫酰胺作用易感的第二個谷氨酰胺由7個殘基(如在QGSFQPSQQ(SEQ ID NO1907)中發(fā)現(xiàn)的)隔開，表明在由tTG脫酰胺后，這些脫酰胺的序列會變成HLA-DQ8的高親和力結(jié)合劑(HLA-DQ8的結(jié)合基序偏好位置1和9處的谷氨酸)。另一組20聚體具有對脫酰胺作用易感的谷氨酰胺殘基，但是其與對tTG-介導(dǎo)的脫酰胺作用易感的第二個谷氨酰胺未由7個殘基隔開。
HLA DQ8腹部疾病麥醇溶蛋白和麥谷蛋白表位具有HLA DQ2和HLA DQ8等位基因的5位腹部疾病受試者經(jīng)歷了小麥谷蛋白攻擊。使用來自2位初始攻擊的受試者的PBMC，篩選第1輪“Melbourne”小麥麥醇溶蛋白20聚體文庫。通過在包括2位最初的受試者的5位HLA DQ8+DQ2-CD受試者中，篩選基于第1輪文庫中的反應(yīng)性的20聚體的第2輪文庫，進一步仔細分析使用來自這兩位HLA DQ8 CD受試者的PBMC鑒別的20聚體序列。第2輪文庫由篩選級重疊16聚體和預(yù)期與tTG-介導(dǎo)的表位的脫酰胺產(chǎn)物的13聚體組成，所述表位具有位置1和/或位置9處的谷氨酰胺的脫酰胺潛力(與HLA DQ8肽結(jié)合基序相一致)。另外，在這5位受試者中，也篩選了“Melbourne”小麥谷蛋白文庫中的1400種麥谷蛋白(HMW和LMW)tTG-預(yù)處理的20聚體。
最有效的和始終如一地優(yōu)勢的麥醇溶蛋白16聚體是有關(guān)的序列VYIPPYCTIAPFGIFG(SEQ ID NO1908)(3/5受試者對最大麥醇溶蛋白16聚體＞70％反應(yīng))和也在3/5受試者中優(yōu)勢的AMCNVYIPPYCAMAPF(SEQ ID NO1908)(4/5受試者生成了對這些肽中的一種或兩種的優(yōu)勢反)。另外，鑒別了源自以前鑒別的生物活性的20聚體的一系列肽，其在ELISPOT中的反應(yīng)被增強，或?qū)μ囟ǖ拿擋０返墓劝滨０窔埢窃试S的(QE)QPTPIQP(QE)(SEQ ID NO1909)、(QE)QPFPLQP(QE)(SEQ ID NO1910)、(QE)QPIPVQP(QE)(SEQ ID NO1911)、(QE)QPQQPFP(QE)(SEQ ID NO1912)、(QE)QP(QE)LPFP(QE)(SEQ ID NO1913)、(QE)GSFQPSQ(QE)(SEQ ID NO1914)(以前公布的HLA DQ8表位，van der Wal 1998)、(QE)LPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO1915)和(QE)QPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO1916)。
篩選麥谷蛋白20聚體文庫，鑒別出了另一系列的序列，其在5位受試者中的至少一位中是優(yōu)勢的。優(yōu)勢的20聚體肽共有基序，且具有序列PQQQQQQLVQQQ(SEQ ID NO1917)、QGIFLQPH(LQ)I(AS)QLEV(SEQ ID NO1918)、QPGQGQQG(HY)Y(SEQ ID NO1919)、QSRYEAIRAII(FY)S(SEQ ID NO1920)、RTTTSVPFD(SEQ ID NO1921)、QPPFWRQQP(SEQ ID NO1922)、Q(PS)(PS)(FI)(PS)QQQQ(SEQ ID NO1923)、(QPLR)GYYPTSPQ(SEQ ID NO1924)(以前鑒別的HLADQ8表位，van der Wal 2001)、QGSYYPGQASPQ(SEQ ID NO1925)、GYYPTSSLQPEQGQQGYYPT (SEQ ID NO1926)和QGQQLAQGQQGQQPAQVQQG(SEQ ID NO1927)。在用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶預(yù)處理后，評價了麥谷蛋白肽。由此，不知道對這些表位的脫酰胺作用的需要。
在開始體內(nèi)谷蛋白攻擊后6天，已使用來自HLA DQ2+(且在一些情況中為HLA DQ8+)腹部疾病志愿者的T細胞，評價了“未表征的”篩選級肽的詳盡文庫，所述文庫包括由存在于Genbank中的基因編碼的所有獨特的12聚體序列，所述序列定義為(制備面包的)小麥(普通小麥(Triticum aestivum))、黑麥、大麥或燕麥谷蛋白，麥醇溶蛋白，麥谷蛋白，黑麥醇溶蛋白，大麥醇溶蛋白，或燕麥蛋白。已經(jīng)在HLA DQ2腹部疾病中鑒別出了相對一致模式的表位級系，所述級系類似于在腹部疾病中消耗其它有毒的谷物后的級系但與其不相同。小麥攻擊后，具有序列PQPQLPY的肽，在至少三分之二HLADQ2+腹部疾病中是優(yōu)勢的，但是其它表位偶爾是優(yōu)勢的，而PQLPY肽在少于1/6的患有腹部疾病的HLA DQ2+受試者中基本上是無活性的。篩選大量(例如，＞30)受試者后，能更好地評價罕見的優(yōu)勢表位的貢獻(進行中)。黑麥和大麥消耗后的表位級系類似于小麥消耗后的，不同之處在于，類似于麥醇溶蛋白/大麥醇溶蛋白/黑麥醇溶蛋白序列PQPQQPFP或PFPQQPQQP(而不是PQPQLPY(小麥α-麥醇溶蛋白獨有的序列))的脫酰胺的肽，通常是優(yōu)勢的。包含一系列的和部分重疊的谷蛋白表位的Combitope，與單獨的單個表位的活性相同或更高，并提供有效地送遞多種用于T細胞識別的谷蛋白表位的工具。因此，這樣的combitope可以用于設(shè)計和送遞腹部疾病中的肽治療，其靶向多種獨特的T細胞表位。
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在本文中引用的或參考的每篇PCT公開物、美國專利、其它專利、期刊和任何其它出版物，均在本文中整體引作參考。
權(quán)利要求
1.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用至少一種選自下述的試劑(a)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927的序列，和其等價物；和(b)a)的類似物，其能被識別a)的肽的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是HLA-DQ2-限制的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是HLA-DQ8-限制的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包含小麥表位。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包含燕麥表位。
7.權(quán)利要求1的方法，其中一種試劑包含小麥表位，且一種試劑包含燕麥表位。
8.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用藥物組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
9.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用藥物組合物，所述組合物包含具有如權(quán)利要求1所定義的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
10.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含給個體施用組合物，以用于使個體耐受谷蛋白，以抑制生成對如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細胞或抗體反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑。
11.預(yù)防或治療腹部疾病的方法，其包含通過下述方法，診斷個體的腹部疾病a)使來自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ IDNO1-1927的序列，和其等價物；和ii)i)的類似物，其能被識別i)的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸；和體外測定樣品中的T細胞是否識別該試劑；T細胞的識別指示著個體患有或易感腹部疾?。换騜)施用如權(quán)利要求1所定義的試劑，和體內(nèi)測定個體中的T細胞是否識別該試劑，其中試劑的識別指示著個體患有或易感腹部疾病；和給診斷為患有或易感腹部疾病的個體，施用用于預(yù)防或治療腹部疾病的治療劑。
12.試劑在制備用于治療或預(yù)防腹部疾病的藥物中的用途，其中所述試劑包含(a)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ ID NO1-1927的序列，和其等價物；和(b)(a)的類似物，其能被識別(a)的肽的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑是HLA-DQ2-限制的。
14.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑是HLA-DQ8-限制的。
15.權(quán)利要求12的用途，其中一種試劑是HLA-DQ2-限制的，且第二種試劑是HLA-DQ8-限制的。
16.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑包含小麥表位。
17.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑包含燕麥表位。
18.權(quán)利要求12的用途，其中一種試劑包含小麥表位，且一種試劑包含燕麥表位。
19.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于藥物組合物中，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
20.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于藥物組合物中，所述組合物包含具有如權(quán)利要求12定義的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
21.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑存在于組合物中，所述組合物用于使個體耐受谷蛋白，以抑制生成對如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細胞或抗體反應(yīng)。
22.如權(quán)利要求1所定義的試劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過使識別試劑的T細胞耐受來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
23.具有如權(quán)利要求1所定義的T細胞受體的T細胞的拮抗劑，其任選地與載體相結(jié)合，以用于通過拮抗這樣的T細胞來治療或預(yù)防腹部疾病的方法中。
24.如權(quán)利要求1所定義的試劑或結(jié)合抗體的類似物，所述抗體結(jié)合如權(quán)利要求1定義的試劑的表位，其用于通過使個體耐受以預(yù)防這樣的抗體的生產(chǎn)，來治療或預(yù)防個體的腹部疾病的方法中。
25.蛋白，其包含能結(jié)合T細胞受體的序列，該T細胞受體識別能如權(quán)利要求1所定義的試劑，且該序列能造成攜帶這樣的T細胞受體的T細胞的拮抗作用。
26.如權(quán)利要求1所定義的試劑或如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑。
27.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所定義的試劑或如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
28.組合物，其用于使個體耐受谷蛋白，以抑制生成對如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細胞或抗體反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求1所定義的試劑。
29.組合物，其用于拮抗對如權(quán)利要求1所定義的試劑的T細胞反應(yīng)，所述組合物包含如權(quán)利要求9所定義的拮抗劑。
30.突變的谷蛋白，其野生型序列可以被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如權(quán)利要求1所定義的試劑的序列，該突變的谷蛋白包含突變，所述突變可以預(yù)防它被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成作為如權(quán)利要求1所定義的試劑的序列；或這樣的突變的谷蛋白的片段，其長度是至少7個氨基酸，且其包含該突變。
31.多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求25或30定義的蛋白或片段的編碼序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的多核苷酸，其另外包含一個或多個可操作地連接到編碼序列上的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能確保編碼序列在細胞中的表達。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的多核苷酸，其中調(diào)節(jié)序列允許編碼序列在原核或哺乳動物細胞中表達。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中的任一項的多核苷酸，它是載體，或它是載體的形式。
35.細胞，其包含如權(quán)利要求31-34中的任一項定義的多核苷酸，或其已經(jīng)被這樣的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的細胞，它是原核細胞或哺乳動物細胞。
37.哺乳動物，其表達如權(quán)利要求1所定義的T細胞受體。
38.診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包?a)使來自宿主的樣品接觸至少一種選自下述的試劑i)肽，其包含至少一個表位，所述表位包含選自SEQ IDNO1-1927的序列，和其等價物；和ii)(i)的類似物，其能被識別(i)的T細胞受體識別，且其長度不超過50個氨基酸；和(b)體外測定樣品中的T細胞是否識別該試劑；T細胞的識別指示著該個體患有或易感腹部疾病。
39.如權(quán)利要求38所定義的試劑在制備用于診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒ㄖ械脑\斷工具中的用途，所述方法包含，測定個體的T細胞是否識別該試劑，其中T細胞的識別指示著該個體患有或易感腹部疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的方法或用途，其中所述試劑是類似物(iii)，其包含結(jié)合到(a)HLA分子或(b)能結(jié)合(i)或(ii)的HLA分子的片段上的(i)或(ii)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法或用途，其中所述HLA分子或片段是在復(fù)合物中，所述復(fù)合物包含4個HLA分子或HLA分子的片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求39-41中的任一項的用途，其中所述方法包含，給個體的皮膚施用試劑，和檢測炎癥在施用部位的存在，其中炎癥的檢測指示著個體的T細胞識別該試劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求39、41或42的方法，其中所述樣品是血液樣品。
44.根據(jù)權(quán)利要求38、40、41或43的方法，其中在所述測定之前，未以抗原特異性的方式體外地再次刺激T細胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求38-44中的任一項的方法或用途，其中通過檢測T細胞對細胞因子的分泌，來確定T細胞對試劑的識別。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法或用途，其中所述細胞因子是IFN-γ。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的方法或用途，其中通過允許細胞因子結(jié)合固定化的對該細胞因子特異性的抗體，且然后檢測抗體/細胞因子復(fù)合物的存在，來檢測細胞因子。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-44中的任一項的方法或用途，其中所述測定是通過測量試劑是否結(jié)合T細胞受體來完成的。
49.鑒別如權(quán)利要求38、40或41中所定義的類似物的方法，其包含測定候選物質(zhì)是否能被T細胞受體識別，所述T細胞受體識別包含如權(quán)利要求38所定義的序列的表位，其中該物質(zhì)的識別指示著該物質(zhì)是類似物。
50.診斷個體中的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含測定來自個體的樣品中結(jié)合包含如權(quán)利要求38所定義的序列的表位的抗體的存在，其中抗體的存在指示著該個體患有或易感腹部疾病。
51.測定組合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含測定組合物中是否存在能被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾成如權(quán)利要求38所定義的寡肽序列的蛋白，其中該蛋白的存在指示著該組合物能造成腹部疾病。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中如下完成所述測定使組合物接觸對能被修飾成寡肽序列的序列特異性的抗體，其中抗體與組合物中蛋白的結(jié)合，指示著該組合物能造成腹部疾病。
53.鑒別T細胞的拮抗劑的方法，所述T細胞識別如權(quán)利要求1所定義的試劑，所述方法包含使候選物質(zhì)接觸T細胞，和檢測該物質(zhì)是否造成T細胞經(jīng)歷抗原特異性的反應(yīng)的能力的降低，其中所述能力的任何這樣的降低的檢測，指示著物質(zhì)是拮抗劑。
54.試劑盒，其用于實現(xiàn)根據(jù)權(quán)利要求38-48中的任一項的方法或用途，其包含如權(quán)利要求38、40或41所定義的試劑和用于檢測T細胞對肽的識別的工具。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的試劑盒，其中用于檢測識別的工具包含IFN-γ的抗體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述抗體固定化在固體支持物上，且任選地該試劑盒也包含用于檢測抗體/IFN-γ復(fù)合物的工具。
57.如權(quán)利要求56所定義的試劑或拮抗劑或如權(quán)利要求30所定義的野生型序列在生產(chǎn)對試劑、拮抗劑或野生型序列特異性的抗體中的用途。
58.谷蛋白的表位中的突變在降低谷蛋白造成腹部疾病的能力中的用途，所述表位如權(quán)利要求38所定義。
59.鑒別作為腹部疾病的治療劑的產(chǎn)物的方法，其包含給患有或易感腹部疾病的如權(quán)利要求37所定義的哺乳動物施用候選物質(zhì)，并測定該物質(zhì)是否預(yù)防或治療哺乳動物中的腹部疾病，其中腹部疾病的預(yù)防或治療指示著該物質(zhì)是治療產(chǎn)物。
60.如權(quán)利要求59的方法所鑒別的治療產(chǎn)物，其用于預(yù)防或治療腹部疾病的方法中。
61.診斷個體的腹部疾病或?qū)Ω共考膊〉囊赘行缘姆椒?，其包含施用如?quán)利要求38所定義的試劑，和體內(nèi)測定個體中的T細胞是否識別該試劑，其中試劑的識別指示著個體患有或易感腹部疾病。
62.根據(jù)權(quán)利要求35的細胞，它是禾本科單子葉植物物種的細胞。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的細胞，它是小麥、玉米、燕麥、黑麥、稻、大麥、黑小麥、高梁或甘蔗的細胞。
64.生產(chǎn)由如權(quán)利要求31所定義的編碼序列編碼的蛋白的方法，該方法包含(a)在允許表達蛋白的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求35、36、62或63中的任一項的細胞；和任選地(b)回收表達的蛋白。
65.得到轉(zhuǎn)基因的植物細胞的方法，其包含(a)用根據(jù)權(quán)利要求34的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物細胞。
66.得到第一代轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含(b)再生用根據(jù)權(quán)利要求34的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因的植物細胞，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
67.得到轉(zhuǎn)基因植物種子的方法，其包含(c)從可從權(quán)利要求66的步驟(b)得到的轉(zhuǎn)基因植物得到轉(zhuǎn)基因種子。
68.得到轉(zhuǎn)基因后代植物的方法，其包含從可通過根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物，和任選地從由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因植物。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其包含(d)從可通過根據(jù)權(quán)利要求67的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，得到轉(zhuǎn)基因種子，然后從轉(zhuǎn)基因種子得到第二代轉(zhuǎn)基因后代植物；和/或(e)克隆繁殖可通過根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，以生產(chǎn)第二代后代植物；和/或(f)使可通過根據(jù)權(quán)利要求66的方法得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物與另一種植物雜交，以生產(chǎn)第二代后代植物；和任選地(g)從這樣得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的轉(zhuǎn)基因后代植物。
70.可通過根據(jù)權(quán)利要求65-69中的任一項的方法得到的轉(zhuǎn)基因的植物細胞、植物、植物種子或后代植物。
71.轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，其包含根據(jù)權(quán)利要求62或63的植物細胞。
72.轉(zhuǎn)基因的植物細胞愈傷組織，其包含可從權(quán)利要求62、63或65-69中的任一項所定義的轉(zhuǎn)基因的植物細胞、第一代植物、植物種子或后代得到的根據(jù)權(quán)利要求62或63的植物細胞。
73.根據(jù)權(quán)利要求70-72中的任一項的植物或愈傷組織，它是如權(quán)利要求62或63所定義的物種。
74.得到作物產(chǎn)物的方法，其包含從根據(jù)權(quán)利要求70-73中的任一項的植物收獲作物產(chǎn)物，和任選地進一步加工收獲的產(chǎn)物。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述植物是小麥植物，且所述收獲的作物產(chǎn)物是谷物；任選地進一步加工成面粉或另一種谷物產(chǎn)物。
76.可通過根據(jù)權(quán)利要求74或75的方法得到的作物產(chǎn)物。
77.食物，其包含如權(quán)利要求25或30所定義的蛋白。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的食物，其中使用如權(quán)利要求25或30所定義的蛋白代替野生型谷蛋白。
全文摘要
此處公開的本發(fā)明涉及在診斷、治療和預(yù)防腹部疾病的方法中使用的表位。提供了包含至少一種表位的治療組合物。
文檔編號A61P1/00GK1976715SQ200580021704
公開日2007年6月6日 申請日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者R·安德森, T·貝斯巴思, J·T·丁 申請人:英國技術(shù)集團國際有限公司