專利名稱：H3、h9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。
背景技術：
流行性感冒(簡稱流感，Influenza)是由流感性感冒病毒(簡稱流感病毒，Influenza virus，IV)引起的一種古老的疾病，公元1173年發(fā)生了第一次流感樣疾病的流行，在以后的幾百年內有幾十次流感流行。甲型流感病毒曾引起了數(shù)次大范圍的流行，包括1918～1919年的西班牙流感(H1N1)，1957年的亞洲流感(H2N2)，1968年的中國香港流感(H3N2)和1977年的俄國流感(H1N1)，每次大流行都造成了巨大的人力資源和物力資源的損失。1999年證實禽源H9N2感染人類。如果禽流感在人際間傳播能力增強，那么人類因此而死亡和染病情況將十分嚴重。
到目前為止，免疫接種是防制流感最為有效的手段。但由于流感病毒易變異，所以至今尚未開發(fā)出長期有效的疫苗。另外，目前所設計的和正在研究的諸多基因工程疫苗仍存在許多問題和不足。在許多疫苗設計的抗原成分中仍含有大量與特異性免疫誘導無關的成分，如免疫抑制、增強抗體和自身免疫等免疫病理成分，而這些成分正是引起局部或全身不良反應的重要因素；另外，有些疫苗在設計時為了達到純度和安全性高的目的(如寡肽疫苗)，往往采用少數(shù)幾個抗原決定簇，這樣又造成了抗原單一，免疫原性弱等缺陷。
技術內容基于上述問題，本發(fā)明構建了一種具有預防H3、H9亞型流感的多價復合多表位DNA疫苗。
本發(fā)明以H3、H9亞型流感病毒的HA表位基因，流感病毒的主要抗原NP、NA、M表位基因為基礎，以編碼脯氨酸的堿基序列和編碼絲氨酸的堿基序列作為各表位的連接基因，連接模式為-CCT-CCT-TCA-，再附以Kozak序列，并在多表位基因分子的5′端引入3個酶切位點SmalI，NheI，NotI，在3′端引入4個酶切位點NheI，EcoRI，ApaI，XbaI，利用計算機的模擬設計與抗原性預測功能，確定各表位的最佳組合方式，通過人工合成的方法獲得了針對H3、H9亞型流感病毒的一段長765bp的復合多表位目的基因Epi，將復合多表位目的基因Epi插入到安全性核酸疫苗表達載體pIRES1neo中，構建了具有預防H3、H9亞型流感的多價復合多表位DNA疫苗pIRE-Epi。
本發(fā)明由上述方法所獲得的H3、H9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗SEQ ID NO1。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果1、本發(fā)明獲得的重組核酸疫苗pIRE-Epi可表達完整的融合蛋白，可與H3、H9亞型流感的HA抗體發(fā)生特異性反應。
2、本發(fā)明獲得的核酸疫苗可刺激小鼠產生特異的體液免疫和細胞免疫。
3、本發(fā)明獲得的重組核酸疫苗對實驗動物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
4、本發(fā)明所使用的目的基因為包含H3、H9亞型流感的HA抗原表位的復合多表位基因，從而構建的重組核酸疫苗可作為預防H3、H9亞型流感的DNA疫苗。
5、本發(fā)明以流感病毒主要抗原表位基因為基礎，以Kozac序列為輔助基因，以真核表達載體pIRES1neo為載體分子，對抗原表位基因進行人工分子設計并輔以計算機模擬來研制新型流感基因工程疫苗的新思路，獲得針對不同血清型和不同流行株的安全高效復合多表位DNA疫苗。


附圖是本發(fā)明流感復合多表位DNA疫苗pIRE-Epi構建流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明以H3、H9亞型流感病毒的HA表位基因，流感病毒的主要抗原NP、NA、M表位基因為基礎，以編碼脯氨酸的堿基序列和編碼絲氨酸的堿基序列作為各表位的連接基因，連接模式為-CCT-CCT-TCA-，再附以Kozak序列，并在多表位基因分子的5′端引入3個酶切位點SmalI，NheI，NotI，在3′端引入4個酶切位點NheI，EcoRI，ApaI，XbaI，利用計算機的模擬設計與抗原性預測功能，確定各表位的最佳組合方式，通過人工合成的方法獲得了針對H3、H9亞型流感病毒的一段長765bp的復合多表位目的基因Epi，將復合多表位目的基因Epi插入到安全性核酸疫苗表達載體pIRES1neo中，構建了具有預防H3、H9亞型流感的多價復合多表位DNA疫苗pIRE-Epi。對所構建的核酸疫苗用脂質體轉染法轉染HeLa細胞，經(jīng)反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫蛋白印記(WesternBlot)和免疫熒光試驗進行檢測，鑒定重組核酸疫苗質粒所表達外源基因的體外活性。將篩選出的重組核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，進行免疫學指標的檢測。用酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)方法和血凝/血凝抑制(HA/HI)試驗方法進行體液免疫檢測，用流式細胞檢測法和ELISpot試劑盒進行細胞免疫檢測。
下面敘述本發(fā)明的實施方法1、分子生物學常規(guī)的實驗操作大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化、質粒的提取及限制性內切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質粒的篩選與鑒定、PCR擴增反應等均參照《分子克隆實驗指南》(黃培堂等譯，第三版，科學出版社，2002)相關章節(jié)進行。
2、目的基因的分子設計及合成2.1目的基因的分子設計選擇IV優(yōu)勢表位作為疫苗抗原的成分。表位選擇的原則為①既含有能激發(fā)機體產生CTL反應的T細胞表位，也含有抗體反應B細胞表位，以前者為主；②以抗原保守區(qū)的優(yōu)勢表位為主；③避免誘發(fā)產生免疫抑制、增強抗體和自身免疫等免疫病理反應的組分；④表位序列以IV中國流行株為基礎；⑤以流感病毒HA、NA、NP、M等主要保護性抗原基因的表位為主。將選擇的優(yōu)勢表位以柔性氨基酸連接，形成一段人工多肽序列Epi；通過蛋白質同源建模(Homologicalmodelling)，利用結構和序列的同源性在PDB庫中搜索同源蛋白模板，預測未知結構Epi蛋白的三維構象。
2.2目的基因分子的合成2.2.1DNA片段的制作根據(jù)2.1設計的DNA序列，合成單鏈小片段DNA，再通過PCR方法，把單鏈小片段DNA拼接成一條完整的雙鏈DNA片段。
2.2.2限制酶切反應①在Microtube管中配制下列反應液

②37℃保溫1小時。
③經(jīng)乙醇沉淀后溶解于20μl的TE Buffer中(Insert DNA)。
2.2.3連接反應①在Microtube管中配制下列反應液

*TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2的組份(TaKaRa Code.D6022)②16℃保溫30分鐘。
③連接液全量轉化至E.coli JM109 Competent Cell。
④挑取單個菌落，提取質粒，即得重組質粒pMD18-T-Sim-Epi。
3、針對H3、H9亞型流感核酸疫苗重組體的構建(流程圖見附件2)3.1雙酶切反應用限制性內切酶Not I和EcoR I消化質粒pMD18-T-Sim-Epi，獲得基因片段Epitopes；用限制性內切酶Not I和EcoR I消化真核表達載體pIRES1neo，獲得線性化的載體片段。具體步驟如下將1.0μg的質粒DNA與適量水混勻，使其總體積為17μl，各加入兩種限制性內切酶2～3U及2μl相應的10×限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應溫度水浴2～3h，取5μl反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。完全酶切后，回收片段備用。
3.2連接反應將獲得Epitopes基因片段定向插入到pIRES1neo載體中，獲得pIRE-Epi重組體質粒。具體步驟如下取0.5μg回收的載體DNA，加2-10倍摩爾量的外源DNA片段，2μl 10×連接緩沖液加水定容至20ul，最后加入適量的T4DNA連接酶(1weiss單位)，混勻并瞬間離心以使液滴聚集管底，置16℃水浴過夜或25℃連接1-4h，取5μl連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。最后挑取單個菌落，進行質粒提取后獲得DNA重組體pIRE-Epi。
4、重組質粒表達產物的檢測4.1SDS-PAGE凝膠電泳轉染后72h，棄培養(yǎng)液，用1ml 37℃預熱的TEN(40mmol/L Tris·ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脫細胞，收集于Eppendorf管中，3000rpm離心5min，棄上清，細胞沉淀用PBS洗一次，加60μl細胞裂解液(10mmol/L Tris·Cl pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000rpm離心5min，取上清液，加入等量2倍上樣緩沖液混勻，于12％SDS-PAGE進行電泳。
以轉染空白真核表達載體質粒的細胞、空白細胞和低分子量標準蛋白質(97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa)作對照，分別取適量樣品加等量2倍上樣緩沖液，用微量移液器加入加樣槽，以8V/cm電壓電泳。當溴酚藍前沿進入分離膠后，換以12v/cm電壓電泳，溴酚藍至分離膠底部后，取出凝膠，進行考馬斯亮藍染色或蛋白印跡。
4.2Western blot檢測SDS-PAGE電泳結束后，切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的Whatman 3mm濾紙和1張硝酸纖維素膜(Millipore HAWP)，用軟鉛筆在纖維膜一角做好標記。將它們漂浮于ddH2O水平面上，潤濕后浸于水中5min，驅除膜上的氣泡，再浸泡于轉移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，使濾紙、凝膠和硝酸纖維素膜對齊，且各層之間無氣泡存在；將塑料支架夾緊插入電轉移槽中；硝酸纖維素膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加轉移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·Cl，0.037％SDS，20％甲醇)稍超過凝膠，以30V～35V電壓，4℃轉移14～16h。轉移完畢，將硝酸纖維素膜浸于封閉液(5％脫脂奶粉或3％BSA，150mmol/L NaCl，0.02％Tween-20)中約室溫2h，以封閉無關蛋白結合位點，同時對凝膠進行染色，檢查蛋白轉移是否完全。封閉后，用洗滌液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；將一抗(雞抗AIV多克隆血清)用抗體稀釋液(0.01mol/L TBS，1％BSA，0.05％Tween-20)適當稀釋，滴在保鮮膜上，然后將硝酸纖維素膜正面(吸附抗原面)向下覆蓋在加抗體的保鮮膜上，室溫反應2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；同樣方法加酶標二抗(堿性磷酸酶標記的山羊抗雞IgG)，室溫反應2h；用洗滌液洗膜3次，每次5min；膜稍干，加酶底物反應液進行反應。
酶底物反應液配制(1)NBT(氮蘭四唑)在10ml 70％的二甲基酰胺中溶解0.5g NBT；(2)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)在10ml 100％二甲基酰胺中溶解0.5g BCIP；(3)堿性磷酸酶緩沖液100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5。取66μl NBT與10ml堿性磷酸酶緩沖液混勻，加入33μl BCIP，該溶液在30min內使用；將洗滌過的膜移入淺托盤中，按0.1ml/cm2加入底物反應液，于室溫平緩搖動進行溫育顯色。顯色5～20min后將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中，終止顯色，觀察結果。
4.3間接免疫熒光實驗(IFA)
按步驟4的方法，將質粒轉染到長有70％HeLa細胞單層的玻片上，5％CO2、37℃培養(yǎng)3d后，取出玻片，用PBS液沖洗三次，100％冷丙酮固定10～30min，再用PBS液洗滌三次；用含有3％BSA的PBS封閉2h，沖洗3次，每次5min；加入一抗(雞抗AIV血清)，37℃作用2h后，沖洗3次；加入二抗(異硫氰熒光素標記的羊抗雞IgG)，室溫避光作用1h，沖洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察(加入二抗后操作步驟均應避光進行；一般情況下，盡量在較短時間內完成拍照，以免熒光淬滅)。
5、核酸疫苗質粒免疫小鼠用堿裂解法大量制備質粒DNA，PEG純化后溶于無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用紫外分光光度法進行DNA定量，終濃度調至1μg/μL。
5.1實驗分組6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分成9組，每組12只，分別按100ug/只腿部肌肉注射重組質粒、空質粒pVAX1和PBS溶液。每間隔2周加強免疫一次，第三次免疫后10d殺鼠取血清和脾淋巴細胞檢測抗體、T淋巴細胞亞群的數(shù)量及Elisapot檢測單細胞水平IFN-γ分泌。分組情況見表1。
5.2脾T淋巴細胞的制備小鼠免疫后斷頸處死取脾，用載玻片毛面相對研磨脾臟，加入4mL PBS，通過濾膜過濾去除組織碎片；將細胞懸液吸入10ml離心管，2000rpm離心10min，棄上清；加入3ml紅細胞裂解液懸浮細胞(Tris-NH4Cl緩沖液，取Tris 1.03g及NH4Cl 3.735g，加雙餾水至500ml，過G-5漏斗，4℃儲存?zhèn)溆?室溫放置10min，2000rpm離心10min，棄上清；加入4ml Hank’s液洗滌并進行細胞計數(shù)，離心(同上)后加入適量10％1640培養(yǎng)液，調整細胞數(shù)達1×107個/ml。
表1小鼠實驗免疫分組

5.3單細胞水平IFN-γ分泌的檢測按試劑盒說明書進行。
5.4免疫小鼠血清抗體效價檢測眼眶采血后分離血清，離心收集上清備用。用間接ELISA方法測定抗體效價，同時用非免疫鼠血清做陰性對照，主要參照《動物病毒學》第二版進行。具體操作如下ELISA試劑PBS(pH7.4)NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，溶于1000ml蒸餾水；包被液(pH7.6)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，溶于1000ml水中；或用pH9.6的PBS包被；封閉液用PBS緩沖液配3％BSA；洗滌液PBS緩沖液中加0.05％Tween-20；底物溶液pH5.0磷酸檸檬酸緩沖液0.2M Na2HPO4(28.4g/L)25.7ml與0.1M檸檬酸24.3ml混合后，取出10ml，加入以下成分鄰苯二胺(OPD)4mg，30％H2O210μL?；靹蚝罅⒓词褂?。
步驟1)包被用包被液等體積稀釋抗原，在96孔酶標板每孔加入，100μL 37℃包被1.5h(也可4℃包被過夜)；
2)封閉加入100μL/孔的封閉液，37℃封閉1.5h；3)洗滌用洗滌液洗板三次，每次3min；4)結合一抗用含0.3％BSA的PBS緩沖液倍比稀釋抗血清，每孔加100μL，其中一列加倍比稀釋的對照陽性血清，每孔100μL。37℃孵育1.5h；5)洗滌用洗滌液洗板3次，每次3min；6)結合二抗用含0.3％BSA的PBS緩沖液按適當比例(參照說明書)稀釋，37℃孵育1.5h；7)洗滌用洗滌液洗板5次，每次3min；8)顯色每孔加100μL底物溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，暗處放置1～3min，待顯色后每孔加入50μL30％濃硫酸終止顯色；9)讀板使用酶標儀讀490nm的OD值。
5.5脾T淋巴細胞亞群數(shù)量的檢測制備小鼠脾單細胞懸液1-2×106/ml，用熒光洗液洗兩遍(熒光洗液100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％NBS)。加入PE標記的CD4抗體和FITC標記的CD8抗體各20μl，總體積為40ul混均，或加入FITC標記的CD3抗體45μl，置4℃避光30min，取出后用熒光洗液洗兩遍。加入0.5ml熒光保存液(熒光保存液100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％葡萄糖，1％甲醛，0.1％NaN3)，4℃保存(一周以內)，用流式細胞儀分析T細胞亞群。FACS共檢測10000個細胞，分別得到脾細胞中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
檢測結果設計及人工合成的流感復合多表位基因序列Epitopes見附件1。
將獲得的核酸疫苗pIRE-Epi轉染HeLa細胞，用間接免疫熒光實驗和Western-blot檢測，結果均為陽性。說明構建的核酸疫苗可在體外表達具有生物活性的融合蛋白。將此核酸疫苗免疫小鼠后，能刺激脾T淋巴細胞增殖，激發(fā)產生抗H3、H9亞型AIV抗體；pIRE-Epi免疫組與其他各組相比較，CD4+和CD8+的數(shù)量顯著提高(P＜0.05)；其免疫所產生的IFN-γ水平明顯高于其它對照組。
<110>金，寧一<120>H3、H9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗pIRE-Epi<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>765<212>DNA<213>Influenza A virus<221>gene<222>(1)..(765)<400>1cccggggcta gcgcggccgc cgccgccacc atgtgttgtt tcatgtgggg catacatcac 60ccacctactg atactcctcc ttcagcagtt ggtctgagga atgtacctgc tagatcaagt 120agacctcctt caaaatatgt tggagtaaag agtctcaaat tgcctccttc atgtgtaaat 180ggctcttgct ttactgtacc tccttcattg aaatacaatg gcataataac agacactatc 240cctccttcag catatgagag aatgtgcaac atcctccctc cttcaacata ccagagaaca 300agagctctcg tgcctccttc aatcctgaga ggatccgtag cccataagcc tccttcaatt 360ttagggtttg tgttcacgct caccgtgcct ccttcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg 420cagagacttg aacctccttc agggatttta gggtttgtgt tcacgctccc tccttcattt 480atcactgagg gtttcacttg gactggggtc actcagaatg ggggaagcaa tgctcctcct 540tcaagatcag atgcacctat tgacacctgc atttctgaat gcatcactcc aaatggaagc 600atccctcctt caaatagtaa tggaaaccta atcgctcctc ggggctattt caaaatgcgc 660actgggaaaa gccctccttc acggggctat ttcaaaatgc gcactgggaa aagctcaata 720atgagatcac cttgtggtgc tagctaagaa ttcgggccct ctaga 76權利要求
1.一種H3、H9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗，其特征在于以H3、H9亞型流感病毒的HA表位基因，流感病毒的主要抗原NP、NA、M表位基因為基礎，以編碼脯氨酸的堿基序列和編碼絲氨酸的堿基序列作為各表位的連接基因，連接模式為-CCT-CCT-TCA-，再附以Kozak序列，并在多表位基因分子的5′端引入3個酶切位點SmalI，NheI，NotI，在3′端引入4個酶切位點NheI，EcoRI，ApaI，XbaI，利用計算機的模擬設計與抗原性預測功能，確定各表位的最佳組合方式，通過人工合成的方法獲得了針對H3、H9亞型流感病毒的一段長765bp的復合多表位目的基因Epi，將復合多表位目的基因Epi插入到安全性核酸疫苗表達載體pIRES1 neo中，構建了具有預防H3、H9亞型流感的多價復合多表位DNA疫苗pIRE-Epi。
2.由權利要求1的方法所獲得的H3、H9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗SEQ ID NO1。
全文摘要
一種H3、H9亞型流感復合多表位二價核酸疫苗，屬于生物技術領域。本發(fā)明的目的是構建了一種具有預防H3、H9亞型流感的多價復合多表位DNA疫苗。本發(fā)明以流感病毒主要抗原表位基因為基礎，以Kozac序列為輔助基因，以真核表達載體pIRESlneo為載體分子，對抗原表位基因進行人工分子設計并輔以計算機模擬來研制新型流感基因工程疫苗的新思路，獲得針對不同血清型和不同流行株的安全高效復合多表位DNA疫苗。本發(fā)明獲得的核酸疫苗可刺激小鼠產生特異的體液免疫和細胞免疫，并且獲得的重組核酸疫苗對實驗動物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
文檔編號A61P31/00GK101053658SQ20061001676
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月12日 優(yōu)先權日2006年4月12日
發(fā)明者金寧一, 賈雷立, 金擴世, 魯會軍, 田明堯, 連海, 李昌, 金洪濤, 鄭敏 申請人:金寧一