專利名稱：蓍草中倍半萜內(nèi)酯a的提純及其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和藥理學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤(tumor)是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。中藥應(yīng)用于惡性腫瘤的防治已有悠久的歷史，并且常以復(fù)方的形式為主。在目前的腫瘤治療中，中草藥主要以化療的輔助性藥物應(yīng)用在腫瘤術(shù)后的治療過程中，因其毒副作用小，越來越受到人們的青睞。目前臨床上在治療食道癌、前列腺癌、胃癌和婦科惡性腫瘤等惡性腫瘤的藥物，因其在抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，無選擇地也抑制骨髓等細(xì)胞的增殖，所以目前期待著在抗惡性腫瘤藥物的研究中，研究和開發(fā)毒副作用低、選擇性高的抗惡性腫瘤藥物已成為亟待解決的問題。本發(fā)明的目的就在于提供對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖具有選擇性高、毒副作用低的天然化合物。
本發(fā)明為達(dá)到上述目的，對(duì)許多的化合物進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了菊科植物蓍草(Achillea millefolium)中的倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了下述是表示的倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
本發(fā)明化合物可按以下步驟制備1)取蓍草的花4.2公斤，用甲醇在室溫下浸泡2周，重復(fù)提取兩次，減壓除去甲醇，得到的甲醇提取物溶于飽和的鹽水中，用水飽和的正己烷萃取，除去脂溶性成分，水層用水飽和的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液用無水硫酸鈉脫水，回收溶劑，得到149g乙酸乙酯萃取物。
2)將乙酸乙酯萃取物用硅膠干柱層析技術(shù)，用乙酸乙酯/甲醇洗脫，再將硅膠柱分成15段，把第3段至第6段進(jìn)行合并，得到43g倍半萜類化合物的富集物。
3)將此富集物再次進(jìn)行柱層析分離純化，用環(huán)己烷/乙酸乙酯(3∶1-1∶4)進(jìn)行梯度洗脫，得到10份的梯度洗脫物。
4)將第3份洗脫物用制備型TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3為展開劑進(jìn)行展開；展開后刮取在紫外燈下有吸收色帶的部分，用丙酮進(jìn)行洗脫，丙酮洗脫物回收溶劑后再用高效液相進(jìn)一步純化處理(乙氰-水25-75梯度系統(tǒng))，得到7.1mg的倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
通過以下實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明化合物的活性1)選用的細(xì)胞株為人前列腺癌細(xì)胞株(MCF7)、人乳腺癌類細(xì)胞株(PC3)、人子宮頸癌細(xì)胞瘤(HeLa)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(T98)。
2)使用的實(shí)驗(yàn)方法為MTT實(shí)驗(yàn)法。
將各腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔板，每孔90μl(含1×104個(gè)細(xì)胞)，分別加入加入終濃度為30μM、15μM、7.5μM和3.8μM的Achillinin A各10μl，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，各培養(yǎng)孔加入5mg/ml四氮唑鹽(MTT)10μl，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入15％SDS100μl，過夜。次日用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，測(cè)定波長λ＝570nm，參考波長λ＝630nm。并計(jì)算抑制率。
3)本發(fā)明化合物溶解于DMSO，添加后的最終濃度在0.1％以下。以只添加DMSO的培養(yǎng)基作為對(duì)照。
本發(fā)明化合物的抗人前列腺癌細(xì)胞株(MCF7)和人乳腺癌類細(xì)胞株(PC3)的細(xì)胞增殖活性以相對(duì)于對(duì)照(添加DMSO)的結(jié)果在下表中表示。

權(quán)利要求
1.由下述結(jié)構(gòu)式表示此倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A
2.
權(quán)利要求
倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A具有以下理化特性1)外觀白色結(jié)晶；2)分子式C15H20O6；3)質(zhì)譜m/z[M+]296.1260；4)核磁共振波譜數(shù)據(jù)包括氫譜，碳譜，碳?xì)溥h(yuǎn)程偶合等簡(jiǎn)表1表1.1H-and13C-NMR spectral data of Achillinin A in CDCl3(500MHz for1H，125MHz for13C).
3.權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其包括以下步驟1)取蓍草的花4.2公斤，用甲醇在室溫條件下浸泡2周，該步驟重復(fù)提取兩次，合并三次浸泡液，減壓蒸餾除去甲醇，得到的甲醇提取物并溶于飽和的鹽水中，用水飽和的正己烷萃取三次，除去脂溶性成分，水層繼續(xù)用水飽和的乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯萃取液合并后用無水硫酸鈉脫水，過濾，減壓蒸餾除回收溶劑，得到149g乙酸乙酯萃取物。2)將乙酸乙酯萃取物用硅膠干柱層析技術(shù)進(jìn)行分離，用乙酸乙酯/甲醇洗脫，再將硅膠柱分成15段，把第3段至第6段進(jìn)行合并，得到43g倍半萜(Sesquiterpene)比較富集的流分。3)將此倍半萜富集流分再次進(jìn)行柱層析分離純化，用環(huán)己烷/乙酸乙酯(3∶1-1∶4)進(jìn)行梯度洗脫，得到10份的梯度洗脫物。4)將第3份梯度洗脫物用制備型TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3為展開劑進(jìn)行展開；展開后刮取在紫外燈下有吸收色帶的部分，并用丙酮進(jìn)行洗脫，丙酮洗脫物回收溶劑后再用高效液相進(jìn)一步純化(乙氰-水25-75梯度系統(tǒng))，得到7.1mg的倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
4.權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其由下述方法組成1)取蓍草的花，用甲醇在室溫下浸泡三次，減壓蒸餾除去甲醇，得到的甲醇提取物溶于飽和的鹽水中，用水飽和的正己烷萃取三次，除去脂溶性成分，水層繼續(xù)用水飽和的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液并用無水硫酸鈉脫水，減壓蒸餾回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取物。2)將乙酸乙酯萃取物用硅膠干柱層析技術(shù)進(jìn)行分離，用乙酸乙酯/甲醇洗脫，得到倍半萜(Sesquiterpene)比較的富集的流分。3)將此倍半萜比較富集流分再次進(jìn)行柱層析純化，用環(huán)己烷/乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到10份的梯度洗脫物。4)將第3份洗脫物用制備TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3為展開劑進(jìn)行展開；展開后刮取在紫外燈下有吸收色帶的部分，并用丙酮進(jìn)行洗脫，丙酮洗脫物回收溶劑后再用高效液相純化(乙氰-水25-75梯度系統(tǒng))，得到倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A 7.1mg。
5.組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1所述化合物以及藥學(xué)上可以接受的載體。
6.權(quán)利要求6所要求的組合物，其用于前列腺癌和乳腺癌的治療。
7.權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求5-6的組合物在制備抑制前列腺癌和乳腺癌增殖的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求5-6的組合物在制備特異性地抑制前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從菊科植物蓍草(Achillea millefolium)中分離得到的倍半萜內(nèi)酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法以及發(fā)明化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101037428SQ200610070868
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者史清文, 董玫, 叢斌 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)