專利名稱：銀杏提取物的制作方法
發(fā)明的目的 本發(fā)明涉及銀杏葉的新型提取物，用于獲得所述提取物的方法及其用于制備適用于在藥物和/或食品添加劑和/或食品(包括功能性食品、用于特殊營(yíng)養(yǎng)目的食品、藥用食品等)中的口服制劑的用途。
現(xiàn)有技術(shù)的陳述 銀杏樹是一種珍品。Darwin稱它為“活化石”，因?yàn)樗乃行阅芏寂c長(zhǎng)壽有關(guān)。由于古代這種樹就一直種植在中國(guó)和日本的寺廟花園里，否則，這種植物或許存活不到今天。
盡管銀杏(Ginkgo biloba)僅是目前現(xiàn)存的一種銀杏屬(ginkgos)的植物，許多銀杏屬的相關(guān)物種已在化石資料中找到。銀杏目是一組可追溯至二疊紀(jì)的裸子植物。該組被認(rèn)為與針葉樹的關(guān)系較與其它任何裸子植物關(guān)系更緊密?，F(xiàn)代的銀杏最高可以長(zhǎng)到30米并且能活1千年。盡管籽的使用更頻繁些，但樹葉可作為草藥使用。中國(guó)所謂的“白果葉”，被用來(lái)治療呼吸道病、聽覺失靈、內(nèi)障摘除術(shù)(couching)、結(jié)核病、不良循環(huán)、記憶失靈、淋病、胃痛、皮膚病、白帶、心絞痛、痢疾、高血壓、焦慮以及其它。吸入粉末狀樹葉用于治療氣喘病、耳、鼻和咽喉病癥。
在西藥中，50年代后期該樹葉成為研究的項(xiàng)目。Willmar Schwabe分析過(guò)樹葉天然物質(zhì)的組分和活性，并且使銀杏提取物開始商業(yè)化。商標(biāo)Tebonin的酊劑和片劑，以10∶1的濃度(原料∶提取物比)提供。后來(lái)，其他公司也開發(fā)出了該提取物；當(dāng)今的濃度大多在50∶1(原料∶提取物比)。同時(shí)，對(duì)于該樹葉的化學(xué)、藥物學(xué)和臨床效果進(jìn)行了許多對(duì)照的研究和探討，大部分使用提取物EGb761，其又叫做Kaveri、Tebonin、Tanakan、Rkan或Ginkgold。1988年，Harvard大學(xué)的Corey固合成了銀杏苦內(nèi)酯(ginkgolide)B，并對(duì)防止器官移植排斥和氣喘以及毒性中風(fēng)的用途進(jìn)行了研究而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。
銀杏葉提取物的主要活性成分是類黃酮(如豕草花粉苷、莰非醇、異鼠季亭、楊梅黃酮)及其苷類、萜類化合物(如銀杏內(nèi)酯(ginkgolides)A、B、C、I、M和白果內(nèi)酯(bilobalides))、以及某些少量的酚類化合物。

五羥黃酮R2、R3＝OH R1＝H；莰非醇R1、R3＝H R2＝OH；異鼠季亭R1＝OMe R2＝OH R3＝H 由許多文獻(xiàn)已知，其已公開銀杏提取物和獲得它們的方法。然而，其中，特別感興趣的是EP 0431535 B1和EP 0431536 B1(Schwabe)，他們涉及銀杏葉提取物，其含有(a)20～30％重量的黃酮糖苷；(b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯A、B、C和J(總計(jì))；(c)2.0～4.0％重量的白果內(nèi)酯；(d)低于10ppm的烷基酚化合物和(e)低于10％重量的縮合單寧，更特別地(低聚的)原花色素(proanthocyanidins(OPC))，以及獲得它們的方法。事實(shí)上，按Schwabe所要求保護(hù)的說(shuō)明書，已作為適于銀杏屬提取物的所有藥用申請(qǐng)的標(biāo)準(zhǔn)而接受。應(yīng)當(dāng)把注意力吸引到化合物(d)和(e)的含量上假若銀杏提取物經(jīng)靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，由此超過(guò)口服，懷疑銀杏酸會(huì)引起刺激作用，則原花色素(OPCs)是造成血細(xì)胞凝集(haemagluinating)和血清沉淀性質(zhì)的主要原因。OPC的消極性質(zhì)也在EP 0477968 B1(Schwabe)中作了報(bào)道，該專利全面地討論了通過(guò)一個(gè)特定方法從提取物中除去這些化合物。
EP 0360556 B1(Indena)在實(shí)施例1中公開了一種，含有24％重量的黃酮糖苷、3.6％重量的銀杏苦內(nèi)酯、3.1％重量的白果內(nèi)酯和所謂的原花青色素(procyanidolic)指標(biāo)的銀杏組合物，該指標(biāo)可認(rèn)為與9％重量的OPC含量等效。專利文獻(xiàn)EP 1037646 B1和EP 1089748 B1(Schwabe)公開了銀杏的組分，該組分的特征在于降低其他成分的含量，像4′O-甲基-吡哆醇(pyridoxines)、雙黃酮和萜內(nèi)酯含量。
就深知銀杏的健康性質(zhì)來(lái)說(shuō)，雖然已有的銀杏提取物已在市場(chǎng)滿足需要特性，但現(xiàn)今的顧客仍希望具有改進(jìn)的和/或有另外性能的產(chǎn)品。在銀杏的情況下，例如，人們希望開發(fā)出一種新型提取物，該提取物通過(guò)口服給藥，通常具有使機(jī)體免遭自由基的各種負(fù)面影響。第二個(gè)要求是開發(fā)出一種銀杏的提取物，其改善人體的整體狀態(tài)，例如有關(guān)血液的微循環(huán)。事實(shí)上，這樣的產(chǎn)品，易于通過(guò)加入特定的活性劑而獲得，例如，對(duì)現(xiàn)存提取物已知特定活性劑用于自由基清除和血液循環(huán)促進(jìn)性能，然而，由于生產(chǎn)這種產(chǎn)品需付出巨大的技術(shù)努力，所以貴得多，另外，這種提取物可能不再代表為藥物標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書所覆蓋的真實(shí)銀杏提取物。因此，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的另外一個(gè)問(wèn)題是，提供一種具有如上所述的附加性能而不添加活性成分的銀杏提取物。
本發(fā)明的描述 本發(fā)明要求保護(hù)的是來(lái)自銀杏葉的新型提取物，其中含有 (a)20～30％重量的黃酮糖苷， (b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯A、B、C和J(總量)， (c)2.0～4.0％重量的白果內(nèi)酯， (d)低于10ppm的烷基酚化合物，和 (e)大于10％重量的低聚原花色素(proanthocyanidins(OPC))。
作為各種實(shí)驗(yàn)和檢驗(yàn)的結(jié)果，本申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)了，通過(guò)增加低聚原花色素的含量在臨界極限10以上，更優(yōu)選11，優(yōu)選12％重量，來(lái)自銀杏葉提取物，完全滿足所期待的改善健康的優(yōu)點(diǎn)。這一點(diǎn)必須理解成克服來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)的偏見，由于一般接受的科學(xué)知識(shí)-已經(jīng)降低所述OPC量至低于10％重量的含量或者甚至全部除去這些化合物。特別地，具有增加的OPC含量的銀杏提取物的改善健康優(yōu)點(diǎn)，正如本發(fā)明所述，與改善提取物的抗氧劑作用有關(guān)，導(dǎo)致改善的抗炎活性和改善的對(duì)血管組織的有利作用，包括降低毛細(xì)管脆性和連結(jié)組織的穩(wěn)定作用。通過(guò)改善視網(wǎng)膜的微循環(huán)，加速視紫紅質(zhì)的再合成、視網(wǎng)膜酶活性的調(diào)節(jié)等這些特別與眼健康有關(guān)，具有增視紫紅質(zhì)加OPC含量的銀杏提取物的改善益處所提供的有利包括但不限于改善夜間視覺和黑暗適應(yīng)，而且還改善與糖尿病的視網(wǎng)膜病有關(guān)的視網(wǎng)膜血流，其它類型的視網(wǎng)膜病、與年齡有關(guān)的斑點(diǎn)變性和青光眼。
低聚的原花色素(OPCs) 低聚的原花色素，又稱原花青色素(procyanidins)、無(wú)色花色素(leucoanthocyanins)或縮合單寧，是具有作為形成堿性單元的黃烷-3-醇如(+)-兒茶素或(-)-表兒茶素的低聚物或聚合物。它們的名稱反映出在酸水解時(shí)它們轉(zhuǎn)化成有色的花色素。通常，連續(xù)的單體間的可通過(guò)C4～C8連接，但也可經(jīng)C4～C6產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)反映在下圖中。

低聚的原花色素 本發(fā)明銀杏提取物中的OPC含量分析，可按照Indena的專利EP0360556 B1中陳述的方法完成，因此，將其清楚地引入作為參考。
提取方法 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供從銀杏葉中制備提取物的方法，該提取物包括 (a)20～30％重量的黃酮糖苷， (b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯， (c)2.0～4.0％重量的百果內(nèi)酯， (d)低于10ppm的烷基酚化合物，和 (e)大于10％重量的低聚原花色素(OPC)。
該發(fā)明方法由下列步驟組成 (i)把銀杏葉或干提取物(dry extract)，用水性極性溶劑提取，以產(chǎn)生第一液體中間體LI-1； (ii)使所述中間體LI-1從有機(jī)溶劑分離，并用非極性C4～C10烴進(jìn)行液-液提取，以產(chǎn)生第二(含水)液體中間體LI-2； (iii)調(diào)節(jié)所述中間體LI-2至pH為2.5～6.0并且下一步用極性C2～C6脂族醇進(jìn)行液-液提取，產(chǎn)生富含OPC的(含水)液體中間體LI-3和另一種富含苷的(有機(jī)的)液體中間體LI-4； (iv)使所述LI-4濃縮，用水稀釋，再與非極性C4～C10烴混合，以產(chǎn)生另外的(有機(jī)的)液體中間體LI-5和另一種(含水)液體中間體LI-6，如有必要，然后可將LI-5，干燥，以調(diào)節(jié)最終萜內(nèi)酯的含量； (v)使所述液體中間體LI-6干燥以產(chǎn)生第一固體中間體SI-1； (vi)使所述液體中間體LI-3從有機(jī)溶劑分離，用水稀釋，調(diào)節(jié)pH值至6～8并冷卻至溫度最高為10℃，持續(xù)足夠的時(shí)間以使OPC從溶液中沉淀； (vii)將所述沉淀過(guò)濾，洗滌并干燥，以產(chǎn)生第二固體中間體SI-2；和最終 (viii)把第二固體中間體SI-2加到第一固體中間體SI-1中，其量使最終產(chǎn)品含有大于10％重量的OPC。
更具體地說(shuō)，按照本發(fā)明獲得的提取物，通常顯示OPC含量為11～20，更優(yōu)選為12～18，最優(yōu)選為13～15％重量的OPC。
通常，它們含有 (i)低于50ppm的4′O-甲基-吡哆醇(pyroxidines)， (ii)低于100ppm的雙黃酮，和 (iii)5～10％重量的萜內(nèi)酯。
提取物的水含量一般至多為5％重量的。
新方法的特別優(yōu)點(diǎn)在于人們可以或從銀杏葉(通常顯示黃酮糖苷、銀杏苦內(nèi)酯和百果內(nèi)酯的含量至少為10％重量)或從市場(chǎng)上買到的干銀杏提取物(一般顯示黃苷酮、銀杏苦內(nèi)酯和百果內(nèi)酯含量為5～20％重量)以使最后得出與說(shuō)明書相匹配的最終產(chǎn)品，尤其是顯示大于10，優(yōu)選約12％重量的OPC含量。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(i)的極性溶劑是丙酮或乙醇?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)丙酮對(duì)于葉的提取特別合適，而乙醇對(duì)于人們從市場(chǎng)上買到的干中間體的提取是優(yōu)選溶劑。步驟(ii)和(iv)中的非極性烴優(yōu)選是正庚烷，其極為有用于保證去除所有不想要的銀杏酚酸并且在廢有機(jī)相中濃縮。然而，步驟(iii)的所述極性醇優(yōu)選是正丁烷。新方法超過(guò)從前方法的最主要的改進(jìn)在于從主流(main stream)中分離富有OPC的餾分、以濃縮、提純和分離所述OPC，并且最終把它們加回到主流中，以使OPC含量從典型的4～8％重量提高到大于10，典型地約12％重量的。
包囊(encapsulation) 按照本發(fā)明的干燥混合物可配制成粉末、顆?；虬牍腆w以裝入膠囊。當(dāng)以粉末形式使用時(shí)，所述組分可與任何一種或多種賦形劑一起進(jìn)行配制，或以未稀釋的形式存在。對(duì)于以半固體形式存在，可把干混合物溶解或懸浮于粘性液體或半固體溶媒中，如聚乙二醇，或液體載體，如二醇，例如丙二醇，或丙三醇，或植物油或魚油，例如，選自橄欖油、向日葵油、紅花油、大豆油和其它的油。這樣的提取物可以是常量包囊(macro-encapsulated)的，其意味著裝入硬明膠或軟明膠型的膠囊，或由硬或軟明膠同等物(無(wú)明膠)制備的膠囊，軟明膠或明膠同等物的膠囊，優(yōu)選用于粘性液體或半固體填充。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述活性組分是微包囊的?？梢园选拔⒛z囊”理解成直徑約0.1～約5mm的球形聚集體，它含有一種由至少一種連續(xù)膜圍繞的至少一種固體或液體的芯。更準(zhǔn)確地說(shuō)，它們是細(xì)分散的包衣有成膜聚合物的液相或固相，在其制備中，在乳化和凝聚或界面聚合后，所述聚合物沉積在待包囊的物質(zhì)上。在另一方法中，液體活性組成主要被吸收在基質(zhì)(“微型海綿狀物(microsponge)”)中，并且作為微粒，可以用另外的成膜聚合物包衣。顯微鏡下可見的小的膠囊，也可稱作納米膠囊，可用如粉末的同樣的方法干燥。除了單芯微膠囊以外，還有多芯的聚集體，又稱作微球，它含有兩種或更多種分配于連續(xù)膜材料中的芯。另外，單芯或多芯微膠囊可用另外的第二種、第三種等膜包繞。所述膜可以由天然的、半合成的或合成材料組成。天然膜材料是，例如，阿拉伯樹膠、瓊脂、瓊脂糖、麥芽糖糊精、海藻酸及其鹽，例如，海藻酸鈉或海藻酸鈣、脂肪和脂肪酸、十六醇、膠原、殼聚糖、卵磷脂、明膠、白蛋白、蟲膠、多糖，如淀粉或葡聚糖、多肽、蛋白水解物、蔗糖和石蠟。半合成膜材料是，其中有，化學(xué)改性纖維素，更特別的是纖維素酯和醚，例如，乙酸纖維素酯、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素、和淀粉衍生物、更特別的是淀粉醚和酯。合成膜材料是，例如，聚合物，如聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。已知微膠囊的例子是下列商業(yè)化產(chǎn)品(膜材料在括號(hào)中表示)Hallcrest Microcapsules(明膠、阿拉伯樹膠)、Coletica Thalapheres(海洋骨膠原(martime collagan))、LipotecMillicapseln(海藻酸、瓊脂)、Induchem Unispheres(乳糖、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素)、Unicerin C30(乳糖、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素)、KoboGlycospheres(改性淀粉、脂族酸酯、磷脂)、Softspheres(改性瓊脂)、KuhsProbiol Nanospheres(磷脂)和Primaspheres或Primasponges(殼聚糖、陰離子聚合物)。按照本發(fā)明的組合物包囊優(yōu)選是在活性成分口服情況下并且應(yīng)在腸的特定部分釋放。此外，所屬技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員通過(guò)對(duì)比膠囊在腸相應(yīng)部分的pH條件下的穩(wěn)定性而很容易選擇適當(dāng)?shù)陌殷w系。合適的方法公開在例如WO 01/01926、WO 01/01927、WO 01/01928、WO01/01929(Primacare)或EP 1064088 B1(Max Planck Gesellschaft)，因此，將這些文件引入作為參考。
商業(yè)化應(yīng)用 如上概述，新型提取物與在市場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)銀杏屬提取物的已知有利的性能結(jié)合，其具有新的奇異特征，尤其是改善人體的整個(gè)狀態(tài)，特別是有關(guān)保護(hù)免遭自由基損傷并且改善視網(wǎng)膜微循環(huán)。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，富有OPC的新型提取物在制備藥物制劑和/或食品添加劑和/或食品(包括功能性食品，用于特殊營(yíng)養(yǎng)目的食品、藥用食品(medical food)等)中的應(yīng)用，其中，它們的存在量在10～1000mg，優(yōu)選30～500mg，更優(yōu)選60～240mg(根據(jù)最終組合物計(jì)算)。通過(guò)局部給藥或通過(guò)口服而給藥入體的提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，最終使用所述提取物用于制作適于改善視網(wǎng)膜微循環(huán)和人體狀態(tài)的藥物。
實(shí)施例 制備實(shí)施例A1 來(lái)自銀杏葉的具有提高的OPC含量的銀杏提取物的制備 步驟I.把具有總計(jì)為0.8％重量的黃酮糖苷、銀杏苦內(nèi)酯和百果內(nèi)酯含量的銀杏葉1000g放入攪拌的容器內(nèi)，并于50℃下使用5L的含水丙酮(60％w/w)提取2小時(shí)。使液相與殘余物分離并進(jìn)行過(guò)濾和溶劑蒸發(fā)，以產(chǎn)生具有約30％重量的干殘余物的液體中間體LI-1。之后，所述相LI-1用正庚烷提取，以獲得含所有不想要的銀杏酚酸的有機(jī)相和含有有價(jià)值產(chǎn)物的第二(含水)液體中間體LI-2。
步驟II.如此獲得的中間體相LI-2，在調(diào)節(jié)pH至2.5～6后，用正丁醇三次提取，以獲得富含OPC的第三(含水)液體中間體相LI-3以及第四(有機(jī))液體中間體相LI-4，后者用水洗滌兩次以除去不想要的副產(chǎn)物。之后，濃縮所述相LI-4以獲得顯示約20％重量的干殘余物的濃縮餾分。之后，濃縮物用水稀釋至10％重量的干殘余物，再與正庚烷(70∶30 w/w)混合。在分離富含銀杏苦內(nèi)酯和百果內(nèi)酯的第五(有機(jī))液體中間體LI-5后獲得富有有價(jià)值產(chǎn)物的第六(含水)液體中間體LI-6。最后，濃縮餾分LI-6并干燥。最終固體顯示約7％重量的OPC含量。
步驟III.將在步驟II中獲得的液體中間體LI-3，與所有的痕量有機(jī)溶劑分離，用水稀釋，獲得約30％重量的干殘余物并且通過(guò)添加氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值到約6.8～7.2。其后，使液體餾分過(guò)夜冷卻至8℃。第二天過(guò)濾出主要由OPC組成的沉淀物，洗滌，干燥并作為步驟II的最終產(chǎn)物加到所獲得的固體中。合并的產(chǎn)物顯示下列的技術(shù)規(guī)格(括號(hào)內(nèi)為三個(gè)樣品的平均值) 銀杏黃酮糖苷22～27(24)％重量 百果內(nèi)酯2.6～3.2(2.9)％重量 銀杏苦內(nèi)酯2.8～3.4(3.0)％重量 OPC12～13(12.2)％重量 銀杏酚酸＜10ppm 制備實(shí)施例A2 從干銀杏提取物制備具有提高含量的OPC的銀杏提取物 將1000g市售可得的銀杏的干提取物放入攪拌容器中并用乙醇水溶液(80％ w/w)提取，所述干提取物具有黃色～棕色的外觀并含有低于4.5％重量的黃酮糖苷。使如此獲得的液體餾分過(guò)濾并除去溶劑。用水稀釋如此獲得的中間體至約10％重量的干殘余物，之后用正庚烷提取以清除銀杏酚酸。隨后，按實(shí)施例A1中的步驟II和III的闡述，處理如此獲得的水相。
應(yīng)用實(shí)施例 抗氧化劑性的驗(yàn)證 如果活性氧類(ROS)和活性氮類(RNS)不為所謂的抗氧劑抵制，其為可損傷重要生物分子如蛋白、脂質(zhì)、糖和DNA的活性化合物。一些但不是所有的ROS和RNS都是自由基，即，含有一個(gè)或多個(gè)未成對(duì)電子的原子或分子。ROS和RNS的形成，作為人體代謝的整體部分出現(xiàn)，例如通過(guò)線粒體呼吸鏈，在作為免疫系統(tǒng)正常功能一部分的活性吞噬細(xì)胞的氧化性爆發(fā)過(guò)程中，或通過(guò)酶如黃嘌呤氧化酶而產(chǎn)生。外源因子如陽(yáng)光、香煙煙霧或某些環(huán)境污染物，可促使人體暴露于ROS和RNS。ROS/RNS通過(guò)過(guò)多的抗氧化劑而抵制，氧化應(yīng)激只有在這種平衡移向有利于ROS/RNS時(shí)才發(fā)生。之后，可誘導(dǎo)對(duì)活體生物分子和生物系統(tǒng)進(jìn)行損傷，而這種損傷，當(dāng)在很長(zhǎng)的期間內(nèi)積累時(shí)，與許多變性疾病的發(fā)展和在老化本身的過(guò)程有關(guān)。
活性物質(zhì)的抗氧化性能，如有關(guān)本發(fā)明的銀杏提取物可以通過(guò)各種檢驗(yàn)，或在體外或在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中或其它方法測(cè)定，通常各檢驗(yàn)對(duì)于某種類型的ROS和/或RNS為特異性的。因?yàn)槿梭w與所有范圍的這些活性物質(zhì)接觸，所述活性物質(zhì)還可稱為“促氧化劑”-抗氧化劑有效抗各種促氧化劑抵制可能是理想的。此外，為了評(píng)價(jià)產(chǎn)物的性質(zhì)，將銀杏提取物進(jìn)行各種檢驗(yàn)，測(cè)定其還原自由基陽(yáng)離子的能力(DPPH檢驗(yàn))，其清除羥基自由基(HO)超氧化物(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)的能力及其清除單線態(tài)氧的能力。另外，可對(duì)金屬螯合性能評(píng)價(jià)。
DPPH試驗(yàn) DPPE試驗(yàn)是測(cè)定待測(cè)物質(zhì)清除自由基的能力，特別是降低自由基陽(yáng)離子。試驗(yàn)使用DPPH(2，2-二苯基-1-苦基偕腙肼(picrylhydrazyl)，一種穩(wěn)定的自由基，其在515nm下的最大吸收呈“紫色”，并且其在受抗氧劑還原時(shí)，轉(zhuǎn)化成無(wú)色化合物。這樣，待測(cè)物質(zhì)的抗氧化活性是根據(jù)515nm下的吸收下降而測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果列于下面的表I中。 表I 銀杏提取物的自由基清除活性與OPC含量變化的關(guān)系 *對(duì)照試驗(yàn)中無(wú)提取物；C1，C2對(duì)照銀杏提取物1和2，不依從本發(fā)明(OPC含量≤10％)；1、2、3銀杏提取物1、2、3，依從本發(fā)明(OPC含量＞10％) II.清除羥基自由基的清除活性 清除羥基自由基(HO·)的能力可以在體外通過(guò)所謂的“脫氧核糖分析”法測(cè)定?？梢哉J(rèn)為，HO·是所有ROS/RNS中活性最強(qiáng)的，它幾乎能攻擊所有的細(xì)胞化合物，包括DNA組分如脫氧核糖。在試驗(yàn)中，通過(guò)抗壞血酸、H2O2、和Fe3+-EDTA的混合物產(chǎn)生HO·，即，經(jīng)Fenton反應(yīng)(H2O2在鐵存在下)。HO·攻擊脫氧核糖，使其降解成為片段，當(dāng)在低pH下，在與硫代巴比妥酸(TBA)下加熱時(shí)，產(chǎn)生粉紅的發(fā)色團(tuán)。所加入的羥基自由基“清除清除劑”與脫氧核糖競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生的羥基并減少發(fā)色團(tuán)的形成。試驗(yàn)是在EDTA存在和不存在下完成的，以檢驗(yàn)OPCs鰲合(＝結(jié)合)過(guò)渡金屬離子如鐵的能力。結(jié)果列于下面表II中，并且以2次試驗(yàn)的平均值表示。
表II銀杏提取物的清除羥基自由基活性和金屬螯合活性與OPC含量改變的關(guān)系 *見表I的說(shuō)明 III.清除超氧化物和過(guò)氧化氫的活性 兩種另外的ROS是超氧化物(O2·-)和過(guò)氧化氫(H2O2)。體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化物-例如在活性吞噬細(xì)胞的氧化裂解(oxidative burst)過(guò)程中，或者在包含細(xì)胞色素P450氧化酶的反應(yīng)中-大量酶促轉(zhuǎn)化(SOD，超氧化物歧化酶)或者通過(guò)非酶促歧化成H2O2，其不帶電，很容易穿過(guò)細(xì)胞膜。例如，在血管組織中增加生成的O2·-和H2O2，引起前炎癥和與血管機(jī)能障礙有關(guān)的事件和相關(guān)疾病。
為了試驗(yàn)本發(fā)明所述的銀杏提取物清除O2·-和H2O2的能力，使用黃嘌呤氧化酶/次黃嘌呤體系產(chǎn)生這些ROS，而使用化學(xué)發(fā)光(luminol)進(jìn)行檢測(cè)。
表III銀杏提取物清除超氧化物和過(guò)氧化氫的活性 與OPC含量變化的關(guān)系 *見表I的說(shuō)明 IV. 抑制單線態(tài)氧的活性 單線態(tài)氧(1O2)是分子氧的電激發(fā)形式，它可以在體內(nèi)以光化學(xué)法產(chǎn)生，即，暴露于光線下，或用代謝方法，例如通過(guò)活化的中性白細(xì)胞，在脂質(zhì)的過(guò)氧化過(guò)程中，和抗炎癥介質(zhì)(前列腺素)以及解毒(細(xì)胞色素P450氧化酶)有關(guān)的酶促反應(yīng)中產(chǎn)生。為了檢測(cè)本發(fā)明所述的銀杏提取物的抑制單線態(tài)氧活性，使用與單線態(tài)氧有關(guān)的光誘導(dǎo)皮膚損傷。經(jīng)單線態(tài)氧對(duì)皮膚的光誘導(dǎo)損傷，如光老化(photoageing)，又稱作皮膚早期老化，是由與皮膚外細(xì)胞基質(zhì)降解有關(guān)的酶誘導(dǎo)，以及與皮膚外細(xì)胞基質(zhì)蛋白之一的膠原直接反應(yīng)所引起的。反應(yīng)包括畸變(aberrant)/交聯(lián)的形成，因此，擾亂了皮膚基質(zhì)的整體。為了檢測(cè)誘導(dǎo)膠原損傷的1O2，通過(guò)使用核黃素作感光劑的UVA輻射而在體內(nèi)產(chǎn)生1O2，并且，借助于提高膠原和葡萄糖水溶液的粘度來(lái)測(cè)定膠原損傷。得到的結(jié)果列于表IV中。表IV銀杏提取物的抑制單線態(tài)氧活性與OPC含量變化的關(guān)系 *見表I中的說(shuō)明 各種試驗(yàn)的結(jié)果表明，照本發(fā)明的具有增加的OPC含量的銀杏提取物作為抗氧化劑抗各種相關(guān)ROS，所述ROS是由人體及經(jīng)外源產(chǎn)生的，并且，ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的對(duì)人體健康有關(guān)的重要生物分子和生物系統(tǒng)損傷。應(yīng)該更好地注意，有益性能的提高并不是簡(jiǎn)單地按比例，但是，人們能觀察到存在約11～12％重量的臨界OPC濃度。
具有提高的OPC含量的銀杏提取物的抗氧化作用，一般顯示針對(duì)自由基，如在DPPH檢測(cè)中所證實(shí)。此外，它們涉及清除被認(rèn)為是所有ROS的活性最強(qiáng)的羥基自由基(HO·-)的，所述羥基自由基在人體代謝的許多途徑中產(chǎn)生并且也被認(rèn)為是超氧化物(O2·-)和過(guò)氧化氫(H2O2)引起損傷的真正的有效物質(zhì)。另外，具有提高的OPC含量的銀杏提取物表明，具有金屬螯合性能，因此，能夠防止因過(guò)渡金屬離子催化而產(chǎn)生ROS。此外，試驗(yàn)結(jié)果證明了提取物的清除超氧化物和過(guò)氧化氫性質(zhì)以及抑制單線態(tài)(1O2)性能，即，其抗氧化劑活性進(jìn)一步阻止ROS所導(dǎo)致的許多方面的自由基損傷人體細(xì)胞和組織。各種試驗(yàn)的結(jié)果清楚地證明，本發(fā)明的具有改進(jìn)抗氧化性能的新提取物，與來(lái)自顯示OPC含量降低的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)的已知的那些提取物相比，更適用于控制老化信號(hào)、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)、炎癥以及其它健康狀態(tài)，特別是那些與眼睛健康有關(guān)的病癥的口服制劑。
實(shí)施例B1 新型銀杏提取物的包囊(encapsulation) 在一500ml配有攪拌器和回流冷凝管的三頸燒瓶中，使3g的瓊脂溶于加熱煮沸的200ml水中。在約30分鐘期間，在劇烈攪拌下首先將10g甘油在約100g水中的均勻分散液，然后將25g殼聚糖制劑(Hydagen DCMF，10％重量的乙醇酸溶液，Cognis Deutschland GmbH & Co.KG，Düsseldorf IFRG)，10g實(shí)施例A1的銀杏的噴霧干燥提取物，0.5g Phenonip(含苯氧乙醇和對(duì)羥基苯甲酸酯(parabens)的防腐混合物)以及0.5g聚山梨醇酯-20(Polysorbate-20)(Tween 20，ICI)在約100g水中的溶液加到混合物中。過(guò)濾所得基質(zhì)，加熱到50℃并在劇烈攪拌下分散到2.5倍其體積的預(yù)冷到15℃的石蠟油中。分散液用含1％重量的月桂基硫酸鈉和0.5％重量藻酸鈉的水溶液洗滌，然后重復(fù)用0.5％重量的Phenonip水溶液洗滌，取出油相。過(guò)篩后得到含8％重量平均直徑為1mm的微膠囊的含水制劑。
實(shí)施例B2 新型銀杏提取物的包囊 在一500ml安裝有攪拌器和回流冷凝管的三頸燒瓶中，使1g的瓊脂溶解于33g的水中并加熱至100℃。隨后，加入50g的2％重量的藻酸鈣水溶液和5g的1％重量的Gellan Gum(Kelgocel，Degussa AG)水溶液。在強(qiáng)烈地?cái)嚢韬?，于約30分鐘的期間內(nèi)10g實(shí)施例A1的噴霧干燥的銀杏提取物、0.5g Phenonip和0.5g聚山梨醇酯-20(Tween20，ICI)于約100g水中的溶液加入到混合物中。把如此獲得的組合物滴加至由癸基辛基甘油三脂(Myrito 331，Cognis Deutschland GmbH & Co.KG)組成的浴中。把所獲得的瓊脂/明膠/藻酸鹽型的微囊分離出，并用含1％重量聚山梨醇酯-20的水溶液洗滌，以除去痕量的油成分。之后，把軟膠囊送入由0.5％重量的氯化鈣水溶液組成的浴中，以進(jìn)行交聯(lián)并使膠囊壁硬化。過(guò)篩后，獲得含8％重量其平均直徑為0.25mm微囊的含水制劑。
權(quán)利要求
1.來(lái)自銀杏葉的提取物，其中包含
(a)20～30％重量的黃酮糖苷；
(b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯A，B，C和J(總計(jì))；
(c)2.0～4.0％重量的白果內(nèi)酯；
(d)低于10ppm的烷基酚化合物；和
(e)大于10％重量的低聚原花色素(OPC)。
2.按照權(quán)利要求1所述的提取物，其中，含有11～20％重量的OPC。
3.按照權(quán)利要求1和/或2所述的提取物，其中，含有12～18％重量的OPC。
4.按照權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的提取物，其中，含有低于50ppm的4′O-甲基-吡哆醇。
5.按照權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的提取物，其中，含有低于100ppm的雙黃酮。
6.按照權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的提取物，其中，含有5～10％重量的萜內(nèi)酯。
7.按照權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的提取物，其中，含有最多5％重量的水。
8.膠囊，其含有權(quán)利要求1所述的提取物。
9.一種制備銀杏葉提取物的方法，其中包括
(a)20～30％重量的黃酮糖苷；
(b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯A，B，C和J(總計(jì))；
(c)2.0～4.0％重量的白果內(nèi)酯；
(d)低于10ppm的烷基酚化合物；和
(e)大于10％重量的低聚原花色素(OPC)。
其中
(i)使銀杏葉或干提取物，經(jīng)過(guò)含水極性溶劑提取，產(chǎn)生第一液體中間體LI-1；
(ii)使所述中間體LI-1從有機(jī)溶劑分出，并用非極性C4～C10的烴的液-液提取，以獲得第二(含水)液體中間體LI-2；
(iii)所述中間體LI-2，在調(diào)節(jié)pH至2.5～6之后，用極性C2～C6脂族醇的液-液提取，以獲得富含OPC的(含水的)液體中間體LI-3以及另一種(有機(jī)的)富含苷的液體中間體LI-4；
(iv)濃縮所述中間體LI-4，用水稀釋，并與非極性C4～C10烴混合，以獲得另一種(有機(jī)的)液體中間體LI-5和另一種(含水)液體中間體LI-6；
(v)干燥所述液體中間體LI-6，產(chǎn)生第一固體中間體SI-1；
(vi)將所述液體中間體LI-3從有機(jī)溶劑分離，用水稀釋，調(diào)節(jié)pH值至6～8，在最多10℃冷卻足夠的時(shí)間以使OPC從溶液中沉淀；
(vii)濾出所述沉淀，洗滌并干燥，以得到第二固體中間體SI-2；以及，最終
(viii)將所述第二固體中間體SI-2以使最終產(chǎn)品含有大于10％重量的OPC的量加到第一固體中間體SI-1中。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中，銀杏葉顯示至少10％重量的黃酮糖苷、銀杏苦內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的含量。
11.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中，干銀杏提取物顯示5～20％重量的黃酮糖苷、銀杏苦內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的含量。
12.按照權(quán)利要求9～11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(i)的極性溶劑是丙酮或乙醇。
13.按照權(quán)利要求9～12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(ii)和(iv)中的所述非極性烴是正庚烷。
14.按照權(quán)利要求9～13中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(iii)中的所述極性醇是正丁醇。
15.按照權(quán)利要求1所述提取物在制備藥物組合物和/或食品添加劑和/或食品中的用途。
16.按照權(quán)利要求15的所述用途，其中，所述組合物是功能性食品、用于營(yíng)養(yǎng)目的食品，和藥品食品。
17.按照權(quán)利要求15和/或16的所述用途，其中，所述提取物根據(jù)最終組分計(jì)是以10～1000mg的量存在。
18.按照權(quán)利要求15和/或16所述的用途，其中，所述提取物是通過(guò)口服施用向人體給藥。
19.按照權(quán)利要求1所述提取物在制備用于改善視網(wǎng)膜微循環(huán)的藥物組合物中的用途。
20.按照權(quán)利要求1所述提取物在制備用于改善人體狀態(tài)的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自銀杏葉的新型提取物，其含有(a)20～30％重量的黃酮糖苷；(b)2.5～4.5％重量的銀杏苦內(nèi)酯A，B，C和J(以總量計(jì))；(c)2.0～4.0％重量的白果內(nèi)酯；(d)低于10ppm的烷基酚化合物和(e)大于10％重量的低聚原花色素(OPC)。
文檔編號(hào)A61K36/16GK101222929SQ200680025381
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2006年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者克里斯托弗·卡里特, 圣地亞哥·魯爾普勞斯, 斯梅爾·阿拉奧伊伊斯梅利, 佩德羅·福納, 克里斯廷·蓋特納, 西比爾·巴赫沃爾德-沃納 申請(qǐng)人:考格尼斯知識(shí)產(chǎn)權(quán)管理有限責(zé)任公司