專利名稱：：紐激酶及其在治療心血管疾病中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)藥領域，更具體而言，本發(fā)明涉及紐激酶(一類新的心肌專一性的肌球蛋白輕鏈激酶，在本發(fā)明中將其命名為紐激酶)多肽、編碼紐激酶的核苷酸片段以及其在心血管疾病中的作用。發(fā)明背景心血管疾病已成為導致中國人死亡率最高的疾病，也是困擾全世界人口健康的主要疾病。目前治療心血管病可用的藥物主要包括地高辛、血管緊張素轉換瞎抑制劑(angiotensinconveringenzymeinhibitor,ACEinhibitor)和P腎上腺素阻斷劑(P-adrenergicantagonist,(5-blocker)，但這些藥物對改善心血管病的發(fā)病率和死亡率的作用有限。因此，有必要開發(fā)新的更有效的藥物來預防、延緩和治療心血管疾病。為發(fā)現(xiàn)更有效地治療心血管疾病的治療方法，需要深入的了解心臟收縮和舒張的機理甚至心肌細胞中的信號傳遞途徑，然后尋找適合的靶點或物質，開發(fā)新的藥物。澤生公司在研究心肌細胞信號傳遞的過程中，己經發(fā)現(xiàn)一定濃度的神經調節(jié)蛋白(neuregulin)能促進心肌細胞的分化和肌小節(jié)的重構，改善心肌細胞的收縮功能，促進心血管病人恢復健康(ZL99107175;US7226907;CN03811866;US10997167)。在進一步研究神經調節(jié)蛋白對心衰動物左心室基因表達的影響時，發(fā)現(xiàn)神經調節(jié)蛋白能顯著地提高類似肌球蛋白輕鏈激酶(similartomyosinlightchainkinase,我們通過研究鑒定為心肌專一性的肌球蛋白輕鏈激酶，并將該激酶命名為紐激酶)的表達水平，提示紐激酶在心臟的收縮舒張過程中有重要的作用。肌球蛋白和F肌動蛋白是心肌的收縮單位肌小節(jié)的主要組成部分。肌球蛋白由三種亞單位組成，包括1個肌球蛋白重鏈(myosinheavychain)、2個組成性輕鏈(essentiallightchain,ELC)、2個調節(jié)性輕鏈(regulatorylightchain,RLC)。在血管平滑肌細胞中，肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)能磷酸化RLC，影響平滑肌的收縮；如果RLC不被磷酸化，平滑肌肌球蛋白ATP酶就不能激活，平滑肌將保持舒張狀態(tài)。而在心臟中，雖然己有報道骨骼肌MLCK可磷酸化心肌RLC，且心肌RLC的磷酸化與心肌的收縮和肌小節(jié)的重構有關[Sanbe等，J.Biol.Chem.，274:21085-21094(1999);Aoki等，#a&/reJ/e力'cj'/e,6:183-188(2000)]，但是否有心肌特異性的MLCK以及該MLCK是否磷酸化RLC還沒有人研究過。為此，本領域迫切需要尋找到心肌特異性且能磷酸化RLC的MLCK，以通過調控心肌細胞的收縮和肌小節(jié)的重構來預防和治療心臟疾病。下面列舉了與本發(fā)明有關的一些現(xiàn)有技術文獻1.生長因子神經調節(jié)蛋白及其類似物的新應用，ZL99107175;2.Cardiacmusclefunctionandmanipulation,US7226907;3.神經調節(jié)蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物，CN03811866;4.Neuregulinbasedmethodsandcompositionsfortreatingcardiovasculardiseases,US10997167;5.Abnormalcardiacstructureandfunctioninmiceexpressingno叩hosphorylatablecardiacregulatorymyosinlightchain2，/.化i丄C力e饑274:21085-21094，1999;6.Myosinlightchainkinasemediatessarcomereorganizationduringcardiachypertrophyinvitro，vVat"rei/eo7c_z'/e，6:183-188，2000。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的正是提供一種心肌特異性且能磷酸化RLC的MLCK——紐激酶(即本發(fā)明的蛋白質或本發(fā)明分離的蛋白質)。在本發(fā)明的第一方面，提供紅了一種分離的蛋白質，其具有磷酸化調節(jié)性肌球蛋白輕鏈的活性，所述蛋白質包括如下氨基酸序列(a)SEQIDN0:7或8所示氨基酸序列；(b)SEQIDNO:6編碼的氨基酸序列;(c)在(a)或(b)所示氨基酸序列中有一個或幾個氨基酸添加、缺失或置換的序列，條件是所述蛋白質仍然具有所述活性；(d)與(a)、(b)或(c)中所述氨基酸序列至少有70y。序列相同性的氨基酸序列，條件是所述蛋白質仍然具有所述活性。在一個優(yōu)選例中，(c)中所述氨基酸序列具有1-10個氨基酸的添加、缺失或置換，優(yōu)選卜8個，更優(yōu)選l-5個，最優(yōu)選l-3個。在另一優(yōu)選例中，(d)中所述氨基酸序列與(a)、(b)或(c)中所述氨基酸序列至少80%，優(yōu)選90%,更優(yōu)選95%的氨基酸序列相同性。在另一優(yōu)選例中，所述分離的蛋白質在心肌細胞中特異性表達。在一個實施方式中，所述蛋白質的編碼核酸或者該編碼序列中至少10個連續(xù)核苷酸的反義序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種構建物，所述構建物包含啟動子和i-io個拷貝的本發(fā)明的蛋白質的編碼核酸或該編碼序列中至少10個連續(xù)核苷酸的反義序列。在一個優(yōu)選例中，所述核酸序列位于啟動子序列的反義方向。在一個優(yōu)選例中所述反義序列包含所述蛋白質編碼核酸中10-50個連續(xù)核苷酸到全部序列的反義序列，優(yōu)選包含10-30個連續(xù)核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述拷貝數(shù)為1-10中的任意整數(shù)個，優(yōu)選1-8個，更優(yōu)選1-5個。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達載體，其包含本發(fā)明的蛋白質的編碼核酸或反義序列或構建物。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于表達本發(fā)明所述的蛋白質的宿主細胞。在一個優(yōu)選例中，所述宿主細胞是原核生物細胞或真核生物細胞。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是將本發(fā)明的構建物或表達載體轉化大腸桿菌得到的。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明蛋白質的特異性抗體。在一個優(yōu)選例中，所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述抗體是用本發(fā)明的蛋白質免疫動物而制得的。在另一優(yōu)選例中，所述抗體可識別SEQIDN0:10所示的多肽。在本發(fā)明的第六方面，提供了體外篩選本發(fā)明蛋白質的促效劑或抑制劑的方法，所述方法包括(a)提供一ATP水解活力檢測體系；(b)提供測試組、陰性對照組和陽性對照組，其中所述測試組為加入了測試物質和本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系；所述陰性對照組為不含測試物質和本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系；所述陽性對照組為不含測試物質但含有本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系，(c)孵育后，觀察測試組中ATP水解能力變化，并與陰性和陽性對照組進行比較；其中，與對照組相比，測試組ATP水解能力降低，就表示測試物質是潛在的本發(fā)明蛋白質的抑制劑；而測試組ATP水解能力提高，就表示測試物質是潛在的本發(fā)明蛋白質的促效劑。在一個優(yōu)選例中，所述ATP水解能力測試體系中至少包括ATP、調節(jié)性輕鏈、鈣離子、鈣調蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(a)提供一檢測體系，所述檢測體系包含ATP、調節(jié)性輕鏈、鈣離子、鈣調蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶、e-NADH和任選的緩沖溶液；(b)提供測試組、陰性對照組和陽性對照組，其中所述測試組為加入了測試物質和本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系；所述陰性對照組為不含測試物質和本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系；所述陽性對照組為不含測試物質但含有本發(fā)明分離的蛋白質的所述檢測體系，(C)孵育后，觀察測試組中0D:,4。值的變化，并與陰性和陽性對照組的OD34。值進行比較其中，與對照組相比，測試組的OD，值提高，就表示測試物質是潛在的本發(fā)明蛋白質的抑制劑；而OD，值降低，就表示測試物質是潛在的本發(fā)明蛋白質的促效劑。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，其包含(i)有效量的活性物質，所述活性物質選自(a)本發(fā)明分離的蛋白質、編碼核酸或其反義序列、構建物、或表達載體；(b)通過本發(fā)明方法篩選得到的本發(fā)明蛋白質的促效劑；或(c)通過本發(fā)明方法篩選得到的本發(fā)明蛋白質的抑制劑、或本發(fā)明的編碼核酸的反義序列、或特異性抗體；(ii)藥學上可接受的載體。在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于治療與心肌收縮異常相關的疾病。在另一個優(yōu)選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，所述心臟病為心功能紊亂。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括收縮紊亂、舒張紊亂、心臟肥大、心肌病、冠心病、心肌梗死、心力衰竭和充血性心力衰竭。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括瓣膜性心臟疾病。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于增強或維持動物的心臟功能。所述動物優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。在另一優(yōu)選例中，所述促效劑選自本發(fā)明蛋白質的融合蛋白、具有促進該蛋白質活性作用的天然提取物或化合物。在另一優(yōu)選例中，所述抑制劑選自本發(fā)明蛋白質的抗體、反義核苷酸、干擾性RNA(RNAi)、具有抑制該蛋白質活性的天然提取物或化合物。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包含其它治療或預防心臟病的藥物，所述藥物優(yōu)選選自神經調節(jié)蛋白、ACE抑制劑、(3腎上腺素阻斷劑、地高辛或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，以藥物組合物的總重量為基準計，所述藥物組合物中活性物質的含量為O.001-99.9wt%,優(yōu)選O.01-95wt%，更優(yōu)選O.l_90wt%，最優(yōu)選0.5-80wt%。在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明蛋白質、其促效劑或其抑制劑在制備治療心臟病的藥物中的用途。在一個優(yōu)選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，所述心臟病為心功能紊亂。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括收縮紊亂、舒張紊亂、心臟肥大、心肌病、冠心病、心肌梗死、心力衰竭和充血性心力衰竭。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括瓣膜性心臟疾病。在另一優(yōu)選例中，所述藥物用于增強或維持動物的心臟功能。所述動物優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。在另一優(yōu)選例中，所述蛋白質的促效劑或抑制劑選自用本發(fā)明方法篩選得到的促效劑或抑制劑。在本發(fā)明第九方面，提供了體外檢測心肌細胞中本發(fā)明蛋白質和/或其基因存在異常的方法，所述方法包括(a)提供相同數(shù)量的樣品心肌細胞和正常心肌細胞，其中所述的正常心肌細胞為正常表達本發(fā)明蛋白質的心肌細胞；(b)在步驟(a)后，用本發(fā)明的特異性抗體免疫沉淀裂解的樣品心肌細胞和正常心肌細胞，然后測定沉淀的ATP水解活力，其中與正常心肌細胞相比，ATP水解活力發(fā)生變化，則表明樣品心肌細胞中本發(fā)明蛋白質存在異常；或者(b')在步驟(a)后，提取樣品心肌細胞或正常心肌細胞的RNA，以對應本發(fā)明蛋白質編碼序列的5'端或3'端的序列為引物，做實時PCR后定量比較和/或PCR擴增后測序比較，樣品心肌細胞的測試結果與正常心肌細胞的測試結果存在變化，則表明樣品心肌細胞中本發(fā)明蛋白質的基因存在異常。在一個優(yōu)選例中，與正常心肌細胞相比，樣品心肌細胞的ATP水解活力提高，則表明所述樣品心肌細胞中本發(fā)明蛋白質的活性增強；而ATP水解活力降低，則表明所述樣品心肌細胞中本發(fā)明蛋白質的活性降低。在另一優(yōu)選例中，所述蛋白質或其基因的異常表明動物對心臟肥大的易感性。在另一優(yōu)選例中，所述蛋白質或其基因的異常表明動物對擴張性心肌病的易感性。本發(fā)明的蛋白質可特異性地表達于心肌細胞，使得肌球蛋白調節(jié)性輕鏈得以磷酸化，既降低對其它組織或系統(tǒng)的副作用，又調控了心肌細胞的收縮和肌小節(jié)的重構，有望成為治療心臟病的有效藥物。而其促效劑和抑制劑也可用于心臟病的治療。圖1所示為紐激酶基因在大鼠各器官中的mRNA水平。圖中分別顯示了心臟、腦、脾、肺、肝、骨骼肌、腎和睪丸中的mRNA水平。0-actin(P-肌動蛋白)反映了各泳道m(xù)RNA的總量。圖2所示為用制備的人紐激酶抗體檢測紐激酶在人體各組織中的表達的結果。圖中顯示了紐激酶分別在腸、肝、心、骨骼肌、肺、腎、子宮、脾和甲狀腺中的表達，以GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)為蛋白量的對照。圖3所示為紐激酶對RLC的磷酸化檢測結果。圖中RLC-P代表磷酸化的RLC,CaM代表鈣調蛋白。圖4所示為在昆蟲細胞中表達的紐激酶純化后電泳鑒定的結果。具體實施方式本發(fā)明人在對神經調節(jié)蛋白的研究過程中意外地發(fā)現(xiàn)了一類新的肌球蛋白輕鏈激酶，將其命名為紐激酶。為研究紐激酶、RLC和肌球蛋白的相互作用及其對心肌細胞收縮或舒張過程的影響，發(fā)明人克隆了紐激酶的cDNA并確定了其核苷酸序列，并且發(fā)現(xiàn)紐激酶只在心臟中有特異性表達，能夠磷酸化心肌細胞中的RLC，從而調控心肌細胞的收縮和肌小節(jié)的重構。在此基礎上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明人在前期的研究中已發(fā)現(xiàn)給大鼠注射一定量(10mg/kg:蛋白量/體重)的神經調節(jié)蛋白能激活體內的ERK和AKT信號通路，進而促進了心力衰竭的恢復。近來通過基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)在給心衰大鼠使用神經調節(jié)蛋白后，其心臟中與編碼肌球蛋白輕鏈激酶的DNA類似的一段DNA片段表達上升。為此，發(fā)明人首先提取大鼠左心室總脂A，通過逆轉錄得到單鏈cDNA，再通過PCR擴增得到雙鏈cDNA，并將該cDNA編碼的蛋白命名為紐激酶(neukinase)。本發(fā)明人還利用大鼠紐激酶cDNA特異的探針發(fā)現(xiàn)大鼠紐激酶mRNA僅在心臟中表達。通過進一步克隆人的紐激酶cDNA，確定了其氨基酸序列。發(fā)明人還將含編碼人紐激酶特異性片段的DNA的質粒轉化大腸桿菌以表達人紐激酶的多肽片段，并將純化后的多肽片段注射家兔以獲得人紐激酶的抗體。在隨后的研究中，發(fā)明人用制備的人紐激酶的抗體檢測發(fā)現(xiàn)該激酶僅在心臟中有特異性表達。通過在C0S7細胞中表達人紐激酶，并檢測其磷酸化調節(jié)性肌球蛋白輕鏈(RLC)的活性，發(fā)現(xiàn)天然紐激酶的激酶活性是依賴于Ca"和鈣調蛋白的。本發(fā)明人還在昆蟲細胞中表達并純化了人紐激酶，并建立了定量測定紐激酶活性的方法，為篩選調控紐激酶活性的物質提供了可行的途徑。神經調節(jié)蛋白在本發(fā)明中，術語"神經調節(jié)蛋白(neuregulin，NRG)"是指能夠激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異二聯(lián)蛋白酪氨酸激酶的分子，包括神經調節(jié)蛋白異構體、神經調節(jié)蛋白中的EGF區(qū)域、神經調節(jié)蛋白突變體、以及任何能激活上述受體的神經調節(jié)蛋白類的基因產物。作為例子，但非限制性地，本發(fā)明的神經調節(jié)蛋白是神經調節(jié)蛋白e2異構體的一個片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了受體結合區(qū)EGF類似區(qū)。該片段的氨基酸序列為SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ。本發(fā)明的神經調節(jié)蛋白可以從天然的動物組織分離得到，或者通過重組技術或其它手段得到。紐激酶在本發(fā)明中，術語"紐激酶(neukinase)"是指含有SEQIDN0:7或8所列部分或全部氨基酸序列的蛋白質或多肽，其具有紐激酶活性。在本發(fā)明中，術語"紐激酶活性"是指能夠水解ATP，同時將調節(jié)性肌球蛋白輕鏈(RLC)的絲氨酸位點磷酸化的活性，即磷酸化調節(jié)性肌球蛋白輕鏈的活性。較佳的，該活性是心肌特異性的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述紐激酶是由SEQIDN0:7或8所示的氨基酸序列組成的蛋白質或多肽。在另一優(yōu)選實施方式中，所述紐激酶是由SEQIDNO:6編碼的氨基酸序列組成的蛋白質或多肽。術語"紐激酶"的定義中也包括含有一個或幾個氨基酸添加、缺失或置換的前述蛋白質或多肽，還包括與前述蛋白或多肽至少有70%、更佳為80%、90%、95%的氨基酸序列相同性的蛋白質或多肽，條件是該蛋白質或多肽必須具有紐激酶活性。術語"活性物質"或"本發(fā)明的活性物質"可互換使用，均指直接或間接具有紐激酶活性的物質，例如但不限于紐激酶、具有紐激酶活性的變體或融合蛋白、它們的編碼序列、表達載體等。在本發(fā)明中，術語"紐激酶活性區(qū)域"是指紐激酶氨基酸序列中水解ATP，并將調節(jié)性肌球蛋白輕鏈(RLC)的絲氨酸位點磷酸化所必須的片段區(qū)域。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明多肽也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛、EDAC。紐激酶基因、構建物、cDNA、表達載體及宿主細胞在本發(fā)明中，術語"紐激酶基因"是指含編碼紐激酶的外顯子序列的基因，其核苷酸序列通過拼接形成編碼紐激酶的mRNA，此mRNA可逆轉錄得到編碼紐激酶的cDNA。紐激酶基因還包括其突變體，即該基因的核苷酸序列變化，核苷酸增加或刪除，部分基因的刪除，大部分或整個基因的復制。紐激酶基因還包括種群中序列的多樣性和等位基因變異。紐激酶基因主要包括編碼序列，也包括其部分或全部調控序列或內含子序列。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。在本發(fā)明中還包含了具有上述編碼序列中至少10個連續(xù)核苷酸的反義序列。本發(fā)明還涉及包含紐激酶編碼序列或其反義序列的構建物，所述構建物可為單拷貝或多拷貝，例如含有l(wèi)、2、3、4、5、6、7、8、9或10拷貝。在本發(fā)明中，術語"紐激酶cDNA"是指用轉染或其它方式被引入細胞后表達紐激酶蛋白的cDNA分子。紐激酶cDNA可由無內含子和轉錄調控序列的紐激酶基因編碼的mRNA逆轉錄得到。人紐激酶cDNA序列見SEQIDN0:6所示序列。在本發(fā)明中，術語"紐激酶表達載體"是指負載有本發(fā)明的紐激酶基因、編碼序列或其反義序列或包含紐激酶表達構建物，且在基因操作中可用于轉化宿主細胞的復制子，包括但不限于質粒、病毒或噬菌體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述表達載體為桿粒(Bacmid)。在本發(fā)明中，術語"用于表達紐激酶的宿主細胞"或"宿主細胞"可互換使用，均是指能夠接收和容納重組分子，并在其中實現(xiàn)重組基因的擴增和表達的細胞。在本發(fā)明中，所述宿主細胞可以是原核生物細胞或真核生物細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述宿主細胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是用本發(fā)明的表達載體轉化大腸桿菌得到的。以上表達載體及宿主細胞的選擇和獲得均可通過本領域技術人員所知曉的常規(guī)方法得以實現(xiàn)。紐激酶促效劑或抑制劑及其篩選方法本發(fā)明還涉及紐激酶的促效劑或抑制劑。如本文所用，術語"紐激酶的抑制劑"指能夠對抗、抑制或降低紐激酶的活性或表達的物質。常見的抑制劑包括但不限于紐激酶抗體、反義核苷酸、干擾性腦A(RNAi)、某些天然提取物、小肽、蛋白質或化合物。如本文所用，"紐激酶的促效劑"指能夠增加、或促進紐激酶的活性或表達的物質。常見的促進劑包括但不限于紐激酶融合蛋白、某些天然提取物、小肽、蛋白質或化合物等。在本發(fā)明中，可根據紐激酶的如下反應特性，在ATP水解活力檢測體系中，通過體外篩選的方法篩選紐激酶的促效劑或抑制劑Ca2+，CaM紐激酶+ATP+RLC-紐激酶+ADP+RLC-P本發(fā)明檢測紐激酶促效劑或抑制劑的方法包括(a)提供一ATP水解活力檢測體系；(b)提供測試組、陰性對照組和陽性對照組，其中所述測試組為加入了測試物質和紐激酶的檢測體系；所述陰性對照組為不含測試物質和紐激酶的檢測體系；所述陽性對照組為不含測試物質但含有紐激酶的檢測體系，(c)孵育后，觀察測試組中ATP水解能力變化，并與陰性和陽性對照組進行比較；其中，與對照組相比，測試組ATP水解能力降低，就表示測試物質是潛在的紐激酶抑制劑；而測試組ATP水解能力提高，就表示測試物質是潛在的紐激酶促效劑。在本發(fā)明中，術語"ATP水解活力檢測體系"是指本領域己知的用于檢測ATP水解反應后ATP/ADP變化的常規(guī)檢測體系，在該體系中通過一步或多步反應使得測試系統(tǒng)中ATP/ADP含量變化直接或間接地被檢測出。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，在檢測體系中提供與紐激酶反應的ATP和調節(jié)性輕鏈，在Ca離子和鈣調蛋白的存在下，產生ADP;然后通過檢測體系中的丙酮酸激酶催化檢測體系中的磷酸烯醇式丙酮酸與所產生的ADP反應生成丙酮酸和ATP;然后使所產生的丙酮酸與檢測體系中的P-NADH在檢測體系中的丙酮酸脫氫酶的作用下產生P-NAD，通過在340nm下檢測該P-NAD的含量變化來間接反應紐激酶的活性。因此，該反應體系中包括ATP、調節(jié)性輕鏈、鈣離子、鈣調蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶和P-NADH，且所述檢測在340nm下進行。該檢測中所發(fā)生的反應如下Ca2*,CaM紐激酶+ATP+RLC-紐激酶+ADP+RLC-PPKPEP+ADP-丙酮酸+ATPLDH丙酮酸+P-NADH--乳酸+3-NAD在一個優(yōu)選實施方式中，所述方法包括(a)提供一檢測體系，所述檢測體系包含ATP、調節(jié)性輕鏈、鈣離子、鈣調蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶、e-NADH和任選的緩沖溶液；(b)提供測試組、陰性對照組和陽性對照組，其中所述測試組為加入了測試物質和紐激酶的檢測體系；所述陰性對照組為不含測試物質和紐激酶的檢測體系；所述陽性對照組為不含測試物質但含有紐激酶的檢測體系，(c)孵育后，觀察測試組中0D:,4。值的變化，并與陰性和陽性對照組的0D340值進行比較；其中，與對照組相比，測試組的0D34。值提高，就表示測試物質是潛在的紐激酶抑制劑；而OD，值降低，就表示測試物質是潛在的紐激酶促效劑。在另一個實施方式中，提供了如下方法.(a)提供一測試組和一對照組，其中所述的對照組為表達紐激酶的細胞的培養(yǎng)體系或添加了紐激酶的細胞培養(yǎng)體系，所述的測試組是添加了測試物質的表達紐激酶的細胞的培養(yǎng)體系、或添加了測試物質以及紐激酶的細胞培養(yǎng)體系；(b)培養(yǎng)細胞、裂解并純化裂解產物，觀察測試組中340nm處吸光值的變化，并與對照組的進行比較；其中，與對照組相比，測試組的吸光度值不變或提高，就表示測試物質是潛在的紐激酶的抑制劑；而吸光度值降低，就表示測試物質是潛在的紐激酶的促效劑。體外檢測紐激酶和/或其基因異常的方法本發(fā)明中還提供了體外檢測紐激酶和/或其基因異常的方法，該方法包括(a)提供相同數(shù)量的樣品心肌細胞和正常心肌細胞，其中所述的正常心肌細胞為正常表達紐激酶的心肌細胞；(b)在步驟(a)后，用抗紐激酶的抗體免疫沉淀裂解的樣品心肌細胞和正常心肌細胞，然后測定沉淀的ATP水解活力，其中與正常心肌細胞相比，ATP水解活力發(fā)生變化，則表明樣品心肌細胞中紐激酶存在異常；或者(b')在步驟(a)后，提取樣品心肌細胞或正常心肌細胞的DNA或mRNA，以對應紐激酶編碼序列的5端或3端的序列為引物，做實時PCR后定量比較和/或PCR擴增后測序比較，樣品心肌細胞的測試結果與正常心肌細胞的測試結果存在變化，則表明樣品心肌細胞中紐激酶的基因存在異常。在一個優(yōu)選實施方式中，與正常心肌細胞相比，樣品心肌細胞的ATP水解活力提高，則表明所述樣品心肌細胞中紐激酶的活性增強；而ATP水解活力降低，則表明所述樣品心肌細胞中紐激酶的活性降低。心肌細胞中紐激酶或其基因的異常表明動物對心臟肥大的易感性或對擴張性心肌病的易感性。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全的治療有效量(如0.001-99wt。/。)的本發(fā)明的活性物質，包括(a)紐激酶、其編碼核酸、本發(fā)明的構建物、或本發(fā)明的表達載體；(b)通過本發(fā)明方法篩選得到的紐激酶的促效劑；或(c)通過本發(fā)明方法篩選得到的紐激酶抑制劑、或紐激酶編碼序列編碼核酸的反義序列、或其特異性抗體；以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本領域技術人員可根據治療目的確定所用活性物質或其組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述活性物質的含量為0.001-99.9wt%，優(yōu)選0.01-95wt%，更優(yōu)選0.1-90wt%，最優(yōu)選0.5-80wt%。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療與心肌收縮異常相關的疾病。例如因心肌收縮過度或不足而引起的心臟疾病，諸如現(xiàn)有技術報道的心肌缺血、冠脈阻塞等。在另一優(yōu)選例中，所述心臟病為心功能紊亂。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括收縮紊亂、舒張紊亂、心臟肥大、心肌病、冠心病、心肌梗死、心力衰竭和充血性心力衰竭。在另一優(yōu)選例中，所述心功能紊亂包括瓣膜性心臟疾病。本文所用的術語"有效量"指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明活性物質。此外，本發(fā)明的活性物質還可與其它治療劑一起使用。術語"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。本發(fā)明的組合物中除了含有具有紐激酶活性的成分之外，還可含有額外的心臟病預防或治療藥物。較佳地，所述的額外的心臟病預防或治療物選自神經調節(jié)蛋白、ACE抑制劑、p腎上腺素阻斷劑、地高辛或其組合。給藥方式藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約l微克/千克體重-約5毫克/千克體重。本發(fā)明的藥物組合物，可以經口服、皮下、皮內、靜脈注射等方式應用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明活性物質施用于哺乳動物，尤其是人。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。此外，本發(fā)明的紐激酶活性物質可單獨直接用于心臟病預防和/或治療，還可與其它物質聯(lián)用，例如其它心臟病預防或治療藥物、紐激酶促效劑等。本發(fā)明的優(yōu)點1.本發(fā)明的紐激酶具有心臟特異性，并能磷酸化調節(jié)性肌球蛋白輕鏈，從而在調控心肌細胞的收縮和肌小節(jié)的重構的同時，對其它組織或系統(tǒng)具有較低的副作用，有望成為治療心臟病的有效藥物；2.本發(fā)明還建立了篩選紐激酶促效劑或抑制劑的方法，為進一步開發(fā)出新的心血管藥物提供了平臺；其促效劑或抑制劑有望成為治療心臟病的有效有望3.通過本發(fā)明的方法體外監(jiān)測紐激酶的活性，可用于反映對象對某些心血管疾病的易感性。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。動物實驗方法1.大鼠冠脈結扎、心超檢測及分組將200土20g的Wistar雄性大鼠(中國科學院上海實驗動物中心提供)腹腔注射氯胺酮(Ketamine)100mg/kg麻醉后，仰臥固定于鼠板，頸部及胸部去毛后用新潔爾滅消毒。頸部正中切口，鈍性分離氣管，將18G動靜脈針留置第3-5氣管軟骨間，退出針芯，將塑料套管推入氣管內l-2cm，固定，以備接小動物呼吸機(SAR-830/Pventilator,潮氣量約lml/100g/次，頻率60次/分鐘)。胸部左前切口，鈍性分離，暴露第4、5肋骨，用彎頭紋式止血鉗從肋間穿透胸壁并剪斷第4肋，接通開啟呼吸機，暴露心臟，觀察肺充氣及心跳情況。撕開心包，將上部脂肪墊上翻，充分暴露左心耳和肺動脈圓錐，于二者之間用6/0醫(yī)用無損傷縫合線結扎冠狀動脈前降支，可看到結扎后心肌局部呈現(xiàn)白色(約8咖X8mm),活動明顯減弱?？p合胸壁，堵住呼吸機回氣口使肺充盈，用力擠壓胸部排氣后，縫合胸部肌肉和皮膚。觀察呼吸情況，待自主呼吸后去除呼吸機。結扎后第14天用心臟超聲儀(PhilipsSonos7500S4探頭)檢測，選用EF值在30-50%之間的大鼠隨機分組，每組12只。2.冠脈結扎大鼠給藥分組后做膠囊式滲透壓泵(ALZET2ML1)植入手術，泵中充入2ml賦形劑(lOmMNa2HP04-NaH2P04;150mMNaCl;0.2%HSA(人血清白蛋白)；5%甘露醇，pH6.0)或2ml重組人神經調節(jié)蛋白(NRGie2的177-237氨基酸片段，購自澤生科技開發(fā)有限公司，批號200503002;溶解于上述賦形劑中，濃度為125Pg/ml)溶液(含神經調節(jié)蛋白250Pg，如果大鼠體重按照250g計算，給藥速度相當于5Pg/kgxh，達峰血藥濃度大約相當于靜脈注射0.7Pg/kg)。"對照組"靜脈滴注給賦形劑，"給藥組(IVGTT)"靜脈滴注給神經調節(jié)蛋白。給藥7天后，心超檢查。次日做血流動力學檢查、心臟解剖學檢査，留取血清。2.1.膠囊式滲透壓泵安裝方法在無菌操作臺內給每支(250^)神經調節(jié)蛋白先注入lml無菌注射用水，再注入lml無菌生理鹽水，然后用無菌注射器抽取神經調節(jié)蛋白溶液。給注射器換上鈍頭注射針頭，排凈氣泡，將泵直立，從泵的頂端小孔處插入至最底部，緩慢推入神經調節(jié)蛋白溶液，直至有溶液溢出小孔，拔出注射針頭，擦凈泵外周溶液。把流量調節(jié)器上方的半透明蓋子去掉，露出一小段不銹鋼管，將長5cm的PE管與之連緊。注射器吸取神經調節(jié)蛋白溶液，排凈氣泡，針頭與PE60管相連，充入藥物溶液至流量調節(jié)器滿為止。將流量調節(jié)器另一端插入泵中，至流量調節(jié)器的白色邊緣與泵貼緊為止，拔掉注射器及針頭。將連接好的泵浸入37'C的無菌生理鹽水中過夜，用前取出。用氯胺酮麻醉大鼠，取仰臥位，頸部備皮并消毒，用滅菌鋪巾覆蓋大鼠身體。在頸前偏右側縱向切口，小心分離頸外靜脈，在遠心端結扎，穿雙線，用眼科剪在頸外靜脈上做一斜剪口，再用顯微鑷撐開切口，將連接了膠囊式滲透壓泵的PE60管插入約2cm,近心端扎緊，遠心端多處扎緊固定PE60管。然后自切口處向頸后外側鈍性分離一竇道至背部肩胛處，再鈍性分離一空間，將膠囊式滲透壓泵自竇道塞入背部肩胛處的空間內?？p合切口，并開始計時。待大鼠蘇醒后送其回鼠房，讓其自由進食水。實施例1.神經調節(jié)蛋白對心肌梗死大鼠心臟的紐激酶基因表達的增強作用取正常大鼠、IVGTT給賦形劑的大鼠和IVGTT給神經調節(jié)蛋白的大鼠各3只，剪取左心室，在液氮中速凍，然后送到Affymetrix公司。由公司人員從樣品中提取mRNA，再用基因芯片AffymetrixRatExpressionArray2302,0研究mRNA的水平。分析得出的與肌球蛋白輕鏈激酶類似的蛋白的相對mRNA水平如表1所示。表中數(shù)值為三只大鼠數(shù)據的平均值及標準偏差。表1.大鼠左心室中與肌球蛋白輕鏈激酶類似蛋白的mRNA表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表1可看出，與用賦形劑的心衰大鼠相比，用神經調節(jié)蛋白的心衰大鼠左心室中與探針族1376789和與探針族1382239結合的mRNA水平幾乎上升了2倍，提示神經調節(jié)蛋白在心衰大鼠心臟中能顯著增強與探針族1376789和與探針族1382239結合的mRNA水平。因此，與這兩類探針結合的mRNA極有可能編碼神經調節(jié)蛋白信號途徑的下游蛋白。實施例2.從大鼠左心室RNA克隆紐激酶cDNA由于與探針族1376789和與探針族1382239結合的raRNA可能編碼神經調節(jié)蛋白信號通路的下游蛋白，因此有必要克隆與這些mRNA對應的cDNA來研究它們編碼的蛋白和神經調節(jié)蛋白的相互關系。從大鼠左心室提取RNA。將部分RNA、引物(GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT)和腦v逆轉錄酶(Promega公司)加入Promega逆轉錄反應系統(tǒng)(含TaqDNA聚合酶)以進行逆轉錄。反應完成后，將一定量的產物、反向弓|物(GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT)和正向引物(ATGTCAGGAGTTTCAGAGGA)(該引物源自預測的肌球蛋白輕鏈激酶2類似蛋白DNA序列)加入PCRmastermix(sinobio公司)中進行PCR以擴增目的基因cDNA。反應完成后，將反應產物通過電泳純化后用連接酶(Fermentas)連接到pUCm-T質粒(Promega)上并測序(SEQIDNO:1所示核苷酸序列)。我們將大鼠中該序列編碼的蛋白命名為紐激酶(neukinase)，其氨基酸序列見SEQIDN0:2所示序列。將紐激酶cDNA序列與探針族1382239和探針族1376789的源序列(SEQIDN0:3所示序列對應探針族1382239，SEQIDNO:4所示序列對應1376789)分別進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQIDN0:3所示序列的5'端與紐激酶3'端有325個堿基重疊，而SEQIDNO:4所示序列的5，端與SEQIDNO:3所示序列的3'端有77個堿基基本重疊。這說明這兩個探針族檢測的是同一個raRNA序列。實施例3.紐激酶基因在大鼠心臟中的特異性表達以紐激酶的cDNA為模板，將一定量的正向引物(ATGTCAGGAGTTTCAGAGGA)和反向引物(CTTGAATTCTCACAGTGACGTATCGATGAT)(即與紐激酶第868到第885位核苷酸序列互補的序列再連上設計的酶切位點)加入PCRmastermix(sinobio公司)進行PCR,以擴增目的DNA片段(SEQIDN0:5所示序列)。電泳純化該片段后以其為模板，將一定量的[a-32P]dCTP加入Promega公司的prime-a-gene，示記系統(tǒng)(含DNA聚合酶I大片段，隨機寡聚6核苷酸)以合成探針。反應完成后將產物用S印hacryrS-400柱(Promega)離心純化，得到長于270個核苷酸的標記的探針混合物。將該探針混合物與購自Clontech公司的大鼠MT,印跡膜(為心、腦、脾、肺、肝、骨骼肌、腎和睪丸的polyA+RNA分別在8個泳道電泳后的印跡膜)結合，檢測紐激酶mRNA在各器官的表達。圖1為用紐激酶特異的探針檢測的紐激酶在各器官中表達的mRNA水平。由圖可見，紐激酶探針僅與心臟組織中一個mRNA片段結合。同時圖中P-肌動蛋白cDNA探針(Clontech公司)檢測的P-肌動蛋白在各器官表達的mRNA水平說明各泳道總mRNA量基本相同。綜合上述結果說明紐激酶僅在心臟中有較高表達，即紐激酶基因是心臟特異性的基因。實施例4.從人左心室組織克隆紐激酶cDNA從人左心室組織勻漿液中提取總RNA。將少量RNA，OligodT引物(TTTTTTTTTTTTTTT)和逆轉錄酶(Promega)加入Promega反應系統(tǒng)進行逆轉錄反應。然后將少量反應混合物、正向引物(GACACCACCGCCTGAGTGAGAAC)、反向引物(CCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)加入PCRmastermix(sinobio公司)中PCR以擴增人紐激酶cDNA,將反應混合物電泳，切出目標條帶，從凝膠中提取cDNA后與pUCm-T質粒用連接酶(Fermentas)連接以便測序。人紐激酶cDNA序列見SEQIDN0:6所示序列。從紐激酶cDNA推測其蛋白氨基酸序列有兩種可能，見SEQIDNO:7所示序列和SEQIDN0:8所示序列，我們表達的紐激酶對應分子量較大的SEQIDN0:8。(SEQIDN0:7對應SEQIDNO:6的211到2598位核苷酸，SEQIDN0:8對應SEQIDNO:6的128到2598位核苷酸)。實施例5.人紐激酶抗體的制備將人紐激酶cDNA、正向引物(CGCGGATCCATGGACACAAAGCTGAACATG)、反向引物(CCTTAAGTCACGTGGCCCCCACCAAAGCGAT)加入PCRmastermix(sinobio公司)中進行PCR反應。將反應混合物凝膠電泳后提取目標DNA。將目標DNA和pGEX-2T質粒(GE)分別用BamHI和EcoRI酶切后用連接酶(Fermentas)連接以表達帶谷胱甘肽S轉移酶(GST)的紐激酶片段。人紐激酶片段的cDNA序列見SEQIDN0:9所示序列，對應的氨基酸序列見SEQIDNO:IO所示序列。將含紐激酶片段的pGEX-2T質粒轉入BL21后用IPTG誘導大量表達。收集誘導后的菌體超聲破碎后離心分離包涵體，洗滌后用8M的脲溶解然后透析去脲以復性紐激酶片段，最后用GST親和層析柱純化，得到所需的紐激酶片段。將純化的人紐激酶片段皮下多點注入家兔，一段時間后殺兔取血并純化抗體。實施例6.紐激酶蛋白在人心臟中的特異性表達取液氮凍存的人腸(gut)、肝(liver)、心(heart)、骨骼肌(skeletalmuscle)、肺(lung)、腎(kidney)、子宮(uterus)、脾(spleen)和甲狀腺(thyroid)的組織分別在冰上研磨，再分別加入裂解液[50mMTris，pH7.4;150mMNaCl;1%TritonX-100;5mMEDTA;50mMNaF;2mM釩酸鈉；2mMPMSF;cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片)]振蕩5分鐘后離心，取上清用BCA法測定蛋白濃度。根據蛋白濃度各取少量加入電泳上樣緩沖液混合，煮沸3分鐘再上樣，電泳并轉移到PVDF膜，然后用實施例5中制備的抗體做Western印跡檢測。紐激酶在各組織中的表達如圖2所示。從圖中可看出紐激酶在腸、肝、骨骼肌、肺、腎、子宮、脾和甲狀腺中都沒有表達，而僅在心臟中有表達，說明紐激酶是心臟特異性表達的蛋白。實施例7.人紐激酶在C0S7細胞中的表達及其活性的檢測1.人RLC的表達、純化從人左心室組織勻漿液中提取總RNA。再將RNA、正向引物(GGGAATTCCATATGGCACCTAAGAAAGCAAAGAA)、反向引物(CCGCTCGAGGTCCTTCTCTTCTCCGTGGGTG)和AMV逆轉錄酶(Promega)加入Promega反應系統(tǒng)并按Promega的方法進行逆轉錄反應。將反應混合物電泳，切出目標條帶，從凝膠中提取cDNA后用Ndel和XhoI切割，再與Ndel和XhoI切割后的pet22b質粒連接并測序。將測序正確的質粒轉化BL21,IPTG誘導表達，破菌提取包涵體，將包涵體用8M的脲變性后用鎳柱純化，再透析復性。所得RLC的氨基酸序列見SEQIDNO:11所示序列。2.紐激酶的表達及活性測量將實施例4所述從凝膠中提取的紐激酶cDNA、正向引物(CATCATCTGGTTCCGCGTGGATCTATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGT)、反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)及PfuTurb(/DNA聚合酶(Stratagene公司)加入Stratagene的PCR反應系統(tǒng)反應后，再將少量反應產物、新的正向引物(CGGGATCCATGCATCATCATCATCATCATCTGGTTCCGCGT)、反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)及PfuTurbo豕腿聚合酶(Stratagene公司)加入Stratagene的PCR反應系統(tǒng)再反應。將反應混合物電泳后切出目標條帶，用試劑盒(Axygen公司)純化DNA，再用內切酶BaraHI和EcoRI(Takara)分別切割純化的DNA及pcDNA3，將反應混合物分別電泳，取較大的條帶再分別用試劑盒(Axygen公司)純化DNA。將切割后的pcDNA3和紐激酶簡A以1:3的摩爾比混和再加連接酶(Fermentas)室溫連接2小時。用連接后的產物轉化DH5a并涂在含Ampicillin的平板上于37t:過夜培養(yǎng)。挑幾個單菌落在含Ampicillin的培養(yǎng)基中于37'C再過夜培養(yǎng)。加少量培養(yǎng)液、正向引物(CGGGATCCATGCATCATCATCATCATCATCTGGTTCCGCGT)、反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)于PCRmastermix(sinobio公司)中再做PCR，將PCR產物電泳檢測。將PCR檢測陽性的培養(yǎng)液取少量送Invitrogen公司測序后取序列正確的培養(yǎng)液大量培養(yǎng)并用Qiagen公司的試劑盒(PlasmidMaxiKit)提取含紐激酶DNA的質粒。在轉染的前一天，收集C0S7細胞并轉移到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿約含106個細胞，這樣次日轉染時培養(yǎng)皿90%的面積都充滿細胞。將純化的質粒與Opti-MEMl(invitrogen)混合。將Lipofectamine2000(invitrogen)搖勻后用Opti-MEMl稀釋，在室溫下放置5分鐘。然后將質粒與LipofectamineTM2000混合，輕輕搖勻后在室溫放置20分鐘。將所得溶液加入有90%匯合度C0S7細胞的培養(yǎng)皿，邊加邊搖動以混勻。當日下午換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后吸去培養(yǎng)液，加入lml裂解液[50mMTris，pH7.4;150mMNaCl;1%TritonX-100;5mMEDTA;50mMNaF;2mM釩酸鈉；2mMPMSF;cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片)]振蕩吹打后收集于離心管中超聲破碎，于4°C，12000g離心20分鐘后將上清用0.45mm濾膜(Millipore)過濾。將l:200體積的His-Tag抗體(Beyotime)加入EppendorfTw管中的濾液，再加入1/10體積含50%nProteinAS印harose4FastFlow(AmershamBiosciences,用裂解液洗過3次)的裂解液，冰浴輕搖3小時后于4°C，12000g離心20秒，吸去上清，沉淀再用裂解液洗3次，吸去上清，加入lml反應緩沖液(20mMTris，pH7.5;60mMKC1)，冰浴5分鐘后同上離心，棄上清后再加入300ml反應緩沖液。紐激酶的測活反應式如下Ca2，，CaM紐激酶+ATP+RLC-紐激酶+ADP+RLC-P其中CaM代表鈣調蛋白(Calmodulin,Calbiochem)，RLC代表調節(jié)性輕鏈(regulatorylightchain),RLC-P代表磷酸化的RLC。反應后通過檢測磷酸化RLC的量來確定紐激酶的活性。實驗分3組，組1反應混合物為紐激酶、ATP、RLC、Ca2+、CaM;組2(無鈣)反應混合物為紐激酶、ATP、RLC、EGTA(鈣離子螯合劑)、CaM;組3(無CaM)反應混合物為紐激酶、ATP、RLC和Ca2+。反應系統(tǒng)中含2mMATP，2.5mMRLC，0.3mMCa2+，ImMCaM，含或不含2mMEGTA。反應混合物于室溫輕搖2小時，取20ml樣品加入5u16X電泳上樣緩沖液，煮沸3分鐘再上樣電泳并轉移到PVDF膜，然后用兔抗人RLC-P抗體(CellSignaling)、羊抗兔抗體(Sigma)做Western印跡檢測，檢測結果如圖3所示。從圖中可看出，相對于有Ca2+和鈣調蛋白的情況，沒有Ca2+或鈣調蛋白時，紐激酶對RLC的磷酸化很少，可見，紐激酶對RLC的磷酸化是Ca"和鈣調蛋白高度依賴的。實施例8.人紐激酶在昆蟲細胞中的表達、純化及其活性的檢測1.含人紐激酶cDNA的桿粒(Bacmid)的制備將實施例7中所得含紐激酶cDNA的pcDNA3用內切酶BamHI和EcoRI(Takara)切割，將反應混合物電泳，取較小的條帶用試劑盒(Axygen公司)純化得到紐激酶cDNA。同時將pFastBac質粒用內切酶BamHI和EcoRI(Takara)切割，將反應混合物電泳，取較大的條帶用試劑盒(Axygen公司)純化DNA。將純化后的pFastBac和紐激酶cDNA以1:3的摩爾比混和再加連接酶(Fermentas)于Fermentas反應系統(tǒng)中室溫反應2小時。用連接后的產物轉化DH5a并涂在含氯節(jié)西林的平板上于37'C過夜培養(yǎng)。挑幾個單菌落在含氨芐西林的液體培養(yǎng)基中于37。C再過夜培養(yǎng)。加少量培養(yǎng)液、正向引物(CGGGATCCATGCATCATCATCATCATCATCTGGTTCCGCGT)、反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)于PCRmastermix(Sinobio公司)中做PCR,將PCR產物電泳檢測。將PCR檢測陽性的培養(yǎng)液取少量送Invitrogen公司測序后取序列正確的培養(yǎng)液大量培養(yǎng)并用Qiagen公司的試劑盒(PlasmidMaxiKit)提取含紐激酶cDNA的pFastBac質粒。用含紐激酶cDNA的pFastbac質粒轉化DH10Bac并涂在含50mg/ml卡那霉素、7mg/ml慶大霉素、10mg/ml四環(huán)素、200mg/mlX-gal、40mg/mlIPTG的平板上于37。C培養(yǎng)48小時。挑白色菌落接種在含前述成分的新平板中于37。C過夜培養(yǎng)。挑單菌落在含50mg/ml卡那霉素、7mg/ml慶大霉素、10mg/ml四環(huán)素的液體培養(yǎng)基中于37。C過夜培養(yǎng)。取6ml培養(yǎng)液于14000g離心1分鐘，吸取上清，加入1.2ml溶液1(15mMTris-HC1,p朋.0;IO福EDTA;100mg/mlRNaseA)，振蕩懸浮細胞，再加入1.2ml溶液2(0.2NNaOH;1%SDS)，輕輕混合，室溫放置5分鐘，然后邊搖晃邊緩慢加入1.2ml3M的乙酸鉀，pH5.5，14000g離心10分鐘，將上清轉移到含3.2ml異丙醇的離心管中，顛倒離心管幾次混合后，冰上放置6分鐘，室溫14000g離心15分鐘，小心吸走上清，不要擾動沉淀。然后加入2ml70%的乙醇，顛倒離心管幾次，再于14000g離心5分鐘，盡可能地吸走上清，隨后在室溫放置5-10分鐘以使沉淀干燥，最后加入40mlTE緩沖液，pH8.0，輕敲離心管以溶解DNA。加少量純化的Bacmid、正向引物(M13+,即GTTTTCCCAGTCACGAC)、反向引物(CGGAATTCCCATTGGAGCAGCAGAGTTGAAGA)于PCRmastermix(sinobio公司)中做PCR，將PCR產物電泳檢測。2.人紐激酶的表達和純化用Grace培養(yǎng)液(Grace'sinsectmediumsupplemented,Invitrogen)吹打收集培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)的sf9昆蟲細胞，把約5.4乂106個細胞接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置1小時。同時將24ug含紐激酶cDNA的Bacmid加入1.5mlGrace培養(yǎng)液(無抗生素和FBS)中，混勻，再將60w1Lipofectamine2000(invitrogen)加入1.5ml的Grace培養(yǎng)液(無抗生素和FBS)中，混勻后室溫放置5分鐘。然后將含Bacmid的溶液和含Lipofectamine的溶液混合，室溫放置20分鐘，再加入2mlGrace培養(yǎng)液(無抗生素和FBS)，混勻。吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入含Bacmid的混合液，27。C溫浴5小時后再吸去培養(yǎng)皿中的溶液，加入10mlGrace培養(yǎng)液(含100U鏈霉素、100U氨芐青霉素和10%的FBS)，27。C培養(yǎng)72小時后吸取培養(yǎng)液，500g離心5分鐘，上清為含病毒的溶液，可轉入離心管中4'C短期避光保存，也可分裝保存于-8CTC。取少量病毒溶液加入貼壁1小時的Sf9細胞，27'C培養(yǎng)72小時，收集上清，得到高效價的病毒溶液。隨后用適量病毒溶液再感染100mlSf9細胞懸液(2Xl(f個細胞/ml)，在搖瓶中于27i:懸浮培養(yǎng)84小時，搖瓶轉速為130rpm。收集培養(yǎng)液，1000rpm離心10分鐘，倒掉上清，向沉淀中加入細胞裂解液[50mMTris，pH7.4;150mMNaCl;1%TritonX-100;5mMEDTA;50niMNaF;2mM釩酸鈉；2mMPMSF;cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片)]，冰浴超聲破碎細胞，于4°C，12000rpm離心20分鐘，取上清過濾，將濾液過鎳柱(Nis印harosehighperformance,GE)純化，洗脫蛋白后再上凝膠過濾柱(HiTrapDesaltingcolumn,GE)，用緩沖液(50mMTris-HCl,pH7.5;150mMNaCl;0.5mMEDTA;0.02%TritonX-100;2mMDTT;20%甘油)洗脫后，分裝凍存于-80°C以備活性檢測，人紐激酶取樣點泳的結果如圖4。3.紐激酶活性的檢測紐激酶活性檢測的反應式如下Ca2+,CaM紐激酶+ATP+RLC-紐激酶+ADP+RLC-PPKPEP+ADP-丙酮酸+ATP固丙酮酸+P-NADH--乳酸+P-NAD其中PEP代表磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)，PK代表丙酮酸激酶(pyruvatekinase),P-NADH代表還原型P煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(P-NicotinamideAdenineDi薩leotide，reducedform)，LDH代表孚L酸脫氫酶(LacticDehydrogenase)，P-NAD代表氧化型P煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(e-NicotinamideAdenineDinucleotide，oxidizedform)。由于P-NADH被氧化成0-NAD時在340nm處的吸光值會降低，所以可通過監(jiān)測該吸光值的降低來間接反映紐激酶的ATP水解活力，活力單位為0D/min/mg。在800ml含20mMTris'pH7.5，60mMKC1，ImMDTT'3.75mMMgCl2，ImMATP,0.3mMCaCl2,1.5mMPEP,20U/mlPK，20U/mlLDH,90mMRLC,250mMP-NADH,ImMCaM禾BlOOnM紐激酶的反應體系中，DOD/min/nmol紐激酶=0.0152/min/nmol紐激酶。實施例9:紐激酶促效劑或抑制劑的體外篩選實施例8中的測活原理和體系還可用于定量研究其它物質對紐激酶活力的影響，從而篩選出紐激酶的促效劑和/或抑制劑。取等量純化的紐激酶分別加入每孔含有測試液(實施例8中測活體系，總體積160^1)的酶標板中，不加酶做陰性對照，在測試孔中加入待測的促效劑或抑制劑，以紐激酶做陽性對照，混合后保溫30分鐘，再加入適量的ATP，反應1小時后測0DM。值。OD值高于陽性對照，說明該物質是紐激酶的抑制劑，OD值低于陽性對照，說明該物質是紐激酶促效劑。并且，根據OD值升高或降低的量可計算出待測物的抑制或促進效率。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海澤生科技開發(fā)有限公司<120>紐激酶及其在心血管疾病中的應用〈130〉2007-07-12<140〉11<150〉FastSEQforWindowsVersion4.0<210〉1〈211〉2728<212〉腿〈213〉大鼠(Rattusnorvegicus)〈220〉〈223〉紐激酶cDNA序列<400〉1caagggcctgggcca犯ctcagcctgtcgctctctcagtggUgagtgggagatagacac60柳g雄ttggccctctccgtcccccacscagUcagtcaggaggacaggttggttccct120gceigC3Eiggctcttagcagcggaggacaatggccttccagacgttaccac180agcagacccttcgtgctccagtttccttgtctttgccctt犯ttgggatg240tcaggagtttcagaggaggatccagagggtctgggcccccagggtctgccagcgttgggc300ggagcctgcttagtcaccgtggaca犯aaactt犯tgtgctgactgagaaggtcgacaga360ctcttgcatttcc犯g犯gatgtcacagagaagctacagtgtgtgtgccaaggcatggat420cacctggaacaaggtctgcatcggctggaggcctcccaggagttgggtctggcagggccc480ggcagcacttccccagccgctgctcaggccgcatggcctgaggtcctggagctggtgagg540gccgtgcggcaggagggtgcccagcacggtgccaggctcgaagccctcttcaagatggtg600gtggctgtggacagggctattactttggtagggtccacaatcc卿actccaaagtggat660gatttcatcctgcaagggaccgtgccctggaggaaaggcagtctggctgatggccctgag720gagaacaaggagc犯gc卿agtggctggagtg犯gccaaagcatgtgctgsatacaggs780agtgtgcaagctgccacUctagggcgctgtgggaagagagccagaagcaggacacaccc840gtggggacagtggaggggctgcctctcatcatcgatacgtcactgaagggagctgacctc900acccaggctggagcctcactgaggcagggagttgaagctcttgacccaggCC33g犯CCC960ccacccacagaggc卿atccaggcttcctgcactagccagcgaggacactgggaccacc腳ctggaattgtctgtagcaattgacagaatcagtgaggtcctcactagcctcaggatgtcc1080caaagtgctggcgaaggaacctcatccagcaagcctgactgttcagagcctggccctcag1140cccctagggccactaactacagacagtgacattcacagtgatgaaggacttcccaggatc1200tctgtccgtatgcgagagatgactactcctgaggagctgtttg卿cccaaggtggcagc1260cccattggctcggcag犯gctccaggccctggaactgtgtgatccctaaa1320ggagccagaccatUccacccctgcc犯agaggagctgcaacaatggtggcgcgagtgca，gaggaggcaaceigggcctggggctgagcccatc卿ggaccaagcttggtC3C33ggg3C1440tggagagatgaacctgttgggaccacagacctgcagcaaggc卿gacccaggagcggtg1500agccctgaacctgggaaggaccatgcagcccagggcccagggagaaccgaagctggaagg1560agggtgtcttctgctgc卿ggctgccatcgtagttctaggtgacagcgc3gC3CCCCC31620gccccUttgaacaccgggtagtgagcatctcatctcgac1680gtgtcccaacacgaagtcttgggagggggccggtttggccaggtgcacaggtgtacagag1740cggtccacaggccttgcactggcagccaagatcatc犯agaaaggaccgg1800gaggatgtgaagaatgagatcaacatcatgaaccagctcagccacgtaa3cttgatccaa1860ctttatgatgcttttgagagcaagaacagcttcaccctgatcatggagtatgtggatgga腦ggtgaactcttcgaccggatcacggatgagaagtaccacctgaccgagctggatgtggtc畫Ugttcacsaggcagatctgtgagggtgtgcattacctgcaccagcactacattctgcac2040ctggacctcaagccagagaacatactgtgtgtcagccagactgggcatcaaattaagatt2100attgactttgggctggctagaagatataaacctcgggagaagcta犯ggttaacUtggt2160actccagagttcctggctccagaagttgtt謀tatgagtUgtctcattccc犯c卿c2220atgtggagtgtgggagttatcacctacatgctactcagtggUtgtccccatttctaggg2280g犯ttttattgtgaactgcagctgggatttcgatgctgat2340ggctgtcagaggaagccaaggacUtgtttcacggttgctggtcaaagag24003卿gttgtaggatgagcgccacacagtgcctg犯ac3tgagtggttaaatcacctgatt2460gcca犯gcctcaggctcc犯cgUcgcctcagatccc犯ctactgctgcagaaatatatg2520gctcagcgtaaceiUtxcatgtggtgactgcagtcaacaggctaagaaaa2580tttccaacgtgtccctaatctacaactgggcctgggagttcctgaggcgacacgcagtgg2640taatgtgaag柳tgactcaggattttatggagtcaggagcUggctgttattgatctta2700ttttgcaaagaatggtggaaggaagaaa2728<210〉2<211〉786<212〉蛋白質<213〉大鼠(Rattusnorvegicus)<400〉2msgvseedpeglgpqglpalggaclvtvdkklnvltekvdrllhfqedvteklqcvcqgm60dhleqglhrleasqelglagpgstspaaaqaawpevlelvr譜qeg叫hgarlealfkm120vvavdraitlvgstiqnskvddfilqgtvpwrkgsladgpeenkeqaevagvkpkhvlnt180gsvqaatsralweesqkqdtpvgtveglpliidtslkgadltqagaslrqgvealdpgqe240pppteaesrlpalasedtgttlelsvaidrisevltslrmsqsagegtssskpdcs印gp300qplgplttdsdihsdeglprisvrmre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