專利名稱：去甲斑蝥素及其衍生物在預(yù)防和治療艾滋病中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及去甲斑蝥素在預(yù)防和治療艾滋病中的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及去甲斑蝥素衍生物在預(yù)防和治療艾滋病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病(AIDS)以來(lái)，全世界迅速蔓延開來(lái)。雖然全球合作采取了各種干預(yù)艾滋病的措施，但它還是以迅猛發(fā)展的速度嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。所引起的危害已經(jīng)成為21世紀(jì)人類面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前已有27種化學(xué)合成的抗HIV藥物(包括蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和膜融合抑制劑)。雖然聯(lián)合用藥成功地降低了AIDS的發(fā)病率和患者的死亡率，但仍存在如毒性、耐藥性等諸多問(wèn)題，且由于疫苗的研究尚未獲得突破，因此研發(fā)具有防治HIV感染的新型藥物就顯得十分重要[Garber DA，F(xiàn)einberg MB.AIDS vaccine developmentthe long and winding road.AIDS Rev.2003，5(3)131-139]。
人類應(yīng)用斑蝥醫(yī)治疾病已有兩千多年的歷史。斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥Mylabris p halerata Pall.或黃黑小斑蝥M.cichorii L.的干燥體。斑蝥素(Cantharidin)為斑蝥抗癌的基本有效成分，主要用于治療肝癌、食管癌、肺癌及胃癌等惡性腫瘤，因其毒性較大，限制了其臨床應(yīng)用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，Nd)為斑蝥素的衍生物，明顯減輕了毒副作用，且增強(qiáng)了抗癌效果，為口服制劑，已在臨床應(yīng)用[吳建梅，任天池，虞梅.去甲基斑蝥素的藥學(xué)研究與臨床應(yīng)用進(jìn)展.中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37(8)566-569]。去甲斑蝥素及其衍生物具有抗癌作用，目前已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道[曾文南，盧懿.斑蝥素及其衍生物的合成與活性研究進(jìn)展.有機(jī)化學(xué)，2006，26(5)579-591]，如去甲斑蝥素金屬元素配合物，在體內(nèi)外也具有抗癌癥的作用[武德柱，崔景榮.去甲斑蝥素-釹的合成.專利申請(qǐng)?zhí)?00510069072.2]。此外，去甲斑蝥素還對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制具有一定的抑制作用[譚知顯，李聰賢，王廣生.去甲基斑蝥素治療乙型肝炎表面抗原攜帶者的療效觀察.藥學(xué)通報(bào)，1988，23(1)46]。但是迄今為止，尚未見有任何關(guān)于去甲斑蝥素及其衍生物用于治療艾滋病的報(bào)道。近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明，去甲斑蝥素及其衍生物具有顯著的抗艾滋病毒活性且毒性很小。
本發(fā)明的目的在于，提供去甲斑蝥素在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的新用途；本發(fā)明的另一目的在于，提供去甲斑蝥素衍生物在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了去甲斑蝥素(結(jié)構(gòu)式I)在制備防治艾滋病藥物中的新用途。
結(jié)構(gòu)式I(Nd)本發(fā)明提供了去甲斑蝥素金屬元素配合物(結(jié)構(gòu)式II)在制備防治艾滋病藥物中的新用途。
M＝金屬元素；n＝1，2，3，4，5結(jié)構(gòu)式II(若金屬元素為釹，則為實(shí)施例所說(shuō)化合物NdR4)本發(fā)明還提供了去甲斑蝥素-金屬元素(結(jié)構(gòu)式III)的制備方法，其技術(shù)方案包括以下步驟(2種方法) M＝金屬元素，n＝1，2，3，4，5結(jié)構(gòu)式III(若金屬元素為釹，則為實(shí)施例所說(shuō)化合物NdR3)方法1將順丁烯二酸酐于丙酮中，溶解后向其滴加呋喃。加畢后回流反應(yīng)，再向其加入氫化鈉后繼續(xù)反應(yīng)。過(guò)濾掉丙酮并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶。然后將產(chǎn)品于無(wú)水乙醇中后加入金屬化合物，于室溫下反應(yīng)收集產(chǎn)品，并用無(wú)水乙醇洗產(chǎn)品三次，收產(chǎn)品去甲斑蝥素-金屬元素。
方法2將順丁烯二酸酐于無(wú)水乙醚中，溶解后向其滴加呋喃。加畢后回流反應(yīng)，再過(guò)濾掉乙醚并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶，收產(chǎn)品。取該產(chǎn)品于丙酮溶液中，然后向其加入氫化鈉攪拌反應(yīng)，分出晶體并用無(wú)水乙醚洗二次，收產(chǎn)品。將這一步所得產(chǎn)品于水中溶解后再向其加入金屬化合物。然后反應(yīng)，蒸出大部分水后再分離出產(chǎn)品并用乙醚洗產(chǎn)品，獲得去甲斑蝥素-金屬元素。
本發(fā)明又提供了去甲斑蝥素-金屬元素化合物在制備防治艾滋病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了去甲斑蝥素及其衍生物為活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物組合物在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了去甲斑蝥素及其衍生物與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等抗艾滋病制劑聯(lián)合給藥在治療艾滋病中的應(yīng)用。
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去甲斑蝥素及其衍生物在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)中具有明顯的抗HIV的活性，其抑制HIV復(fù)制的作用機(jī)制與現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的抗HIV作用機(jī)制不同，屬于新型抗HIV的藥物。小鼠口服或腹腔注射試驗(yàn)證明毒付作用小。
發(fā)明效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，所說(shuō)的去甲斑蝥素及其衍生物在細(xì)胞培養(yǎng)中具有抑制艾滋病病毒感染和復(fù)制的活性，且與現(xiàn)有的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑具有不同的抗艾滋病的作用機(jī)理。若制備成藥物，或與現(xiàn)有艾滋病治療藥物聯(lián)合使用，將可增添預(yù)防/治療艾滋病病毒感染的新手段，這對(duì)防治艾滋病的蔓延具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
具體實(shí)施方案下面所列實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
<實(shí)施例1>去甲斑蝥素-釹的合成(方法1)將5克順丁烯二酸酐于20ml丙酮中，溶解后向其滴加5克呋喃。加畢后回流反應(yīng)過(guò)夜，再向其加入1克氫化鈉后繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)。過(guò)濾掉丙酮并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶。然后將產(chǎn)品于30毫升無(wú)水乙醇中再加入2.6克氯化釹，于室溫下反應(yīng)15小時(shí)后收集產(chǎn)品，并用無(wú)水乙醇洗產(chǎn)品三次，得到去甲斑蝥素-釹(NdR3)。
<實(shí)施例2>去甲斑蝥素-釹的合成(方法2)將15克順丁烯二酸酐于50毫升無(wú)水乙醚中，溶解后向其滴加15克呋喃。加畢后回流反應(yīng)過(guò)夜，再過(guò)濾掉乙醚并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶，收產(chǎn)品26克。取該產(chǎn)品5克于20毫升丙酮溶液中，然后向其加入1克氫化鈉攪拌反應(yīng)過(guò)夜，分出晶體并用無(wú)水乙醚洗二次，收產(chǎn)品4.8克。將這一步得的產(chǎn)品3克于20毫升水中溶解后再向其加入2.1克氯化釹。然后于室溫下反應(yīng)16小時(shí)，蒸出大部分水后再于室溫下分離出產(chǎn)品并用乙醚洗產(chǎn)品三次，收2.3克去甲斑蝥素-釹(NdR3)。
<實(shí)施例3>目標(biāo)化合物在MT-4細(xì)胞中抑制HIV-1P24抗原活性試驗(yàn)MT-4細(xì)胞預(yù)先用100TCID50HIV-1IIIB吸附感染1.5小時(shí)，制成細(xì)胞濃度為2×105/ml的細(xì)胞懸液，接種100μl于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)分別加入100μl不同濃度的化合物，或陽(yáng)性對(duì)照藥齊多夫定(AZT)，每濃度2孔，設(shè)細(xì)胞和病毒對(duì)照組。置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于加藥96小時(shí)吸出上清液，以抗原試劑盒測(cè)定P24抗原含量，用Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)。培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞用MTT染色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm的OD570nm值，用Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)有毒濃度(CC50)。并計(jì)算治療指數(shù)(SI)，結(jié)果見表1。
表1目標(biāo)化合物對(duì)MT-4細(xì)胞毒性和在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)中抑制HIV-1P24抗原活性

結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在細(xì)胞內(nèi)具有明顯的抗HIV-1的作用。
<實(shí)施例4>目標(biāo)化合物口服或腹腔注射給藥對(duì)小鼠的毒性取昆明種小鼠，18-20g，雌雄各半，目標(biāo)化合物不同劑量灌胃或腹腔注射小鼠1次后，觀察藥物對(duì)小鼠的急性毒性，記錄小鼠死亡情況，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物的毒性很小，如表2所示。


<實(shí)施例5>目標(biāo)化合物抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性試驗(yàn)將標(biāo)定濃度的基因工程HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/51)和不同濃度藥液及含有3H-dTTP反應(yīng)緩沖液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，混合，37℃反應(yīng)30分鐘，0℃終止反應(yīng)。反應(yīng)液滴加于濾紙片上，冷三氯乙酸洗滌、乙醇脫水后烤干。液閃儀測(cè)定CPM值。同時(shí)設(shè)酶對(duì)照、陰性對(duì)照及陽(yáng)性有效藥物NVP對(duì)照，用Reed-Muench法計(jì)算IC50，結(jié)果見表3。
<實(shí)施例6>目標(biāo)化合物抑制HIV-1整合酶(IN)活性試驗(yàn)將供體底物包被COVALINK NH酶標(biāo)板加入反應(yīng)緩沖液和不同濃度藥液及標(biāo)定濃度的基因工程HIV整合酶，同時(shí)設(shè)酶對(duì)照、陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)有效的陽(yáng)性對(duì)照(S-y)，37℃反應(yīng)1小時(shí)。加入靶底物DNA，37℃反應(yīng)1小時(shí)；加入BSA(牛血清蛋白)，室溫30分鐘；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫反應(yīng)1小；加顯色底物顯色30分鐘，加0.1N NaOH終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀405nm測(cè)定OD值。用Reed-Muench法計(jì)算IC50，結(jié)果見表3。
<實(shí)施例7>目標(biāo)化合物抑制HIV-1蛋白酶(PR)活性試驗(yàn)制備優(yōu)化組合的提供水解環(huán)境的反應(yīng)混合物，在96孔培養(yǎng)板孔中加入不同濃度藥液，同時(shí)設(shè)酶對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性有效藥IND對(duì)照。于37℃反應(yīng)20分鐘后，加入HIV-1蛋白酶開始反應(yīng)。在熒光檢測(cè)儀中以355nm激發(fā)光和490nm發(fā)射光連續(xù)進(jìn)行6分鐘測(cè)定熒光讀數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算IC50，結(jié)果見表3。
表3目標(biāo)化合物抑制HIV-1復(fù)制酶活性。


權(quán)利要求
1.去甲斑蝥素(結(jié)構(gòu)式I)在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。 結(jié)構(gòu)式I
2.去甲斑蝥素金屬元素配合物(結(jié)構(gòu)式II)在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。 其中 M＝金屬元素；n＝1，2，3，4，5結(jié)構(gòu)式II
3.去甲斑蝥素金屬元素結(jié)構(gòu)如式III所示， 其中 M＝金屬元素；n＝1，2，3，4，5結(jié)構(gòu)式III其制備方法包括以下步驟(2種方法)方法1將順丁烯二酸酐于丙酮中，溶解后向其滴加呋喃，加畢后回流反應(yīng)，再向其加入氫化鈉繼續(xù)反應(yīng)，過(guò)濾掉丙酮并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶，然后將產(chǎn)品于無(wú)水乙醇中再加入金屬化合物，于室溫下反應(yīng)后收集產(chǎn)品，并用無(wú)水乙醇洗產(chǎn)品，收產(chǎn)品去甲斑蝥素-金屬元素；方法2將順丁烯二酸酐于無(wú)水乙醚中，溶解后向其滴加呋喃，加畢后回流反應(yīng)，再過(guò)濾掉乙醚并用無(wú)水乙醚洗結(jié)晶，收產(chǎn)品；取該產(chǎn)品于丙酮溶液中，然后向其加入氫化鈉攪拌反應(yīng)，分出晶體并用無(wú)水乙醚洗二次，收產(chǎn)品；將這一步所得產(chǎn)品于水中溶解后再向其加入金屬化合物，然后反應(yīng)，蒸出大部分水后再分離出產(chǎn)品并用乙醚洗產(chǎn)品，獲得去甲斑蝥素-金屬元素。
4.權(quán)利要求3所說(shuō)去甲斑蝥素—金屬元素在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述化合物為活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物組合物在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述化合物為活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物組合物在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述化合物為活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物組合物在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述化合物與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等抗艾滋病藥物聯(lián)用在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述化合物與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等抗艾滋病藥物聯(lián)用在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3所述化合物與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等抗艾滋病藥物聯(lián)用在制備預(yù)防和治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及去甲斑蝥素及其衍生物的新用途，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，所說(shuō)化合物對(duì)艾滋病病毒有顯著的抑制作用，毒性小，與現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制藥物、蛋白酶抑制藥物具有不同的作用機(jī)制，有望開發(fā)成為臨床有效的新型防治艾滋病新藥。
文檔編號(hào)A61P31/18GK101019861SQ20071008715
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日
發(fā)明者武德柱, 彭宗根, 陳鴻珊 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所