專利名稱：：假性感染性黃病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學，病毒學和免疫學領(lǐng)域。一般而言，本發(fā)明公開了屬于黃病毒科的復制缺陷病毒的構(gòu)建和它們作為疫苗在預防由屬于該科的病毒引起的疾病中的用途。更特別地，本發(fā)明提供了復制缺陷黃病毒或假性感染性黃病毒(PIVakaRepliVAX)并公開了其作為針對黃病毒相關(guān)疾病的預防性疫苗的用途。相關(guān)領(lǐng)域的描述黃病毒科的黃病毒屬包含了多種重要的人和動物病原體，并且基于免疫學測試中的反應性差異分類為四種不同的抗原復合物。通常，黃病毒在禽類或哺乳動物擴增宿主和蚊子或蜱(tick)載體之間循環(huán)。黃病毒基因組是缺少3'端聚(A)序列的陽性極性的單鏈戴帽的RNA。它編碼單個多肽，所述單個多肽在翻譯時或翻譯后加工為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，C、prM/M和E,形成病毒顆粒，和病毒基因組復制和包裝為感染性病毒體所需要的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5(Chambers,1990)。病毒體(virions)包含病毒基因組RNA的單個拷貝，所述病毒基因組RNA包裝為含C蛋白的核殼，被具有M和E蛋白的異源二聚體的脂質(zhì)體被膜包圍。與許多其它被膜病毒相比，核殼和被膜刺突之間的反應不是非常特異性的，并且含M/E^f皮膜可在源于異源黃病毒的核殼周圍有效形成，證實了衣殼序列的有限水平的同源性(Lorenz,2002)?；蛘撸跊]有C的情況下prM和E的表達可導致形成亞病毒顆粒(SVPs),其不包含RNA或C蛋白(Mason,1991)。生產(chǎn)亞病毒顆粒的prM/M-E盒已成為本領(lǐng)域已知的幾種疫苗候選物的基礎。這些疫苗候選物包括亞基(Konishi,1992;2001;2002;Qiao,2004),DNA(Phillpotts,1996;Kochel,1997;Schmaljohn,1997;Colombage,1998;Aberle,1999;Konishi,2000;Konishi,2000;Kochel,2000;Davis,2001),活載體(Mason,1991;Konishi,1992;Pincus,1992;Fonseca,1994;Pugachev,1995;Colombage,1998;Kanesa,2000;Minke,2004)疫苗。但是，這些疫苗具有嚴重的缺點。例如，亞基疫苗是使用安全的，但難以大量生產(chǎn)；DNA疫苗免疫原性很弱，病毒載體疫苗在存在載體免疫性時缺乏效價。因此，盡管人們非常關(guān)注黃病毒相關(guān)疾病和黃病毒持續(xù)擴散到新領(lǐng)域，對于這些感染仍然沒有開發(fā)出抗病毒治療劑，并且至今只生產(chǎn)出了非常有限量的批準疫苗。失活病毒疫苗(INVs)已被批準用于防止蜱傳腦炎(TBEV)和日本腦炎(JEV)。然而，像其它失活病毒疫苗一樣，這些疫苗具有低的有限的效價并且需要多次疫苗接種。盡管有這些缺陷，日本腦炎和蜱傳腦炎INVs具有好的安全性記錄的優(yōu)點。唯一批準的針對黃病毒的活減毒疫苗(LAV)是廣泛應用的基于黃熱病病毒(YFV)17D株的活減毒疫苗，所述黃熱病病毒17D抹是通過黃熱病病毒的野生型Asibi抹在雞胚組織中連續(xù)傳代而發(fā)展出的。盡管這種活減毒疫苗被認為是非常安全和有效的，接種者中黃熱病的例子還是有報導，包括最近在美國新兵招募中的出現(xiàn)的例子(Gerasimon,2005)。而且，這種疫苗不推薦用于嬰兒、孕婦和免疫受損的個體中，因為有副反應，包括疫苗相關(guān)腦炎。然而，黃病毒反向遺傳學系統(tǒng)的發(fā)展已經(jīng)引起了基于這些病毒的合理減毒的新型活減毒疫苗的生產(chǎn)和設計。這種新型的疫苗包括基于黃熱病病毒17D的嵌合體，其中黃熱病病毒prM-E-編碼基因組片段盒已被源于異源黃病毒的prM-E-盒取代(Chambers,1999)。類似的基于嵌合病毒的方法應用于基于登革熱和TBE的骨架(Pletnev,2002;Huang,2003)。在大多數(shù)例子中，嵌合黃病毒證實為高度減毒的表型并且能夠引起有效的保護性免疫反應并且在病毒感染之后進行保護，所述病毒的結(jié)構(gòu)蛋白^L嵌合體表達(Monath,2002)。這些嵌合疫苗候選物的有效免疫接種沒有顯示出被預先存在的"載體"免疫性預防(Monath,2002),其干擾基于其它病毒載體的重組病毒疫苗的效價。而且，盡管嵌合黃病毒可能提供了相當普遍的生產(chǎn)新疫苗的方法，仍然存在關(guān)于嵌合體自身可能至少在免疫受損個體中是致病性的考慮(Chambers,1999)，或存在可能會產(chǎn)生致病性嵌合體的考慮，因為在這些病毒的繁殖過程中已經(jīng)檢測到突變(Pugachev,2004)。另一種在疫苗開發(fā)中有前途的方向是基于在黃病毒基因組中產(chǎn)生不可修復的缺失，其使得被免疫宿主中的生產(chǎn)性病毒復制效率更低或成為不可能事件。在后一個情形中，編碼整個復制性機構(gòu)但缺少例如C-編碼區(qū)的病毒基因組可為體內(nèi)免疫而被遞送，其作為能夠自我復制的體外合成的RNA(Kofler,2004;Aberle,2005)，或可能地，以在RNA聚合酶II啟動子的控制下的DNA形式或作為體外合成的RNA,并且其能夠自我復制(Kofler，2004;Aberle,2005)。用體外合成的缺陷性RNA基因組的直接免疫(其明確了在不存在完整病毒復制循環(huán)時SVPs的生產(chǎn))，已被證明在產(chǎn)生保護性免疫性中是安全和有效的(Kofler,2004;Aberle,2005)。但是，因為合成、穩(wěn)定性和遞送的問題，在生產(chǎn)基于RNA的疫苗候選物時可能存在顯著的障礙。因而，現(xiàn)有技術(shù)對于可用于針對由屬于黃病毒科的病毒感染引起的疾病的安全、有力和有效類型的疫苗是有缺陷的。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域長期以來的需求和期望。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了黃病毒科的復制缺陷4叚性感染性病毒。所述復制缺陷假性感染性病毒包含編碼衣殼(C)蛋白的核普酸序列中的缺失，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列；prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信號序列，或其組合，所述復制缺陷假性感染性病毒僅僅在表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞中復制。在本發(fā)明的另一相關(guān)實施方式中，提供了有效表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使上述黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒能夠在適當條件下繁殖。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了生產(chǎn)上述黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的方法。所述方法包括產(chǎn)生黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣殼基因中的缺失，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列，prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信號序列，或其組合；產(chǎn)生表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞系，所述細胞系提供高水平的黃病毒蛋白，所述蛋白為黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的繁殖所需要；并且用黃病毒科的假性感染性病毒感染細胞系，從而生產(chǎn)黃病毒科復制缺陷假性感染性病毒。在本發(fā)明的另一相關(guān)實施方式中，提供了藥物組合物，其包含由本文描述的方法生產(chǎn)的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒。在本發(fā)明的進一步相關(guān)的實施方式中，提供了保護受試者免受由暴露于黃病毒引起的感染的方法。所述方法包括給予受試者免疫有效量的由本文描述的方法生產(chǎn)的藥物組合物，其在受試者中引起針對黃病毒的免疫反應，從而保護受試者免受感染。附圖簡述圖1是在生產(chǎn)C或用于缺陷的反式互補的所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細胞中黃病毒PIV復制的圖示。PIVs在正常細胞中體內(nèi)或體外的復制導致不具有核殼的SVPs的釋放。圖2A-2C顯示表達YFVC以及YFVC、prM和E的細胞系可補助YFPIV復制。圖2A是表達YFV和GFP的YFPIV基因組的圖示。圖2B是表達具有prM信號肽的Pac基因和YFVC(錨定的C;VEErep/Cl/Pac)，或具有20a.a.的prM的錨定的C(VEErep/C2/Pac),或所有YFV結(jié)構(gòu)蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)的VEEV復制子的圖示。圖2C顯示了YFPIV被用體外合成的PIV基因組轉(zhuǎn)染的細胞系的釋放。在顯示的時間點替換培養(yǎng)基，測定PIVs滴度。箭頭顯示了細胞以1:5的比例更替繼代接種的時間點。圖3A-3B顯示了在包裝細胞系上的YFPIV的生長曲線。用顯示的每細胞感染單位MOIs的YFPIV感染包含VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac復制子的BHK-21細胞。在顯示的時間時，培養(yǎng)基被替換并且確定釋放的PIV的滴度。箭頭顯示了當細胞以l:5的比例更替繼代接種時的時間點。圖3A顯示了在M0110inf.u/細胞時的生長曲線并且圖3B顯示了在M010.1inf.u/細月包時的生長曲線。圖4A-4C顯示了表達密碼子優(yōu)化的C基因的細胞生產(chǎn)的YFPIV。圖4A顯示了合成基因的核苷酸序列。引入的突變通過小寫字母表示(SEQIDNO:l)。圖4B顯示了在包裝細胞系上的YFPIV的生長曲線。用顯示的每細胞感染單位MOIs的YFPIV感染包含VEErep/C2/Pac、VEErep/C-prM-E/Pac、VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac復制子的BHK-21細胞。在顯示的時間替換培養(yǎng)基并確定釋放的PIV滴度。圖4C顯示了在37°C接種4天后YFV和YFPIV在包含VEErep/C2opt/Pac的細胞系中發(fā)展的噬菌斑。圖5A-5C顯示了WNPIV在包裝細胞中發(fā)展了彌漫性感染。圖5A是WNPIV基因組和表達WNV結(jié)構(gòu)基因的VEEV復制子的圖示。圖5B顯示了接種70小時后WNPIV生產(chǎn)WNV抗原陽性細^^的集落(用NS1抗體-針對BHK(VEErep/C氣E、Pac)細胞感染顯示)。圖5C顯示了相同的WNPIV制劑針對Vero細胞單層感染僅僅生產(chǎn)單獨感染細胞(在感染之后70小時用與圖5B使用的相同黃芪膠染色方法顯示)。圖6A-6C顯示對于從用YF和WNPIVs感染的細胞釋放的E蛋白的檢測。在圖6A中，用5inf.u/細胞MOI的YFPIV感染BHK-21細胞。釋放的SVPs;故收獲并通過超速離心而純化。樣品通過SDSPAGE溶解，轉(zhuǎn)移到濾器，通過D1-4G2MAB檢測E蛋白。第一道，從未感染細胞收獲的培養(yǎng)基；第二道，感染48小時后從用YFPIV感染的細胞中收獲的培養(yǎng)基；第三道，感染72小時后從用YFPIVs感染的細胞中收獲的培養(yǎng)基；第四道，YFV(2X107PFU)。圖6B中，用WNPIV感染vero細月包24小時,并且然后澄清培養(yǎng)液(在檢測任何細胞裂解之前收集)的部分，通過SDSPAGE溶解，轉(zhuǎn)移到濾器，并與E-特異性MAB反應(7H2;Bioreliance)。相同樣品與多克隆血清的反應沒有顯示在這種制劑中的任何細胞相關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白(結(jié)果未顯示)，確認了E蛋白^L活3夭地分泌。第一道，WNV樣品；第二道，從未感染細胞中收獲的培養(yǎng)基；第三道，感染48小時后從用WNPIV感染的細胞中收獲的培養(yǎng)基。在圖6C中，western印跡顯示了獲自用YFVPIVRNA電穿孔的正常(非包裝)BHK細胞的SVPs的蔗糖密度梯度中制備的部分的E蛋白成分。E蛋白反應的峰(在32%蔗糖時)相應于SVPs密度，并與這種事實一致，比在并行分析(42%)中運行的YFV遷移得更慢。圖7A-7F顯示了用于黃熱病(YF)和西尼羅河(WN)假性感染性病毒(PIV)生產(chǎn)的質(zhì)粒的圖示。圖7A顯示pYFPIV,圖7B顯示pWNPIV,圖7C顯示pVEErep/Cl/Pac,圖7D顯示pVEErep/C2/Pac，圖7E顯示pVEErep/C3/Pac,圖7F顯示pVEErep/C*-E*-Pac。圖8A-8V顯示本文使用的質(zhì)粒的序列。圖8A-8D顯示pYFPIV的序列(SEQIDNO:6)，圖8E-8H顯示pVEErep/Cl/Pac的序列(SEQIDNO:7)，圖8I-8K顯示pVEErep/C2/Pac的序列(SEQIDNO:8)，圖8L-80顯示pVEErep/C陽prM畫E/Pac的序列(SEQIDNO:9),圖8P-8R顯示pVEErep/C2opt/pac的序列(SEQIDNO:10)，圖8S-8V顯示pVEErep/C叩t-prM-E/Pac的序列(SEQIDNO:11)。圖9顯示用于反式(intrans)提供C的RepliVAX和VEE的重疊區(qū)域的圖示。1三十六種突變被插入VEErep/pac-Ubi-C*以最小化與RepliVAX基因組編碼的C片l殳的同源重組。25，和3，CS序列在RepliVAX基因組中的位置。圖10顯示了在第0代(從電穿孔開始)和第10代通過WNRepliVAX在C-表達細胞系(BHK(VEErep/Pac-Ubi-C")中生產(chǎn)的感染性集落的并行(sidebyside)的比較，顯示出更好生長的變體被容易地選擇出。圖11顯示在包含C-表達盒(VEErep/Pac-Ubi-C"的WHO-檢定(certified)的Vero細胞中生產(chǎn)的RepliVAXPIV的滴定。盡管產(chǎn)生的PIV比在BHK細胞中生產(chǎn)的滴度稍低，Vero細胞使高滴度PIV的收獲成倍增加，這對于BHK細胞是不可能的。圖12A-12B顯示了環(huán)化突變體。圖12A顯示具有單石咸基，匹配的CS突變的WNV/IRES-RLuc復制子的復制顯示一些單堿基突變以WT水平復制。圖的左邊部分顯示了在5'和3'CS序列之上的測試基因組。右邊顯示了利用Rluc報告基因檢測的復制水平，以WT復制水平的百分比表示。下劃線堿基表示突變的堿基。圖12B顯示源于通過組合ml0和ml3(圖A)的具有匹配雙堿基改變(ml7)的WNV/IRES-RLuc復制子的復制，與以每種可能的模式組合WT和突變的CS的突變體，以及設計為產(chǎn)生非活性聚合酶(陰性對照)的突變體檢測的復制水平相比較。圖的左邊部分顯示了在5'和3'CS序列之上的測試基因組。右邊顯示了利用Rluc報告基因檢測的復制水平，以WT復制水平百分比表示。下劃線堿基表示突變的堿基。*表示沒有檢測到復制。發(fā)明詳述人們僅僅為少數(shù)由黃病毒引起的疾病生產(chǎn)了安全和有效的疫苗。已經(jīng)用于生產(chǎn)針對YE、JE和TBEV的疫苗的經(jīng)典的失活病毒疫苗(INV)和活減毒疫苗(LAV)方法仍然沒有產(chǎn)生許可的產(chǎn)品以預防由其它黃病毒引起的疾病，特別是登革熱和西尼羅河腦炎(WNE)。對于現(xiàn)有的LAVs(殘余毒力和毒力逆轉(zhuǎn))和INV產(chǎn)品(由于抗原負荷和偶發(fā)抗原的反應原性)存在安全性考慮。另外，INVs通常需要多次接種。而且，對兩種類型的疫苗都有生產(chǎn)上的考慮，包括需要避免在活減毒疫苗的繁殖過程中的毒力逆轉(zhuǎn)，原因是生產(chǎn)對于失活病毒疫苗產(chǎn)品的強免疫反應需要的大量物質(zhì)，和對繁殖用于生產(chǎn)INV產(chǎn)品的毒性病毒的高水平保存設施(highcontainmentfacilities)的需要。盡管存在對于新型黃病毒疫苗的有前途的候選物，它們的發(fā)展將需要克服這些問題。本發(fā)明一般而言涉及屬于黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的構(gòu)建和利用。在這點上，本發(fā)明描述了結(jié)合了失活疫苗的安全性和活減毒疫苗的效率和可規(guī)模化能力的新型復制缺陷黃病毒，其也被稱為RepliVAX。本發(fā)明中也稱為假性感染性病毒(PIVs)的這些黃病毒包含基因工程化的黃病毒基因組，其具有大部分衣殼-編碼區(qū)域的缺失，從而防止該基因組在正常細胞系或接種了疫苗的動物中產(chǎn)生感染性子代。但是，這些假性感染性病毒可在表達C,或C-prM-E盒的細胞系中繁殖，其中它們高水平復制。因此，由于缺少C蛋白的反式互補，這些假性感染性黃病毒不能在正常動物中體內(nèi)或體外發(fā)展出彌漫性感染，并且因此不能在動物中產(chǎn)生疾病。與本領(lǐng)域已知的疫苗和生產(chǎn)這些疫苗的方法相反，本發(fā)明提供了假性感染性黃病毒的產(chǎn)業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)系統(tǒng)，其將使得所述疫苗比失活疫苗更廉價地生產(chǎn)，同時比活減毒疫苗的利用更安全。通過提供新型重組疫苗達到這些目的，所述新型重組疫苗能夠在被免疫動物和人中僅僅單輪復制，導致釋放缺少遺傳物質(zhì)但是作為有效免疫原的亞病毒顆粒(SVPs)。本發(fā)明已經(jīng)證明假性感染性黃病毒可對于黃病毒(YFV)和西尼羅河病毒(WNV)生產(chǎn)?；诖?，本發(fā)明預料本文描述的方法可廣泛的應用于對抗其它黃病毒的疫苗的發(fā)展。而且，用所述假性感染性黃病毒的正常細胞系的感染產(chǎn)生缺少核殼和遺傳物質(zhì)的SVPs。本文描述的假性感染性黃病毒證明不能引起任何疾病，因而是安全的。另夕卜，由于單輪復制和SVPs釋放的能力，這些假性感染性黃病毒在小鼠中是免疫原性的，呈遞病毒抗原。WNPIVs也保護小鼠免受WNV攻擊之后的致死腦炎。本文描述的PIVs可以允許在細胞培養(yǎng)物中高產(chǎn)量生產(chǎn)的方式生產(chǎn)，并且不能引起動物中的疾病。這些產(chǎn)品可遞送給動物，在動物中它們的缺陷性復制過程預防了傳播和疾病，但允許SVPs,黃病毒亞基免疫原的產(chǎn)生，所述黃病毒亞基免疫原已經(jīng)顯示對于引起針對由幾種黃病毒導致的疾病的有效免疫反應是有效的。本發(fā)明還證實了假性感染性黃病毒途徑可應用于兩種聯(lián)系4艮遠的蚊媒黃病毒。用于蜱媒黃病毒(Kofler,2004)的基于RNA的疫苗發(fā)展的類似技術(shù)的適用性顯示了基于PIV的技術(shù)將適用于聯(lián)系更遠的黃病毒。另外，利用基于TBEVRNA的疫苗的工作顯示了除了對于SVPs的抗體反應之外(類似于本文描述的)，具有復制活性的黃病毒基因組導入接種疫苗的宿主的細胞將也產(chǎn)生T細胞反應(Kofler,2004;Aberle,2005)。雖然T細胞反應在本文中沒有測量，預測PIVs能夠誘導模擬由病毒感染產(chǎn)生的T細胞反應。雖然本文描述的PIV疫苗依賴于為TBEV制備的基于RNA的疫苗利用的相同黃病毒復制和SVP生產(chǎn)策略(Kofler,2004;Aberle,2005),這些PIV疫苗不需要基因槍傳遞給動物，可在細胞培養(yǎng)物中容易地生長，并且可遭受與目前應用于商業(yè)上生產(chǎn)的YFV17D疫苗的相同類型的穩(wěn)定化和儲存(凍干)條件，因而提供了一種可規(guī)?；蓛Υ?，并且可市場化的疫苗產(chǎn)品。對于WNRepliVAX的穩(wěn)定性的測的滴度損失。為發(fā)展假性感染性黃病毒的有效反式互補(并且因此生產(chǎn)該病毒)所需要的高水平生長條件，本發(fā)明利用了表達來自VEEV復制子的高水平的c(或C-prM-E)的細胞。VEEV復制子比源于其它曱病毒屬的復制子是較少引起細胞病變的，并且在脊推動物和昆蟲來源的一些細胞系中容易地建立起持久的復制。這種系統(tǒng)對于假性感染性黃病毒的生產(chǎn)看來是適合的，因為i)VEEV復制子在異源蛋白的合成，和在本發(fā)明中合成的C合成到黃病毒基因組去衣殼化所需要水平中是高效的。ii)VEEV復制子不會可檢測地干擾黃病毒復制(Petrakova,2005)。而且，VEE復制子和YFPIV基因組可在BHK-21細胞中一起復制，而不導致CPE。iii)VEEV復制子可以高滴度包裝成VEE病毒體，所述病毒體可被用于快速建立生產(chǎn)黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細胞系。而且，C表達的前后對PIV生產(chǎn)的效果的監(jiān)測顯示表達錨定形式的C以及另外20a.a.的prM的包裝細胞比單獨表達錨定C的細胞產(chǎn)生更多的顆粒，暗示病毒體形成中處理事件的正確順序的重要性。被包含prM的起始20個氨基酸的構(gòu)建體增強的包裝效率的基礎是不清楚的，但是這種現(xiàn)象可通過兩個鄰近剪切位點(NS2B/NS3-和信號肽特異)(Yamshchikov和Compans,1994)的特定剪切順序的需要和/或C蛋白產(chǎn)品在這兩種不同的環(huán)境中的分配/穩(wěn)定性的差異而解釋。另外，觀察到C與prM和E(VEErep/C-prM-E/Pac)的共表達僅僅導致相對于VEErep/C2/Pac的PIV產(chǎn)量的微小增加，所述VEErep/C2/Pac表達錨定C與prM片段。當檢查VEEV復制子-編碼C基因的密碼子最優(yōu)化以確定C基因序列的改變是否增加PIV的產(chǎn)量時，沒有顯示出在YFVPIV釋放上與不表達密碼子最優(yōu)化的C基因的細胞有很大的差別。這種觀察暗示了甚至利用沒有最優(yōu)化基因的VEEV復制子顯示出產(chǎn)生飽和水平的C。這些結(jié)果與其它研究是一致的，所述其它研究證實了表達編碼WNVC-E盒的VEEV復制子產(chǎn)生比在WNV感染細胞中監(jiān)測到的更高的E水平。盡管最優(yōu)化C基因的轉(zhuǎn)表達不能提高YFPIV的產(chǎn)量，包含表達Copt的VEEV復制子的細胞當用YFPIV感染時發(fā)展了CPE并且產(chǎn)生了噬菌斑。這使得在Copt細胞中PIV的感染更類似于通過有復制能力的的病毒發(fā)展的感染。利用編碼YFVCopt基因的VEEV復制子在假性感染性黃病毒生產(chǎn)中的用途的另外優(yōu)點是安全水平，因為密碼子的改變降低了與假性感染性黃病毒基因組的同源重組的機會。而且，C叩t基因還可在其環(huán)化序列中被改變(本文為BHK(VEErep/C、E、Pac)細胞的WNVC編碼區(qū)所述的)，以降低產(chǎn)生一種復制活性C-編碼黃病毒的重組機會。到目前為止，本文描述的WN或YFPIV系統(tǒng)都沒有產(chǎn)生可在細胞培養(yǎng)物或在高度易感染動物中檢測的復制活性的黃病毒。另外，體內(nèi)實騶r證實YF和WNPIVs都是安全的，并且甚至在用高劑量的PIVsi.c.接種3到4天齡小鼠之后不會導致任何疾病。然而，WNPIVs能夠誘導高水平的中和抗體并且保護小鼠免受有復制能力的WNV的感染。而且，丙型肝炎與AIDS歸類為目前沒有獲得疫苗的致病性和致死性的主要感染性原因。在日本和韓國，HCV現(xiàn)在對肝細胞癌癥的發(fā)展的作用超過了乙肝，肝細胞癌癥是一種最普遍類型的癌癥和一種歸因于肝疾病的普遍死亡才莫式。這種方式在其它亞洲國家和其它發(fā)展中國家很可能變得越來越普遍，這歸因于越來越流行的HCV以及對乙肝的有效免疫。在埃及和其它國家的一些社區(qū)中，丙肝感染的流行驚人的高J艮可能至少部分歸因于傳統(tǒng)衛(wèi)生保健實踐和/或過去危險的西方技術(shù)的引入(例如在對血吸蟲病的公共健康運動中病毒的以針為媒介的傳播)。在許多發(fā)展中國家，肝癌和硬化的比例很高，在輸血過程中;[艮少有有效的丙肝的控制。丙肝也是美國的主要公共健康問題，有大約4百萬HCV攜帶者，許多由于肝病或肝癌的晚期面臨著死亡的威脅。目前估計在美國每年有8000到10000個由于丙肝的死亡。在沒有新的治療劑或預防性方法的情況下，這一數(shù)字很可能在接下來的10-20年中增至三倍，潛在地超過由于AIDS的死亡數(shù)。然而，沒有預防這種感染的疫苗，由于可以理解的技術(shù)困難、大藥廠對開發(fā)疫苗通常缺少興趣，和主要基金機構(gòu)的慣性，發(fā)展疫苗的努力(國內(nèi)和國際)嚴重地受限。并且，由于有許多感染性疾病，面臨歸因于丙肝的嚴重肝疾病或死亡的很大風險的人是弱勢的。到目前為止，產(chǎn)生抗HCV感染的有效疫苗的努力是不成功的。然而，在最近幾年內(nèi)，HCV領(lǐng)域開始迅速發(fā)展，并且現(xiàn)在這種病毒在組織培養(yǎng)物中復制到相當高的滴度，到達106inf.u/ml。在HCV基因組和其它黃病毒，如YF,JEV,TBE和其它的基因組之間有明顯的相似。因此，設計復制缺陷黃病毒的策略可不僅應用于黃病毒屬的成員，而且也可應用于肝病毒(Z/e/^c^n^)屬(其包括HCV)。HCV衣殼蛋白可通過在許多細胞系中的重組曱病毒復制子(基于SINV，VEEVEEEV和其它)生產(chǎn)，所述細胞系包括目前已知對于HCV感染易感的Huh-7和Huh-7.5細胞。復制缺陷HCV基因組，缺少衣殼基因，可被轉(zhuǎn)染入衣殼生產(chǎn)細胞系并且將被包裝成感染性含衣殼的顆粒。大規(guī)才莫生產(chǎn)需要的連續(xù)輪感染也可在這些細胞上進行。然而，在體內(nèi)，在原初肝細胞中(以及可能其它細胞類型)，缺乏全衣殼基因或根本沒有衣殼基因的HCV基因組將僅僅產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)病毒蛋白和糖蛋白El和E2。這些蛋白將被呈遞給免疫系統(tǒng)i)在蛋白酶體降解之后；ii)在細胞表面上和iii)以具有含E1和E2一皮膜的病毒樣顆粒的形式。衣殼缺陷將使得病毒不能夠擴散，并且因而限制被免疫接種感染的細胞。概括而言，本發(fā)明證實了衣殼缺陷性假性感染性黃病毒i)可在表達衣殼或所有黃病毒結(jié)構(gòu)基因的細胞系中產(chǎn)生一種彌漫性感染；ii)PIVs不能在正常細胞中產(chǎn)生彌漫性感染，iii)當PIVs感染正常細胞時，PIVs產(chǎn)生含SVPs的E蛋白；iv)PIVs在動物中顯示了高水平的安全性；v)PIVs保護小鼠免受隨后的黃病毒感染。總的來說，本發(fā)明證實了黃病毒PIVs可能是一種對于抗黃病毒感染和類似于黃病毒的病毒引起的感染的疫苗的發(fā)展安全，有力，并且有效的平臺。本發(fā)明涉及復制缺陷假性感染性黃病毒科，包含在編碼衣殼(C)的RNA序列，prM/M的正確成熟所需要的prM蛋白的信號序列，或其組合，所述黃病毒科僅僅在表達黃病毒科病毒的C蛋白或C，prM,被膜蛋白，突變C蛋白，突變prM,突變被膜蛋白或其重組體的細胞中復制。一般而言，黃病毒科包含屬于黃病毒屬、肝病毒屬或瘟病毒屬(Pestivims)的病毒，或通過將其它病毒的prM-E盒與假性感染性黃病毒科的prM-E盒交換而產(chǎn)生的所述病毒的其它嵌合體。屬于黃病16毒屬的病毒的例子不限于但可包括黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、圣路易(SaintLouis)腦炎病毒、日本腦炎病毒、墨累谷(MurrayValley)腦炎病毒。而且，屬于肝病毒屬的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且屬于瘟病毒屬的病毒包括但不限于牛病毒寸生腹瑪病毒(Bovinevirusdiarrhea)、豬痘病毒(swinefevervirus)或豬霍亂病毒(hogcholeravirus)。在黃病毒的例子中，缺失的編碼黃病毒C蛋白的核苷酸序列可編碼氨基酸26到100或C蛋白的氨基酸26到100之內(nèi)的氨基酸組合。所述組合可包括^旦不限于氨基酸26-93,31-100或31-93。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用相同的準則從屬于黃病毒科的其它病毒或具有與這些病毒相同的基因結(jié)構(gòu)的其它病毒刪除C蛋白的核普酸序列。通常并且可適用于所有這些病毒的是，缺失的基因被編碼標記蛋白或抗原的基因取代。標記蛋白的例子可包括但不限于綠色熒光蛋白。本發(fā)明還涉及表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、帔膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)對于保證上述復制缺陷黃病毒科在適當條件下繁殖是有效的。為此目的，表達黃病毒科野生型或突變蛋白的細胞可利用基因工程化的源于病毒載體的復制子而產(chǎn)生。一般而言，復制子中編碼黃病毒科病毒的蛋白的基因被密碼子最優(yōu)化型的編碼病毒蛋白的基因取代，使得所述取代降低細胞系編碼基因與黃病毒科的假性感染性病毒的基因組重組的能力和/或提高黃病毒科假性感染性病毒的生產(chǎn)。例如，所述復制子可表達包含在編碼黃病毒科病毒的C蛋白的基因的至少36個核苷酸位點的突變的C蛋白。復制子可表達復制子中的C蛋白，所述C蛋白包含非天然環(huán)化序列使得環(huán)化序列的存在降低復制缺陷假性感染性病毒與天然病毒的生產(chǎn)性重組的機會。而且，復制子可表達蛋白，所述蛋白包含編碼截短的C-prM連接的改變的核苷酸序列，在體內(nèi)提高含prM/E的SVP的產(chǎn)量，或其組合，所述改變的序列的存在提高細胞培養(yǎng)物中復制缺陷z假性感染性病毒的產(chǎn)量。而且，通過利用體外合成的復制子RNAs轉(zhuǎn)染，通過用設計為從細胞RNA-聚合酶II-特異性啟動子合成功能性甲病毒復制子的質(zhì)粒DNAs轉(zhuǎn)染，或通過利用包裝在曱病毒結(jié)構(gòu)蛋白之內(nèi)的曱病毒復制子感染，將表達黃病毒科蛋白的復制子引入細胞中。本文使用的病毒載體可以是甲病毒。所述曱病毒的代表性例子包括但不限于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VenezuelanEquineEncephalitisVirus)(VEEV),辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)，東方馬腦炎病毒(EasternEquineEncephalitisvims)(EEEV)，西方馬腦炎病毒(WesternEquineEncephalitisvirus)(WEEV)或羅斯河病毒(RossRivervirus)。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的方法，包含產(chǎn)生黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣殼基因中的缺失，prM/M的正確成熟所需要的prM蛋白的信號序列，或其組合，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列；產(chǎn)生表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、；故膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞系，所述細胞系提供黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒繁殖所需要的高水平蛋白；和用黃病毒科的假性感染性病毒感染細胞系，因而產(chǎn)生黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒。關(guān)于病毒類型，衣殼基因缺失位點，產(chǎn)生表達黃病毒科的突變和野生型蛋白的細胞系的方法，復制子類型和復制子中的突變和編碼復制子中黃病毒科突變和野生型蛋白的基因的修飾的所有其它方面都與上面討論的相同。本發(fā)明還涉及包含通過上述方法生產(chǎn)的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的藥物組合物。本發(fā)明進一步涉及保護受試者免受由于暴露于黃病毒科導致的感染的方法，包含給予受試者免疫有效量的本文所述的藥物組合物，所述組合物在受試者中引起抗黃病毒科的免疫反應，因而保護受試者免受感染。所述組合物可通過腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服或鼻內(nèi)途徑給藥。而且，受益于所述組合物的使用的受試者可以是人，或動物。如本文所用的，術(shù)語"一種(a或an)"可表示一種或多種。如本文在權(quán)利要求所用的，當與"包含"聯(lián)用時，"一種"可表示一種或多于一種。如本文所用的，"另一種"或"其它"可表示至少第二或更多種與其相同或不同的要求的成分或組分。如本文所用的，術(shù)語"黃病毒矛ip'包4舌黃病毒、肝病毒、瘕病毒屬。屬于黃病毒屬的病毒的例子包括但不限于黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、日本腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒，類似的，屬于肝病毒屬的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且屬于瘟病毒屬的例子包括但不限于牛病毒性腹瀉病毒(Bovinevirusdiarrhea)、豬痘病毒(swinefevervirus)或豬霍亂病毒(hogcholeravirus)。而且，盡管本發(fā)明公開了屬于黃病毒屬的復制缺陷假性感染性黃病毒科病毒的構(gòu)建和用途，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用相同的準則構(gòu)建包含屬于黃病毒科的其它病毒的嵌合體，或通過置換黃病毒科或其它類似病毒之內(nèi)的病毒的prM-E盒構(gòu)建嵌合體。包含本文討論的屬于黃病毒科的假性感染性病毒的藥物組合物可彼此或與其它藥物組合物同時或序貫給藥。所述組合物共給藥的效果是為了保護個體免受由所述病毒引起的感染和其它疫苗可治療的疾病。本文所述的組合物，其它藥物組合物，或其組合可通過本領(lǐng)域的任何標準方法全身或局部獨立給藥，例如，皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部、經(jīng)腸、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、向頰地、經(jīng)陰道或通過吸入噴霧，通過藥泵或包含在透皮貼劑(patch)或植入片中。本文所述的組合物的劑量制劑可包含適于本給藥方法的傳統(tǒng)的無毒，生理或藥學可接受的載體或媒介，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的。本文所述的組合物，其它藥物組合物，或其組合，可獨立給藥一次或多次，以獲得，維持或提高治療劑效果。確定劑量或確定組合物中的每種或兩種的適當劑量是包含單個給藥劑量還是多個給藥劑量是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)的。適當?shù)膭┝恳蕾囉谑茉囌叩慕】?，對個體免受黃病毒感染的保護，給藥途徑和利用的制劑。下述實施例是為了解釋本發(fā)明的不同實施方式而給出，不意味著以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解到本發(fā)明非常適于實現(xiàn)目的并獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點，以及本發(fā)明固有的目的，結(jié)果和優(yōu)點。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到包含在如權(quán)利要求范圍所限定的本發(fā)明的精神之內(nèi)的改變和其它用途。實施例1細月包培養(yǎng)BHK國21細月包由PaulOlivo(WashingtonUniversity,St.Louis,Mo)提供。它們在37°C下保持在補充了10%胎牛血清(FBS)和維生素的a極限必需培養(yǎng)基(aMEM)中。WHO-核定的Vero細胞，最初為用于人疫苗生產(chǎn)而制備，由NIH的Dr.SteveWhitehead提供。Vero細胞保持在包含6%FBS的MEM中。實施例2質(zhì)粒構(gòu)建對于所有的質(zhì)粒構(gòu)建體使用標準重組DNA技術(shù)。使用的質(zhì)粒的圖示顯示于圖7A-7F。圖和序列顯示于圖8A-8F。在別處已經(jīng)描述了包含YFV17D抹基因組的感染性cDNA的親本低拷貝量的質(zhì)粒pACNR/FLYF-17Dx(Bredenbeeketal.,2003),所述質(zhì)粒由Dr.CharlesM.Rice提供(RockefellerUniversity,NewYork,N.Y.)。pYFPIV包含有缺陷的YFV基因組(YFPIV),其中編碼YF衣殼基因的氨基酸26-93的片段被源于pEGFP-Nl(Clontech)的密碼子最優(yōu)化的GFP基因取代。WNPIV基因組(pWNPIV)源于Texas2002感染性cDNA(Rossietal.,2005),通過融合C的密碼子30與C的密碼子101(見圖5A)。質(zhì)粒pVEErep/Cl/Pac,pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM畫E/Pac(圖2A)編碼雙亞基因組VEEV復制子，其中第一亞基因組啟動子驅(qū)動RNAs的轉(zhuǎn)錄，所述RNAs包含VEEV26SRNA的5，UTR,后面分別緊接著對應于YFV基因組的nt119-481,119-541和119-2452的序列。第二亞基因組啟動子驅(qū)動噤呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pac)基因的表達，其產(chǎn)品使細胞產(chǎn)生對由噤呤霉素(Pur)引起的翻譯阻滯的抗性。表達與Pac基因融合的WNV的C-prM-E盒(源于Sindbis病毒復制子(Scholleetal.,2004))的非細胞致病性VEEV復制子(命名為pVEErep/C、E、Pac)從VEE非細胞致病性復制子中(Petrakovaetal.,2005)產(chǎn)生；E-編碼序列與Pac基因通過連接體融合，所述連接體由NS1的起始9密碼子和NS2B的最后25密碼子，緊接著與直接融合于FMDV2A的NS3的2密碼子組成(見圖5A)。編碼YFV17D衣殼的密碼子和prM的起始20氨基酸的最優(yōu)化序列利用別處描述的密碼子頻率數(shù)據(jù)設計(Haasetal.,1996)。這種基因通過PCR從重疊人工寡核苷酸中合成。擴增的片段在克隆入表達盒VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac之前被測序。后一個復制子具有與pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM-E/Pac基本上相同的設計，但包含圖4A所示的密碼子最優(yōu)化的序列。另外，還產(chǎn)生了表達JEVprM-E的嵌合WN-RepliVAX。這通過取代編碼WNV基因組的ARepliVAX中的JEV的Nakayama株的prM和E基因而構(gòu)建?；蚪粨Q是通過將截短的WNVC蛋白的最后密碼子與JEV的prM編碼序列的起始密碼子(Nakayama株)直接融合而獲得。相同的融合策略應用于盒的3'末端，JEVE蛋白的最后密碼子與WNV的NS1的起始密碼子直接融合。這些融合被引入編碼結(jié)合了T7啟動子和核酶的全WNRepliVAXcDNA的BAC質(zhì)粒，并且從這種BACDNA回收的RNA被引入BHK(VEErep/Pac-Ubi-C承)細胞。產(chǎn)生成彌漫性感染性集落(foci)。對于WNRepliVAX,形成于這種細胞系上的集落比通過完全感染性WNV-JEV嵌合體產(chǎn)生的小。JERepliVAX生長到比WNRepliVAX低大約10倍的滴度，獲得在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C"中超過106U/ml的滴度。如所期望的，JERepliVAX與JE-特異性Mabs反應，并且期望類似的嵌合黃病毒，JERepliVAX將誘導高水平的JEV-中和抗體，并產(chǎn)生抗JE保護。實施例3RNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒通過在CsCl梯度中離心而純化。在轉(zhuǎn)錄反應之前，質(zhì)粒通過Xhol(用于pYFPIV)或Mhul(用于VEE復制子和VEE輔助編碼質(zhì)粒)或5V"I(用于pWNPIV)線性化。RNAs在帽子類似物的存在下通過SP6或T7RNA聚合酶合成。轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量和完整性在非變性條件下通過凝膠電泳而分析。轉(zhuǎn)錄反應的等分試樣用于電穿孔而不用另外純化。實施例4RNA轉(zhuǎn)染和PIV復制分析BHK-21細胞的電穿孔在前述條件下進行(Liljestrometal.,1991)。為建立包裝的細胞培養(yǎng)物，VEEV復制子電穿孔24小時后將Pur加入到培養(yǎng)基中達到10g/ml。體外合成的YFPIV基因組的轉(zhuǎn)染在5天后進行，那時含復制子細胞重新開始有效生長。在圖示時間點通過用含Pur的相同培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基而收獲樣品。在許多實驗中，PIV分泌細胞在到達匯合時分裂。VEEV復制子通過體外合成的復制子和2輔助RNAs(Volkovaetal.,2006)的共電穿孔入BHK-21細胞而包裝入VEEV感染性病毒顆粒。含復制子病毒顆粒在轉(zhuǎn)染后24小時收獲，用于感染原初BHK-21細胞，緊接著Pur選擇。在WNPIV的例子中，體外合成的PIVRNA轉(zhuǎn)染入含表達WNC、prM和E和Pac的VEErep/C*-E*-Pac復制子的BHK細胞[BHK(VEErep/C、E、PAC)細胞]。VEErep/C*-E*-PAC基因組的THE方案示于圖5A。收獲的PIVs利用標準方法在這些細胞上傳^(Rossietal.,2005)。實施例5測量YFPIV的滴度為測量釋放的YFPIV的滴度，BHK-21細胞以5xl05細胞/孔接種入六孔Costar皿。四小時后，用不同稀釋的包裝病毒子感染細月包，37°C下在5%C02培養(yǎng)箱中培育1小時之后，用補充了10%FBS的2mlMEM覆蓋它們。感染的細胞數(shù)量通過在倒置UV顯微鏡下計數(shù)GFP-陽性細胞而評價。來自接種量的感染細胞分數(shù)通過計數(shù)限定區(qū)域的顯微鏡視野中熒光-產(chǎn)生細胞而確定。平均5個不同視野的計數(shù)，重新計算對應于每系列稀釋的滴度。在后一個實驗中，滴度也通過單層BHK-21細月包上的噬菌斑測定而測量，所述BHK-21細月包攜帶VEErep/Copt-prM-E/Pac復制子，所述測量利用前述條件(Lemmetal.,1990)，除了細胞為了噬菌斑發(fā)展在瓊脂糖下培育5天，然后用2.5%的曱醛固定并用結(jié)晶紫染色。實施例6YFPIVs的傳代包裝的細胞系通過體外合成的VEEV復制子RNAs的轉(zhuǎn)染或通過用包裝入VEEV結(jié)構(gòu)蛋白的相同復制子以10inf.u/細胞的感染復數(shù)(MOI)感染細胞而建立。Pur選擇之后，用YFPIV以不同MOIs感22染它們。在圖示時間點通過替換培養(yǎng)基收獲樣品。實施例7YFSVP生產(chǎn)的分析BHK-21細胞以每100-mm皿2xl()6的濃度接種。在37。C下培育4小時之后，用YFPIV以10inf.u/細胞的MOI感染細胞，并且然后在補充了10%FBS的10ml的MEM中培育24小時。然后培養(yǎng)基被每24小時替換的10ml無血清培養(yǎng)基VP-SF(Invitrogen)替換以分析SVP釋放。收集的VP-SF樣品通過低速離心而澄清(5,000r.p.m,10分鐘,4°C)，并且然后通過超速離心濃縮，所述超速離心通過2ml的10%蔗糖，制備于PBS上，在SW-41轉(zhuǎn)子上以39,000r.p.m在4°C進行6小時。粒狀沉淀材料溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的缺少b-巰基乙醇(為了保持與D1-4G2MAB的結(jié)合)的加載的緩沖液中，并進一步通過Western印跡分析。蛋白轉(zhuǎn)移之后，用D1-4G2MAB和購自SantaCmzBiotechology的辣根過氧化物酶(HRP)-連接驢抗小鼠二級抗體處理硝化纖維素膜。利用Western印跡Luminol試劑(SantaCruzBiotechnology)根據(jù)制造者的建議檢測HRP。為獲得陽性對照樣品，如對于SVPs所述的那樣將YFV(2xl08PFU)通過10%蔗糖墊進行超速離心。對于YFVSVPs的蔗糖密度梯度分析，BHK-21細胞用體外合成的YFPIV基因組RNA進行電穿孔。轉(zhuǎn)染后24小時時，完全MEM被VP-SF培養(yǎng)基替代，其在24小時后收獲。在此時間時，超過95%的細胞是GFP-陽性的并且不顯示任何CPE的征兆。收獲的樣品通過低速離心澄清(5000rpm,10分鐘，4°C)，并且然后通過在SW-28轉(zhuǎn)子在25,000rpm,4°C下進行過夜離心而濃縮。得到的粒狀沉淀懸浮于TN緩沖液中(10nmTrisHC1(pH7.5),lOOmMNaCl,0.1%BSA)并且進一步的分析如所述的進行(Schalichetal.，1996)。簡要地，0.5ml樣品被加載到不連續(xù)的蔗糖梯度中(1.5ml50%,1.5ml35%和1.5ml10%的制備于PBS緩沖液中的蔗糖)。離心在OptimaMAXUltracentrifuge(Beckman)中在SW-55轉(zhuǎn)子中以45,000rpm在4°C下進行1小時。粒狀沉淀溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的缺少b_巰基乙醇(為了保持與D1-4G2MAB的結(jié)合)的加載的緩沖液中，并進一步通過Western印跡分析。蛋白轉(zhuǎn)移之后，用D1國4G2MAB和購自SantaCruzBiotechology的夢束才艮過氧^:物酶(HRP)-連接驢抗小鼠二級抗體處理硝化纖維素膜。利用Western印跡Luminol試劑(SantaCruzBiotechnology)根據(jù)制造者的建議檢測HRP。用YFV(2X108PFU)進行并行的(sidebyside)梯度分析，進行如上述用于YFV-PIV源的SVPs相同的程序。實施例8WNPIV的分析WNPIV的滴度通過用病毒的系列稀釋感染Vero細胞單層而確定，并且然后24小時后固定，用特異于WNV的多克隆超免疫小鼠腹水液進行免疫組織化學染色，如前面所描述的一樣進4亍(Rossietal.,2005)。感染的細胞^^皮計數(shù)并用于確定滴度。為評價WNPIV用于在Vero細胞，或BHK(VEErep/C、E、PAC)細胞上形成集落的能力，單層用WNPIV稀釋液感染，用半固體黃芪膠覆蓋層覆蓋，在37。C下培育，并且然后固定并用特異于WNVNS1的MAB染色(E.Konishi,Kobe,Japan提供)，如上面所描述的一樣進行。實施例9PIV安全研究通過將不同劑量的病毒(回收自親本感染性cDNAs的YFV17D或WNVTX02)或PIV通過顱骨內(nèi)(i.e.)途徑(20ml體積)接種入3-到4-天齡小鼠(outbredSwissWebster,Harlan)或通過腹膜內(nèi)(i.p.)途徑(100ml體積)接種入4-5周齡雌性小鼠(outbredSwissWebster,Harlan)建立PIV安全。監(jiān)測14天小鼠疾病和死亡的征兆，垂死并且表現(xiàn)為不能存活到接下來的一天的動物:被人道地處死，并記錄為接下來的一天"死亡"。實施例10WNPIV歲文〗介和效率研究用上述WNPIV4姿種的選擇的動物;波處以安樂死，在接種后21天流血。血清從動物中收獲，合并，并利用上述方法測試它們降低在Vero細胞單層上WNV集落形成的能力。剩余的動物用1,000inf.u(通過在Vero細胞上集落形成測試而確定)接種，對應于WNV的NY99林的大約100LD5Q(Xiaoetal.,2001),并且動物然后如上所述另外觀察14天。實施例11YFVC-和YFVC-prM-E-表達盒都可補助YFVPIV的復制補助黃病毒基因組中C缺失缺陷的一般策略顯示于圖1。它是基于缺少C基因的基因組的發(fā)展，和在表達C(或所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白)的細胞中但不在正常細胞中的這些假性感染性病毒基因組(PIV基因組)的繁殖。后者細胞中的復制，不產(chǎn)生PIV基因組中缺陷的反式互補需要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，導致包含關(guān)鍵保護性免疫原E但缺少包含C和病毒遺傳物質(zhì)的核殼的SVPs的釋放。重組YFC基因組(YFPIV基因組)被工程化以包含GFP代替C的氨基酸26-93,與剩下的多肽框內(nèi)克隆(圖2A)。GFP的表達提供了在實驗中確定含基因組PIVs滴度的方便的方法。C-編碼序列從這種PIV基因組的缺失期望可破壞C形成功能性核殼的能力，但不期望影響功能性形式的prM和E的產(chǎn)生。因而，表達這種基因組的細胞，其產(chǎn)生GFP熒光，不能釋放感染性病毒。然而，感染性子代期望可從表達高水平的C的"包裝"細胞中產(chǎn)生。為了用于有效PIV生產(chǎn)的細胞系的快速開發(fā)，利用了基于委內(nèi)瑞4立馬腦炎病毒(VenezuelanEquineEncephalitisVims)(VEEV)基因組的表達系統(tǒng)(復制子)(Petrakovaetal.,2005)。VEEV復制子比源于其它甲病毒的復制子致細胞病變性更小，并且在脊推動物和昆蟲起源的一些細胞系中容易地建立持久的復制。表達盒被設計為雙亞基因組結(jié)構(gòu)(圖2B),其中一種亞基因組啟動子驅(qū)動Pac的表達，提供消除不包含Pac表達VEEV復制子的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細胞的有效方法。第二亞基因組啟動子驅(qū)動編碼YFV結(jié)構(gòu)蛋白的亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。為鑒定最有效的包裝盒，VEEV復制子編碼i)具有prM信號肽的YFVC,也已知為錨定的C(LindenbachandRice,2001)，(VEErep/Cl/Pac),或ii)具有prM的信號肽和20氨基酸的C(VEErep/C2/Pac),或iii)所有YFV結(jié)構(gòu)蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)。該設計的基本原理是在C-編碼盒中保持信號肽，其期望對于將C靶向到正確的細胞區(qū)室是關(guān)鍵的。體外合成的VEEV復制子RNAs轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中，并且在接下來的4-5天內(nèi)在含Pur培養(yǎng)基中選擇Pui"R穩(wěn)定細胞系。在轉(zhuǎn)染后起始的2-3天中，源于VEEV的RNAs的復制導致生長阻滯，然后，如先前所描述的(Petrakovaetal.,2005)，復制變得效率更低并且細胞重新開始生長。產(chǎn)生的Pui^培養(yǎng)物用體外合成的YFPIVRNAs轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后不同的時間點，釋放的包含GFP-表達基因組的感染性顆粒的滴度被確定(圖2C)。令人驚訝的是，BHK-21細胞中兩種不同的復制RNAs(YFV-和VEEV-特異性)的存在不產(chǎn)生致細胞病變效應(CPE),并且保持對Pur的抗性和高水平GFP的表達，顯示出VEEV復制子和YFPIVRNA的復制。如圖2C所示，表達這兩種標記物基因的培養(yǎng)物能夠生長并需要更替繼代接種(以每4天1:5的比例)以防止培養(yǎng)物到達匯合。圖2的實驗證實了所有的三種VEEV復制子能夠供應為形成感染性PIVs的充分水平的YFVC;在沒有VEEV復制子的情況下從用YFPIVRNA轉(zhuǎn)染的原初BHK-21細胞中沒有釋放感染性顆粒(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，表達這些包裝盒的細胞生產(chǎn)PIV的能力是不同的。表達YFVC后面緊接著prM信號肽的構(gòu)建體(錨定的C;VEErep/Cl/Pac)證實了與表達更長蛋白序列的盒相比較最低水平的YFPIVRNA包裝。C1構(gòu)建體的更低包裝效率的基礎是不清楚的，但這種現(xiàn)象可能通過在兩個相鄰剪切位點的特定順序的剪切的需要(NS2B/NS3和信號肽酶)(Yamshchikov和Compans,1994),和/或在這兩種不同的背景中產(chǎn)生的C蛋白的分配/穩(wěn)定性的不同，而解釋。因而，這些實驗之后，從所有進一步實驗中清除VEErep/Cl/Pac。VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac復制子都包裝了YFPIV到類似滴度，達到超過107inf.u/ml。而且，PIV顆粒的釋放持續(xù)到實驗結(jié)束，每24小時的時期內(nèi)每種細胞釋放20感染性YFPIV。相同的細胞可能也釋放缺少核殼和基因組的包含prM/E的SVPs,但這種可能性沒有進一步研究。實施例12具有缺陷基因組的YFPIVs可大規(guī)才莫生產(chǎn)PIV作為疫苗候選物的最終用途依賴于以需要的規(guī)模生產(chǎn)這些顆粒的能力，例如，為商業(yè)化生產(chǎn)。對用于疫苗制備的基于RNA的反式互補系統(tǒng)(VEEV復制子)的依賴需要進一步的標準化，因為存在在克隆入RNA病毒基因組的異源基因中突變累積的可能性。低傳代細胞系的利用，是克服這種限制的一種方法。替代地，可通過將復制子重復轉(zhuǎn)染入初始細胞，或通過生產(chǎn)包裝的VEEV復制子然后感染初始細胞而最小化VEErep基因組中的突變累積。包裝的VEE復制子的利用被認為是建立包裝細胞系的一種簡單和有效的方法。為有效生產(chǎn)PIVs，利用一種允許在先前包裝的VEEV復制子中生產(chǎn)甲病毒復制子表達細胞培養(yǎng)物的技術(shù)。簡短地，VEEV復制子利用先前描述的二輔助系統(tǒng)(Volkovaetal.,2006)包裝為VEEV感染性病毒體，包裝為包含到達109inf.u/ml滴度的制劑。用這些顆粒感染和在Pur存在下選擇的BHK-21細胞可用于在3-5天內(nèi)獲得YFV結(jié)構(gòu)蛋白編碼細胞培養(yǎng)物。建立之后，含VEErep/C2/Pac-和VEErep/C-prM-E/Pac-包含細胞系用先前產(chǎn)生的YFPIVs樣品以高(lOinf.u/細胞)和低(0.1inf.u/細胞)MOIs感染。在所有例子中，缺陷YFVs生產(chǎn)性地復制(見圖3)并且感染單層中所有細胞，產(chǎn)生高滴度的PIVs。因而，通過用包裝的VEEV復制子感染細胞建立包裝的細胞系，然后用PIVs感染，看來是一種用于大規(guī)模生產(chǎn)基因組中缺失C序列的PIVs的簡單和有效的系統(tǒng)。實施例13利用表達密碼子最優(yōu)化形式的YFCC基因的VEE復制子的YFPIVs在利用包裝系統(tǒng)支持缺陷病毒的復制中的另一可能的問題是在缺陷病毒基因組和編碼反式互補基因的RNAs之間的重組。所述重組可能導致感染性病毒的產(chǎn)生。在本文描述的實驗中，利用噬菌斑測試不再檢測到感染性YFV,但有必要排除掉病毒可在這些細胞中形成的可能性。另外，許多節(jié)肢動物傳播病毒編碼的蛋白期望發(fā)展為利用兩種非常不同的宿主的翻譯機制。因而，它們的密碼子使用不期望為對于每種宿主中的表達是最佳的。因此，表達盒中C-編碼序列被修飾以達到兩個目標i)提高C生產(chǎn)的產(chǎn)量和ii)降低YFPIV基因組和VEE復制子的C-編碼亞基因組RNA之間的同源重組的可能性。利用在最有效翻譯的哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子頻率合成YFVC(圖4A)。這些沉默的突變也破壞了黃病毒基因組復制需要的環(huán)化序列，因而，降低了YFPIV基因組和VEEV復制子的YFVC-編碼RNA之間的重組事件中產(chǎn)生有復制能力的YFV的可能性。Copt基因利用與VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac相同的策略克隆入VEErep構(gòu)建體，VEErep/C叩t/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac,并且反式互補PurR細胞系通過RNA轉(zhuǎn)染或通過用包裝的RNAs感染細胞而建立。用體外合成的PIV基因組RNA轉(zhuǎn)染這些細胞有效產(chǎn)生了PIV，其類似于用表達VEEV復制子的細胞選擇的那些，所述VEEV復制子表達非最優(yōu)化YFVC基因(圖4B)。然而，表達密碼子最優(yōu)化的C的細胞證明是有用的試劑，因為當用YFPIV感染并用含具有低密度FBS的培養(yǎng)基的瓊脂糖覆蓋時，它們能夠發(fā)展CPE并清楚地形成可見的噬菌斑(圖4C)。因而，盡管YFVC基因的密碼子最優(yōu)化沒有改變PIV從這些細胞中的生產(chǎn)，表達密碼子最優(yōu)化的YFVC的細胞代表了一種對于評價YFPIVs非常有用的系統(tǒng)，特別是不表達熒光標記物的那些。在另外的測試中，在用噬菌斑形成測試和GFP-焦點測試中確定的相同樣品的滴度之間觀察到非常好的相關(guān)性。YFPIV形成的噬菌斑比YFV的噬菌斑小，顯示了結(jié)構(gòu)蛋白最可能以順式功能(cisfunction)在病毒顆粒形成中更有效地生產(chǎn)。獲得形成噬菌斑的能力的原因尚不清楚。然而，預測YFVC具有一定水平的細胞毒性，因為包含表達密碼子最優(yōu)化形式的蛋白的VEEV復制子的細胞系證實了比編碼天然C基因的復制子的相應物具有更低的生長率。因而，YFPIV基因組復制可能導致足以引起CPE的細胞內(nèi)環(huán)境的另外改變。實施例14可為其它黃病毒產(chǎn)生PIVs為證明可容易地為其它黃病毒產(chǎn)生PIVs,將上述策略應用于WNV。為達到這一點，生產(chǎn)了一種具有35-氨基酸長的C蛋白的WNPIV基因組(圖5A)。為包裝這種WNPIV基因組，利用通過用非細胞致病性VEEV復制子轉(zhuǎn)染BHK細胞而產(chǎn)生的包裝細胞系，所述非細胞致病性VEEV復制子表達WNVC/prM/E和Pac[BHK(VEErep/C*-E*-Pac)]。為最小化在這種細胞系中復制的WNPIV基因組與VEErepRNA-編碼C蛋白之間的重組可導致產(chǎn)生感染性WNV的可能性，在VEEV復制子中的WNVC-編碼基因被修飾以包含在WNV環(huán)化區(qū)域中的群生(clustered)沉默突變。細胞的培養(yǎng)基能夠生產(chǎn)包裝細;包中的抗原-陽性集落(圖5B)，顯示感染性WNPIV已經(jīng);故生產(chǎn)。然而，對于用相同樣品的Vero細月包單層的感染僅僅檢測到抗原-陽性細胞(圖5C)。1x108inf.u/ml的滴度的WNPIV在包裝細胞上一皮生產(chǎn)，并且如期望的，WNPIV可在這種細胞系上反復傳遞(passed)。因而，利用一種已建立的細胞系，可利用與上面對于YFV描述的相同的補助系統(tǒng)容易地獲得高滴度儲量的WNPIV。令人感興趣的，在WNV包裝細胞系和WNPIV的例子中，觀察到病毒產(chǎn)量在感染后期達到穩(wěn)定水平，同時出現(xiàn)CPE(結(jié)果未顯示)，然而，共復制YFPIV基因組和VEEV復制子的細胞持續(xù)生產(chǎn)PIV許多天(圖2).實施例15用YF或WNPIVs感染的細胞生產(chǎn)SVPs為證實用PIVs感染的細胞生產(chǎn)SVPs,BHK-21細胞用體外合成的YFPIVRNA轉(zhuǎn)染或用在C-表達細胞中產(chǎn)生的YFPIVs感染。從BHK-21細胞中釋放的顆粒通過超速離心而純化，并且通過利用特異于E,D1-4G2的小鼠單克隆抗體的western印跡而分析(Gentryetal.,1982)。RNA-轉(zhuǎn)染和PIV-感染的細胞產(chǎn)生可從培養(yǎng)基中成粒狀沉淀的E蛋白(圖6A)，顯示其可以微粒形式存在。由于這些細胞不顯示任何CPE,并且樣品在超速離心之前以低速離心而被澄清，在粒狀沉淀部分中4企測的E蛋白不可能代表細胞碎片。類似的，western印跡分析證實用WNPIV感染的Vero細胞產(chǎn)生細胞外形式的E(在CEP的任何征兆發(fā)展之前)，其與通過WNV-感染Vero細胞生產(chǎn)的在大小上是不能區(qū)別的(圖6B)。為進一步評價PIV-感染細胞釋放的E蛋白的物理性質(zhì)，從僅包含復制PIV基因組的細胞中收集的培養(yǎng)基根據(jù)已公開的數(shù)據(jù)進行蔗糖密29度梯度分析(Schalichetal.,1996)。SVPs在具有2%蔗糖組分中被發(fā)現(xiàn)(圖6C)。在同樣的實驗中，YFV病毒體證實了高密度，并且在具有42%蔗糖組分中被檢測到。以WNVSVPs期望大小遷移的E蛋白-包含顆粒也在WNVPIVs感染的培養(yǎng)物中祐J險測。E在PIV-感染細胞的培養(yǎng)基中的存在與通過僅表達缺少功能性C基因的prM/E或TBEVRNA疫苗的SVPs的生產(chǎn)是一致的。實施例16PIV在動物中的安全性，效<介，和歲文率WN和YFPIVs的安全性通過i.c.接種數(shù)胎的(littersof)3到4天齡的小鼠而建立。這些研究顯示接種了WTYFV或WNV的小鼠祐二快速殺死，并且這些病毒在這些動物中展現(xiàn)了大約1PFU的50%致死劑量(LD5q)(表1)。然而，以2x106inf.u劑量接種到乳鼠的WN和YFPIVs沒有殺死任何小鼠(表1)。安全性進一步通過用野生型(wt)病毒和WNPIVsi.p.接種成體小鼠而證明。這些研究顯示了WNPIVs在成體小鼠中是完全安全的(表2)。而且，wtWNV殺死了顯著一部分的成體小鼠，LD5o小于1PFU,3x106inf.u的劑量的WNPIV不能導致任何死亡(表2)。然而，最令人感興趣的是如下發(fā)現(xiàn)WNPIVs是非常有力的免疫原(利用接種30,000inf.u檢測NEUT滴度)，并且免疫接種了3x104,3x105,或3xl06inf.u的100%的動物獲得抗WNV的NY99株的100LD5Q攻擊的保護(表2)。表l:在乳鼠中的PIVs的安全性。接種物a劑量(inf.u)b%存活c平均存活時間WNPIV2,000,000100(9/9)NAeWNVTX020.256(5/9)8.5(+/-2.9)WNVTX0220(0/9)5.4(+/-0.5)WNVTX02200(0/8)6(+/誦0)WNVTX022000(0/10)4.9(+/-0.3)YFPIV2,000,000100(10/10)NAeYFV17D0.289(8/9)8(+/-0)YFV17D256(5/9)7(+/-0)YFV17D2011(1/9)6.9(+/-2.4)YFV17D_^_0(0/12)_6(+/-0)a接種制劑，在具有10%FBS的培養(yǎng)基中稀釋。b通過i.C.途徑以20ml/動物的體積遞送。e接種后14天的存活(存活/死亡)。d來自死于感染的動物的平均存活時間(標準偏差)。e不適用。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>a接種制劑，在具有10%FBS的培養(yǎng)基中稀釋。b通過i.p.途徑以100ml/動物的體積遞送。。接種后14天的存活(存活/死亡)。d來自死于感染的動物的平均存活時間(標準偏差)。'e在接種后21天收集自2個動物的匯集血清的NEUT滴度(顯示的滴度是最高稀釋度，產(chǎn)生WNV集落形成80%的降低)。f抗100LD5q的WNV的NY99抹的攻擊的保護被攻擊后14天的存活所證實；來自稀釋接種組的單個存活者從笫8-14天顯示了疾病的征兆(駝背，皺毛，和不適)。PIV接種動物在14天的攻擊后觀察期中沒有顯示任何疾病的征兆。s不適用。h來自未免疫小鼠血清的NEUT滴度與來自WNPIV-接種小鼠的血清被并行地測試。實施例17進一步修飾以提高PIVs/RepliVAX的產(chǎn)量和安全性本發(fā)明證實了RepliVAX的反復傳代不產(chǎn)生重組，但是具有增強的生長的變體^皮選擇WNVRepliVAX在編碼WNVC蛋白的細胞系上反復傳代。通過將WNVC基因的一種拷貝與Pac基因融合，其由一種非細胞致病性VEErep亞基因組啟動子(Petrakovaetal.，2005)驅(qū)動，而生產(chǎn)C蛋白。在獲得的構(gòu)建體中(VEErep/Pac-Ubi-C",泛素(Ubi)基因被插入到C基因之前，并且C后面緊接著終止密碼子。在本背景中，可生產(chǎn)Pac-Ubi融合蛋白連同成熟C蛋白(缺少疏水性錨；見圖9)。在VEErep中的C基因(表示為"C^")通過插入36個突變被進一步修飾，所述36個突變切除CS信號，將GUCAAUAUGCU(SEQIDNO:2)的11堿基區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)镚UgAAcAUGuU(SEQIDNO:3)同時保持C編碼能力。這種大量的突變顯著降低了同源重組的可能性，并且，如果不發(fā)生基因組之間的重組，復制活性基因組的生產(chǎn)不能發(fā)生，因為產(chǎn)生的RNA將具有不匹配的CSs，這防止了復制(圖9)。為測試生產(chǎn)性重組的不可能性，從表達VEErep/Pac-Ubi-C*(BHK(VEErep/Pac-Ubi-C")的BHK細胞產(chǎn)生了一種克隆細胞系，并且這種細胞系^L用于傳代WNRepliVAXlO次(在每個例子中以0.01的MOI感染)，并且產(chǎn)生的RepliVAX已經(jīng)詳細描述。為確定lO-(plO)代群體是否包含任何活病毒，用p10WNRepliVAX以0.1,l,和10的復數(shù)感染Vero細胞單層，并且廣泛清洗以去除細胞外RepliVAX。這些單層在24小時后重新清洗，并且然后在2天后收獲。當用WNV的高敏感多克隆抗體染色時來自這些培養(yǎng)物的上清液傳遞到新鮮Vero細胞培養(yǎng)物上不能顯示出任何免疫陽性細胞，顯示出RepliVAX沒有與包裝的細胞系編碼的C蛋白生產(chǎn)性重組。令人感興趣的是，當p10WNRepliVAX與p0RepliVAX在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C"細胞系上比較時，p10RepliVAX產(chǎn)生了感染的多態(tài)集落，許多比p0RepliVAX產(chǎn)生的大得多(圖10)。而且，p10RepliVAX與p0RepliVAX相比在早期時間點復制高10倍，終點滴度為兩倍。獲自產(chǎn)生自用p10RepliVAX感染的Vero細胞的cDNA的PCR產(chǎn)品的分析證實沒有包含全長C編碼區(qū)的產(chǎn)品。然而，跨越這些區(qū)域變。如從在包裝細胞上的p10RepliVAX生產(chǎn)的集落的異源性質(zhì)所期望的(圖10),兩種突變都表示為具有初始RepliVAX序列的混合物。一種突變，其表現(xiàn)為存在于這些序列反應中一半核酸群體之上(在兩個方向的測序)，由在RepliVAX基因組的信號肽剪切位點(S(c)VGA|VTLS(SEQIDNO:4)之前的P4位點的AGOuGC(S〉C)突變組成。第二種突變，其僅僅存在于大約30%的擴增序列中(也在兩個方向完成的反應中)，由在NS2B/NS3剪切位點(QKKR|GGK(m)T)(SEQIDNO:5)之后的位點P3中的AAG〉AuG(K〉M)組成。盡管這些突變在缺失了SL5的位點中，它們不改變預測的RNA結(jié)構(gòu)。更好生長的RepliVAX的快速選擇(僅僅10個生長循環(huán))是非常令人興奮的，因為它顯示出更好生長變體的選擇是一種改進RepliVAX的有力的方法。這些突變的位點不是不期望的，因為已知NS2B/NS3對(versus)信號肽剪切的改變效率可影響黃病毒顆粒產(chǎn)量和感染性(Keelapangetal.,2004;Leeetal.,2000;LobigsandLee,2004;Yamschikovetal.,1997)。持續(xù)研究了甚至更好生長的變體的選擇，并且為插入第二代RepliVAX構(gòu)建體這兩種突變被革巴向，以確認它們分別(或一起)提高RepliVAX產(chǎn)量和抗原生產(chǎn)的能力。然而，本文表示的數(shù)據(jù)顯示在這些傳代條件下l)沒有發(fā)生重組，2)陽性選擇可用于生產(chǎn)改善的RepliVAXs。JERepliVAX的盲目傳代類似地產(chǎn)生了具有在基因組相同區(qū)域突變的更好生長的變體。對于生產(chǎn)更好生長的變體盲目傳代RepliVAX產(chǎn)品的能力是本發(fā)明的關(guān)鍵特征，和相對于傳統(tǒng)LAV的一種清楚的優(yōu)點，所述傳統(tǒng)LAV中由于考慮到更好生長變體可能已經(jīng)喪失了它們在人中的減毒性，更好生長變體的生產(chǎn)通常是復雜的。而且，突變的改善的C-表達盒(VEErep/Pac-Ubi-C",其已經(jīng)顯示為穩(wěn)定的并證實了當用于BHK細胞系(對于人疫苗生產(chǎn)沒有批準)中時不會重組，當引入Vero細胞(一種已經(jīng)接受的用于人疫苗生產(chǎn)的細胞系)中時也已經(jīng)顯示出對于PIV繁殖是穩(wěn)定并有用的。特別的，33對應于VEE復制子的RNAs已利用與應用于BHK細胞相同的方法從合格種引入Vero細胞。RNA引入Vero細胞之后，細胞維持在含噪呤霉素的無血清培養(yǎng)基中(一種對于疫苗生產(chǎn)重要的問題)，并且這些細胞顯示出對于PIV繁殖是有用的。在這些繁殖條件下，這些細胞顯示出生產(chǎn)比類似來源的BHK細胞稍低的PIV滴度，但VEErep/Pac-Ubi-C*-Vero細胞在這些培養(yǎng)條件下進行得更好，允許多重收獲。圖11顯示了為在無血清條件下的多重收獲可獲得PIV從這些細胞的生產(chǎn)?？傊?，表達C(特別是包含prM的信號序列，或該區(qū)加上prM和E基因的部分的C盒)的細胞系中PIVs的繁殖理論上可與PIV基因組重組，產(chǎn)生可導致疾病的活病毒，增加疫苗生產(chǎn)方法的風險。為克服這一問題，本發(fā)明證實了用于WNPIV繁殖的細胞系可利用C蛋白生產(chǎn)，所述C蛋白正好終止于NS2B/NS3剪切位點，使在PIV基因組該區(qū)域的重組機會最小化，提供了相對于其它繁殖方法的優(yōu)點，在所述其它方法中，細胞系編碼RNAs,所述RNAs編碼與PIV共享的C的錨部分(也已知為prM的信號肽)。為進一步增強這種C-表達盒的安全性，本發(fā)明證實了用于制備補助PIV基因組的VEErep-編碼C的盒的部分(也就是由于病毒復制需要的潛在的RNA元件，編碼生產(chǎn)復制性PIV基因組所需要的氨基酸序列的最初30密碼子，)可被特異性突變以生產(chǎn)與PIV基因組在36核苷酸位點不同的盒(不改變蛋白產(chǎn)品地引入)，產(chǎn)生顯著降低與PIV基因組的重組可能性的C基因(圖9)。而且，這種突變的C基因被產(chǎn)生以具有在環(huán)化信號(CS)中的三種突變，其必須與PIV基因組的3，UTR中的CS互補以允許病毒復制，提供了防止重組的進一步的安全性特征(圖9)。最后，通過將泛素基因利用到來自得到的多聚蛋白的完整C產(chǎn)品(替代的自我剪切序列例如FMDV的自身-蛋白酶2A,或其它相關(guān)序列可容易地替代泛素)將這種C基因插入到VEE復制子，在可選擇標記物基因(pac)之后。這種單獨-多聚蛋白盒的產(chǎn)生提供了生產(chǎn)遺傳上更穩(wěn)定的VEE復制子的優(yōu)點，降低了在繁殖細胞系中的重組機會，消除了C-表達盒，并降低了PIV產(chǎn)量。得到的構(gòu)建體(VEErep/Pac-Ubi-C氣圖9)被引入BHK細胞，并且利用已經(jīng)建立的方法將細胞用于生產(chǎn)表達VEE復制子的克隆細胞系(Fayzulinetal.,Virology2006)。從單個細胞克隆18次傳代之后檢查克隆細胞系，發(fā)現(xiàn)沒有任何C盒的遺傳缺失的證據(jù)(通過RT-PCR),也沒有發(fā)現(xiàn)在C-表達盒中有任何可檢測的突變。最重要的是，這種細胞系顯示出以41的傳代水平繁殖WNVPIV的類似能力。最后，在細胞系上10次傳代之后，沒有觀察到重組生產(chǎn)的能夠在不表達C盒的細胞(也就是WTVero細胞)上生產(chǎn)性復制的PIV-重組體的證據(jù)，也沒有觀察到通過RTPCR將C-編碼序列fI入到PIV基因組的證據(jù)。而且，為處理PIV可能與疫苗中的黃病毒在免疫時重組產(chǎn)生新的有毒的黃病毒的考慮，本發(fā)明證實了具有"非天然"存在于所有已知的天然循環(huán)黃病毒中的環(huán)化信號(CS)的WNV基因組可被產(chǎn)生，復制到高水平。在一些實驗室中產(chǎn)生了在所有黃病毒基因組的5，和3，末端發(fā)現(xiàn)的兩種CS必須是100%互補以提供生產(chǎn)性病毒復制的證據(jù)(Khromykhetal.J.Virol.,2001;Loetal.,J.Virol.,2003;Alvarezetal.,Virol.,2003)。這些研究還證實了非天然CSs可生產(chǎn)復制性基因組，只要CS是100%互補。然而這些研究者報告了具有非天然CS序列的所有基因組具有復制缺陷。通過WNV基因組中的CS系統(tǒng)性分析，特別是測試仔細選擇的單個堿基交換產(chǎn)生高水平復制的能力，鑒定了允許高水平的基因組復制的單堿基交換，和后來的雙堿基交換(圖12A)。圖12B證實了具有兩個堿基取代的WNV基因組的高水平復制是可能的，并且具有錯配CS序列的故意生產(chǎn)的基因組(也就是WT和2-堿基突變體)不具有復制活性。這種突變，和其它類似的突變，可因此被利用以生產(chǎn)具有很好安全性能的PIV,因為產(chǎn)生自CS-修飾PIV疫苗和在接受免疫接種的人群的區(qū)域傳播的病毒之間的單點遺傳重組的任何重組病毒將不具有復制活性，并因而不能導致疾病。實施例18表達WNVC基因的BHK細胞維持它們的表型多代對源于用VEErep/Pac-Ubi-C承轉(zhuǎn)染的BHK細胞的WNVC-表達克隆細胞系的研究已經(jīng)證實了由于幾種原因的其在產(chǎn)生RepliVAX中長期穩(wěn)定性和實用性。首先，這些細胞對于RepliVAX的反復傳代是有用的。第二，在兩種不同的代水平時(單個細胞克隆后8&24代)對于細胞的并行(sidebyside)集落形成測試顯示不能區(qū)別的WNRepliVAX滴度和集落大小。最后，對在24代水平的這些細胞的C-編碼盒的序列的直接分析顯示相對于原初VEErep序列沒有改變。將這些數(shù)據(jù)拿到一起顯示了含有C-表達VEEreps的細胞應該對于在目前接受的用于生產(chǎn)人疫苗的主細胞種子批模式(mastercellseedlotformat)的應用是足夠穩(wěn)定的。而且，VEEreps已^皮用于人的實-瞼中的事實使得4艮可能VEErep-細胞技術(shù)在Vero細胞中的應用在規(guī)章審批過程中不會遇到任何意想不到的障礙。實施例19WNVVLPs的'淋巴組織革巴向如上所示，WNVVLPs與RepliVAX類似，除了代替了黃病毒prM/E蛋白之外，它們可編碼報道基因，或它們可簡單地包含不具有報道基因的黃病毒復制子。VLPs可在表達所有三種WNV結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細胞中容易地生產(chǎn)，并且已經(jīng)以高滴度被生產(chǎn)(Fayzulinetal.,2006)。當107U的VLP被接種入小鼠時，接種24小時后這些動物在血清中產(chǎn)生了1,000到5,000U/ml的I型干擾素(IFN)。通過ip和皮下足墊注射(fp)產(chǎn)生了IFN響應。而且，fp接種b-半乳糖苷酶-表達VLPs24小時后切割的腿彎部淋巴結(jié)包含大量b-半乳糖苷酶-陽性細胞，顯示VLPs,其以不可區(qū)別于RepliVAX的方式進入細胞，是靶向于重要的淋巴器官的。這種結(jié)果與通過VLP-注射引發(fā)的高水平IFN是一致的，并且暗示了類似的靶向是RepliVAX的高效價和高效率的原因。下列參考文獻在此引用Aberle,J.H.等,1999,//畫畫/163，6756-61.Aberle,J.H.等,2005,/79，15107-13.Bredenbeek,P.J.等，2003JK,'ra/84，1261-8.Chambers,T.J.等,1999/K/ra/73，3095-101.Clyde和HArris,2006,JVirol80:2170-2182.Colombage,G.等，1998,K/ra/ogy250，151-63.Davis,B.S.等，2001,Jbw歷/q/Tz油gy75，4040-4047.Fayzulin等，2006,Virology351:196-209.Filomatori等，2006,GenesDev20:2238-2249.Fonseca,B.A.等，1994,Fac""e12，279-85.Gentry,M.K等，1982,爿mJ7>op31，548-55.Gemsimon,G.,和Lowry,K,,2005,SowAA/^/J98，653-6.Haas,J.等,1996C群編6，315-24.Hall,R.A.等，2003，尸tocA^"cac/&/t/S爿100，10460-10464.Huang,C.Y.等,2003,/77,11436-47.Kanesa,T.N.等,200019，483-491.Keelapang等，2004，JVirol78:2367-2381.Kochel,T等，1997,Fac""e15，547-52.Kochel,T.J.等，2000.18，3166-3173.Kofler,R.M.等，2004,Ato/y4c^/S"'VS爿101，1951-6.Konishi,E.,和Fujii,A.,2002,20，1058-67.Konishi,E.等，2001Jow""/o/Tz>o/ogy75，2204-2212.Konishi,E.等，1992aK/油gy190，454-8.Konishi,E.等，1992b,188，714-20.Konishi,E.等，2000a,Fac">ze.18，1133-1139.Konishi,E.等，2000b,Wra/ogy268，49-55.Lee等，2000,JVirol，74:24-32.Lemm,J.A.等,1990,JK/ra/64,3001-11.Liljestrom,P.等,1991JWra/65,4107-13.Lobigs和Lee,2004,JVirol78:178-186.Lindenbach等，2001,2001,黃病毒病毒和它們的復制，Knipeetal.(Eds.4thEd.FieldsVirology,Vol.1,LippincottWilliams和WilkinsPhiladelphia"pp.991畫1041(2vols)).Lorenz,I.C.等,2002/Wro/76，5480-91.Mason,P.W.等，1991,Wro/ogy180，294-305.Minke,J.M.等，2004,K/ra/Sw;//,221-30.Mishin，V.P.等,2001K細^扁rc/z81，113-123.Monath,T.P.1991,爿m/7>o/她c/外g45，1畫43.Monath,T.P.等，2002Faccz力e20，1004-18.Petrakova,O.等，2005JF,>o/79，7597-608.Phillpotts,R.J.等，1996Jrc/zP7ra/141，743-9.Pincus,S.等，1992Kra/ogy187，290-7.Pletnev等,2002,7Va"ow"/Jcac/e，o/5""'ewc^t/&499:3036-3041.Pugachev,K.V.等，2004JK/ra/78,1032-8.Pugachev,K.V.等，1995F/ro/ogy212，587-94.Qiao,M.等，2004l卯，2104-8.Rossi,S.L.等，2005,Wra/ogy331，457-70.Schalich等，1996,Virology,70:4549-4557.Schmaljohn,C.等，1997,JK>o/71，9563-9.Scholle,F.等,2004,J78，11605-14.Volkova,R等，2006,Kz>o/。gv344，315-27.Xiao,S.Y.等,2001,五腸rgz力g/"/^"z'ous1Z)&eas^JwMwg7，714-721.Yamshchikov,V.F.,和Compans,R.W.,1994),JJ/z>o/68，5765-71.Yamshchikov等，1997,JVirol,71:4364-4371.Zuker,2003,NucleicAcidRes31:3406-3415.任何在本說明書中提到的專利或公開文獻對于本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是提示性的。而且，這些專利和公開文獻在此引入作權(quán)利要求1.黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其包含在編碼衣殼(C)蛋白的核苷酸序列中的缺失，prM/M的正確成熟所需要的prM蛋白的信號序列，或其組合；所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列，所述復制缺陷假性感染性病毒僅僅在表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞中復制。2.權(quán)利要求1的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述病毒是黃病毒、肝病毒或瘟病毒，或通過將其它病毒的prM-E盒與，￡性感染性病毒的prM-E盒交換而產(chǎn)生的所述病毒的其它嵌合體。3.權(quán)利要求2的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述黃病毒是黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、日本腦炎病毒或墨累谷腦炎病毒。4.權(quán)利要求3的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中缺失的編碼所述黃病毒的C蛋白的核苷酸序列編碼C蛋白的氨基酸26到100或氨基酸26到100中的氨基酸的組合。5.權(quán)利要求2的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述肝病毒是丙型肝炎病毒。6.權(quán)利要求2的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述瘟病毒是牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒或豬霍亂病毒。-7.權(quán)利要求1的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述缺失的基因被編碼標記蛋白或抗原的基因取代。8.權(quán)利要求7的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中標記基因是綠色熒光蛋白。9.表達黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、^f皮膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其對于使權(quán)利要求1的復制缺陷的病毒能夠在適當條件下繁殖是有效的。10.權(quán)利要求9的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中利用源于病毒載體的基因工程化復制子產(chǎn)生表達病毒的野生型或突變蛋白的細胞。11.權(quán)利要求10的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中編碼復制子中黃病毒科病毒蛋白的基因被編碼所述病毒的蛋白的密碼子最優(yōu)化形式的基因取代，使得所述取代降低細胞系編碼基因與黃病毒科假性感染性病毒基因組重組的能力和/或提高黃病毒科假性感染性病毒的生產(chǎn)。12.權(quán)利要求11的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述復制子表達C蛋白，所述C蛋白包含在編碼屬于黃病毒科的病毒的C蛋白的基因的至少36個核苷酸位點的突變。13.權(quán)利要求11的細胞培養(yǎng)，其中所述復制子表達復制子中的C蛋白，所述復制子包含非天然環(huán)化序列，使得所述環(huán)化序列的存在降低復制缺陷假性感染性病毒與天然病毒的生產(chǎn)性重組的機會。14.權(quán)利要求11的細胞培養(yǎng)，其中所述復制子表達蛋白，所述復制子包含編碼截短的C-prM連接的改變的核苷酸序列使得所述改變的序列的存在提高細胞培養(yǎng)中復制缺陷假性感染性病毒的產(chǎn)量，體內(nèi)提高包含prM/E的SVP產(chǎn)量，或其組合。15.權(quán)利要求10的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中通過用體外合成的復制子RNAs轉(zhuǎn)染，通過用設計為從細胞RNA-聚合酶II-特異性啟動子合成功能性曱病毒復制子的質(zhì)粒DNAs轉(zhuǎn)染，或通過用包裝在曱病毒結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)部的曱病毒復制子感染，將表達黃病毒科病毒的野生型或突變蛋白的復制子引入細胞中。16.權(quán)利要求10的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中病毒載體是曱病毒。17.權(quán)利要求16的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中曱病毒是委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、辛德畢斯病毒、東方馬腦炎病毒(EEEV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)或羅斯河病毒。18.生產(chǎn)黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒的方法，其包括產(chǎn)生黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含在衣殼基因中的缺失，prM/M的正確成熟所需的prM蛋白信號序列，或其組合，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需的RNA序列；產(chǎn)生表達黃病毒科病毒的衣殼蛋白或衣殼、prM、E蛋白、突變衣殼蛋白、突變prM、突變E蛋白或其組合的細胞系，其中所述細胞系提供黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒繁殖所需的高水平的蛋白；和用黃病毒科的假性感染性病毒感染細胞系，從而產(chǎn)生黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述病毒是黃病毒、肝病毒或瘋病毒或通過將其它病毒的prM-E盒與假性感染性病毒的prM-E盒交換而產(chǎn)生的所述病毒的其它嵌合體。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述黃病毒是黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、埤傳腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、日本腦炎病毒或墨累谷腦炎病毒。21.權(quán)利要求20的方法，其中缺失的編碼所述黃病毒的C蛋白的核苷酸序列編碼C蛋白的氨基酸26到100或氨基酸26到100中的氨基酸的組合。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述肝病毒是丙型肝炎病毒。23.權(quán)利要求19的方法，其中所述瘟病毒是牛病毒性腹瀉病毒、豬痘病毒或豬霍亂病毒。24.權(quán)利要求18的方法，其中利用源于病毒載體的基因工程化復制子產(chǎn)生表達病毒的野生型或突變蛋白的細胞。25.權(quán)利要求24的方法，其中編碼復制子中黃病毒科病毒突變蛋白的基因被編碼所述病毒的蛋白的密碼子最優(yōu)化形式的基因取代，使得所述取代降低細胞系編碼基因與假性感染性黃病毒科基因組重組的能力和/或提高假性感染性黃病毒科的生產(chǎn)。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述復制子表達C蛋白，所述復制子包含在編碼屬于黃病毒科的病毒的C蛋白的基因的至少36個核苷酸位點中的突變。27.權(quán)利要求2:的方法，其中復制子表達復制子中的C蛋白,i所陷假性感染性病毒與天然病毒的生產(chǎn)性重組的機會。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述復制子表達蛋白，所述復制子包含編碼截短的C-prM連接的改變的核苷酸序列，在體內(nèi)提高包含prM/E的SVP的產(chǎn)量，或其組合，所述改變的序列的存在提高復制缺陷假性感染性病毒在細胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量。29.權(quán)利要求24的方法，其中通過用體外合成的復制子RNAs轉(zhuǎn)染，通過用設計為從細胞RNA-聚合酶II-特異性啟動子合成功能性曱病毒復制子的質(zhì)粒DNAs轉(zhuǎn)染，或通過用包裝在甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)部的甲病毒復制子感染，將表達黃病毒科病毒的野生型或突變蛋白的復制子引入細胞中。30.權(quán)利要求24的方法，其中病毒載體是甲病毒。31.權(quán)利要求30的方法，其中甲病毒是委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、辛德畢斯病毒、東方馬腦炎病毒(EEEV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)或羅斯河病毒。32.藥物組合物，其包含通過權(quán)利要求18所述方法生產(chǎn)的黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒。33.保護受試者免受暴露于黃病毒導致的感染的方法，其包括給受試者施用免疫有效量的權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述組合物在受試者中產(chǎn)生針對黃病毒的免疫反應，從而保護受試者免受感染。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述施用是通過腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服或鼻內(nèi)途徑。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述受試者是人或動物。全文摘要本發(fā)明公開了缺失了衣殼基因的屬于黃病毒科的復制缺陷假性感染性病毒，其中所述復制缺陷假性感染性病毒僅僅在表達黃病毒的衣殼或衣殼、prM和被膜蛋白的細胞中繁殖。本發(fā)明還公開了大規(guī)模生產(chǎn)所述病毒的方法和這些假性感染性病毒作為疫苗的用途，所述疫苗用于預防由屬于該家族的病毒感染人或動物引起的疾病。文檔編號A61K39/12GK101454022SQ200780015007公開日2009年6月10日申請日期2007年2月27日優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日發(fā)明者E·弗羅洛瓦,I·弗羅洛夫,P·C·梅森申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學評議會