專利名稱：表皮生長因子增加胰島素分泌并降低血糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療糖尿病的藥劑及預(yù)防或治療糖尿病的方法。另外，本發(fā)明涉及控制血糖水平的藥劑及控制血糖水平的方法、鑒定誘導(dǎo)哺乳動物中不依賴于葡萄糖的胰島素分泌的藥劑的方法以及診斷糖尿病或低血糖水平的方法。
背景技術(shù)：
胰臟p-細(xì)胞的主要功能是以適當(dāng)?shù)乃俣群铣刹⒎置谝葝u素以減少血糖波動。胰島素的過量分泌會導(dǎo)致低血糖癥，而分泌不足會導(dǎo)致糖尿病。因此很容易理解，胰島素分泌受到非常緊密的控制以確保體內(nèi)的葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。胰島素儲存于胰臟p-細(xì)胞的分泌顆粒中，在受到促分泌劑刺激時(shí)通過胞吐作用釋放。p-細(xì)胞的活性水平由多種不同的刺激劑決定，所述刺激劑包括葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)和激素。雖然進(jìn)行了深入的研究，但是涉及該刺激-分泌偶聯(lián)并維持對胰島素釋放的精密調(diào)控的過程依然不完全清楚。
糖尿病是在所有年齡組和人群中出現(xiàn)的最常見的內(nèi)分泌障礙性疾病之一。有兩種主要形式的糖尿病在所有病例中占5-10%的胰島素依賴性(1型)糖尿病(IDDM)，以及大約占病例的卯％的非胰島素依賴性(2型)糖尿病(NIDDM)。 2型糖尿病與年齡增加有關(guān)，然而現(xiàn)在被診斷為患有NIDDM的年輕人的數(shù)量有增加的趨勢，這被稱為青年的成年發(fā)病型糖尿病(MODY)。在1型和2型兩種病例中，通過胰臟中p-細(xì)胞的破壞或者胰島素分泌或產(chǎn)生的不足導(dǎo)致胰島素分泌的喪失。在NIDDM中，對患者的治療通常由進(jìn)行最適膳食的食療、減輕體重和鍛煉開始。
2型糖尿病的特征是胰島素耐受性和受損的胰島素分泌。胰島素分 泌的控制主要受葡萄糖本身的調(diào)控，但也涉及到一系列的代謝因素、神 經(jīng)因素、激素因素并且有時(shí)還涉及藥物因素。引發(fā)劑可以在無其他刺激 物的情況下增加胰島素的分泌，但增強(qiáng)劑需要引發(fā)劑的存在，所述引發(fā) 劑通常為葡萄糖(Hedeskov CJ et al.，戶Aj;w》/及ev 60:442-509， 1980 )。許 多報(bào)道已經(jīng)指出，由糖尿病治療引起的低血糖會造成嚴(yán)重的問題。
表皮生長因子(EGF)是一種用于不同類型的細(xì)胞增殖(尤其是成 纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞)的重要生長因子。EGF還可以誘導(dǎo)包括頂體胞吐 和多種激素分泌的分泌事件。已提出所述EGF家族的某些成員在胰臟發(fā) 育中有作用。EGF和白血病抑制因子(LIF)的體外處理產(chǎn)生了生產(chǎn)胰 島素的P國細(xì)胞團(tuán)(Baeyens L et al" 48:49-57, 2005)。所述
EGFR在整個(gè)人胚胎胰臟中都表達(dá)，并且缺失EGFR的小鼠出現(xiàn)不正常 的胰島(Miettinen PJ， et al" Z)eve/，we/iZ 127:2617-2627， 2000 )。還已經(jīng) 證明EGF與大鼠胰臟p-細(xì)胞的胰島素含量及其再生有關(guān)(Li L， et al.， D/由to 53:608-615， 2004; Brand SJ， et al"尸/inf麵co/ 7b;d^ 91:414-420， 2002; Suarez-Pinzon WL et al.， Z)/fl&tes 54:2596-2601， 2005 )。 EGF也是 在胰臟中產(chǎn)生的，并且在糖尿病動物中EGF的循環(huán)水平以及EGFR都 會降低(Burgess AW，必,3/^/忍"〃 45:401-424， 1989; Kasayama S， et al" iW胸/爿cW " 86:7644—7648， 1989; Kashimata M， et al"
fi/od/附fi/印/^s爿""923:496-500， 1987 )。然而，EGF在葡萄糖調(diào)節(jié)中 通過調(diào)節(jié)胰臟的功能例如胰島素分泌而發(fā)揮的作用還沒有被研究。
胰島素分泌主要由細(xì)胞內(nèi)Ca"的升高觸發(fā)，但其可被多種細(xì)胞信號 例如蛋白激酶和鱗脂酶調(diào)節(jié)。在它們中，哺乳動物磷脂酶D (PLD)是 一種膜結(jié)合酶，它應(yīng)答于多種信號(包括生長因子)而將磷脂酰膽堿(PC ) 水解，生成多功能的脂質(zhì)——磷月旨酸(PA) (ExtonJH， ^W^/附祝op/^s
1439:121-133， 1999 )。 PA是一種參與多生理事件的胞內(nèi)脂質(zhì)第二信 使。這些發(fā)現(xiàn)表明，激動劑誘導(dǎo)的PLD活化可以在多信號傳遞事件中起 作用(Jones D， et al" 5/—1439:229-244,1999; Honda A，
etal，，CW/99:521-532， 1999)。迄今為止，已經(jīng)克隆了兩種類型的哺乳動 物PLD——PLD1和PLD2。它們共享約50%的序列同源性并包含相似 的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，但在定位和調(diào)節(jié)蛋白相互作用方面顯示有差異(FrohmanMA， et al.， J /oc/i/附i ,o/7/ij;s爿c似1439:175-186， 1999 )。 PLD活性可涉及 到多種運(yùn)輸過程，特別是調(diào)節(jié)胞吐作用(Jones D， et al.， AZ0/7/yw ^cto 1439:229-244， 1999 )。 PLD1和PLD2在肥大細(xì)胞中通過一個(gè)兩步過 程調(diào)節(jié)胞吐的不同階段(Choi WS， et al., //附/mmo/ 168:5682-5689， 2002)。另夕卜，PA是一種胰島素胞吐的重要介導(dǎo)劑(Metz SA， 5z》c/^附/ 270:427-435， 19卯)。

發(fā)明內(nèi)容
然而，EGF在葡萄糖調(diào)節(jié)中通過調(diào)節(jié)胰臟的功能例如胰島素分泌而 發(fā)揮的作用還沒有被研究。通過促分泌劑對PLD進(jìn)行的具體調(diào)節(jié)仍是不 清楚的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過與EGF的短暫接觸可經(jīng)由Ca2+內(nèi)流和PLD2 依賴性的機(jī)制刺激不依賴于葡萄糖的胰島素分泌。再者，本發(fā)明示出了 ， EGF是一種降低正常小鼠和糖尿病小鼠中血漿葡萄糖水平的新型促分 泌劑，說明EGF有治療糖尿病的潛力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于預(yù)防或治療糖尿病并含有 EGF作為有效藥劑的藥物組合物。本發(fā)明提供了一種包含EGF的胰島 素分泌劑，更優(yōu)選一種包含EGF的不依賴于葡萄糖的胰島素分泌劑，其 中所述EGF以一種不依賴于葡萄糖的方式刺激胰臟p-細(xì)胞的胰島素分 泌。本發(fā)明還提供了一種治療糖尿病的方法，該方法包含對受試者給予 有效量的EGF,其中所述EGF的量啟動胰島素的分泌并降低
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含EGF的控制血糖水平 的藥劑，以及一種控制血糖水平的方法，該方法包含對需要它的受試者 給予有效量的EGF。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含所述EGF的糖尿病診 斷試劑盒，以及一種使用所述EGF診斷哺乳動物體內(nèi)糖尿病的方法。更 具體地，所述診斷糖尿病的方法可通過以下方式實(shí)現(xiàn)取受試者的血樣 并用抗原-抗體反應(yīng)確定所述血樣中EGF的濃度。
在另外的實(shí)施方案中，，本發(fā)明提供了一種鑒定可在哺乳動物體內(nèi)誘 導(dǎo)不依賴于葡萄糖的胰島素分泌的藥劑的方法，所述方法包含使用所述 EGF。


通過將下文的詳細(xì)敘述與附圖結(jié)合考慮可更全面理解本發(fā)明及伴
隨于它的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其中
圖1A至1C顯示，EGF迅速地且不依賴于葡萄糖地刺激MIN6細(xì) 胞中的胰島素分泌。EGF顯示以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式刺激MIN6 細(xì)胞中的胰島素分泌，具有比葡萄糖更快的動力學(xué)(圖1A和1B); EGF 在基礎(chǔ)葡萄糖濃度(2.7 mM)下升高了胰島素水平，并且也在高(11 mM ) 葡萄糖水平下額外地增加葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放(圖1C)。
圖2A至2B顯示，Ca"內(nèi)流介導(dǎo)了 EGF觸發(fā)的MIN6細(xì)胞中的胰 島素分泌。圖2A證明了 ， EGF刺激了胞外Ca"內(nèi)流(這可以通過EGTA 處理而減少)和EGF誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞中的胰島素分泌可被Ca"螯合 劑減少(圖2B)。
圖3C至3D顯示，PLD2特別地參與了依賴于EGF的胰島素分泌。 PLD被EGF刺激快速地(在2分鐘內(nèi))激活(圖3A);依賴于EGF的 胰島素分泌被PLD抑制劑——正丁醇處理抑制，而不被作為對照的叔丁 醇處理抑制(圖3B); PLD2排他性地介導(dǎo)了依賴于EGF的胰島素分泌， 且PLD1的過表達(dá)顯示了有限的效應(yīng)(圖3C的上圖)；PLD2的沉默消 除了 EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌(圖3D的上圖)；并且依賴于EGF的PLD 活性(通過PBt形成測定)被PLD2的過表達(dá)或沉默排他地調(diào)節(jié)(圖3C 和3D的下圖)。
圖4A至4B顯示，Ca"內(nèi)流對于EGF誘導(dǎo)的PLD激活是至關(guān)重要 的；通過使用EGTA或BAPTA/AM阻斷Ca"內(nèi)流抑制了大部分的PLD 活性(圖4A);通過沉默PLD同工酶(PLD的成功沉默通過蛋白質(zhì)印 跡法獲證實(shí))抑制PLD活性對依賴于EGF的Ca"內(nèi)流幾乎沒有影響(圖 4B )。
圖5A至5C顯示，EGF通過Ca"內(nèi)流和PLD活性增加了小鼠胰 島中的胰島素分泌；EGF迅速地增加了胰島素的分泌(圖5A);抑制 Ca"內(nèi)流或PLD活性完全阻斷了所述依賴于EGF的胰島素分泌(圖5B 和5C )。
圖6A至6E顯示，EGF降低血漿葡萄糖并升高血漿胰島素水平； EGF (50g/kg)的葡萄糖降低效應(yīng)有類似于胰島素的功效并且具有劑量 依賴性(圖6A)。此外，EGF和葡萄糖(0.5g/kg)還都升高了血漿胰島
6素水平(圖6B);與鹽水處理相比，口腔注射葡萄糖引起了血漿EGF水 平的升高(圖6C); EGF還降低了肥胖db/db小鼠的血漿葡萄糖并升高 了血漿胰島素水平(圖6D和6E )。
具體實(shí)施例方式
參考下文的詳細(xì)敘述，可更全面理解本發(fā)明及伴隨于它的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
表皮生長因子(EGF)在胰臟中合成，糖尿病動物具有較低水平 的EGF。然而，EGF在調(diào)節(jié)胰臟的主要機(jī)能例如葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的作用 還沒有被研究。在本文中，本發(fā)明顯示了 EGF不但快速地增加胰臟細(xì)胞 系中的胰烏素分泌，而且還快速增加小鼠胰島中的胰島素分泌。這些事 件依賴于Ca"內(nèi)流和PLD (尤其是PLD2)活性，這是通過使用藥物阻 斷劑和分子變換例如PLD同工酶的過表達(dá)和siRNA確定的。另外，在 正常和糖尿病小鼠中，EGF還升高血漿胰島素水平并介導(dǎo)葡萄糖的降 低。在本文中，本發(fā)明首次證明EGF是一種新型的調(diào)節(jié)血漿葡萄糖水平 的促分泌劑和一種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療糖尿病的 藥物組合物，包含EGF和藥用載體。更具體地，所述EGF可以是人EGF。 所述EGF以不依賴于葡萄糖的方式刺激胰臟p-細(xì)胞中的胰島素分泌。所 述EGF通過胰臟P-細(xì)胞或胰島中的Ca2+內(nèi)流和PLP2活化刺激所述胰 島素分泌。
按5錄/kg至100//g/kg受試者體重的量給予所述EGF,并更優(yōu)選 10庫/kg至60//g/kg受試者體重。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種控制需要的受試者體內(nèi)的 血糖水平的方法，該方法包含給予所述受試者有效量的EGF。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種控制需要的受試者體內(nèi)的 血液胰島素水平的方法，該方法包含給予所述受試者有效量的EGF。
在所述控制受試者體內(nèi)的血糖水平或者控制受試者體內(nèi)的血液胰烏 素水平的方法中，通過以不依賴于葡萄糖的方式調(diào)節(jié)所述血液胰島素水 平以實(shí)現(xiàn)對血糖水平的控制。所述EGF可以是人EGF。所述有效量為5 錄/kg至100//g/kg受試者體重，并更優(yōu)選10俾/kg至60錄/kg受試者 體重?？山?jīng)口腔、皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給予所述EGF。所述受試者為患有糖尿病的患者或者正常受試者。
本發(fā)明的藥物組合物或其各個(gè)活性成分的劑型包括口服的劑型，例
如片劑、膠嚢(包括軟膠嚢和微膠嚢)、粉劑、粒劑、糖漿劑等；以及非 口服的劑型，例如注射液(例如皮下注射液、靜脈注射液、肌內(nèi)注射液、 腹腔內(nèi)注射液等)、外用型(例如鼻腔噴霧制劑、經(jīng)皮吸收制劑、軟膏劑 等)、栓劑(例如直腸栓劑、陰道栓劑等)、丸劑、點(diǎn)滴注劑等。
本發(fā)明的藥物組合物的劑量可參考所述各個(gè)藥物的推薦劑量來適當(dāng) 地確定，并且可依照以下因素適當(dāng)?shù)剡x擇受試者、受試者的年齡和體 重、當(dāng)前的臨床狀況、給藥時(shí)間、劑型、給藥方法、藥物的結(jié)合等。胰 島素致敏劑和降食欲劑的劑量可基于臨床使用的劑量適當(dāng)?shù)剡x擇。例如， 對成年糖尿病患者(體重50kg)給予胰烏素致敏劑時(shí)，每天的劑量通 常是O.Ol至1000 mg，優(yōu)選O.l至500 mg。該劑量一天可給予一次至 數(shù)次。
EGF僅需要短暫接觸(1 min )即能刺激胰島素分泌(圖1A ),并在 單獨(dú)處理時(shí)可升高Ca"水平(圖2A)，這表明它可以用作引發(fā)劑。再者， EGF加性地刺激依賴于葡萄糖的胰島素分泌(圖1C)，這意味著EGF 效應(yīng)不依賴于葡萄糖。通過葡萄糖的胰島素分泌具有兩階段的模式在 5min附近有最高點(diǎn)，在10min有最低點(diǎn)，此后是緩慢的升高階段，并 且該第一階段是所述確保葡萄糖穩(wěn)態(tài)的依賴于胰島素的過程的關(guān)鍵
(Caumo A， et al"」附JiVi戸o/E油cW"0/飽fl6 287:E371-385， 2004 )。 EGF受體介導(dǎo)的胰島素分泌的時(shí)間進(jìn)程類似于神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)遞質(zhì) 釋放，并且比所述胰臟細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌的第一階段更迅 速。與葡萄糖相比，EGF誘導(dǎo)的胰島素釋放需要快速的Ca"內(nèi)流，所述 葡萄糖需要3-4 min用于Ca"內(nèi)流，這主要是因?yàn)槠咸烟谴x的時(shí)間以 及ATP/ADP比率變化的延遲(數(shù)據(jù)未顯示)。胰島素分泌有時(shí)可以通過 涉及跨膜受體、異源三聚G-蛋白和第二信使的經(jīng)典信號傳遞級聯(lián)調(diào)節(jié)
(Rosenbaum T, et al"50:1755-1762， 2001; Itoh Y， et al" 7Vfl"re 422:173-176， 2003;Mears D ， / Afe附6r fi/。/ 200:57-66， 2004 )。因 此，EGF受體介導(dǎo)的胰島素分泌的調(diào)節(jié)合理的。在本文中，EGF的一種 新作用被定義為體外和體內(nèi)胰島素分泌的引發(fā)劑，這表明EGF有治療糖 尿病的潛力。
PLD可由EGF刺激激活，且與由其他PLD調(diào)節(jié)分子例如葡萄糖等的激活相比，該激活是一個(gè)很迅速的過程。EGF介導(dǎo)的PLD活化的機(jī)制仍然是有爭議的。其中，依賴于EGF的<^2+升高會激活蛋白激酶C
(PKC )并導(dǎo)致PLD的激活(Yeo EJ， et al" /5/o/ C7^附270:3980-3988，1995)。另一項(xiàng)研究表明，Ca"內(nèi)流與PLD的激活有關(guān)，并且PKC參與至該過程中(Sun SH， et al.， /7Ve"rac/^w 73:334-343， 1999 )。然而，關(guān)于Ca"介導(dǎo)的PLD特定同工酶的激活的研究是有限的。在本研究中，本發(fā)明人鑒定了 PLD2在EGF處理的胰臟p-細(xì)胞中為依賴于Ca^的同工酶
(圖3C和3D )。雖然PLD1和PLD2共享約50%的序列同源性并包含相似的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(Frohman MA， et al.， ^/oc/f/zw fi/o/;/i" ^cto1439:175-186,1999 )，但它們顯示出不同的細(xì)胞定位和調(diào)節(jié)蛋白相互作用
(Min DS, et al"倫/ Ce〃s 11:369-378， 2001; Hiroyama M， et al" / 0〃所oc/^附95:149-164， 2005 )。以前的報(bào)道表明，PLD1和PLD2經(jīng)一個(gè)兩步驟的過程調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中胞吐作用的不同階段(Choi WS， et al.， //附附《"0/ 168:5682-5689， 2002 ):通過連接有顆粒的PLD1調(diào)節(jié)，將顆粒易位至細(xì)胞的外周；以及通過連接至質(zhì)膜的PLD2調(diào)節(jié)，將顆粒與所述質(zhì)膜以Ca^依賴的方式融合。與指出PLD1為葡萄糖刺激的胰島素分泌的介質(zhì)的在先才艮道(Hughes WE， et al.， /丑,W C&附279:27534-27541，2004 )不同的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的情況是EGF的刺激需要PLD2的活化。葡萄糖對PLD1的特異性活化及EGF對PLD2的特異性活化具有不同的動力學(xué)，其機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。本發(fā)明人通過使用PLD2特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡(圖3C和3D)和通過RT-PCR (數(shù)據(jù)未顯示)兩種方法在MIN6細(xì)胞中探測PLD2。再者，本發(fā)明人4吏用過表達(dá)和沉默策略來確定是PLD2而非PLD1介導(dǎo)了 EGF依賴性胰島素分泌(圖3C和3D )。從這些結(jié)果可推定，葡萄糖以相對晚的時(shí)程經(jīng)PLD1刺激胰島素分泌，而EGF激活定位于質(zhì)膜的PLD2，這導(dǎo)致預(yù)?？康囊葝u素顆粒與所述質(zhì)膜的快速融合。本發(fā)明人的工作證實(shí)這樣的XRL點(diǎn)，即PLD1和PLD2介導(dǎo)調(diào)節(jié)胰島素分泌的不同通路。由于PLD是胞吐過程中重要的分子，研究PLD將會提供對胰島素分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制的顯著深入的了解。在胰島素分泌中PLD1和PLD2的不同調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。
葡萄糖代謝導(dǎo)致ATP敏感K+通道的關(guān)閉，并且隨后的質(zhì)膜去極化可開啟電壓敏感Ca2+通道(Henquin JC， D/"6efes 49:1751-1760， 2000 )。所導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)中游離Ca^濃度升高對于觸發(fā)由預(yù)?？康囊葝u素顆粒與
9所述質(zhì)膜融合所介導(dǎo)的胰島素釋放的初始階段是必要且充分的(MearsD， / Me附^ 200:57-66， 2004 )。本發(fā)明人的結(jié)果表明，EGF刺激的Ca"內(nèi)流可介導(dǎo)胰島素分泌(圖2B)。在本發(fā)明中，本發(fā)明人確定了 EGF刺激的胰島素分泌需要Ca"內(nèi)流和PLD活性(圖2B和3B )。本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)(圖4)說明，Ca"內(nèi)流是PLD活性的上游信號。本發(fā)明表明，在胰臟p-細(xì)胞的胰島素分泌中促分泌劑誘導(dǎo)的Ca"內(nèi)流和PLD活性之間有密切的關(guān)系。
EGF調(diào)節(jié)胰臟機(jī)能，并產(chǎn)生于胰臟和胰液中(Huotari MA， et al.，五/i^cn"o/0gj; 139:1494-1499， 1998)。 EGFR在整個(gè)人胚胎胰臟中都表達(dá)，并且缺失EGFR的小鼠出現(xiàn)胰烏形成的異常。所述EGF家族的某些成員在胰臟發(fā)育中有作用。EGF調(diào)節(jié)大鼠胰臟p-細(xì)胞的胰島素含量，以及它們的再生。再者，EGF缺乏與糖尿病有關(guān)在糖尿病動物中，EGF或EGFR在多種器官和體液中的水平降低，所述器官和體液例如肝臟、下頜下腺、血漿和乳(Thulesen J， et al.，五mtocr27:139-144， 1993 )。值得注意的是，在胰島素治愈性治療后這些蛋白的水平一般會恢復(fù)，并且EGF和胰島素在糖尿病瘙愈過程中協(xié)同地作用(Hennessey PJ， et al.,125:926-929， 19卯)。雖然EGF顯示與增量調(diào)節(jié)胰島素分泌的依賴于GLP-1的信號傳遞有交匯(crosstalk) (MacDonald PE， et al.， J祝o/0^附278:52446-52453， 2003 )，但沒有才艮道顯示EGF可以急性地調(diào)節(jié)所述胰島素分泌。與本發(fā)明人從MIN6細(xì)胞系(圖1 )、 RINm5F細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未顯示)和小鼠胰島(圖5)得到的這樣體外發(fā)現(xiàn)一致，即EGF能刺激胰島素釋放，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EGF在正常小鼠并甚至在糖尿病小鼠中升高了血漿胰島素水平并降低了血漿葡萄糖水平(圖6)。再者，本發(fā)明人觀察到，葡萄糖注射升高了生理EGF水平。本發(fā)明人從這些結(jié)果推測，生理EGF快速地增加胰島素分泌，并且該過程在血漿葡萄糖水平的短期調(diào)節(jié)中可能是重要的。EGF依賴的胰島素分泌對于我們體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)可能起到類似于葡萄糖的功能。使用敲低(knock down)、抗體或適體(aptamer)降低EGF的內(nèi)源水平將表明EGF對葡萄糖和胰島素穩(wěn)態(tài)的生理作用。綜合考慮EGF對胰島素分泌以及p-細(xì)胞再生的作用，這些結(jié)果可有利于更好地理解糖尿病的病理生理學(xué)，患糖尿病時(shí)血清EGF水平降低。再者，EGF在糖尿病小鼠體內(nèi)的作用表明EGF可用為糖尿病的潛在治療劑。通過參考下文的實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)一步解釋本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
避
增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire, United Kingdom ); [311]豆蔻酸購自Dupont NEN(Boston, MA);硅膠60薄層色譜板購自MERCK (Darmstadt,Germany);達(dá)爾伯克改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM )、 RPMI 1640和LipofectAMINE購自Invitrogen( Carlsbad, CA);胎牛血清購自HyClone(Logan, UT ); EGF購自Daewoong Pharmaceutical Company ( Seoul,Republic of Korea );辣根過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗兔IgG與抗小鼠IgA、IgG和IgM購自Kirkegaard and Perry Laboratories ， Inc.( Gaithersburg，MD );并且Fluo-3 AM購自Molecular Probes ( Eugene, OR )。按照先前所述方法(Lee et al.，必/oc/f/附必/o/;/^s爿c似1347:199-204， 1997)制備可同時(shí)識別PLD1和PLD2兩者的多克隆抗體(mSTP4 )。按照先前所述方法(Kim et al.， /7Ve"rac/^附85:1228-1236， 2003 )生產(chǎn)PLD2-特異性抗體。所有其他的化學(xué)試劑購自Sigma ( St. Louis, MO )。
實(shí)施例1: EGF刺激MIN6細(xì)胞中胰島素分泌
EGF在胰臟中產(chǎn)生，具有胰臟效應(yīng)，并且它在糖尿病患者體內(nèi)的循環(huán)水平有變化(Burgess AW， 5rM^/5"http:// 45:401-424， 1989; Kasayama Setal"/VociVa"爿cfld5W C/S爿86:7644—7648， 1989)。進(jìn)4亍本實(shí)施例以確定EGF是否能刺激胰島素分泌，以及EGF導(dǎo)致的胰島素分泌與葡萄糖的處理是否是加性的。
1.1方法
小鼠的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞MIN6m9由Susumu Seino博士(Division of Cellular and Molecular Medicine, Kobe UniversityGraduate School of Medicine, Kobe, Japan)提供，使用該細(xì)胞的第19至25代，并且于增濕的C02可控的(5%)培養(yǎng)箱中在37。C下培養(yǎng)于含以下物質(zhì)的DMEM中25 mM葡萄糖、10 mM HEPES、 10% (v/v)胎牛血清、50 IU/ml青霉素和50將/ml鏈霉素。如以前的描述(Kim et al.，J Immunol 163:5462-5470， 1999 )，使用LipofectAMINE轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞。使用LipofectAMINE的轉(zhuǎn)染率為約30-40%。
應(yīng)^#為、必浙定；將在12-孔板或24-孔板中培養(yǎng)的濃度為每孔10-15個(gè)分離的胰島或lxl06細(xì)胞的原料用添加0.2%牛血清白蛋白(BSA)的KRB洗滌兩次，然后在37。C下于KRB溶液中孵育60min。在同一組實(shí)驗(yàn)中使用相同數(shù)量的胰島。在孵育結(jié)束后，用含測試劑的新鮮KRB替換所述溶液并孵育指定的時(shí)間。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心除去細(xì)胞，然后用放射免疫分析(RIA)試劑盒(Linco， St.Louis， MO)測定上清液的胰島素。
鍵^"為、^f.'結(jié)果表示為平均值± SE或平均值± SD (對于PLD活性測定和胰島素分泌測定)。通過Student's ,-檢驗(yàn)評估平均值之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。尸<0.05,皮^人為是統(tǒng)計(jì)顯著的。
1-2.對小鼠MIN6胰島素瘤細(xì)胞進(jìn)行的EGF胰島素分泌測試
為了確定EGF是否能刺激胰島素分泌，本發(fā)明人用EGF處理小鼠MIN6胰島素瘤細(xì)胞。1 min的EGF處理顯著增加了姨鳥素分泌。EGF顯示出以時(shí)間和劑量依賴的方式刺激MIN6細(xì)胞中的胰島素分泌，具有比葡萄糖更快的動力學(xué)(圖1A和1B)。具體地，1-2 min和1.5-15 nM的EGF處理顯示為有效的時(shí)間和濃度(圖1A和1B)。
將所述M1N6細(xì)胞鋪在24-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述細(xì)胞用添加0.2% BSA的KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下孵育60 min。
在圖1A中，在孵育結(jié)束后，用不含其他物質(zhì)(NT)的、含15nMEGF(人EGF, genbank登記號CAA34卯2 )或11 mM葡萄糖的新鮮KRB替換所述溶液，并孵育0、 1、 2、 5或10min。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后測定所述上清液的胰島素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *，與未處理(NT)細(xì)胞相比P< 0.05。
在圖1B中，在賻育結(jié)束后，用含0、 1.5、 15或150 nM的EGF的新鮮KRB替換所述溶液，并孵育lmin。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后測定所述上清液的胰島素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *，與未處理細(xì)胞相比P〈0.05。
1-3.對EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞胰島素分泌的葡萄糖處理
12為了確定葡萄糖處理對于EGF導(dǎo)致的胰島素分泌是否是加性的，本 發(fā)明人測試了高(11 mM )葡萄糖對EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌的作用。EGF 增加了基礎(chǔ)葡萄糖濃度(2.7 mM)下的胰島素水平，也加性地增加了高 (11 mM)葡萄糖水平下葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放(圖1C)?？傊?，這 些數(shù)據(jù)表明，EGF像葡萄糖一樣是胰臟P-細(xì)胞中胰島素分泌的引發(fā)劑， 并且EGF對胰島素分泌的作用是依賴于葡萄糖的。
在圖1C中，在孵育結(jié)束后，在存在2.7或11 mM葡萄糖的情況下 用含0、 15或30 nM的EGF的新鮮KRB替換所述溶液，并賻育5分鐘。 對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后測定所述上清液的胰島 素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *或**, 與2.7或11 mM葡萄糖處理的細(xì)胞相比P< 0.05。
實(shí)施例2: EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌依賴于MIN6細(xì)胞中的Ca"內(nèi)流 胰島素分泌需要細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+i)的升高(Barg S et al.， 51 (Suppl l):S74-82， 2002)。進(jìn)行本實(shí)施例以確定Ca2+內(nèi)流對 EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌的作用。 2.1 [Ca2+i測量法
在共聚焦顯微鏡下使用Ca2十-敏感染料監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變 化。在室溫下用2 W Fluo-3 AM裝載細(xì)胞40 min。用Krebs-Ringer碳 酸鹽(KRB; 129 mM NaCl、 5 mM NaHC03、 4.8 mM KCl、 1.2 mM KH2P04、 1.0inMCaC12、 1.2 mM MgS04、 2.7 mM葡萄糖和10 mM HEPES, pH 7.4 )緩沖液洗滌后，將所述細(xì)胞在無Fluo-3 AM的條件下 繼續(xù)孵育15min以將所述染料去酯化。為了排除可能的染料裝載影響， 在所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)本發(fā)明人用皂苷將水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了標(biāo)準(zhǔn)化，本 發(fā)明人測量了所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的剩余熒光(Fo),并從實(shí)驗(yàn)條件下的焚光 (F )中減去該剩余焚光。通過氬激光器在488-nm下進(jìn)行Fluo-3 AM的 激發(fā)，發(fā)射區(qū)間為515-nm。在倒置的共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510 Meta， Oberkochen， Germany)上用20x的物鏡捕捉圖斗象。
2.2. Ca2+內(nèi)流對EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌的作用
將所述MIN6細(xì)胞鋪在玻璃皿或24-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述細(xì)胞 用添加0.2% BSA的KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下孵育 60 min。
13在圖2A中，在孵育結(jié)束時(shí)，用含溶解于DMSO中的Fluo-3 AM (lmg/ml)的新鮮KRB替換所述溶液，并孵育1 h。在孵育結(jié)束時(shí)，將 細(xì)胞單獨(dú)(未處理)或與EGTA賻育30 min,然后用15 nM EGF處理。 在倒置的共聚焦顯微鏡上用20x的物鏡捕捉圖像。為了標(biāo)準(zhǔn)化，本發(fā)明 人測量了所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的剩余熒光(Fo),并從實(shí)驗(yàn)條件下的焚光(F) 中減去該剩余熒光。顯示的數(shù)據(jù)是平均值士S.E.， n=7。
圖2A證明了 ， EGF刺激了細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，該Ca2+內(nèi)流可以通 過EGTA處理降低。為了確定Ca2+內(nèi)流對EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌的作 用，本發(fā)明人用EGTA處理細(xì)胞以阻斷細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，或者用1,2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N，N，，N，-四乙酸四(乙酰氧基甲酯) (BAPTA/AM )處理細(xì)胞以同時(shí)阻斷細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋 放。
在圖2B中，在孵育結(jié)束時(shí)，用不含其他物質(zhì)(未處理的)、含EGTA 或BAPTA/AM的新鮮KRB替換所述溶液并孵育30 min，然后用15 nM EGF處理0或1 min。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后 測定所述上清液的胰島素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定 的平均值士S.D.。 *，與EGF處理的細(xì)胞相比戶〈0.05。
Ca2+螯合劑減少了 EGF誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞的胰島素分泌(圖2B )。 在RINm5F細(xì)胞中也觀察到了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊?，這些 結(jié)果表明，Ca2+內(nèi)流對于EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌是必需的。
實(shí)施例3: PLD2介導(dǎo)MIN6細(xì)胞中依賴于EGF的胰島素分泌 以前的報(bào)道表明，PLD是一種介導(dǎo)多種胞吐作用的重要分子(Jones D et al" 5/oc/i/附所—f勿"1439:229-244， 1999; Choi WS et al" / /附附腳/ 168:5682-5689， 2002; Metz SA et al".祝oc/^附/ 270:427-435， 19卯)。本發(fā)明人首次在MIN6細(xì)胞中測試了 PLD活性。EGF刺激快速 地(在2min內(nèi))激活了 PLD(圖3A)。依賴于EGF的胰島素分泌被正 丁醇(PLD抑制劑)處理抑制，而不被作為對照的叔丁醇處理抑制(圖 3B)。這些結(jié)果表明，PLD活性對于EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌是必需的。 在RINm5F細(xì)胞中也觀察到了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
^45J^fc將大鼠PLD1或人PLD2的全長cDNA連接至pcDNA 3.1載體中用于轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。S/鼎M y^Wz對應(yīng)于小鼠PLD1 (第1099 - 1119位核苷酸， AACACGUUAGCUAAGUGGUAU) ( SEQ ID NO:l)或PLD2序列(第 2539 - 2559位核苷酸，AACUCCAUCCAGGCUAUUCUG ) ( SEQ ID NO:2 )的長度為21的siRNA購自Dharmacon Research Inc. ( Lafayette, CO )。所有siRNA序列的BLAST搜索結(jié)果均顯示與數(shù)據(jù)庫程序中任何 其他序列無顯著同源性。
勿應(yīng)^i^D活^將培養(yǎng)于6-孔板中的細(xì)胞用KRB洗滌兩 次，然后于KRB溶液中在37。C下用[3H豆蔻酸標(biāo)記4h。通過測量磷脂 ?；〈?PBt)的形成測定PLD活性(Kim JH et al.， J Immunol 163:5462-5470， 1999)。在存在0.4%的正丁醇的條件下測量了 PBt斑的 強(qiáng)度，并且通過減去在無正丁醇的條件下得到的相應(yīng)斑強(qiáng)度得到PLD活 性。
為了鑒定負(fù)責(zé)刺激胰島素分泌的PLD同工酶，本發(fā)人檢查了 PLD 同工酶過表達(dá)和沉默的作用。用空載體、PLD1或PLD2轉(zhuǎn)染MIN6細(xì) 胞，并用EGF刺激這些細(xì)胞。如以前的才艮道所示(Hughes WE et al., C7^附279:27534-27541， 2004 ), PLD1介導(dǎo)了依賴于葡萄糖的胰島素分泌 (數(shù)據(jù)未顯示)。相反，PLD2排他性地介導(dǎo)了依賴于EGF的胰島素分 泌，并且PLD1的過量表達(dá)顯示了一個(gè)有限的影響(圖3C的上圖)。再 者，沉默PLD2 (而非PLD1)消除了 EGF誘導(dǎo)的胰島素分泌(圖3D 的上圖)。在RINm5F細(xì)胞中也觀察到了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。最 后，用PBt形成測量的依賴于EGF的PLD活性可通過PLD2過量表達(dá) 或沉默排他性地調(diào)節(jié)(圖3C和3D的下圖)，這說明在這些細(xì)胞中PLD2 對于EGF刺激的胰島素分泌是必需的。
在圖3A中，將所述MIN6細(xì)胞鋪在6-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述 細(xì)胞用KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下在存在^H豆蔻酸 的條件下孵育4h。在孵育結(jié)束時(shí)，用15nMEGF刺激指定的時(shí)間。測 量了在存在正丁醇和EGF的條件下經(jīng)過O、 1、 2、 5或10min積累后的 PBt斑強(qiáng)度，并且通過減去在無正丁醇的條件下得到的相應(yīng)斑強(qiáng)度得到 結(jié)果。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。
在圖3B中，將所述MIN6細(xì)胞鋪在24-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述 細(xì)胞用添加0.2% BSA的KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下 孵育60min。在孵育結(jié)束時(shí)，用含0.4%叔丁醇或正丁醇的新鮮KRB替換所述溶液并孵育10 min，然后將MIN6細(xì)胞用15 nM EGF處理0或1 min。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后測定所述上清液 的胰島素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *，與EGF處理的細(xì)胞相比戶〈0.05。
在圖3C和3D中，將所述MIN6細(xì)胞鋪在24-孔板(用于測量胰島 素水平)或6-孔板(用于測量PLD活性)上并所示的質(zhì)粒(圖3C中的 載體、PLD1或PLD2)或siRNA (圖3D中的對照(螢光素酶)、小鼠 PLD1或小鼠PLD2 )轉(zhuǎn)染，然后培養(yǎng)24h或72h。轉(zhuǎn)染的效率為約30-40%。 為了測量胰島素分泌(上圖)，將所述細(xì)胞用添加0.2% BSA的KRB洗 滌兩次，然后于KRB溶液中在37""C下孵育60 min。在孵育結(jié)束時(shí)，用 含15 nM EGF的新鮮KRB替換所述孵育培養(yǎng)基0或1 min。對所述孵 育培養(yǎng)基取樣并離心以除去細(xì)胞，然后測定所述上清液的胰島素水平。 顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *，與EGF處理 的細(xì)胞相比P < 0.05。為了測量PLD活性(下圖)，將所述細(xì)胞用KRB 洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37-C下在存在fH]豆蔻酸的條件下孵育 4h。在孵育結(jié)束時(shí)，用15nMEGF刺激0或lmin。測量了在存在正丁 醇和EGF的條件下經(jīng)過1 min積累后的PBt斑強(qiáng)度，并且通過減去在無 正丁醇的條件下得到的相應(yīng)斑強(qiáng)度得到結(jié)果。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú) 立的平行測定的平均值士S.D.。 *,與EGF處理的細(xì)胞相比P〈0.05。將 細(xì)胞用含0.1%曲拉通X-100 (Triton X-100 )的KRB裂解并進(jìn)行 SDS-PAGE,然后使用PLD抗體(圖3C的插圖)和圖3D的PLD1插圖)、 PLD2特異性抗體(圖3D的PLD2 -插圖)或肌動蛋白抗體(圖3C和 3D的肌動蛋白-插圖)進(jìn)行免疫印跡。
實(shí)施例4:在MIN6細(xì)胞中PLD活性依賴于Ca"內(nèi)流 因?yàn)镃a"內(nèi)流和PLD活性都是依賴于EGF的胰島素分泌必需的， 所以本實(shí)施例通過測試Ca^內(nèi)流對PLD活性的作用以及PLD活性對 Ca"內(nèi)流的作用，分析了兩者之間的關(guān)系。通過使用EGTA或 BAPTA/AM阻斷Ca^內(nèi)流抑制了大部分的PLD活性(圖4A )，該活性 與依賴于EGF的胰島素分泌有關(guān)聯(lián)(圖2B)。然而，通過沉默PLD同 工酶抑制PLD活性(PLD的成功沉默可通過蛋白質(zhì)印跡法確證)對依 賴于EGF的Ca"內(nèi)流幾乎沒有影響(圖4B)，這說明Ca"內(nèi)流在依賴
16于EGF的胰島素分泌中位于PLD激活的上游。
在圖4A中，將所述MIN6細(xì)胞鋪在6-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述 細(xì)胞用KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下在存在^H豆蔻酸 的條件下孵育4h。在孵育結(jié)束時(shí)，用不含其他物質(zhì)(未處理的)、含EGTA 或BAPTA/AM的新鮮KRB替換所述溶液并孵育30 min，然后用15 nM EGF處理0或lmin。測量了在存在正丁醇的條件下經(jīng)過1 min積累后 的PBt斑強(qiáng)度，并且通過減去在無正丁醇的條件下得到的相應(yīng)斑強(qiáng)度得 到結(jié)果。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士 S.D.。 *，與 EGF處理的細(xì)胞相比< 0.05 。
在圖4B中，將所述MIN6細(xì)胞鋪在玻璃板皿上并用siRNA(對照(螢 光素酶)、小鼠PLD1或小鼠PLD2)轉(zhuǎn)染，然后培養(yǎng)24h。將所述細(xì)胞 用添加0.2% BSA的KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下孵育 60min。在賻育結(jié)束時(shí)，用含溶解于DMSO中的Fluo-3 AM (1 mg/ml) 的新鮮KRB替換所述溶液，并孵育1 h。在孵育結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞用15 nM EGF處理。在倒置的共聚焦顯微鏡上用20x的物鏡捕捉圖像。為了標(biāo)準(zhǔn) 化，本發(fā)明人測量了所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的剩余熒光(Fo),并從實(shí)驗(yàn)條件下 的熒光(F)中減去該剩余熒光。顯示的數(shù)據(jù)是峰時(shí)的平均值士S.E.， n=7。 將細(xì)胞用含0.1%曲拉通X-100的KRB裂解并進(jìn)行SDS-PAGE,然后使 用PLD抗體(圖4B的PLD1插圖)、PLD2專用抗體(圖4B的PLD2 插圖)或肌動蛋白抗體(圖4B的肌動蛋白插圖)進(jìn)行免疫印跡。
i瘦伊遊》、浙..如以前的描述(Kim JH et al" J Immunol 163:5462-5470,1999 )，通過于Laemmli樣品緩沖液(Laemmli UK et al" 7Vfl似"227:680-685， 1970)中在95'C下煮沸5 min將蛋白變性，通過 SDS-PAGE分離，并進(jìn)行免疫印跡。
實(shí)施例5: EGF刺激的小鼠胰島中的胰島素分泌需要Ca"內(nèi)流和 PLD活性
為了證實(shí)EGF、 Ca"和PLD對胰島素分泌的生理學(xué)重要性，本發(fā)明 人制備了小鼠胰島的原代培養(yǎng)物。如預(yù)期的一樣，lmin的EGF處理快 速地增加了胰島素分泌(圖5A)，并且在多種生長因子中該作用是特異 的(數(shù)據(jù)未顯示)。抑制Ca"內(nèi)流或PLD活性完全阻斷了 EGF誘導(dǎo)的胰 島素分泌(圖5B和5C)，這表明EGF刺激的小鼠胰島中的胰島素分泌需要Ca2+內(nèi)流和PLD。
為了制備小鼠胰島，如以前的描述(Jonas JC， et al.， Diabetes 47:1266-1273， 1998)從7周至8周齡的雄性BALB/c小鼠(Hyochang Science, Korea)分離胰島。將分離的胰島轉(zhuǎn)移至12-孔板中，并且每個(gè) 孔中10-15個(gè)胰島。在同一組實(shí)驗(yàn)中使用相同數(shù)目的胰島。將所述胰島 在含5mM葡萄糖、10%胎牛血清的RPMI1640、 100g/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的培養(yǎng)基中保持最長至2天。
將所述小鼠胰島鋪在12-孔板上并培養(yǎng)24 h。將所述胰島用添加0.2% BSA的KRB洗滌兩次，然后于KRB溶液中在37。C下孵育60 min。
在圖5A中，在孵育結(jié)束時(shí)，用新鮮KRB替換所述溶液，并單獨(dú)(NT ) 孵育或者與15 nM EGF或11 mM葡萄糖孵育1或5 min。對所述孵育培 養(yǎng)基取樣并離心以除去胰島，然后測定所述上清液的胰島素水平。顯示 的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士 S.D.。 *或**，與1或5分 鐘處理的胰島相比P < 0.05。
在圖5B中，在孵育結(jié)束時(shí)，用不含其他物質(zhì)(未處理的)、含EGTA 或BAPTA/AM的新鮮KRB替換所述溶液并醉育30 min，然后用15 nM EGF處理0或1 min。對所述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去胰島，然后 測定所述上清液的胰島素水平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定 的平均值士S.D.。 *,與EGF處理的胰島相比P〈0.05。
在圖5C中，在孵育結(jié)束時(shí)，用含0.4。/。叔丁醇和正丁醇的新鮮KRB 替換所述溶液并孵育10 min，然后用15 nM EGF處理0或1 min。對所 述孵育培養(yǎng)基取樣并離心以除去胰島，然后測定所述上清液的胰島素水 平。顯示的數(shù)據(jù)是來自兩次獨(dú)立的平行測定的平均值士S.D.。 *,與EGF 處理的胰島相比P〈0.05。
實(shí)施例6: EGF降低血漿葡萄糖水平并增加血漿胰島素水平
為了驗(yàn)證EGF能刺激胰島素釋放這一體外發(fā)現(xiàn)，本實(shí)施例通過靜脈
注射EGF表征了正常和肥胖必/必小鼠中EGF介導(dǎo)的對小鼠血漿葡萄
糖水平和血漿胰島素水平的應(yīng)答。
浙量i^^萄溏;^乎^i&《腐4,;^乎7周至8周齡的雄性ICR 小鼠購自Hyochang Science (Seoul, Korea )。 C57BLKSJ-W/i仿小鼠購
18自SLC ( Japan )。在禁食6 h后，給ICR或C57BLKSJ-W/必小鼠經(jīng)尾 靜脈靜脈注射鹽水、EGF、胰島素或葡萄糖，并采集血樣(0.1 ml )。用 便攜式葡萄糖計(jì)(Gluco-Dr， Korea )通過葡萄糖氧化酶法測量血漿葡萄 糖濃度。通過離心分離血漿并用RIA試劑盒進(jìn)行血漿胰島素測定。依照 本發(fā)明人的研究所的指導(dǎo)方針進(jìn)行動物的管理。
浙f血^五GF^乎7周至8周齡的雄性ICR小鼠購自Hyochang Science (Seoul, Korea )。在禁食6h后，給ICR小鼠經(jīng)口腔注射鹽水或 葡萄糖，并采集血樣(O.l ml)至涂鋪有EGTA的管中。通過EGFELISA 試劑盒(KOMA biotech， Korea )測量血漿EGF濃度水平。通過離心分 離血漿并用RIA試劑盒進(jìn)行血漿胰島素測定。依照本發(fā)明人的研究所的 指導(dǎo)方針進(jìn)行動物的管理。
在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，在將50 g/kg的EGF靜脈注射至7周至8周齡的雄性 ICR小鼠體內(nèi)10分鐘后達(dá)到了飽和的血漿葡萄糖降低作用(數(shù)據(jù)未顯 示)。這種EGF (50 g/kg)的葡萄糖降低作用與胰島素的功效類似并具 有劑量依賴性(圖6A)。而且，EGF和葡萄糖(0.5 g/kg )也都可以增加 血漿胰島素水平(圖6B)，這表明該葡萄糖降低作用是由于血漿胰島素 水平變化引起的。胰島素分泌的動力學(xué)和葡萄糖的變化是相關(guān)的。再者， 與用鹽水處理相比，口腔注射葡萄糖引起血漿EGF水平升高(圖6C)。 該結(jié)果表明，EGF的生理濃度可以通過飼養(yǎng)條件來改變，并且分泌的 EGF最終會調(diào)節(jié)胰島素分泌。EGF還降低了肥胖必/必小鼠體內(nèi)的血漿 葡萄糖水平，并增加了血漿胰島素水平(圖6D和6E)?？傊?，本發(fā)明人 的結(jié)論是，EGF在正常和糖尿病小鼠模型中具有刺激胰島素分泌以及降 低血漿葡萄糖的能力。
在圖6A中，7周至8周齡的雄性ICR小鼠(10小鼠/組)經(jīng)靜脈注 射鹽水(0.9%溶于雙蒸水中的NaCl )、胰島素(0.06 U/kg )或EGF( 18.5 或50g/kg)，并測量血漿葡萄糖水平。所顯示的數(shù)據(jù)為平均值士S.E.,卞 (胰島素)、* ( EGF 50 g/kg )或** ( EGF 18.5 g/kg )，在所示時(shí)間內(nèi)與 鹽水處理的小鼠相比7 < 0.05。
在圖6B中，7周至8周齡的雄性ICR小鼠(10小鼠/組)經(jīng)靜脈注 射鹽水、葡萄糖(0.5 g/kg )或EGF (18.5或50 g/kg )，并測量血漿胰島 素水平。所顯示的數(shù)據(jù)為平均值土S.E.， $(葡萄糖)、*(EGF50g/kg)
19或** ( EGF 18.5 g/kg )，在標(biāo)明所示內(nèi)與鹽水處理的小鼠相比/><0.05。
在圖6C中，7周至8周齡的雄性ICR小鼠(10小鼠/組)經(jīng)口腔注 射鹽水、葡萄糖(2g/kg),并測量血漿EGF水平。所顯示的數(shù)據(jù)為平均 值士S.E.， *，在所示時(shí)間內(nèi)與鹽水處理的小鼠相比卩<0.05。
在圖6D中，肥胖C57BLKSJ-必/i仿小鼠(6小鼠/組)經(jīng)靜脈注射鹽 水(0.9%溶于雙蒸水中的NaCl )、胰島素(0.06 U/kg )或EGF( 50 fig/kg ), 并測量血漿葡萄糖水平。所顯示的數(shù)據(jù)為平均值土S.E.,卞(胰島素)、* (EGF 50 fig/kg )，在所示時(shí)間內(nèi)與鹽水處理的小鼠相比P< 0.05。
在圖6E中，肥胖C57BLKSJ-必/必小鼠(6小鼠/組)經(jīng)靜脈注射鹽 水、葡萄糖(0.5 g/kg)或EGF (50嗎/kg)，并測量血漿胰島素水平。 比較在注射前和注射10min后的血漿胰島素水平。所顯示的數(shù)據(jù)為平均 值士S.E.， J(葡萄糖)或A(EGF50fig/kg)，與所示時(shí)間中內(nèi)與鹽水處 理的小鼠相比尸<0.05。所有動物均自由飲水。依照本發(fā)明人的研究所的 指導(dǎo)方針進(jìn)行動物的管理。
雖然已經(jīng)通過參考所述優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在不偏離附屬的權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的 主旨和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種改良和替換。
權(quán)利要求
1. 一種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包含EGF和可藥用的載體。
2. 權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述EGF以一種不依賴于葡萄糖 的方式刺激胰臟P -細(xì)胞的胰島素分泌。
3. 權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述EGF通過Ca2+內(nèi)流和PLP2 活化刺激胰臟P -細(xì)胞的胰島素分泌。
4. 權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述EGF為人EGF。
5. 權(quán)利要求1的藥物組合物，其中以按5滯/kg至100錄/kg所述 受試者體重的量給予所述EGF。
6. 權(quán)利要求5的藥物組合物，其中以按10 //g/kg至60滯/kg所述 受試者體重的量給予所述EGF。
7. —種用于控制需要的受試者體內(nèi)的血糖水平的方法，所述方法包 含對所述受試者給予有效量的EGF。
8. —種用于控制需要的受試者中血漿胰島素水平的方法，所述方法 包含對所述受試者給予有效量的EGF。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中通過以一種不依賴于葡萄糖的 方式調(diào)節(jié)所述血漿胰島素水平以實(shí)現(xiàn)控制血糖水平。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述有效量為5滯/kg至 100溪/kg所述受試者體重。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述有效量為10//g/kg至60雄/kg所述受試者體重。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述EGF為人EGF。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中通過口腔、皮下、靜脈內(nèi)或肌 內(nèi)給予所述EGF。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述受試者為患有糖尿病的患 者或者正常受試者。
全文摘要
本發(fā)明示出了，通過與EGF的短暫接觸經(jīng)由Ca2+內(nèi)流和PLD2依賴性機(jī)制刺激不依賴于葡萄糖的胰島素分泌。再者，本發(fā)明示出了，EGF是一種降低正常小鼠和糖尿病小鼠血漿中葡萄糖水平的新型促分泌劑，說明EGF有治療糖尿病的潛力。
文檔編號A61K38/18GK101489578SQ200780026555
公開日2009年7月22日 申請日期2007年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者徐判吉, 李惠映, 李秉大, 柳成浩, 芮敬武, 蔡榮燦, 金善姬, 金賢洙 申請人:浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)