專利名稱：由跨膜肽組成的自組裝納米顆粒及其用于特異性腫瘤內(nèi)遞送抗癌藥物的應(yīng)用的制作方法
專利說明由跨膜肽組成的自組裝納米顆粒及其用于特異性腫瘤內(nèi)遞送抗癌藥物的應(yīng)用
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體作為用于施用疏水性試劑和用于減輕與抗癌藥物如多柔比星、長春新堿、兩性霉素和類視色素的施用相關(guān)的毒副作用的遞送系統(tǒng)，已經(jīng)在臨床上和實(shí)驗(yàn)上被評價。脂質(zhì)體遞送的潛在優(yōu)點(diǎn)包括由于特異性靶向而增加的活性、在靶點(diǎn)處的藥物的螯合作用(sequestration)、防止藥物迅速代謝、由于各脂質(zhì)體中包裹許多藥物分子而增強(qiáng)的治療效果、以及由于藥物動力學(xué)改變而降低的毒性。
與“裸”藥相比，抗癌劑的脂質(zhì)體制劑已經(jīng)顯示出具有降低的毒性和增強(qiáng)的功效。已有多個抗腫瘤劑的脂質(zhì)體劑型被FDA批準(zhǔn)用于抗癌治療。然而，脂質(zhì)體制造難以工業(yè)化、以及脂質(zhì)體缺乏穩(wěn)定性和再現(xiàn)性妨礙了脂質(zhì)體更廣泛的應(yīng)用。
需要另一種這樣的遞送系統(tǒng)用于施用疏水性試劑如抗癌劑，所述遞送系統(tǒng)顯示出脂質(zhì)體的有利的性能、以及優(yōu)良的穩(wěn)定性、均一性、易于應(yīng)用和制備再現(xiàn)性，而且提供比脂質(zhì)體更小尺寸的顆粒。本發(fā)明提供這樣的遞送系統(tǒng)和應(yīng)用該系統(tǒng)的方法(例如，用于將疏水性試劑如抗癌劑遞送至受試者)。本發(fā)明的這些及其它的目的和優(yōu)點(diǎn)、以及另外的發(fā)明特征，從本文中提供的發(fā)明描述來看應(yīng)該是顯而易見的。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供一種處理疏水性試劑的方法，該方法包括(a)在水溶液中混合(i)疏水性試劑和(ii)分離的肽，即膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物，其中所述肽的一端具有一個或多個帶負(fù)電的殘基，和(b)容許所述肽自組裝成納米顆粒，其中納米顆粒包含所述疏水性試劑。
附圖的若干視圖的簡述

圖1為熒光發(fā)射強(qiáng)度(a.u.)對比納米顆粒濃度(mg/ml)的圖，所述納米顆粒包含SEQ ID NO1-PEG11(以圓表示)或SEQ ID NO1-PEG38(以空方形表示)。
圖2為波長最大值(nm)對比納米顆粒濃度(μM)的圖，所述納米顆粒包含SEQ ID NO1-PEG11(以圓表示)或SEQ ID NO1-PEG38(以空方形表示)。
圖3為靜脈注射一百萬MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的三組裸鼠存活百分比(％)對比治療天數(shù)的圖。在靜脈注射乳腺癌細(xì)胞的第二天和持續(xù)每周兩次，分別對小鼠腹膜內(nèi)注射(1)只有PBS(對照組)；(2)3mg/kg溶于PBS中的SEQ ID NO1-PEG27的納米顆粒(X4-4-6，3mg/kg)；或(3)12mg/kg溶于PBS的SEQ ID NO1-PEG27的納米顆粒(X4-4-6，12mg/kg)。
圖4表示用高分辨率NMR確定的納米顆粒(SEQ ID NO1-PEG27)內(nèi)的CXCR4肽的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及由膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域組成的自組裝納米顆粒用于遞送疏水性試劑如抗癌劑的用途。膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的TM結(jié)構(gòu)域以前被認(rèn)為是高疏水性肽(參見，例如，國際專利申請公開WO 99/43711和WO01/36477和美國專利7,105,488)。然而，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)置于水溶液中時，相應(yīng)于膜內(nèi)在蛋白質(zhì)TM結(jié)構(gòu)域的肽自組裝成穩(wěn)定的納米顆粒(微團(tuán))。
納米顆粒是通過讓分離的肽即膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的TM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物自組裝成納米顆粒而形成的?！癟M結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物”(本文中稱“TM肽”)指與膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的TM結(jié)構(gòu)域的一部分相同或基本上相同的肽。TM肽優(yōu)選包含至少約10個與膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的TM結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸(例如，約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50，或其范圍)?！盎旧舷嗤摹盩M肽包括膜內(nèi)在蛋白質(zhì)TM結(jié)構(gòu)域的一部分的一個或多個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或其范圍)保守氨基酸置換。
TM肽期望具有一個含一個或多個帶負(fù)電的殘基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，及其范圍)的末端。當(dāng)末端包含多于一個帶負(fù)電的殘基時，優(yōu)選地，帶負(fù)電的殘基是連續(xù)的。負(fù)電荷可由任何適宜的方式提供，如由在肽的一末端存在天冬氨酸或谷氨酸殘基提供(例如，通過增加殘基)。用正電荷置換負(fù)電荷會導(dǎo)致形成具有高度變化的直徑的較大顆粒。因此，盡管不希望受任何特定理論的束縛，但還是認(rèn)為帶負(fù)電殘基的存在(例如，兩個天冬氨酸殘基)使納米顆粒在形狀和尺寸上均一。優(yōu)選地，負(fù)電荷存在于肽的C-末端。
盡管不希望受任何特定的理論束縛，但還是認(rèn)為TM肽通過在水溶液中形成β-環(huán)結(jié)構(gòu)而自組裝。該環(huán)通過與淀粉狀原纖維中的淀粉狀肽的機(jī)制相類的機(jī)理連接。負(fù)電荷和短C-末端α-螺旋迫使TM肽納米結(jié)構(gòu)彎曲并限定其圓形形狀。通過高分辨率NMR顯示的納米顆粒中CXCR4肽的結(jié)構(gòu)，如圖4所示。
優(yōu)選地，TM肽與疏水性試劑如抗癌劑組合，然后使該抗癌劑包含在納米顆粒的疏水性中心內(nèi)。使疏水性試劑包載(entrapment)在納米顆粒中允許向受試者施用生理?xiàng)l件下通常不溶的疏水性試劑(例如，抗癌劑)，其中該試劑由于增加的滲透性和保留效應(yīng)在腫瘤內(nèi)濃縮。
因此，本發(fā)明涉及一種處理疏水性試劑的方法，該方法包括(a)在水溶液中組合(i)疏水性試劑和(ii)分離的肽，即膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物，其中所述肽的一端具有一個或多個帶負(fù)電的殘基，和(b)容許所述肽自組裝成納米顆粒，其中所述納米顆粒包含該疏水性試劑。
TM肽還可包含親水性低聚物，如聚乙二醇(PEG)、十一烷乙二醇(undecaethylene glycol)、聚苯乙烯、聚氨基酸(例如，聚甘氨酸)、及其組合。優(yōu)選地，將親水性樹脂加至含負(fù)電荷的同一端。盡管不希望受任何特定的理論束縛，但還是認(rèn)為將親水性低聚物加到TM肽上阻止聚集并促進(jìn)均一形狀和尺寸的顆粒的形成，所述顆粒理想地適合于例如腫瘤滲透。
加到TM肽上的親水性低聚物可以為任何適宜的長度。當(dāng)添加的親水性低聚物為PEG時，優(yōu)選使用PEG5或更大的PEG(例如PEG10、PEG11、PEG12、PEG15、PEG20、PEG25、PEG27、PEG30、PEG35、PEG38、PEG39、PEG40、PEG45，及其范圍)。理想地，PEG由約12至約27個單體單位組成。當(dāng)所添加的親水性低聚物為聚甘氨酸時，優(yōu)選使用3或更大的(例如4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35，或其范圍)聚甘氨酸。理想地，使用約10至約20個殘基的聚甘氨酸。值得注意的是，與相似長度的PEG尾相比，聚甘氨酸尾在降低聚集上更有效。
納米顆粒可以具有任何適宜的直徑。優(yōu)選地，納米顆粒的直徑為約3nm-約50nm(例如，約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、約10nm、約11nm、約12nm、約13nm、約14nm、約15nm、約16nm、約17nm、約18nm、約19nm、約20nm、約25nm、約30nm、約35nm、約40nm、約45nm，及其范圍)。更優(yōu)選地，納米顆粒的直徑為約8nm至約20nm。
形成納米顆粒的TM肽可以為任何適宜的長度。優(yōu)選地，TM肽包含約10至約50個氨基酸(例如，約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45個氨基酸，或其范圍)的長度。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，TM肽為長度約10至約30(例如，約15至約30)個氨基酸。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，TM肽為長度約20至約25個氨基酸，和在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，TM聚肽為長度約22至約25個氨基酸。如實(shí)施例3所示，納米顆粒的聚集隨著TM肽長度的減小而減少。
TM肽可以是任何適宜的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的一部分。適宜的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的實(shí)例包括G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員，如CXCR4，CCR5，CCKAR，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)，D1多巴胺受體(D1DR)，D2多巴胺受體，α1-腎上腺素能受體，β1-腎上腺素能受體，β2-腎上腺素能受體，以及V2血管升壓素受體(參見，例如，Herbert等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，27116384-16392(1996)；George等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，27330244-30248(1998)；Tarasova等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，274(49)34911-34915(1999)；和George等人，J Pharmacol.Exp.Ther.(藥理學(xué)試驗(yàn)治療雜志)，307481-489(2003)；美國專利7,105,488；和國際專利申請公布WO 99/43711)，以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，如P-糖蛋白(P-gp或MDR1)、MRP1、MRP2和BCRP/ABCG2(參見，例如，Tarasova等人，J.Med.Chem.(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)，483768-3775(2005)；國際專利申請公布WO01/36477)。
由某些受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的TM結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的納米顆粒具有其自身的生物學(xué)活性，如抑制轉(zhuǎn)移和/或血管生成的能力(例如，CXCR4TM結(jié)構(gòu)域)或抑制癌細(xì)胞的抗藥性的能力(P-gp和ABCG2TM結(jié)構(gòu)域)。因而，本發(fā)明的納米顆粒可以單獨(dú)施用或與包載在納米顆粒疏水性中心內(nèi)的疏水性試劑一起施用。當(dāng)納米顆粒與疏水性試劑(例如，抗癌劑)一起施用時，兩種生物活性試劑(納米顆粒本身和包載的疏水性試劑)的組合提供雙重活性的優(yōu)點(diǎn)。換言之，與脂質(zhì)體僅僅提供遞送裝置不同，本發(fā)明的納米顆粒具有其自身的活性，如降低癌細(xì)胞的抗藥性、抑制癌細(xì)胞的移動、以及抑制腫瘤環(huán)境中血管的生長。
適宜的TM肽包括國際專利申請公開WO 99/43711和WO 01/36477和美國專利7,105,488中描述的那些，以及 Leu-Leu-Phe-Val-Ile-Thr-Leu-Pro-Phe-Trp-Ala-Val-Asp-Ala-Val-Ala-Asn-Trp-Tyr-Phe-Gly-Asn-Asp-Asp(SEQ ID NO1；CXCR4-8)， Asp-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Tyr-Ser-Gly-Ile-Gly-Ala-Gly-Val-Leu-Val-Ala-Ala-Tyr-Ile-Gln-Val-Ser(SEQ ID NO2；MDR1-2)， Leu-Ile-Tyr-Ala-Ser-Tyr-Ala-Leu-Ala-Phe-Trp-Tyr-Gly-Thr-Thr-Leu-Val-Leu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Asp(SEQ ID NO3；MDR1-5)， Asp-Ser-Phe-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Val-Phe-Ser-Ala-Val-Val-Phe-Gly-Ala-Met-Ala-Val-Gly-Gln-Val(SEQ ID NO4；MDR1-12)，和 Ile-Phe-Gly-Ile-Thr-Phe-Ser-Phe-Thr-Gln-Ala-Met-Met-Tyr-Phe-Ser-Tyr-Ala-Gly-Cys-Phe-Asp-Asp(SEQ ID NO5；MDR1-11). 任何適宜的疏水性試劑都可以與納米顆粒一起使用。適宜的疏水性試劑包括制藥學(xué)上、農(nóng)業(yè)上或工業(yè)上可以使用的那些。這些包括生物學(xué)活性或否則有效分子、藥物、顯象劑、和制造用的試劑、以及所述物質(zhì)的前體和前藥。優(yōu)選的疏水性試劑是在人及其它活體如人中具有生物活性或其它效用的那些。這些包括作為醫(yī)學(xué)中的治療劑的試劑。這類試劑的實(shí)例包括止痛劑和抗炎劑、麻醉劑、抗腎上腺素能藥和抗心律失常藥、抗生素、抗膽堿能藥和擬膽堿試劑、抗驚厥劑、抗抑郁藥、抗癲癇劑、抗真菌劑和抗病毒劑、抗高血壓劑、抗毒蕈堿劑和毒蕈堿劑、抗腫瘤劑(即，抗癌劑)、精神抑制劑、抗焦慮藥、激素、催眠藥和鎮(zhèn)靜劑、免疫抑制劑和免疫激活劑、精神抑制劑、神經(jīng)元阻斷劑和營養(yǎng)素、以及它們的組合。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的疏水性試劑為抗癌劑。適宜的抗癌劑包括紫杉烷類(例如，紫杉醇和多西他賽)、多柔比星、長春新堿、兩性霉素、順鉑、卡鉑、類視色素、咪唑并吖啶酮(imidazoacridone)、二咪唑并吖啶酮(bisimidazoacridone)、喜樹堿、托泊替康、格爾德霉素、依托泊苷、azonifide及其組合。
納米顆?？砂ò邢騽?例如，配體或細(xì)胞受體)以將納米顆粒指向特定的部位。例如，與在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體可加到納米顆粒中以靶向特定的腫瘤細(xì)胞。適宜的配體包括，例如，結(jié)合表皮生長因子受體(EGFR)、促生長素抑制素受體(SSTR)、胰島素樣生長因子受體、葉酸-受體、HER2受體、白細(xì)胞介素-13受體、胃泌素-釋放肽受體、CD30、血管活性腸肽受體、胃泌素受體、前列腺-特異性抗原和雌激素受體的抗體和多肽。
本發(fā)明的方法還可包括將包含疏水性試劑(例如，抗癌劑)的納米顆粒施用于受試者。適宜的受試者包括哺乳動物，如小鼠，大鼠，兔，雪貂，豚鼠，倉鼠，貓，狗，豬，山羊，牛，馬，靈長類動物和人。
納米顆粒可單獨(dú)施用或以組合物的形式施用。當(dāng)納米顆粒以組合物施用時，該組合物優(yōu)選為藥物(例如，生理學(xué)上可接受的)組合物。組合物包含載體(例如，藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體)和納米顆粒。任何適宜的載體(例如，水、鹽水和PBS)都可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用，且這類載體是本領(lǐng)域公知的。載體的選擇將部分取決于組合物欲施用的特定部位和用于施用組合物的特定方法。適宜的載體、以及適用于本發(fā)明組合物中的其它成分，是本領(lǐng)域已知的(例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥科學(xué))，第17版，(馬克出版公司(Mack Publishing Company)，費(fèi)城，Pa.1985))。另外，組合物可包含其它活性試劑，如抗癌劑。
納米顆粒及其組合物可施用于受試者以治療或預(yù)防特定的病癥和疾病。例如，當(dāng)疏水性試劑為抗癌藥物時，本發(fā)明包括癌癥的化學(xué)療法治療，如通過抑制腫瘤生長(例如，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵入或轉(zhuǎn)移，減緩腫瘤的生長，完全停止腫瘤的生長，和縮小腫瘤的尺寸)的方法以及通過抑制癌細(xì)胞形成抗藥性的能力來促進(jìn)癌癥(例如，腫瘤細(xì)胞)對藥物的敏感性的方法的化學(xué)療法治療。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于待治療或預(yù)防的疾病或病癥容易地確定包含在納米顆粒中的具體的疏水性試劑(例如，抗癌劑)。優(yōu)選地，所述疾病或病癥為癌癥，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、頭部及頸部癌、卵巢癌、皮膚癌、睪丸癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、子宮頸癌、胃腸道癌癥，及其組合。
納米顆?；蚱浣M合物優(yōu)選地以治療有效量施用于受試者。治療有效量指治療或預(yù)防特定的疾病或病癥所需的納米顆粒的量。例如，當(dāng)納米顆粒包含抗癌劑時，治療有效量指癌癥的化學(xué)療法治療，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵入或轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤生長、和/或通過抑制癌細(xì)胞形成抗藥性的能力來抑制癌癥對藥物的敏感性所需的包含抗癌劑的納米顆粒的量。納米顆粒或其組合物的適宜劑量取決于包含在納米顆粒疏水性中心內(nèi)的特定抗癌劑和/或形成納米顆粒的特定TM肽。
任何給藥途徑都可用于將納米顆粒遞送到受試者。適宜的給藥途徑包括肌肉注射、經(jīng)皮給藥、吸入、局部施用于組織(例如，腫瘤組織)，腫瘤內(nèi)給藥和腸胃外給藥(例如，靜脈內(nèi)、腹膜、動脈內(nèi)、皮下、直腸、或陰道給藥)。適宜的給藥途徑可由醫(yī)生或研究人員容易地確定。皮下給藥可以導(dǎo)致納米顆粒由注射位點(diǎn)緩慢擴(kuò)散，其中靜脈內(nèi)給藥可以導(dǎo)致納米顆粒迅速擴(kuò)散和迅速通過腎清除。
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制其范圍。
實(shí)施例1 該實(shí)施例證明本發(fā)明的納米顆粒具有均一的形狀和直徑。
合成包含氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的肽。另外，合成包含氨基酸序列Leu-Leu-Phe-Val-Ile-Thr-Leu-Pro-Phe-Trp-Ala-Val-Asp-Ala-Val-Ala-Asn-Trp-Tyr-Phe-Gly-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO6)的肽，其以兩個帶正電荷的賴氨酸殘基替換SEQ ID NO1末端的兩個帶負(fù)電的天冬氨酸殘基。
將肽溶解在DMSO中得到32mg/ml溶液。DMSO儲液用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋以制備0.05-0.5mg/ml溶液。將2μl的樣品直接涂在顯微鏡柵上，風(fēng)干，用0.5％(w/v)四氧化鋨(OsO4)染色，并用Hitachi H-7000電子顯微鏡顯現(xiàn)。
如通過透射電子顯微術(shù)所證明地，所有具有帶負(fù)電的末端的肽產(chǎn)生小納米顆粒(直徑4-15nm)。然而，納米顆粒形成更高級別的聚集體。更高級別的結(jié)構(gòu)的形態(tài)針對不同序列而不同，并顯示出顯著程度的差異。
以正電荷置換負(fù)電荷(如在SEQ ID NO6中)導(dǎo)致形成具有高度變化的直徑的更大的顆粒。因此，TM肽一端存在帶負(fù)電的殘基導(dǎo)致相對均一形狀和直徑的納米顆粒的形成。
實(shí)施例2 本實(shí)施例證明添加親水性低聚物影響納米顆粒聚集。
將親水性低聚物加入到具有氨基酸序列SEQ ID NO1的TM肽中以形成下面的產(chǎn)物SEQ ID NO1-PEG11；SEQ ID NO1-PEG27；SEQ IDNO1-PEG38；和SEQ ID NO1-GGGGG。
為了形成具有親水性低聚物(例如，PEG)的肽，在ABI 433肽合成儀上使Fmoc酰胺樹脂(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystem))脫保護(hù)。將1克的Fmoc-NH-(PEG)11-COOH(NovaBiochem)或Fmoc-NH-(PEG)27-COOH(NovaBiochem)溶于10ml N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中，并通過加入等摩爾量的處在二甲基甲酰胺(DMF)中的0.5M的HBTU/HOBt(O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸鹽/1-羥基-苯并三唑)來活化。將脫保護(hù)的樹脂(80％摩爾，相對于PEG)加入到活化的PEG中并置于振蕩器上18小時。對于較長的PEG分子，如Fmoc-NH-(PEG)38-COOH，重復(fù)從合成儀上脫保護(hù)開始的操作。PPEG38通過順序偶聯(lián)PEG 11和PEG27而獲得。含所需長度的PEG分子的樹脂用NMP和二氯甲烷洗滌，干燥，并用于隨后構(gòu)建TM結(jié)構(gòu)域鏈，所述構(gòu)建是通過利用Fmoc氨基酸衍生物在配備有電導(dǎo)監(jiān)測單元的433A應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)肽合成儀上進(jìn)行固相肽合成進(jìn)行的。由于所有的肽含有在脫保護(hù)過程中進(jìn)行哌啶處理時易于形成天冬氨酰胺的Asp殘基，因而將合成儀程序重調(diào)以使用含0.25M HOBt的NMP中的50％哌啶。校準(zhǔn)溶劑遞送時間，從而在脫保護(hù)過程中獲得0.1M的HOBt最終濃度。
加入HOBt完全阻止天冬酰胺形成，天冬酰胺的形成通常伴隨質(zhì)譜上出現(xiàn)具有-18和+60(哌啶加成物)分子量的產(chǎn)物。以含5％水、5％苯硫基甲烷(thioanisol)和2.5％三異丙基硅烷(TIS)的87.5％三氟乙酸將肽從樹脂中裂解，用冷乙醚沉淀，用醚洗滌5次，并在真空中干燥過夜。溶解在DMF中的肽通過HPLC在制備型(19x250mm)Atlantis C3反相柱(Agilent，PaloAlto，CA)上以0.05％三氟乙酸的水溶液和含0.05％三氟乙酸的乙腈進(jìn)行梯度純化。各級分在Agilent 1100系列儀器(Agilent，Palo Alto，CA)上采用Zobax C3 Poroshell柱和水和乙腈中0.1乙酸的梯度通過離子-噴霧LC/MS進(jìn)行分析。僅將含高于95％的純產(chǎn)物的級分合并和冷凍干燥。其純度和結(jié)構(gòu)在Zorbax C3分析柱上分離的條件下通過離子-噴霧LC/MS進(jìn)一步證實(shí)。
期望長度的聚甘氨酸低聚物在肽合成儀上利用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-方案在HBTU/HOBt活化的條件下通過逐步合成組裝。預(yù)裝載的Gly-樹脂(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems))用于該合成中。
為了確定親水性尾部長度對納米顆粒聚集的影響，通過多角光散射確定具有氨基酸序列SEQ ID NO1；SEQ ID NO1-PEG11；SEQ ID NO1-PEG27；SEQ ID NO1-PEG38；和SEQ ID NO1-GGGGG的TM肽的聚集度。
將肽溶解于DMSO中并用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)稀釋得到0.4mg/ml肽溶液。該溶液用于進(jìn)一步稀釋。DMSO的終濃度為2.5％或1.25％(對于該系列中所有的稀釋保持恒定)。將樣品以最大量強(qiáng)度超聲處理10分鐘并保持在室溫下過夜(測定前約20小時)。第二天，將樣品以13200rpm離心30分鐘。
通過DAWN EOS多角檢測器(懷亞特技術(shù)公司(Wyatt TechnologyCorp.)，Santa Barbara，CA)以690nm波長的激光進(jìn)行光散射(LS)研究。LS檢測器與Agilent 1100HPLC系統(tǒng)(Agilent技術(shù)(Agilent Technologies)，Palo Alto，CA)連接。MALS檢測器以HPLC級的甲苯，99.8％(奧爾德里奇化學(xué)(Aldrich Chemicals)，Milwaukee，WI)校準(zhǔn)，其通過0.02μM Anotop-25無機(jī)膜過濾器過濾然后以清蛋白(牛)98％單體(西格瑪化學(xué)(SigmaChemicals)，St.Louis，MO)標(biāo)準(zhǔn)化。收集數(shù)據(jù)并利用Astra軟件(懷亞特技術(shù)公司(Wyatt Technology Corp)；4.90.04版)處理。
為了確定肽聚集物的分子量和聚集狀態(tài)，進(jìn)行LS小批量測量。簡而言之，溶劑通過HPLC系統(tǒng)遞送，以0.05ml/min的流速繞過柱室。具有不同肽濃度的900μl樣品通過HPLC自動取樣器注入。分析4種肽濃度(即，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml和0.4mg/ml)。由重量測定確定濃度，因?yàn)閺?qiáng)的光散射使得傳統(tǒng)的UV-吸光度測定不準(zhǔn)確。收集各種濃度的LS信號。利用具有Debye圖表和Zimm方程式的Astra軟件分別測定各種濃度的分子量。挑選最小誤差的單份收集的信號用于各濃度下的分子量計算。
結(jié)果如表1所示。
表1.親水性尾部長度對納米顆粒聚集的影響。

其中N為聚集度(分子數(shù)/顆粒)。
如表1給出的數(shù)據(jù)所示，納米顆粒的聚集隨PEG長度的增加而減少。兩種類型的親水性尾部(即，PEG和聚氨基酸)都有效地減少納米顆粒的聚集。PEG比相似長度的聚甘氨酸有效性低。此外，聚胺酸延長是有利的，因?yàn)樗鼈兪巧锟山到獾模蚨谖⒄{(diào)納米顆粒與細(xì)胞膜融合能力方面提供更大的靈活性。
另外，對靶向抗藥性相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2的納米顆粒進(jìn)行的結(jié)構(gòu)-活性研究提示PEG長度的延長超過27個單位損害肽抑制劑的生物活性，大概是干擾了膜融合引起的。因此，理想的具有雙重活性的納米顆粒具有足以防止形成大的超結(jié)構(gòu)的長度的親水性尾部，但是該尾部應(yīng)該在靶組織(例如，腫瘤)中減小尺寸(降解)以允許膜融合，使得形成納米顆粒的TM肽可以對靶膜蛋白發(fā)揮其抑制作用(例如，抑制癌細(xì)胞的抗藥性，抑制腫瘤環(huán)境中血管的生長，或抑制腫瘤細(xì)胞的移動)，并可以釋放結(jié)合的疏水性試劑(例如，細(xì)胞毒性藥物)。
實(shí)施例3 本實(shí)施例證明TM肽的長度影響納米顆粒聚集。
為了確定TM肽的長度對納米顆粒聚集的影響，通過多角光散射確定SEQ ID NO1-PEG27；SEQ ID NO7-PEG27；SEQ ID NO8-PEG27；和SEQ ID NO9-PEG27的TM肽的聚集度。SEQ ID NOs7，8和9作為缺失突變體與SEQ ID NO1相關(guān)，其中SEQ ID NO7缺少SEQ ID NO1的兩個N-末端氨基酸殘基，SEQ ID NO8缺少SEQ ID NO1的5個N-末端氨基酸殘基，且SEQ ID NO9缺少SEQ ID NO1的12個N-末端氨基酸殘基。肽按照實(shí)施例2中的描述形成。
結(jié)果如表2所示。
表2.跨膜部分長度對納米顆粒聚集的影響。


其中N為聚集度(分子數(shù)/顆粒)。
如表2給出的數(shù)據(jù)所示，納米顆粒的聚集隨TM肽的長度減小而減少。然而，具有截斷成11個氨基酸殘基的TM部分的肽不能自組裝成納米顆粒。
實(shí)施例4 本實(shí)施例證明在腫瘤組織中納米顆粒的細(xì)胞和腫瘤攝取。
制備以Alexa546熒光染料標(biāo)記的CXCR4-TM結(jié)構(gòu)域2-衍生的聚乙二醇化(pegylated)肽。合成下面的排序SEQ ID NO1-Peg11-Hcy-Peg27，其中Hcy表示高半胱氨酸。讓肽與處于DMSO中的2倍過量的Alexa5465-馬來酰亞胺(Invitrogen)(以128mg/ml濃度)反應(yīng)過夜并在制備型(19x 250mm)C3柱上純化。將10μl的肽用630μl的PBS稀釋(以制備2mg/ml肽溶液)，超聲處理10分鐘，并用于腫瘤內(nèi)注射。
用一百萬MDA-231乳腺癌細(xì)胞在胸墊(breast pad)中接種裸鼠。6周以后，當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到直徑約5mm時，將0.1ml處于PBS中的2mg/ml熒光納米顆粒溶液注射到腫瘤附近的胸墊中。
利用Maestro 420體內(nèi)光譜成像系統(tǒng)(劍橋資源和儀器公司(CambridgeResources and Instrumentation，Inc.))對完整的動物和切除的腫瘤進(jìn)行成像。結(jié)果表明納米顆粒沒有從注射位點(diǎn)擴(kuò)散很遠(yuǎn)，但有效地穿透腫瘤脈管系統(tǒng)。在完整的動物內(nèi)，注射后30分鐘，納米顆粒定位于腫瘤組織。類似地，24小時之后，納米顆粒定位于腫瘤組織而不由注射位點(diǎn)擴(kuò)散。對注射后24小時切除的腫瘤進(jìn)行分析顯示納米顆粒有效地穿透腫瘤脈管系統(tǒng)。
這些結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的納米顆?？捎糜谶f送疏水性藥物，如抗癌藥物，至靶組織，如腫瘤組織。
實(shí)施例5 本實(shí)施例證明由某些受體(例如，CXCR4)的TM結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)建的納米顆粒具有其自身的生物學(xué)活性并能夠抑制轉(zhuǎn)移。
在第0天將一百萬MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到裸鼠中。在第1天和持續(xù)每周2次，給小鼠腹膜內(nèi)注射(1)3mg/kg溶于PBS中的SEQ ID NO1-PEG27的TM肽的納米顆粒；(2)12mg/kg溶于PBS中的SEQ ID NO1-PEG27的TM肽的納米顆粒；或(3)對照物(只有PBS)。
對照組中被處死的或自然死亡的所有動物都有許多肺腫瘤。如圖3所示，對照組中的動物到第75天時只有約20％存活。相反，在施用3mg/kg納米顆粒的動物中到第75天時有約40％存活。所有施用12mg/kg納米顆粒的動物到第75天時100％存活，且這些動物體重繼續(xù)增加，這表明沒有轉(zhuǎn)移。
盡管在對照組中和在施用3mg/kg納米顆粒的動物中到第91天時沒有動物存活，但相當(dāng)數(shù)量的施用12mg/kg納米顆粒的動物到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(140天)時存活，這表明在乳腺癌的小鼠模型中，納米顆粒的施用可以顯著延遲肺轉(zhuǎn)移并延長存活。
這些結(jié)果證實(shí)由某些受體(例如，CXCR4)的TM結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的納米顆粒能夠抑制轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例6 本實(shí)施例證明本發(fā)明納米顆粒在水溶液中與疏水性試劑締合的能力。
測試由TM結(jié)構(gòu)域的一部分形成的靶向CXCR4受體的納米顆粒與溶解的疏水性細(xì)胞毒性試劑締合的能力。使用咪唑并吖啶酮和二咪唑并吖啶酮，因?yàn)檫@些抗腫瘤劑在水溶液中溶解性差且具有環(huán)境靈敏的熒光性(參見Tarasov等人，Photochem.Photobiol(光化學(xué)和光生物學(xué))，70(4)568-578(1999))。具體地，使用HKA40A，即一種具有有效抗腫瘤活性的1.8-萘二甲酰亞胺咪唑并(4，5，1-de)吖啶酮衍生物(參見美國專利6,664,263)和WMC77，即一種具有環(huán)境靈敏的熒光性能的imiazoacridone(5-{3-[4-(氨丙基)-哌嗪-1-基]-丙基氨基}-2，10b-二氮雜-醋蒽烯-6-酮)(參見美國專利6,187,775)。
肉眼觀察0.038mg/ml的HKA40A溶液，產(chǎn)生了有橙色沉淀的透明、無色液體。相反，在0.4mg/ml處于PBS中的納米顆粒(SEQ ID NO1-PEG27)溶液中的相同濃度的HKA40A產(chǎn)生透明的、黃色溶液，沒有沉淀。
將不同量的納米顆粒(SEQ ID NO1-PEG11或SEQ ID NO 1-PEG38)加入到WMC77的溶液中。測量熒光發(fā)射強(qiáng)度和發(fā)射最大值的變化，結(jié)果如圖1和2所示。結(jié)果反映熒光發(fā)射強(qiáng)度和發(fā)射最大值的變化隨納米顆粒量的增加而增大，這表明熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中。
此外，表3數(shù)據(jù)表明，當(dāng)WMC77(終濃度300nM)與Alexa 546-標(biāo)記的納米顆粒(其是按照實(shí)施例4的描述生產(chǎn)的)混合時，觀察到熒光能量轉(zhuǎn)移，其顯示在納米顆粒和WMC77之間存在緊密的相互作用。
表3.WMC77溶液的熒光強(qiáng)度。
這些試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的納米顆粒在水溶液中與疏水性試劑締合并為試劑提供疏水性環(huán)境。
將所有參考文獻(xiàn)，包括本文中引用的出版物、專利申請和專利在此引入作為參考，其程度如同各參考文獻(xiàn)被分別和具體地描述為引入作為參考并在本文中記述其全部內(nèi)容。
在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在以下權(quán)利要求的上下文中)術(shù)語“一”和“該”以及類似的對象的使用，應(yīng)理解為包括了單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非本文中另有說明或與上下文明顯矛盾。術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)理解為開放的術(shù)語(即，指“包括但不限于”)，除非另作說明。本文中數(shù)值范圍的描述僅僅旨在用作分別談及落入該范圍內(nèi)的各單獨(dú)的數(shù)值的簡寫方法，除非本文中另有說明，且各單獨(dú)的數(shù)值并入說明書中如同其在本文中被分別列舉。本文中描述的所有方法可以以任何適宜的順序進(jìn)行，除非本文中另有說明或明顯地與上下文矛盾。本文中提供的任何和所有實(shí)施例，或示例性的語言(例如，“如”)的使用，僅僅旨在更好地說明本發(fā)明而不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，除非另外要求。說明書中的語言都不應(yīng)理解為表示任何未要求的要素對實(shí)施本發(fā)明是必要的。
在本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括為發(fā)明人所知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式。那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變化對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言在閱讀上述的說明后可變得顯而易見。本發(fā)明人預(yù)期技術(shù)人員酌情應(yīng)用這類變化，且本發(fā)明人旨在本發(fā)明可按照不同于本文中具體描述的方式來實(shí)施。因此，本發(fā)明包括本文中所附權(quán)利要求中描述的主題的所有改變和同等物，這是適用法律允許的。而且，上述要素各種可能的變化的任何組合都被本發(fā)明包括，除非本文中另有說明或與上下文明顯矛盾。
序列表
<110>娜佳·I·塔拉索夫
謝爾蓋·G·塔拉索夫
克里斯托弗·J·米海達(dá)
<120>由跨膜肽組成的自組裝納米顆粒及其用于特異性腫瘤內(nèi)遞送抗癌藥物的應(yīng)用
<130>702121
<140>60/864,665
<141>2006-11-07
<160>9
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>24
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>1
Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala
1 5 10 15
Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Asp Asp
20
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>2
Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ile Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Val Ala Ala Tyr Ile Gln Val Ser
20 25
<210>3
<211>25
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>3
Leu Ile Tyr Ala Ser Tyr Ala Leu Ala Phe Trp Tyr Gly Thr Thr Leu
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Glu Gly Ser Asp Asp
20 25
<210>4
<211>23
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>4
Asp Ser Phe Glu Asp Val Leu Leu Val Phe Ser Ala Val Val Phe Gly
1 5 10 15
Ala Met Ala Val Gly Gln Val
20
<210>5
<211>23
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>5
Ile Phe Gly Ile Thr Phe Ser Phe Thr Gln Ala Met Met Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Cys Phe Asp Asp
20
<210>6
<211>24
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>6
Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala
1 5 10 15
Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Lys Lys
20
<210>7
<211>22
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>7
Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Asn Asp Asp
20
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>8
Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Asn Asp Asp
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>9
Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Asp Asp
1 5 10
權(quán)利要求
1、一種處理疏水性試劑的方法，所述方法包括
(a)在水溶液中混合(i)疏水性試劑和(ii)分離的肽，即膜內(nèi)在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物，其中所述肽的一端具有一個或多個連續(xù)的帶負(fù)電的殘基，和
(b)容許所述肽自組裝成納米顆粒，其中所述納米顆粒包含所述疏水性試劑。
2、權(quán)利要求1的方法，其中所述膜內(nèi)在蛋白質(zhì)為G蛋白偶聯(lián)受體或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。
3、權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性試劑為抗癌劑。
4、權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，還包括向所述肽添加配體，其中所述配體特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的細(xì)胞表面受體。
5、權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，還包括將選自由聚乙二醇、十一烷乙二醇、聚甘氨酸及其組合組成的組中的一種親水性低聚物加至含一個或多個帶負(fù)電的殘基的肽的末端。
6、權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述納米顆粒具有約3nm-約50nm的直徑。
7、權(quán)利要求6的方法，其中所述納米顆粒具有約8nm-約20nm的直徑。
8、權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述肽包含至少約10個與膜內(nèi)在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同的氨基酸。
9、權(quán)利要求8的方法，其中所述肽包含至少約15個與膜內(nèi)在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同的氨基酸。
10、權(quán)利要求9的方法，其中所述肽包含至少約20個與膜內(nèi)在蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同的氨基酸。
11、權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括
(c)將包含所述疏水性試劑的納米顆粒施用于受試者。
12、權(quán)利要求11的方法，其中所述受試者是人。
13、權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水性試劑具有選自由抑制癌細(xì)胞增殖、抑制轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、抑制癌細(xì)胞的抗藥性及其組合組成的組中的第一生物學(xué)活性。
14、權(quán)利要求13的方法，其中所述納米顆粒具有選自由抑制癌細(xì)胞的抗藥性、抑制轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、及其組合組成的組中的第二生物學(xué)活性。
15、由權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法制備的納米顆粒組合物。
16、權(quán)利要求15的組合物，其中所述疏水性試劑是抗癌劑。
17、抑制受試者中腫瘤生長的方法，包括向所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求16的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種處理疏水性試劑的方法，該方法包括(a)在水溶液中混合(i)疏水性試劑和(ii)分離的肽，即膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似物，其中該肽的一端具有一個或多個帶負(fù)電的殘基，和(b)容許所述肽自組裝成納米顆粒，其中該納米顆粒包含所述疏水性試劑。
文檔編號A61K9/51GK101610759SQ200780045937
公開日2009年12月23日 申請日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月7日
發(fā)明者娜佳·I·塔拉索夫, 謝爾蓋·G·塔拉索夫, 克里斯托弗·J·米海達(dá) 申請人:美國政府衛(wèi)生與公共服務(wù)部