專(zhuān)利名稱(chēng)：：九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用本發(fā)明涉及對(duì)糖尿病具有治療作用的中藥有效部位，屬于中醫(yī)中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前糖尿病發(fā)病率和病死率逐漸上升，已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后，危害人類(lèi)健康的第三大病種，我國(guó)糖尿病的發(fā)病率與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家相比雖然并不算高，但我國(guó)人口眾多，病人的絕對(duì)人數(shù)卻居世界首位。因此，尋找安全有效的藥物用于防治糖尿病成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。目前用于治療2型糖尿病的口服降糖藥包括磺酰脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、胰島素增敏劑、促胰島素分泌藥、醛糖還原酶抑制劑等。而這些口服降糖藥存在低血糖癥、胃腸道反應(yīng)等副作用，同時(shí)隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，降糖效果呈降低趨勢(shì)。九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]為蕓香科九里香屬植物，主要產(chǎn)自我國(guó)云南、貴州、湖南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地。到目前為止從九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]葉中共分得9個(gè)黃酮類(lèi)化合物，分別是3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八甲氧基黃酮(3，5,6,7，8,3',4'，5'-octamethoxyflavone)、3，5，6，7，3'，4'，5'—^匕甲氧基黃酮(3，5，6，7，3',4'，5'-h印tamethoxyflavone)(江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典，上冊(cè)，上海人民出版社，1977:44-45);5，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮(5,7,8,3'，4',5'-hexamethoxyflavone)、3，5，7，8，3'，4'，5'-七甲氧基黃酮(3，5,7，8,3'，4'，5'-h印tamethoxyflavone)(植物學(xué)報(bào)1984，26(2):184-186);5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮(5,7，3'，4',5'-pentamethoxyflavone)(化學(xué)學(xué)報(bào)1984，42，1308-1311)以及5,7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮(中國(guó)專(zhuān)利《九里香葉總黃酮及其制備方法及應(yīng)用》，申請(qǐng)?zhí)?00710147357.2)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供的是一種植物提取物的新的醫(yī)藥用途，即九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。所述九里香葉總黃酮其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。而且其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。本發(fā)明所述的藥物可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等口服劑型，也可以是注射劑等非口服劑型。另外本發(fā)明所述的九里香葉總黃酮可以與其他藥物包括化學(xué)藥、中藥以及天然藥物組成復(fù)方藥物用于糖尿病的治療。本發(fā)明是通過(guò)如下創(chuàng)新性研究完成的。(1)通過(guò)對(duì)九里香葉化學(xué)成分的提取分離，從九里香葉中分得了6種黃酮類(lèi)化合物，并通過(guò)麗R等波譜數(shù)據(jù)的分析鑒定了其結(jié)構(gòu)，它們分別是5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3',4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮(2)通過(guò)提取純化工藝的研究，完成了九里香葉總黃酮的制備工藝，所得九里香葉總黃酮以5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基_5，3'，4'-三甲氧基黃酮為主要成分，(3)建立了5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3',4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7_羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的HPLC含量測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果表明九里香葉總黃酮中上述黃酮類(lèi)化合物的含量之和在50%至100%之間(4)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了九里香葉總黃酮對(duì)糖尿病的治療作用(5)對(duì)以九里香葉總黃酮為活性成分的藥物制劑進(jìn)行了研究，從而完成了本發(fā)明。具體如下。1、九里香葉化學(xué)成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定(中國(guó)專(zhuān)利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應(yīng)用》，申請(qǐng)?zhí)?00710147357.2)。2、九里香葉總黃酮的制備工藝(中國(guó)專(zhuān)利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應(yīng)用》，申請(qǐng)?zhí)?00710147357.2)。3、九里香葉總黃酮中黃酮含量測(cè)定(1)儀器、試劑、對(duì)照品Agilent1100Series高效液相色譜儀Z0RBAXExtend—C184.6X250mm0DS，5ym色譜柱VWD可變波長(zhǎng)自外檢測(cè)器色譜甲醇、二次蒸餾水(2)色譜條件色譜柱用ZorbaxExtendODS柱，4.6X250腿，5um;柱溫為25。C;流動(dòng)相為甲醇水二58:42;流速為1.2mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為337nm;進(jìn)樣量為20y1。(3)對(duì)照品溶液的制備分別取5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮和7_羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，制成每1毫升分別含0.4、0.3、0.03、0.03、0.04毫克的溶液，搖勻，即得。(4)供試品溶液的制備取九里香葉總黃酮100mg，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，超聲提取3次，每次加甲醇15ml，超聲時(shí)間均為20min，合并提取液，蒸干溶劑，加甲醇溶解并定容至100ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(4)測(cè)定方法分別精密吸對(duì)照品溶液與供試品溶液各20ul，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，利用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行含量計(jì)算。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取九里香葉2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為10、8、6倍，回流時(shí)間分別為60、45、30分鐘，濾過(guò)，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)乙醇味，加水稀釋?zhuān)^(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附，50升千分之一氫氧化鈉水溶液沖洗，水洗至中性，85%乙醇洗脫至薄層層析檢測(cè)不到JA為止，洗脫液減壓回收乙醇，得九里香葉提取物。取此九里香葉提取物進(jìn)行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集黃酮部分，回收溶劑，得九里香葉總黃酮38克。經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮含量為39.8.0%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮含量33.2%為，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮含量為3.2%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮含量為2.8%，7_羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮含量為5.0%。實(shí)施例2取九里香葉總黃酮10克，加淀粉適量，制粒，裝入膠囊，制成1000粒，得九里香葉總黃酮膠囊。實(shí)施例3取九里香葉總黃酮10克，加預(yù)膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉適量，制粒，壓片，制成iooo粒，得九里香葉總黃酮片。實(shí)施例4取九里香葉總黃酮10克，加吐溫80適量，加10升加熱溶解，高溫滅菌，分裝成100瓶，得九里香葉總黃酮口服液。實(shí)施例5取九里香葉總黃酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，攪拌溶解，過(guò)濾，滅菌，罐裝，每支2ml，得九里香葉總黃酮注射液。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例第一部分九里香葉總黃酮對(duì)腎上腺素所致高血糖小鼠的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重1620g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)SCXK-(吉)2003-0001。九里香葉總黃酮，批號(hào)070905，自制，以下簡(jiǎn)稱(chēng)TFMP。1.2藥品與試劑鹽酸腎上腺素注射液二甲雙胍1.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖血糖試紙2實(shí)驗(yàn)方法昆明種小鼠50只空白對(duì)照組模型組二甲雙胍組TFMP中劑量組TFMP大劑量組上海禾豐制藥有限公司批號(hào)070303天津太平洋制藥有限公司批號(hào)070416優(yōu)克糖惠基生物科技股份有限公司雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組給予0.5%CMC-Na'給予0.5%CMC-Na給予二甲雙胍100mg/kg給予50mg/kgTFMP給予100mg/kgTFMP各組動(dòng)物按上面方案灌胃給藥(容量為20ml/kg)，每日l(shuí)次，共10日，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于給藥第9日禁食不禁水12h，第10日以?xún)?yōu)克糖血糖儀測(cè)定空腹血糖值(ramol/L)為藥前值，然后給藥。末次藥后1小時(shí)，除對(duì)照組外其他各組動(dòng)物分別皮下注射0.1%腎上腺素O.25mg/kg,注射后于30、60、90min斷尾取血，用血糖儀測(cè)定血糖值(mmol/U。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(f±S)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用組間比較t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠注射腎上腺素后3090min血糖均明顯升高，有顯著性差異(代O.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和TFMP大劑量組注射腎上腺素后60min、90min血糖值明顯下降(代0.05或代0.01)，提示TFMP可明顯對(duì)抗腎上腺素所致高血糖，結(jié)果見(jiàn)Tab.1。Tab.1.EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyadrenaline(X±n二lO)GroupFBG(mmol/L)Omin30min60min90minControlModelTFMP50mg/kg100mg/kgMetformin100mg/kg7.56±2.617.36±1.927.34±2.356.99土2.347.55±2.288.49±2.4815.46±5.10*15.92±4.8813.48±2.5812.57±3.538.44±2.0515.24土5.19"14.37±5.6711.23±2.65*9.88±2.18**7.73±1.7713.6±4.52ffi12.34±4.9910.11±2.41*9.99±2.79**P<0.05，M/<0.01vsControl;*尸<0.05，**代0.01vsModel第二部分TFMP的糖耐量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料雌雄各半，體重1620g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，(吉)2003—0001。1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠質(zhì)量合格證號(hào)SCXK1.2藥品與試劑10%葡萄糖注射液格列本脲1.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖血糖試紙2實(shí)驗(yàn)方法昆明種小鼠50只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組吉林科倫康乃爾制藥有限公司天津太平洋制藥有限公司批號(hào)S070224LI批號(hào)070205優(yōu)克糖惠基生物科技股份有限公司空白對(duì)照組給予0.5%CMC-Na模型組給予0.5%CMC-Na格列本脲組給予格列本脲50mg/kgTFMP中劑量組給予50rag/kgTFMPTFMP大劑量組給予lOOmg/kgTFMP各組動(dòng)物按以上方案灌胃給藥，每日1次，連續(xù)10日，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于給藥第9日禁食不禁水12h，第IOR以血糖儀測(cè)定空腹血糖值(mmol/L)為藥前值，然后給藥。末次藥后l小時(shí)，除對(duì)照組外其他各組經(jīng)腹腔注射葡萄糖2g/kg，測(cè)定0.5、1、2小時(shí)的血糖值，觀察各組藥物作用。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差±S)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用組間比較f檢驗(yàn)。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠注射葡萄糖后30120min血糖均明顯升高，有顯著性差異(代O.Ol)。與模型組比較，格列本脲組注射葡萄糖后60、120min血糖值明顯下降(K0.05);TFMP中、大劑量組注射葡萄糖后60min、120min血糖值均下降(A0.05)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示TFMP對(duì)葡萄糖所致高血糖無(wú)顯著性作用，結(jié)果見(jiàn)Tab.2。Tab.2.EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyglucosed±5",n=10)FBG(誦1/L)Group-0min30min60min120minControlModelTFMP50mg/kg100mg/kgGlibenclamide50mg/kg8.59±1.839.09±1.609.26±1.679.12±1.699.84±1.659.60±1.0218.47±7.28;21.63±6.5316.93±5.7218.97±4.679.93±1.0215.15±5.4(T14.45±3.8611.39±3.6011.22±2.06*8.80±1.0013.41±3.36#*12.30±4.0011.52±3.7910.32±3.20*'代O.05，TOK0.01vsControl;*代0.05，林代O.01vsModel第三部分TFMP對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Wistar大鼠，雄性，體重230290g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)SCXK-(吉)2003-0001。1.2藥品與試劑鏈脲佐菌素美國(guó)Sigma化學(xué)公司批號(hào)20070512二甲雙胍天津太平洋制藥有限公司批號(hào)070416膽固醇上海新興化工研究所批號(hào)060228丙硫氧嘧啶上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司批號(hào)070602吐溫-80天津市昆達(dá)工貿(mào)有限公司批號(hào)0703171，2-丙二醇天津市博迪化工有限公司批號(hào)20061003戊巴比妥鈉中國(guó)上海批號(hào)060612TC測(cè)試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號(hào)2007090384HDL測(cè)試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號(hào)2007080011LDL測(cè)試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號(hào)2007080160TG測(cè)試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號(hào)2007090383肝糖原測(cè)試盒南京建成生物研究所批號(hào)20070924SOD測(cè)試盒南京建成生物研究所批號(hào)20071122MDA測(cè)試盒南京建成生物研究所批號(hào)20071121IL-1{3放免測(cè)試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號(hào)20071130IL-6放免測(cè)試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號(hào)20071130TNF-a放免測(cè)試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號(hào)20071130INS放免測(cè)試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號(hào)20071130C肽放免測(cè)試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號(hào)200711301.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖血糖試紙LDZ5-2型普通離心機(jī)DR-冊(cè)-1電熱恒溫水溫箱7202B型可見(jiàn)分光光度計(jì)GAMMAmaticII型r計(jì)數(shù)器QL-901Vortex混懸器優(yōu)克糖惠基生物科技股份有限公司北京醫(yī)用離心機(jī)廠北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠尤尼柯(上海)儀器有限公司瑞士K0NTR0N公司海門(mén)市其林貝爾儀器制造2.實(shí)驗(yàn)方法2.1藥物配制脂肪乳配方豬油25%，膽固醇1%，丙硫氧嘧啶1%，吐溫-8025%，1，2-丙二醇20%。脂肪乳制備取豬油25g放入200ml燒杯中，加熱至100'C，加入25ml吐溫-80，制成油相。另一燒杯中加入30ml蒸餾水和20ml1,2-丙二醇加熱，制成水相。然后將水相加入油相，充分混勻，即制成脂肪乳劑。鏈脲佐菌素(STZ)，臨用時(shí)以0.1mol/L，PH4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制成1%的STZ溶液。將TFMP用0.5%CMC-Na配成0.7%、0.35%的溶液，二甲雙胍在研缽內(nèi)用0.5%CMC-Na配成0.7%的溶液。2.2動(dòng)物造模將110只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，正常組大鼠給予蒸餾水10ml/kg，模型組大鼠在正常飲食基礎(chǔ)上按10ml/kg灌胃(ig)給脂肪乳劑，IO日后，正常組和模型組隨機(jī)取12只大鼠尾靜脈取血檢測(cè)血清TC、TG、FFA含量。然后，各組動(dòng)物禁食不禁水12小時(shí)，正常組舌下iv0.lmol/L，PH4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，模型組舌下ivSTZ30mg/kg，藥后4小時(shí)ig給模型組大鼠25%葡萄糖溶液避免低血糖反應(yīng)，72h后從造模大鼠中選取空腹血糖值〉11.l腿ol/L的大鼠為2型糖尿病模型大鼠。2.3分組及給藥方法將2型糖尿病模型大鼠按血糖和體重隨機(jī)分為5組，每組15只，g卩TFMP大、中、小劑量組、二甲雙胍組及模型對(duì)照組。具體給藥方案為給予0.5%CMC-Na給予0.5°/。CMC-Na給予二甲雙胍70mg/kg給予TFMP17.5mg/kg給予TFMP35mg/kg給予TFMP70mg/kg各組動(dòng)物按照上述方案ig給藥，連續(xù)4周。2型糖尿病大鼠ig給脂肪乳10ml/kg，每3日給藥1次。每周斷尾取血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖值一次，以實(shí)測(cè)值或變化百分率進(jìn)行組間比較。各組存活動(dòng)物于第四周最后l次給藥前禁食不禁水12h，測(cè)定空腹血糖值，ig給藥，藥后lh腹腔注射3。/。戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，進(jìn)行各種生10正常對(duì)照組模型對(duì)照組二甲雙胍組TFMP小劑量組TFMP中劑量組TFMP大劑量組化指標(biāo)和放免指標(biāo)的測(cè)定。采集各鼠同一部位肝臟，測(cè)定肝糖原含量。采集各鼠胰腺，10%甲醛固定。2.4觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法2.4.1—般狀態(tài)觀察監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白組及糖尿病各組大鼠的一般狀態(tài)、體重、攝食及攝水等變化，并記錄各組大鼠每日的攝食攝水量。2.4.2血糖和肝糖元的測(cè)定測(cè)血糖前夜，各組大鼠禁食不禁水12h，次閂斷尾取血，用血糖儀和優(yōu)克糖試紙測(cè)定空腹血糖值，每周1次。給藥第28日采集各鼠同一部位肝臟，按照肝糖元試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝糖原含量。2.4.3糖尿病相關(guān)的氧化因子的測(cè)定腹主動(dòng)脈采血約6ml，注入干凈的試管內(nèi)，4°C，2000rpm離心10min，分離血清，按相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)要求嚴(yán)格操作，一部分血清用于測(cè)定血清中TC、TG、HDL、LDL、SOD、MDA含量；另外一部分血清用放射免疫分析方法測(cè)定IL-ie、IL-6、TNF-a、INS、C肽含量，以HomaModel方法計(jì)算ISI和胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)。2.4.4胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察采集各鼠胰腺，10%甲醛固定，作免疫組化，進(jìn)行胰島細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(i±s)表示，計(jì)量資料進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1高脂飲食對(duì)正常大鼠血脂的影響與正常組比較，模型組大鼠連續(xù)ig脂肪乳劑10日后出現(xiàn)血脂代謝紊亂TC、TG、FFA含量均顯著增高(代O.Ol)，結(jié)果見(jiàn)Tab.3。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.2TFMP對(duì)大鼠2型糖尿病模型FBG及肝糖原的影響在模型組大鼠出現(xiàn)血脂代謝紊亂的基礎(chǔ)上舌下iv30mg/kgSTZ后，模型對(duì)照組大鼠第O、1、2、3、4周血糖值與正常對(duì)照組相比均顯著升高(代O.Ol)，第4周肝糖原含量與正常對(duì)照組相比明顯降低(代0.05)，表明大鼠T2DM模型建立成功。與模型對(duì)照組比較，TFMP35、70mg/kg劑量組于藥后第3、4周FBG均明顯降低(代O.05或代O.01)，第4周肝糖原含量明顯升高(代0.05或代O.Ol)，提示TFMP可顯著改善T2DM大鼠的高血糖癥狀，提高肝糖原含量，見(jiàn)Tab.4及Tab.5。Tab.4.EffectofTFMPonbloodglucoseinT2DMrats(f±5")Bloodglucosecontentaftertreated(mmol/UGroup-0W1W2W3W4WNormal6,34±0.475.09±0.425.94±0.505.91±0.495.05±0.30Model23.44±4.8『20.33±7.69w23.57±7.37**22.16±4.84w20.27±4.24wTFMP17.5mg/kg23.46±4.4219.28±7.6319.94±4.9718.67±5.7919.46±5.7635mg/kg22.61±3.9817.5±5.0019.77±2.1616.45±4.50*15.17±2.54*70mg/kg24.18±4.0416.20±3.5317.60±3.2715.16±3.11**14.92±5.15*Metformin70mg/kg24.68±5.8515.22±6.3414.19±5.36**14.73士5.27林14.89土3.37林*代0.05，**代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodelTab.5.EffectofTFMPonliverglycogencontentinT2DMrats(X±5")GroupDose(mg/kg)liverglucogen(mg/gliver)Normal一10.01±2.36DiabetesModel一7.77±2.09*TFMP17.59.31±2.47359.92±1.89*709.94±2.00*Metformin7010.51±1.8『*代0.05vsnormal;7^0.05，"代O.01vsmodel4.3TFMP對(duì)T2DM大鼠血脂及脂代謝的影響與正常組比較，模型對(duì)照組TG、TC、LDL-C含量值均顯著升高(代O.05或代O.01)，HDL-C含量明顯下降(代O.Ol);與模型對(duì)照組比較，TFMP70mg/kg劑量組TC、TG及LDL-C含量值顯著下降(代O.05或代O.01);TFMP70mg/kgHDL-C值明顯上升(代O.05)，表明TFMP可以改善T2DM大鼠的血脂代謝紊亂。結(jié)果見(jiàn)Tab.6。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>"代O.05，**代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.4TFMP對(duì)T2DM大鼠胰島素分泌功能及胰島素抵抗的影響與正常組相比，模型對(duì)照組血清中胰島素和C-肽含量及胰島素分泌指數(shù)ISI顯著下降(代O.01)，Homa-IR明顯升高(代O.01);與模型對(duì)照組比較，TFMP70mg/kg劑量組及二甲雙胍組胰島素和C-肽含量及ISI顯著升高(代0.05或代0.01)，Homa-IR明顯降低(代0.05或代O.Ol)，說(shuō)明TFMP能改善T2DM胰島e細(xì)胞功能，促進(jìn)胰島素分泌，增強(qiáng)組織對(duì)胰島素的敏感性，改善IR。結(jié)果見(jiàn)Tab.7。Tab.7.EffectofTFMPonIns、C-peptide、Homa-IRandISIinT2DMratsd±5)GroupIns(liIU/ml)C—peptide(ng/ml)Homa-IRISINormal29.30±9.59Model7.87±2.833=TFMP17.5mg/kg10.33±3.5835mg/kg9.78±3.8670mg/kg12.65±4.79*Metformin70mg/kg12.95±3.22**0.49±0.150.32±0.089w0.35±0.150.43±0.12*0.46±0.16*0.49±0.10**6.35±0.4820.62±4.25"°19.92±5.8116.77±2.49*15.48±5.19*15.46±3.27**394.70±156.059.91±3.68抑14,01±5.2516.22±8.20*27.34±18.56*26.74±16.31****代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.5TFMP對(duì)T2DM大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響與正常組相比，模型對(duì)照組S0D活性明顯降低(代O.Ol)，MDA含量明顯增加(代O.Ol);與模型對(duì)照組比較，TFMP35、70mg/kg劑量組及二甲雙胍組S0D活性明顯提高(代O.05或代O.01)，MDA含量明顯降低(代O.05或代O.01)，結(jié)果見(jiàn)Tab.8。Tab.8EffectofTFMPonSODactivityandMDAcontentinT2DMrats(7±5)GroupDose(mg/kg)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)NornEil—338.57±50.8912.68±3.72DiabetesModel—245.96±74.8(T22.59±3.45賴(lài)TFMP17.5300.27±50.742120±51935318.29±40.30*19.71±3.5370328.32±39.72*is-29±3.43*Metformin70323.95±29.73**is.27±4.81*微代O.01vsnormal;*代0.05,林代O.01vsmodel4.6TFMP對(duì)T2DM大鼠血清IL-1P、IL-6、TNF-a的影響與正常組相比，模型對(duì)照組IL-1{3、IL-6、TNF-a含量均明顯升高(P〈0.05或P<0.01);與模型對(duì)照組比較，TFMP35、70mg/kg劑量組及二甲雙胍組IL-10含量明顯降低(P〈0.05或P<0.01);TFMP70mg/kg劑量組IL-6含量下降(P〈0.05);TNF-a含量有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)Tab.9。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.7胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與正常對(duì)照組比較，模型組胰島數(shù)目減少，胰島結(jié)構(gòu)失去完整性，胰島細(xì)胞分散，分布不均勻，胰島內(nèi)P細(xì)胞數(shù)明顯減少；與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)CM35、70mg/kg組及二甲雙胍組胰島數(shù)目增多，胰島結(jié)構(gòu)趨向完整，胰島內(nèi)e細(xì)胞數(shù)增多，對(duì)胰島的損傷有較好的改善作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.TFMP對(duì)小鼠腎上腺素所致高血糖有明顯的對(duì)抗作用，于藥后60min開(kāi)始起效持續(xù)到90min。2.TFMP對(duì)小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的對(duì)抗作用，但無(wú)顯著性差異。3.TFMP可以明顯降低T2匿大鼠的血糖，并于給藥后第3周開(kāi)始血糖值降低最為顯著；并且能升高T2DM大鼠肝糖元的含量。4、TFMP可以改善T2匿大鼠的脂代謝紊亂。5、TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰島素含量，提高胰島0細(xì)胞分泌指數(shù)，降低胰島素抵抗指數(shù)，改善IR。6、TFMP可以降低T2DM大鼠的血清MDA含量，升高S0D活性。7、TFMP可以降低T2DM大鼠的血清IL-ie、IL-6、TNF-a含量，減輕炎性反應(yīng)。證明九里香葉總黃酮對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有顯著的預(yù)防與治療作用。圖l胰島P細(xì)胞形態(tài)學(xué)免疫組化分析。權(quán)利要求1.九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求l所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，t3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5,6，7,3',4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。3、權(quán)利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7,3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，'3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%。4、權(quán)利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7,3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。5、九里香葉總黃酮與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療糖尿病的復(fù)方藥物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。從中藥九里香葉中提取分離的九里香葉總黃酮，主要含有5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3′，4′-三甲氧基黃酮。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，九里香葉總黃酮能夠明顯降低T2DM大鼠的血糖，改善T2DM大鼠的脂代謝紊亂，升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰島素含量，提高胰島β細(xì)胞分泌指數(shù)，降低胰島素抵抗指數(shù)，改善IR，降低T2DM大鼠的血清MDA含量，升高SOD活性，降低T2DM大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。證明九里香葉總黃酮對(duì)糖尿病具有顯著的治療作用。文檔編號(hào)A61K36/185GK101278999SQ20081009136公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年4月8日優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日發(fā)明者于曉風(fēng),曲紹春,李緒文,桂明玉,睢大員,金永日申請(qǐng)人:長(zhǎng)春瑞德醫(yī)藥科技有限公司