專利名稱：一種桑蠶卵的活體解剖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種桑蠶卵的解剖方法，具體涉及一種桑蠶卵的活體解剖方法。
背景技術(shù)：
桑蠶(fio"i6jx L.)在我國已經(jīng)被人工馴養(yǎng)5700多年，人們已經(jīng)可
以根據(jù)生產(chǎn)的需要，調(diào)節(jié)桑蠶卵的外周環(huán)境，隨時(shí)控制桑蠶的發(fā)育或滯育。 桑蠶卵從解除滯育到孵化一般需要11-12天的時(shí)間，在這段時(shí)間里人們每天都 要通過傳統(tǒng)的方法解剖桑蠶卵，根據(jù)卵內(nèi)胚胎的發(fā)育特征，判斷胚胎的發(fā)育 進(jìn)程，調(diào)節(jié)外周的環(huán)境條件，促進(jìn)胚胎發(fā)育齊一。
傳統(tǒng)的桑蠶卵解剖方法是堿法，即將濃度為20V。的NaOH或KOH煮沸后， 用銅絲網(wǎng)漏勺將桑蠶卵浸入堿液后，至卵面變?yōu)槌喽股笕〕觯?jīng)清水漂洗 堿液后，放入平面皿中，用膠頭吸管沖吸，直到卵殼被沖破后，吸出已經(jīng)變 性的胚胎，放顯微鏡下觀察。由于桑蠶的品種很多，卵殼的厚薄存在差異， 在堿液中浸的時(shí)間也要求不同。浸的時(shí)間過長，整個(gè)桑蠶卵包括胚胎都被堿 溶解；浸的時(shí)間過短，則吸管沖時(shí)很難將胚胎沖出。因此，這一技術(shù)要求髙 的操作， 一般都由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員進(jìn)行操作。
另外，隨著桑蠶發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究的飛速發(fā)展，近年來，研 究胚胎的發(fā)生及其分子調(diào)控機(jī)制巳經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。目前，還國內(nèi)沒有解剖 桑蠶卵活體胚胎的相關(guān)報(bào)道，在一定程度上制約了活體胚胎的體外培養(yǎng)。抽 提桑蠶卵核酸(DNA或RNA)的方法都是連同卵殼一起放入液氮后研磨，卵 殼上的附著物中會包含大量的微生物，會影響核酸(DNA或RNA)的抽提效 果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種桑蠶卵的活體解剖方法，該方法可以適用于不同厚度卵殼的桑蠶卵，操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用；而且利用該方法得到的胚胎來確 定桑蠶卵的發(fā)育進(jìn)程檢驗(yàn)快速；并且利用該方法得到的胚胎可以用于活體胚 胎的體外培養(yǎng)；另外利用該方法得到的胚胎提取桑蠶卵核酸DNA或者RNA 的時(shí)候不會有污染。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種桑蠶卵的活體解剖方 法，包括下列步驟
(1) 將桑蠶卵放入PBS緩沖液中浸泡后，削開桑蠶卵的一端，擠出桑蠶卵的 所有內(nèi)容物
(2) 在緩沖液中沖洗桑蠶卵的內(nèi)容物，分離胚胎和卵黃。 上述技術(shù)方案中，所述PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)的配方為本領(lǐng)域技
術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)，其中各化合物的濃度為 NaCl 137mmoI/L KC1 2.7mmol/L Na2HP04 4.3mmol/L KH2P04 1.4mmol/L。
上述技術(shù)方案中涉及的解剖器材包括醫(yī)用鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿、膠 頭吸管，載玻片。
優(yōu)選的技術(shù)方案包括以下具體步驟
(1) 在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)72%乙醇消毒5分鐘的桑蠶卵放入盛有溫度為 50t: 55X:無菌PBS緩沖液培養(yǎng)皿中浸泡5 8分鐘，采用鑷子將蠶卵兩邊夾 緊固定，用解剖刀削開卵的一端，鑷子再輕輕擠壓，擠出卵內(nèi)的所有內(nèi)容物；
(2) 用膠頭吸管在緩沖液中輕輕沖洗內(nèi)容物數(shù)次，分離胚胎和卵黃分離。 上述技術(shù)方案中，桑蠶卵的切口面積占卵面積的10~15%為宜，過大會傷
害到胚胎，過小在擠出內(nèi)容物時(shí)，會使胚胎被擠碎。
本方案所得的胚胎可以應(yīng)用于胚胎發(fā)育分析，以確定桑蠶卵的發(fā)育進(jìn)程， 具體包括以下步驟用吸管吸出胚胎至于載玻片上，在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀 察，根據(jù)胚胎的特征，可確定桑蠶卵的發(fā)育進(jìn)程；如解剖的活體胚胎用于觀 察發(fā)育進(jìn)程用，則桑蠶卵的活體解剖不需要在超凈工作臺中操作，解剖器材 只需用無菌水清洗即可，本方案所得的胚胎可以應(yīng)用于活體培養(yǎng)，具體包括以下步驟用吸管將 完整的胚胎吸入盛有l(wèi)mL培養(yǎng)基(TC100)培養(yǎng)板中，搖勻后，再將胚胎吸 出，植入培養(yǎng)板中即可正常培養(yǎng)；如解剖活體胚胎用于活體培養(yǎng)DNA抽提， 所有試劑和器材需要髙壓滅菌(121" 6.895X104 Pa30分鐘)，并在超凈臺內(nèi) 進(jìn)行操作；如解剖活體胚胎用于RNA抽提，所有器材需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 1%。水浸泡30分鐘后，髙壓滅菌6.895 X104 Pa 30分鐘)后， 180r滅菌4小時(shí)以上，PBS緩沖液(含1、DEPC)進(jìn)行滅菌，并在超凈臺內(nèi)進(jìn) 行操作。
本方案所得的胚胎還可以應(yīng)用于分子生物學(xué)分析領(lǐng)域，具體包括以下步 驟收集活體胚胎，加入液氮后研磨，按照常規(guī)方法可以抽提出核酸(DNA 或)RNA，用于分子生物學(xué)分析。
本發(fā)明的工作原理為在50C 55'C的PBS浸潤下，可使桑蠶卵的卵殼 軟化；用鑷子固定好桑蠶卵后，用解剖刀削開桑蠶卵的一端后，再用鑷子擠 壓桑蠶卵時(shí)所有內(nèi)容物均可通過切口擠到緩沖液中；在緩沖液中用吸管沖洗 所得的桑蠶卵的內(nèi)容物后，即可分離出活體胚胎。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1. 由于本發(fā)明是在軟化后的桑蠶卵殼的一端開口，再將桑蠶卵的內(nèi)容物 擠壓出，因此不需要考慮桑蠶卵卵殼的厚度，適用性強(qiáng)；
2. 由于50t 55'CPBS緩沖液的使用，其pH值為7.2 7.4,在這樣的 環(huán)境下直接活體解剖桑蠶卵，因此本發(fā)明解剖出的胚胎為活體，胚胎特征為 實(shí)體特征，便于做體外培養(yǎng)和抽提核酸(DNA或RNA);
3. 本檢驗(yàn)方法的靈敏度髙，操作方便，檢驗(yàn)快速成本低不會排放強(qiáng)堿污 染環(huán)境。


附圖1實(shí)施例中桑蠶卵活體解剖示意其中，1、桑蠶卵；2、胚胎及其它內(nèi)容物；3、鑷子；4、解剖刀；5、切
PI 。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖1及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 其中涉及的解剖器材的包括
醫(yī)用鑷子(12.5 cm)、解剖刀(12號)、培養(yǎng)皿(9 cm)、 PBS緩沖液(NaCl 137mmol/L, KC1 2.7mmol/L， Na2HP04 4.3mmol/L,KH2P04 1.4mmol/L)、 膠頭吸管(9 cm),載玻片(0.2 mm);
實(shí)施例一 一種桑蠶卵活體解剖方法，胚胎用于發(fā)育分析。 將桑蠶卵放入盛有溫度為50"C-55'CPBS緩沖液培養(yǎng)皿中浸泡5-8分鐘， 采用鑷子將蠶卵兩邊夾緊固定，用解剖刀輕輕削開卵的一端，鑷子再輕輕擠 壓，擠出卵內(nèi)的所有內(nèi)容物。用膠頭吸管在水中輕輕沖洗內(nèi)容物數(shù)次，分離 胚胎和卵黃。
用吸管吸出胚胎在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，根據(jù)胚胎的特征，可確定桑 蠶卵的發(fā)育進(jìn)程。
實(shí)施例二 一種桑蠶卵活體解剖方法，胚胎用于活體培養(yǎng)。
將所有的器材進(jìn)行髙溫滅菌，在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)72%乙醇消毒5分 鐘的桑蠶卵放入盛有溫度為5(TC-55C無菌PBS緩沖液培養(yǎng)皿中浸泡5-8分 鐘，采用鑷子將蠶卵兩邊夾緊固定，用解剖刀輕輕削開卵的一端，鑷子再輕 輕擠壓，擠出卵內(nèi)的所有內(nèi)容物。用膠頭吸管在水中輕輕沖洗內(nèi)容物數(shù)次， 即可將胚胎和卵黃分離。
用吸管將完整的胚胎吸入盛有l(wèi)mL培養(yǎng)基(TC100)培養(yǎng)板中，搖勻后， 再將胚胎吸出，植入培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)。
實(shí)施例三 一種桑蠶卵活體解剖方法，胚胎用于DNA抽提
將所有的器材進(jìn)行髙溫滅菌，在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)72%乙醇消毒5分 鐘的桑蠶卵放入盛有溫度為50X:-55"無菌PBS緩沖液培養(yǎng)皿中浸泡5-8分 鐘，采用鑷子將蠶卵兩邊夾緊固定，用解剖刀輕輕削開卵的一端，鑷子再輕 輕擠壓，擠出卵內(nèi)的所有內(nèi)容物。用膠頭吸管在水中輕輕沖洗內(nèi)容物數(shù)次， 即可將胚胎和卵黃分離。
收集胚胎，放入研缽后加入液氮研磨，按照常規(guī)方法進(jìn)行DNA抽提。實(shí)施例四 一種桑蠶卵活體解剖方法，胚胎用于RNA抽提 將所有的器材用1°/。DEPC水浸泡30分鐘后，髙壓滅菌(121X: 6.895X104 Pa30分鐘)后，180匸滅菌4小時(shí)以上。在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)72%乙醇消毒 5分鐘的桑蠶卵放入盛有溫度為50'C-55"C無菌PBS緩沖液(含"/。DEPC)培養(yǎng) 皿中浸泡5-8分鐘，采用鑷子將蠶卵兩邊夾緊固定，用解剖刀輕輕削開卵的一 端，鑷子再輕輕擠壓，擠出卵內(nèi)的所有內(nèi)容物。用膠頭吸管在水中輕輕沖洗 內(nèi)容物數(shù)次，即可將胚胎和卵黃分離。
收集胚胎，放入研缽后加入液氮研磨，按照常規(guī)方法進(jìn)行抽提RNA。 采用本解剖方法，可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、快速解剖出桑蠶卵活體胚胎，可用于分析 胚胎的發(fā)育進(jìn)程、體外培養(yǎng)和抽提核酸(DNA或RNA)。本發(fā)明對于節(jié)約資 源、減少強(qiáng)堿對環(huán)境的污染、提髙勞動效率具有重要意義。
權(quán)利要求
1. 一種桑蠶卵的活體解剖方法，其特征在于包括下列具體步驟(1)將桑蠶卵放入PBS緩沖液中浸泡后，削開桑蠶卵的一端，擠出桑蠶卵的所有內(nèi)容物；(2)在PBS緩沖液中沖洗桑蠶卵的內(nèi)容物，分離胚胎和卵黃。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑蠶卵的活體解剖方法，其特征在于所述PBS 緩沖液為50 55"C的無菌PBS緩沖液，桑蠶卵在PBS緩沖液中浸泡時(shí)間為5 8分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑蠶卵的活體解剖方法，其特征在于步驟(l) 和步驟(2)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑蠶卵的活體解剖方法，其特征在于解剖過 程涉及的試劑和器材經(jīng)髙壓滅菌，即于12ir下，6.895X104Pa的壓力下，滅 菌30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑蠶卵活體解剖方法，用解剖刀削開桑蠶卵的一端，將卵內(nèi)內(nèi)容物全部擠入緩沖液中，經(jīng)吸管沖吸即可分離胚胎及卵黃。其特征在于該方法解剖出來的胚胎為活體，特征明顯，便于對發(fā)育進(jìn)程的判斷；還可用于胚胎的體外培養(yǎng)及抽提核酸(DNA或RNA)。本發(fā)明對于節(jié)約資源、減少強(qiáng)堿對環(huán)境的污染、提高勞動效率具有重要意義。
文檔編號A61B16/00GK101283919SQ20081009685
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者衛(wèi)正國, 兵 李, 沈衛(wèi)德, 許雅香, 陳玉華 申請人:蘇州大學(xué)