專利名稱：：預(yù)防雞毒害艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有預(yù)防雞毒害艾美耳球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗，屬于生物獸藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。是本疫苗含有毒害艾美耳球蟲(五^er/""ec^r/x)子孢子表面抗原NA4基因和雞白細(xì)胞介素-2基因(chlL-2)。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件。
背景技術(shù)：
：雞球蟲病是艾美耳球蟲寄生所引起的原蟲病，病原有毒害艾美耳球蟲(五.weo^/x)、柔嫩艾美耳球蟲C&fc"e//^、堆型艾美耳球蟲(五.wecflr/x)、巨型艾美耳球蟲CE.wax/wa)、布氏艾美耳球蟲CE.6rawe衍)、早熟艾美耳球蟲(E/raeco;c)、和緩艾美耳球蟲(五.w跑)。其中毒害艾美耳球蟲致病力很強(qiáng)，是工廠化養(yǎng)雞危害最為嚴(yán)重的疫病之一，能引起雞的消化功能障礙，生長發(fā)育遲緩，增重減慢，產(chǎn)蛋率下降。從20世紀(jì)40年代開始，各國主要采用抗球蟲藥為常規(guī)的飼料添加劑進(jìn)行預(yù)防，這種方法的缺點(diǎn)是球蟲會(huì)產(chǎn)生抗藥性,在肉蛋產(chǎn)品中產(chǎn)生藥殘，損害人類健康。目前抗球蟲藥仍是防治雞球蟲病的主要手段，隨著雞球蟲抗藥性問題的日趨嚴(yán)重以及人們對(duì)食品安全的日益關(guān)注，人們期待用更理想的方法代替抗球蟲藥的使用。球蟲活囊疫苗的成功研制和應(yīng)用提供了一種可代替藥物控制雞球蟲病的技術(shù)手段，但活疫苗不可避免地存在成本高、難保存、存在散毒及潛在的致病威脅等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，DNA疫苗以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)顯示其在未來畜禽疫病控制中的誘人前景。特別是在球蟲免疫過程中，細(xì)胞免疫占主要作用，而DNA疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此，DNA疫苗作為新型預(yù)防家禽球蟲病的措施逐漸受到重視。雞球蟲保護(hù)性抗原基因的克隆是基因工程疫苗及核酸疫苗研究的基礎(chǔ)。雞球蟲的生活史復(fù)雜、基因組龐大，不同發(fā)育階段的免疫原性和抗原構(gòu)成都有差異。Jeurissen等(1996)研究表明子孢子是免疫有關(guān)的最重要的發(fā)育階段(JeurissenSHM，JanseEM,VermeulenAN,etal.五/附en'afewe〃ainfectionsinchickens:aspectsofhost-parasite:interaction.VetImmunolImmunopathol1996;54:231-238.)。NA4是五.wecaW;c子孢子表面抗原，其重組蛋白對(duì)wcaWx經(jīng)口感染雛雞能產(chǎn)生部分保護(hù)力，其編碼基因與柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊表面抗原TA4的基因具有高度同源性，并已證實(shí)TA4抗原可以減少卵囊排出數(shù)、降低盲腸病變記分等，在球蟲免疫保護(hù)性方面效果較好(FeilsJQPaulLS，GabeJD.IdentificationandCharacterizationofgeneforamajorsurfaceantigenof5/附e"'afewe〃a.In:MoleclarstrategiesofParasticInvasion,UCLASymposiaonMolecularandCellularBiology,NewSeries,1987,42:713-723)。球蟲感染雞后，既可引起體液免疫應(yīng)答也可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫主要通過腔上囊B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞免疫主要是通過依賴胸腺的T淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。分別摘除胸腺和腔上囊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗體作用居于次要地位，而細(xì)胞免疫居于主要地位。T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在球蟲免疫應(yīng)答中處于核心地位，T細(xì)胞反應(yīng)與整個(gè)抗球蟲免疫效應(yīng)的表達(dá)過程密切相關(guān)。近年來的研究表明，作為控制雞球蟲病的新型策略---DNA免疫能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長期的體液和細(xì)胞免疫抵抗多種疾病，包括球蟲病。雞感染球蟲后會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子多數(shù)在體內(nèi)或體外有抑殺球蟲的作用，研究較多的是雞y干擾素(cMFN-tO和雞白介素2(chlL-2)。雞y干擾素的產(chǎn)生及其活性雖然沒有特異性，但據(jù)Kaspers的研究(KasperB，LillehojHS,JenkinsMC,etal.Chickeninterferon陽mediatedinductionofmajorhistocompatibilitycomplexClassIIantigensonperipheralbloodmonocytes.VetImmunolImmunopathol1994;44:71-84.)，它可以通過激活淋巴細(xì)胞和促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類抗原的表達(dá)來調(diào)節(jié)特異性免疫。雞Y干擾素在體外可抑制雞成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)五.的發(fā)育。雞IL-2是另一個(gè)重要的細(xì)胞因子，雞初次和再次感染Eflc"TO//"a，脾和十二指腸的IL-2mRNA顯著增多，也使十二指腸TCR1細(xì)胞的百分比升高。Gaarter等(CaarterLL，etal.RegulationofTcellsubsetsfronmnativetomemory.JImmunol.1998;21(3):181-187.)報(bào)道在感染第3天和第5天給雞注射IL-2可使卵囊排出量降低。這些結(jié)果提示球蟲抗原對(duì)雞IL-2的產(chǎn)生具有潛在的刺激作用，而這種細(xì)胞因子具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，若能誘導(dǎo)它們大量產(chǎn)生，則對(duì)宿主抗球蟲感染十分有利。本發(fā)明利用雞IL-2基因作為佐劑連接到球蟲抗原基因上，旨在增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種有預(yù)防或治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗。該DNA疫苗編碼雞毒害艾美耳球蟲子孢子階段抗原，編碼的抗原具有較高的免疫原性，含有集中的T細(xì)胞表位。并且連接有cML-2基因作為免疫佐劑。將chlL-2基因與球蟲保護(hù)性基因一起引入真核質(zhì)粒，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)所述球蟲保護(hù)基因的免疫保護(hù)效果。本發(fā)明提供一種有預(yù)防或治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入雞毒害艾美耳球蟲子孢子表面抗原NA4基因的開放閱讀框，核苷酸序列為SEQIDNO.l的第1-744個(gè)堿基。該DNA疫苗還包含雞白細(xì)胞介素-2(chIL-2)基因，核苷酸序列分別為SEQIDNO.l的第763-1194個(gè)堿基，并在chIL-2基因的5，端引入了一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因，核苷酸序列為SEQIDNO.l的第745-762個(gè)堿基。chlL-2基因、cML-2基因的5'端引入的一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因與所述NA4基因連接在一起組成一融合表達(dá)載體pVAX-NA4-IL-2。所述的真核質(zhì)粒載體為pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。該DNA疫苗可以在制備預(yù)防或治療雞球蟲病的藥物制劑中應(yīng)用。有益效果本發(fā)明部分建立在本實(shí)驗(yàn)室下列發(fā)現(xiàn)之上含有毒害艾美耳球蟲子孢子表面抗原NA4基因的真核質(zhì)粒載體能夠?yàn)殡u提供針對(duì)毒害艾美耳球蟲的有效免疫保護(hù)；將chlL-2基因與球蟲保護(hù)性基因一起引入真核質(zhì)粒，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)所述球蟲保護(hù)基因的免疫保護(hù)效果。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)雞毒害艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。簡(jiǎn)而言之，其技術(shù)路線如下1.克隆毒害艾美爾球蟲(五."ec"W;c)子孢子表面抗原NA4基因并進(jìn)行測(cè)序。2.構(gòu)建￡.wecfl^x核酸疫苗重組質(zhì)粒pVAX-NA4、pVAX-NA4-IL2(構(gòu)建流程見附圖4一8)3.重組質(zhì)粒在雞體內(nèi)表達(dá)的檢測(cè)4.雞免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.該疫苗是DNA疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、在體內(nèi)維持時(shí)間長、制備簡(jiǎn)單、熱穩(wěn)定性良好、便于貯藏和運(yùn)輸、使用省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)。2.雞球蟲的生活史復(fù)雜、基因組龐大，不同發(fā)育階段的免疫原性和抗原構(gòu)成都有差異。該疫苗包含編碼雞毒害艾美耳球蟲子孢子階段抗原，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。3.雞感染球蟲后會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括chlL-2。這些細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，并且多數(shù)在體內(nèi)或體外有抑殺球蟲的作用。該疫苗含有chlL-2基因，增強(qiáng)了該疫苗的免疫保護(hù)效果。試驗(yàn)證明，免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-NA4-IL-2在抗球蟲感染中，具有良好的免疫保護(hù)效果。圖1為本發(fā)明毒害艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的結(jié)構(gòu)示意圖圖2為重組質(zhì)粒pMD18-T-NA4的構(gòu)建流程圖圖3為重組質(zhì)粒pET28a-NA4的構(gòu)建流程圖圖4為重組質(zhì)粒pVAX-NA4的構(gòu)建流程圖圖5為重組質(zhì)粒pMD18-T-NA4(不含NA4終止密碼子)的構(gòu)建流程圖圖6為重組質(zhì)粒pVAX-NA4(不含NA4終止密碼子)的構(gòu)建流程圖圖7為重組質(zhì)粒pVAX-IL-2的構(gòu)建流程圖圖8為重組質(zhì)粒pVAX-NA4-IL-2的構(gòu)建流程圖圖9為pVAX-NA4-IL-2的酶切鑒定圖M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000;1.PVAX1.0-NA4-IL2重組質(zhì)粒經(jīng)過BamHI和EcoRI雙酶切片段；2.PVAX1.0-NA4-IL2重組質(zhì)粒經(jīng)過EcoRI和ApaI雙酶切片段；3.PVAX1.0-NA4-IL2重組質(zhì)粒經(jīng)過BamHI和ApaI雙酶切片段；4.未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒圖10為pVAX-NA4、pVAX-NA4-IL-2的RT-PCR檢測(cè)圖M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000;1.DNA疫苗pVAX1.0-NA4重組質(zhì)粒注射部位的NA4基因RT-PCR(NA4基因引物)2.DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2重組質(zhì)粒注射部位的NA4基因RT-PCR(NA4基因引物)4.DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2重組質(zhì)粒注射部位的IL-2基因RT-PCR(IL-2基因引物)6.非注射部位肌肉的RT-PCR對(duì)照實(shí)施例基礎(chǔ)材料1.孢子化卵囊江蘇株毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊(K"M^r/jC)(索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1998.本實(shí)驗(yàn)室對(duì)外提供)，每三個(gè)月經(jīng)雞體復(fù)壯并孢子化，孢子化率在80%以上。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物0日齡的小公雛購自南京某種雞場(chǎng)，自出殼至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)飼養(yǎng)在嚴(yán)格消毒，無球蟲的環(huán)境中，自由采食和飲水。3.質(zhì)粒與菌種宿主菌￡co//DH5a、BL21(Invitrogen公司)，質(zhì)粒pET28a(Novagen公司)、真核表達(dá)載體pVAXl(Invitrogen公司)；pMD18-Tvector克隆載體，購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶與試劑Trizol試劑為Promega公司產(chǎn)品；DEPC為Amresco公司產(chǎn)品；P-巰基乙醇為Fluka公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、01igo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000、T4DNALigase、限制性內(nèi)切酶，水飽和酚、瓊脂糖膠回收試劑盒均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。5.主要儀器設(shè)備冷凍臺(tái)式離心機(jī)(EppendorfcentrifUge5417R);紫外可見分光光度計(jì)(Bio-Rad);PCR儀(HYBAID公司)；空氣浴搖床(THZ，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；紫外分析儀(WD-9304C型，北京市六一儀器廠)；電泳儀(DYY-11B，北京市六一儀器廠)。實(shí)施例1.NA4基因的制備1.1合成引物根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面抗原TA4基因核苷酸序列，利用軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)NA4引物P1、P2，并送往大連寶生物(TaKaRa)合成引物。序列如下Pl:5'—GGGATCCATGGCTCGTCTCTCT—3'，P2:5'_GAATTCCTAGAAGAGAGCGAAA—3'。其中下劃線部分分別為引入的酶切位點(diǎn)5awHI和五coRI，；方框部分為起始密碼子。1.2毒害艾美耳球蟲子孢子總RNA的提取采用一步法提取孢子化卵囊總RNA，具體操作步驟如下取純化的五."ec"Wx孢子化卵囊約107個(gè)分別置于用DEPC處理過的無核酶的玻璃勻漿器中，加入lmlTrizol試劑，迅速研磨5分鐘。將勻漿后溶液置于1.5mlEppendorf管中，室溫下溫育5min，加入200pL氯仿，劇烈震蕩混勻靜置10min;4°C，12000r/min離心15min，分三相，吸取上層水相轉(zhuǎn)至新的Eppendorf管中，加入500pL異丙醇，混勻室溫靜置10min沉淀RNA，隨后4°C12000r/min離心15min，去上清，加入75%乙醇洗滌沉淀兩次，然后12000r/min離心5min。棄去液體待管壁稍干燥后加入用25pL無RNA酶DEPC處理的超純水水溶解沉淀。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量及純度。1.3cDNA的合成以上述的總RNA為模板，用oligodT18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20nL:總RNA7pL，oligodT^L，混勻后75。C變性5min，迅速冰浴5min，再加入下列成分5xRTBuffer4^L，MgCl2(25mM)2.0pL，dNTP(10mM)2.0pL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/pL)1.0pL，RNasin(40U/pL)1.0pL，無RNase水補(bǔ)至20^L。充分混勻，42°C反應(yīng)lh。95'C5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。1.4NA4基因PCR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR:cDNA模板2.5tiL，10xPCRBuffer2.5nL，MgCl2(25mM)1.5pL，上游引物P1(50pM)0.5^L，下游引物P2(50pM)0.5nL，dNTP(2.5mM)l攀，Taq酶(5U4iL)0.5pL，補(bǔ)加滅菌超純水至25^L，充分混勻，于PCR儀上94。C預(yù)變性3min，94。C變性45sec，56。C退火45sec，72。C延伸60sec，30個(gè)循環(huán)，72'C延伸10min。1.5NA4基因的克隆(見圖2)取上述獲得的PCR產(chǎn)物25pl，1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物4.5^1pMD18-T載體0.5^1Ligationsolutioni5.0jj!總體積10.0^1將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后16'C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，用5flwHI和5coRI雙酶切鑒定，用P1、P2引物PCR鑒定及測(cè)序等鑒定，確定為pMD18-T-NA4，經(jīng)測(cè)序表明，擴(kuò)增得到NA4基因。1.6NA4基因的表達(dá)(見圖3)分別用5』1和￡coRI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-NA4和質(zhì)粒pET28a，回收NA4目的基因和pET28a大片段(片段大小5363bp左右)，按照合適比例(摩爾比為1:1)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，確定為pET28a-NA4。實(shí)施例2.dna疫苗的制備2.1重組質(zhì)粒pVAX-NA4的構(gòu)建(見圖4)7分別用Ba附HI和五coRI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-NA4和pVAXl，回收NA4目的基因和pVAXl大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用5awHI和五coRI雙酶切鑒定，確定為pVAX-NA4。2.2重組質(zhì)粒pVAX-NA4-IL-2的構(gòu)建(見圖5-8)2.2.1合成引物為構(gòu)建串聯(lián)細(xì)胞因子的重組質(zhì)粒，利用軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)NA4不含終止密碼子的特異性引物P3，并在NA4的3'端加入凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列(方框部分)，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)五coRI。由大連寶生物(TaKaRa)合成引物。引物P3序列如下P3:5'_GAATTCCCTTCCCTCTATGAAGAGAGCGA—3'2.2.2構(gòu)建pVAX-NA4-IL-2DNA疫苗以pMD18-T-NA4為模板，Pl、P3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得不含終止密碼子的NA4基因，回收純化目的片段，再與pMD18-T載體連接，構(gòu)建新的pMD18-T-NA4質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。用SawHI和五coRI雙酶切新構(gòu)建的pMD18-T-NA4質(zhì)粒和pVAXl，回收NA4目的基因和pVAXl大片段，連接構(gòu)建新的pVAX-NA4質(zhì)粒。用五coRI和力al雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1b-TA4-IL-2(Qi羅ingXu,XiaokaiSong，LixinXu,RuofengYan,MohammedAliA.Shah,XiangruiLi.VaccinationofchickenswithachimericDNAvaccineencodingEimeriatenellaTA4andchickenIL-2inducesprotectiveimmunityagainstcoccidiosis.VeterinaryParasitology,2008，156(3-4):319-323)禾卩pVAXl，回收IL-2目的基因和pVAXl大片段，連接構(gòu)建pVAX-IL-2質(zhì)粒。用五coRI和J;al雙酶切新構(gòu)建的pVAX-NA4質(zhì)粒和pVAX-IL-2質(zhì)粒，回收pVAX-NA4大片段G740bp左右)和IL-2小片段(450bp左右)，按照合適比例(摩爾比1:1)進(jìn)行連接，經(jīng)酶切、PCR鑒定(見圖9)，確定為pVAX-NA4-IL-2重組質(zhì)粒DNA疫苗。實(shí)施例3.DNA疫苗在雞體內(nèi)表達(dá)情況的檢測(cè)分別提取pVAX-NA4和pVAX-NA4-IL-2重組質(zhì)粒，經(jīng)胸部肌肉注射14日齡雛雞(100ng/只)，7天后分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)。3.1RT-PCR檢測(cè)DNA疫苗的轉(zhuǎn)錄一步法提取肌肉總RNA，加入DNaseI除去殘余的重組質(zhì)粒和基因組DNA，用RT-PCR法分別擴(kuò)增目的基因。結(jié)果表明DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)錄(見圖10)。3.2Westernblot檢測(cè)DNA疫苗的翻譯3.2.1重組pET28a-NA4蛋白抗血清的制備將pET28a-NA4轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá)，當(dāng)細(xì)菌OD600為0.5時(shí)，用異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，6h后收集細(xì)菌進(jìn)行超聲波裂解，純化包涵體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。將純化的包涵體用弗氏佐劑乳化后，在SD大鼠背部皮下注射免疫(200pg/只)，首次免疫和二次免疫相隔15天，之后每隔78天加強(qiáng)免疫1次。用ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，收集高免血清，置-20'C保存?zhèn)溆谩?.2.2Westernblot檢測(cè)分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，洗滌后加入5%脫脂奶粉封閉無關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)，然后加入抗重組蛋白免疫大鼠血清(一抗)作用1小時(shí)，洗滌緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗大鼠抗體(二抗)作用1小時(shí)，最后DAB顯色液顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了很好的表達(dá)。實(shí)施例4.免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)150羽1日齡雛雞，隨機(jī)分為5組，每組30羽，設(shè)立感染非免疫組(第一組)、非感染非免疫組(第二組)、空載體對(duì)照組(第三組)、pVAX-NA4(第四組)和pVAX-NA4-IL-2(第五組)。14日齡和21日齡時(shí)分別肌肉注射100nlTE(第一組)、100^1TE(第二組)、100嗎pVAX(第三組)、100嗎pVAX-NA4(第四組)、100嗎pVAX-NA4-IL-2(第五組)。28日齡時(shí)除第一組外其余各組經(jīng)口感染毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊(1><105個(gè)/羽)。35日齡逐只稱重，全部撲殺，分別取每只雞的小腸，進(jìn)行病變記分和卵囊計(jì)數(shù)，對(duì)免疫保護(hù)效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.免疫保護(hù)效果的觀察2.1增重效果注射DNA疫苗前，逐羽稱重，然后分別在攻蟲時(shí)和宰殺時(shí)(即攻蟲后第8天)逐羽稱重，觀察注射后至攻蟲前、以及攻蟲后到宰殺時(shí)雞體重變化情況，然后計(jì)算平均增重和相對(duì)增重。平均增重1=攻蟲時(shí)重一首免時(shí)重；平均增重2=宰殺時(shí)重一攻蟲時(shí)重；增重率=(宰殺時(shí)平均體重一攻蟲時(shí)平均體重)/攻蟲時(shí)平均體重X100%。2.2OPG值(克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù))按麥克馬斯特法計(jì)算卵囊，具體為攻蟲后第7天，宰殺全部雞，逐羽取其盲腸內(nèi)容物，各取2g，加10mL水，攪勻，然后再加50mL飽和食鹽水，混勻后立即取糞液充滿兩個(gè)計(jì)數(shù)室，靜止1-2分鐘，鏡檢計(jì)數(shù)兩個(gè)計(jì)數(shù)室的卵囊數(shù)。計(jì)數(shù)室容積為1X1X0.15=0.15mL，0.15mL內(nèi)含糞便2X0.15/(10+50)=0.005g，兩個(gè)計(jì)數(shù)室則為0.01g所得卵囊數(shù)乘100即為OPG值。2.3腸道病變記分攻蟲后第8天，宰殺全部雞只，逐羽觀察小腸病變，并按Johnson方法進(jìn)行病變記分，并將盲腸病變分為0-+4五個(gè)等級(jí)。0分表示正常，無肉眼病變；+1分從小腸中部漿膜面看到散在的針尖狀出血點(diǎn)或白色斑點(diǎn)，粘膜損傷不明顯；+2分從小腸中部漿膜面看到有多量的出血點(diǎn)，也可見到中部腸管稍充氣；+3分小腸腔有大量出血，漿膜面見有紅色或白色斑點(diǎn)。粘膜面粗糙，增厚，有許多針尖狀出血點(diǎn)。腸內(nèi)容物含量少；充氣達(dá)小腸下半段，小腸粗度明顯加大但長度明顯縮小；+4分小腸因嚴(yán)重出血而呈暗紅色、褐色，大部分腸管氣脹明顯，粘膜增厚加劇，腸腔內(nèi)充滿血液和粘膜組織的碎片，從漿膜面看，在感染部位組織見到白色或紅色病狀，在死亡雞只病灶為白色和黑色，呈"白鹽與黑胡椒"之外觀，有些情況，可見到寄生性肉芽腫，腸管增粗一倍，長度縮短一倍。2.4綜合抗球蟲指數(shù)(ACI)ACI是包括存活率、增重、病變、卵囊產(chǎn)量等多項(xiàng)參數(shù)，綜合評(píng)定后作為判定球蟲耐藥性或藥物效力的指標(biāo)，也可用于球蟲疫苗保護(hù)效果檢測(cè)的指標(biāo)。ACI=(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)存活率=(試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活雞只數(shù)/試驗(yàn)組雞只數(shù))X100%相對(duì)增重率=(試驗(yàn)組增重率/非感染非免疫組增重率)X100%病變值(040)=各試驗(yàn)組的平均病變記分(04)X10卵囊值(040)按以下方法計(jì)算盲腸內(nèi)容物充分進(jìn)行搗碎均勻后，加飽和食鹽水作40倍稀釋，用麥克馬斯特計(jì)數(shù)板記數(shù)，并換算為卵囊值，換算標(biāo)準(zhǔn)見表l:表l克盲腸內(nèi)容物卵囊值換算標(biāo)準(zhǔn)盲腸內(nèi)容物OPG(xl05)卵囊值0—0.100.1--1.012.0—5.0106.0—10.020>11.040以AC&180為保護(hù)效果明顯，ACI=160—179為保護(hù)效果一般，ACK160為無保護(hù)效果。3.免疫保護(hù)效果分析(見表2)pVAX-NA4和pVAX-NA4-IL-2的ACI分別為175.99和180.54，具有較好的免疫保護(hù)效果。表2DNA疫苗抗球蟲綜合保護(hù)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>感染非免疫非感染非免疫pVAX質(zhì)粒pVAX-NA4重組質(zhì)粒pVAX-NA4-IL-2重組質(zhì)粒10010010010010032.3810037.9391.0994.04用pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax代替真核質(zhì)粒載體為pVAXl本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易做到。大家都知道，作DNA疫苗，真核表達(dá)載體差別不是太重要，關(guān)鍵是目的基因，有了pVAX-NA4-IL-2，就很容易得至ljpcDNA3.0-NA4-IL-2，pcDNA3.1-NA4-IL-2和pcDNA4/HisMax-NA4-IL-2，而且免疫保護(hù)效果不會(huì)差別太大。序列表南京農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防雞毒害艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗說明書002008-10-185Patentlnversion3.111194麗人工合成pVAX-NA4-IL-2(l)..(1194)1〈110〉<120〉〈130〉〈140〉〈141〉〈160〉〈170〉〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈221〉〈222〉〈223〉〈400〉atggctcgtcgccagagctcgagctcagaactgccagcatgaaatotgtccteactggcactggagtactgcgttgaacaccca^axxcaggscgc鄉(xiāng)cttggc鄉(xiāng)agtctg犯aagagttatctccgatctttggcttcag犯aa^tactctgcagt3CgggtC"t肌tttcctgatt〈210〉2〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈221〉<222〉〈223〉〈400〉2gggatccatggctcgtctct〈210〉322DNA人工合成tctcttttgt肌gcagcaggEictcgcacgaccaaagtcttactttgcctagg犯aggcggaccccgctgtgccccgttgtttgcggcagggctcaccaccagggtggsgtctttcgctctgtatttcggtgg犯33CtCtttcatctcgagttacctgggaagaMttgtatcacaccggttctccatgattctcttcttCCC肌C8gC8gcttcctg犯ggcc娜gcgaggaggagcactaccccgtcactttcgcaggtac^tgactagttgcgtaattcgacgacttctccagtccttcatagagagcaatgctotcaaacattagctctacacaaactgctatt犯gtgaatgcactgaccaactctctgtcactgctcttcggga犯cgatggagtgtag卿tttgga犯tgCtgttgg3g3gcaccagtggctgaaactct3gggCC33g3gtgttoccgs3ccg3cggc8aasgagagtgttcaacgataaaattcccccagggccgtctcctttgtcgcctactccagtgccctaatgcgctgtcatttgcttgacaaaga^gc犯tggaiagaei肌ttgtggcccttcagtagccctcatgg卿gg組tcstgatgtgatgactacagcttatggagc3to犯gg3tttag3aatattccaactggigacccaggagtg3ctctg犯g3犯gaaactgs犯gatctgtgaagcta^caeitttgtgagatatctgcaaaaggcgatgaactgca_gta_gttgtgg犯gscgagctgtc犯gcagcgatgctaacatttcaacctatacaac郷aggtggtccctgctccttgactctctactctgcggcgatctctatcagga犯8tatcC3CCC3gC犯agatgacsctcaagagtcttataa22DNA人工合成引物Pl(l)..咖ct〈211〉〈212〉〈213〉<220>〈221><222>〈223〉60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140119422引物P2(l)..咖12<400>3gaattcctsgaagagagcgaaa22<210>429腿人工合成〈211〉<212>〈213〉〈220〉<221〉<222><223>〈400>引物P3(l)..(29)4gaattcccttccctctatgaagagagcga〈210>5248PRT人工合成<211><212><213〉<220>〈221><222><223><400>NA4編碼的氨基酸(1).5MetAlaArg1GlyGinGinMetGluCys35ProGluPhe50SerHisGlu65GlulieCysGluAlaValGlyLysArg115SerGinPhe130ProAlaVal145ProLysProAlaGlyGlylieCysLeu195AspAspGlu210GlyGlyVal225VallieSer(248)LeuSer5AlaAla20ArgGluGlyAsnAlaArgProLys85LysLeu100GluCysAsnAspTyrAsnSerPro165GlyGly180ThrAsnGinTrpSerProAlaPhe245PheArgAlaAlaAla70ValThrSerLysAsp150ValArgProLysVal230AlaValSerLeuLeuSerLeuSerLeuI>euPhe1015AlaGinGluThrTyrProThrAlaGluThr2530MetAsnGluLeuArgLysAlaAlaGlyLeu4045ValGlyAspAlaValValLeuProAlaTyr5560AlaProValAlaGluThrLeuTrpLysThr7580LeuGlyGlyAlaArg.AlaLysSerValThr9095GlyAsnPheAlaTyrTyrProValThrAsp105110AspAlaLeuGluTyrTrpLysGlyGlyLeu120125lieProProThrPheGinAlaLeuAsnAsn135140ArgAlaValSerPheValAlaLeuTyrAsn155160ValSerCysValLeuLeuGinCysProAsn170175ArgLeuAlaAlaGlyThrThrAspAlaVal185190AlaProLeuAlaAlaGlySerProProPhe200205LyslieValAspSerLeuSerGluLysLys215220GlyProSerValAlaLeulieSerAlaAla235240LeuPhe29權(quán)利要求1、一種雞毒害艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入的雞毒害艾美耳球蟲子孢子表面抗原NA4基因，核苷酸序列為SEQIDNO.1的第1-744個(gè)堿基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中進(jìn)一步還包含雞白細(xì)胞介素-2即chlL-2基因，核苷酸序列為SEQIDNO.l的第763-1194個(gè)堿基，并在chlL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因，核苷酸序列為SEQIDNO.l的第745-762個(gè)堿基。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其中chlL-2基因、chlL-2基因的5'端引入的一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因與權(quán)利要求1所述雞毒害艾美耳球蟲子孢子表面抗原NA4基因連接在一起組成一融合表達(dá)載體pVAX-NA4-IL-2，核苷酸序列為SEQIDNO.l。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。5、權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗在制備預(yù)防或治療雞球蟲病的藥物制劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種雞毒害艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，屬于生物獸藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。利用分子生物學(xué)技術(shù)將毒害艾美耳子孢子表面抗原NA4基因和雞白細(xì)胞介素-2(chIL-2)基因進(jìn)行串連，構(gòu)建了融合表達(dá)載體pVAX-NA4-IL-2。該疫苗包含其中插入的雞毒害艾美耳球蟲子孢子表面抗原NA4基因，和雞白細(xì)胞介素-2即chIL-2基因。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件，具有安全性高、在體內(nèi)維持時(shí)間長、制備簡(jiǎn)單、熱穩(wěn)定性良好、便于貯藏和運(yùn)輸、使用省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地預(yù)防和治療雞的球蟲病。試驗(yàn)證明，免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-NA4-IL-2在抗球蟲感染中，具有良好的免疫保護(hù)效果。文檔編號(hào)A61K39/002GK101422605SQ200810155080公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年11月3日優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日發(fā)明者嚴(yán)若峰,宋小凱,娜張,徐立新,李祥瑞申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)