專利名稱：：一種重組雞α-干擾素的注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組雞『干擾素的注射液及其制備方法，屬于禽畜藥物生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：干擾素(Interferon,IFN)是脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞因子之一，它在機(jī)體抵多種病原微生物、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。雞的干擾素?zé)o論是天然的還是重組干擾素均具有較強(qiáng)的抗病毒的能力。其中雞a-干擾素抗流感病毒和水皰性口炎病毒的能力最強(qiáng)，對(duì)新城疫病毒，傳染性支氣管炎病毒，馬立克病毒等都有較強(qiáng)的抑制效果。公開號(hào)為CN1594568的中國專利申請(qǐng)，公開了一種重組雞a-干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體屬于用分子生物學(xué)方法獲得的基因工程生物制品。它將雞a-干擾素的基因序列通過電轉(zhuǎn)化方式整合到酵母上的特定位置。采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，表達(dá)外源蛋白的純度高于70%,經(jīng)過65636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1000TCID5。的水皰性口炎病毒的攻擊。雞a干擾素對(duì)VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段抑制能力尤其明顯，對(duì)新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒等也都有較強(qiáng)的抑制作用，而且還有強(qiáng)大抗腫瘤、抗增殖作用，對(duì)雞的馬立克氏病毒也具有較強(qiáng)的抑制作用。雖然該專利文件較好的解決了重組雞a干擾素的制備問題，但在具體重組雞a-干擾素的使用上，并未找到合適的用量，當(dāng)使用過量時(shí)，會(huì)造成機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，當(dāng)使用不足時(shí)，達(dá)不到很好的預(yù)防和治療效果，以至于疾病的重新爆發(fā)，并且該專利無法進(jìn)行正常的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，只能是實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，具有產(chǎn)品局限性和應(yīng)用規(guī)模局限性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組雞a-干擾素的注射液及其制備方法。一種重組雞a-干擾素的注射液，其特征在于，組分如下，均為重量百分比黃芪多糖1%-5%，苯甲酸0.1%。-0.5%。，雞01-干擾素原液5%-20%，白蛋白0.1%-0.5%，余量為注射用水。注射用水為溶劑，單支干擾素制品體積為lOml。所述的重組雞a-干擾素注射液的pH=5.0-6.0。所述的白蛋白為雞血白蛋白或牛血白蛋白。所述的雞a-干擾素原液可為參照公開號(hào)為CN1594568的中國專利申請(qǐng)公開的制備方法進(jìn)行制備獲得的產(chǎn)品。一種上述重組雞a-干擾素注射液的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)將黃芪多糖、苯甲酸、白蛋白混勻，然后溶于注射用水并高壓滅菌處理，得注射溶劑；(2)將步驟(1)中制得的注射溶劑與雞a-干擾素原液混合并補(bǔ)加剩余注射用水，得注射液原液；(3)將步驟(2)制得的注射液原液調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0，得重組雞a-干擾素的注射液。(4)將步驟(3)制得得重組雞a-干擾素的注射液在無菌條件下分裝成瓶。所述的高壓滅菌處理可采用濕熱高壓蒸汽滅菌法滅菌。所述步驟(3)中調(diào)節(jié)pH采用lOOmM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)。所述步驟(4)中分裝后每瓶注射液的活力為25008000萬活力單位?；盍挝?U)是指以能抑制50%細(xì)胞病變的干擾素最大稀釋度定義為一個(gè)活性單位。使用方法-預(yù)防病癥注射每次1-5萬活力單位/羽，每大1次，2-3天治療普通病癥注射每次2-8萬活力單位/羽，每天l次，連續(xù)2-5天治療重癥注射每次4-12萬活力單位/羽，每天1次，連續(xù)3-5天本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明針對(duì)雞新城疫、傳染性支氣管炎病有顯著療效，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)雞新城疫、傳染性支氣管炎病治愈率達(dá)70%-90%，高于以往的相關(guān)同類禽藥，并且由于X用生物試劑，可有效避免化學(xué)合成藥品對(duì)患禽肉質(zhì)的污染，提高禽類食用品質(zhì)。本產(chǎn)品使用時(shí)能夠節(jié)約養(yǎng)殖過程藥物成本10%-35%，并且本產(chǎn)品對(duì)雞輪狀病毒引起的腹瀉和腸炎亦有很好的療效，同時(shí)能降低雛雞階段因免疫抑制引起抵抗力下降而導(dǎo)致的死亡率。圖l:雞(X-干擾素酵母表達(dá)載體構(gòu)建示意圖2:雞ot-干擾素成熟蛋白基因PCR產(chǎn)物電泳分析1、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為2000bp，750bp，500bp,100bp;2、陰性對(duì)照；3、PCR產(chǎn)物，箭頭為530bp;圖3:PCIZa-A-chIFNot陽性克隆載體的酶切鑒定1、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為2000bp，1000bp，500bp,250bp:2、3是ECORI和SalI酶切的重組表達(dá)載體。箭頭為530bp的條帶；圖4:轉(zhuǎn)化酵母的PCR鑒定1、陰性對(duì)照；2、未重組上的酵母，箭頭為588bp的條帶；3、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，箭頭從上到下依次為1000bp，500bp的條帶；4、陽性重組酵母，箭頭所指為1100bp的條帶；圖5:陽性對(duì)照孔的水皰性口炎病毒的嚴(yán)重病變；圖6:千擾素稀釋濃度低于48處理的雞胚成纖維細(xì)胞；圖7:陰性對(duì)照孔中的雞胚成纖維細(xì)胞；圖8:雞用a-干擾素在凝膠電泳中鑒定1、為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，2、為酵母表達(dá)雞用a—干擾素結(jié)果，3、為空載體重組酵母表達(dá)的結(jié)果；具體實(shí)施方式本發(fā)明通過以下實(shí)施例做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:篩選高表達(dá)的酵母菌種(可參考專利200410041075.0的基因構(gòu)造方法及序列)(1)提取雞全血淋巴細(xì)胞總RNA，通過在PCR儀上設(shè)置30個(gè)循環(huán)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的雞a-干擾素基因大小為488bp。RT-PCR的方法克隆出雞a-干擾素成熟蛋白的基因。(2)利用通過PCR擴(kuò)增的雞a-干擾素成熟蛋白基因(pMD18-T-cWFNa)有ECORI和Xbal兩個(gè)酶切位點(diǎn)。把雞a-干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內(nèi)切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連，再經(jīng)ECORI和XbaI酶切，如能切下大小為530bp的條帶則可以鑒定為陽性；結(jié)果見圖3。(3)制備感受態(tài)酵母菌，將含有雞ot-干擾素成熟蛋白基因的酵母表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌。電擊結(jié)束后，取250pL轉(zhuǎn)化物涂含有l(wèi)OOpg/mlZeocin抗生素的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28'C恒溫培養(yǎng)2-4天，能在YPDS培養(yǎng)基上生長的菌落為陽性轉(zhuǎn)化子。(4)將篩選得到的重組高拷貝菌株，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，取5ul反應(yīng)液做瓊脂糖凝膠電泳觀察末重組任何目的基因的PPICZa-A酵母的染色體通過引物擴(kuò)增及陽性重組酵母表達(dá)菌株通過以上的引物擴(kuò)增的片段，結(jié)果見圖4。(5)含有雞a-干擾素高表達(dá)酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長出的最初轉(zhuǎn)化子，影印法依次接種含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ug/ml的YPDS培養(yǎng)基中，逐級(jí)篩選Zeocin高抗性菌株即含目的基因的高拷貝菌株。(6)含有雞cx-干擾素成熟蛋白基因的酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)從含有高拷貝目的基因的酵母菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株與25ml的BMGY中，經(jīng)28。C搖床培養(yǎng)至OD6of2-6時(shí)，室溫12000rpm離心5min收獲細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞用100ml的BMMY培養(yǎng)液懸浮與1000ml的三角瓶中28r誘導(dǎo)表fe每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加0.5%的甲醇，以保持誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)。最終取誘導(dǎo)72h的上清，透析后用于測定其抗病毒活性。(7)含雞a-干擾素成熟蛋白基因高表達(dá)酵母菌株的表達(dá)產(chǎn)物的初步純化培養(yǎng)上清的處理將誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)液離心，收集上清液留樣后，用50mM含lmMPMSF的Tris-HCl緩沖液溶解。用50mM的Tris-HCl緩沖液透析除去雜質(zhì)，再用PEG20000濃縮獲得雞a干擾素成熟蛋白。實(shí)施例2:發(fā)酵工藝(1)種子液的制備將雞a-干擾素酵母菌種劃線接種到Y(jié)PDS+zeocin平板上3(TC培養(yǎng)96小時(shí)后，挑單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中3(TC搖床培養(yǎng)1618小時(shí)，在無菌條件下取樣測OD,在0.60.8之間，PH值在5.56.0之間，鏡檢無雜菌存在即可作為發(fā)酵使用的菌種。發(fā)酵使用種子液一般保存在04°C，保存時(shí)間不得超過48小時(shí)。(2)發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY/BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度為28-30°C，誘導(dǎo)時(shí)間48-72小詠24-48小時(shí)流加甲醇量為0.5-1%，發(fā)酵PH5.5-6.0，接種量為5-20%，攪拌轉(zhuǎn)速為450-500rpm/min。將發(fā)酵除菌后的干擾素樣品"微量細(xì)胞病變抑制法"檢測其生物活性。觀察可見陽性對(duì)照孔完全出現(xiàn)100%嚴(yán)重病變(圖5)，而酵母表達(dá)的干擾素進(jìn)行107，106，105稀釋后所加入的細(xì)胞孔分別有卯％,50%，0%的病變，在加入低于105稀釋的重組酵母雞01-干擾素的細(xì)胞孔，細(xì)胞狀態(tài)良好(圖6)。陰性對(duì)照孔中是正常的雞胚成纖維細(xì)胞(圖7)。從上述結(jié)果得出重組酵母雞a干擾素的生物學(xué)活性為106U/ml。實(shí)施例3:后提取工藝取按實(shí)施例2方法制得的發(fā)酵液，按如下步驟進(jìn)行提取先采用10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心除菌；板框過濾除雜和進(jìn)一步除菌；再通過10萬分子量的膜包超濾取清液，除去大分子的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)；再用6千分子量的膜包超濾收集濃縮液，除去一些醛、醇類和小分子量的無機(jī)鹽等雜質(zhì)；最后再一次除菌，得到粗制干擾素，在凝膠電泳中的鑒定結(jié)果見圖8。采用"微量細(xì)胞病變抑制法"檢測提取后的干擾素生物活性，結(jié)果如下取60升發(fā)酵液，效價(jià)測定為5.2xl06U/ml，平行三次進(jìn)行后提取工藝處理，測量體積并測定效價(jià)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4:制備一天給藥一次的雞a-干擾素8000萬活力單位1000支，組份如下雞a-干擾素原液1500ml(可參照專利200410041075.0中的方法進(jìn)行制備)苯甲酸l-5g白蛋白10-15g(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為69003431的白蛋白或Bovin生產(chǎn)的型號(hào)為10-B11的白蛋白)黃芪多糖100-500g(購自四川海鑫植物原料有限公司生產(chǎn)的針用70%含量的黃芪多糖)注射用水補(bǔ)加至總體積為10000ml制備方法按上述量將黃芪多糖、苯甲酸、白蛋白混勻，溶于500ml注射用水中，經(jīng)高壓滅菌處理后，與雞oc-干擾素原液1000ml混合，補(bǔ)加注射用水，同時(shí)以100mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，定溶體積至10000ml。在無菌條件h將干擾素制品分裝為每瓶10ml的成品干擾素，并軋蓋封存于0-4'C冰箱巾。隨機(jī)抽取2瓶成品干擾素，以"微量細(xì)胞病變抑制法"測其效價(jià)，以不低于8000萬活力單位為合格。活力單位定義為以能抑制50%細(xì)胞病變的十?dāng)_素最大稀釋度定義為一個(gè)活性單位。實(shí)施例5:雞a-干擾素對(duì)雞病毒性疾病治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)案例一雞a-干擾素對(duì)傳染性支氣管炎的治療20R齡SPF雞、AA肉雞、羅曼褐蛋雞各720只，每品種均隨機(jī)分成I、II、IH三大組，每組240只雞，每大組中再隨機(jī)分成24個(gè)小組，每小組10只，包括3個(gè)批號(hào)9個(gè)批次平行試驗(yàn)小組27組和3個(gè)對(duì)照組，即為3xXm。分別于攻毒后肌肉注射三個(gè)批次的雞oc-干擾素0.5萬單位、l萬單位、1.5萬單位、2.0萬單位、2.5萬單位、3.0萬單位，乂8為接種病毒，非治療對(duì)照組注射0.5ml生理鹽水。攻毒后2天開始治療，肌肉注射0.5ml相應(yīng)單位的雞a-下擾素，每天一次，連續(xù)使用二天。連續(xù)觀察14d。保護(hù)率=(AXB—C)/AXB，A為試驗(yàn)組雞，B為對(duì)照組死亡比例，C為試驗(yàn)組死亡雞數(shù)。表l各組試驗(yàn)雞干擾素注射量(萬單位/只)組別批號(hào)批次試驗(yàn)組X(X氣A或B或C)對(duì)照組X)X2x3X4x5x6x7x810.30.51.01.52.02.53.0一A040320.30.51.01.52.02.53.0一30.30.51.01.52.02.53.0—10.30.51.01.52.02.53.0—B040520.30.51.01.52.02.53.0—30.30.51.01.52.02.53.0一10.30.51.01.52.02,53.0一C040820.30.51.01.52.02.53,0—30.30.51.01.52.02.53.0—肉雞可獲得65%以上的保護(hù)率；以1.5萬單位/只以上的劑量肌肉注射治療，羅曼褐蛋雞可獲得65%以上的保護(hù)率。故雞基因工程a-干擾素可用于預(yù)防治療傳染性支氣管炎病毒感染，治療時(shí)呈現(xiàn)相對(duì)的劑量依賴性。肌肉注射治療使用時(shí)以2萬單位/羽為宜。案例二雞a干擾素對(duì)傳染性喉氣管炎的治療取羅曼褐商品代蛋雞720只，隨機(jī)分成I、II、III三大組，每組240只雞，每大組中再隨機(jī)分成24個(gè)小組包括3個(gè)批號(hào)9個(gè)批次平行試驗(yàn)小組21組和3個(gè)對(duì)照組每小組10只，即為3XXw。每只雞氣管內(nèi)LITV105EID50/0.1ml強(qiáng)毒0.05ml，攻毒后2天開始治療，每只雞的肌肉注射0.5ml相應(yīng)單位的干擾素Xw分別于攻毒后肌肉注射每個(gè)批號(hào)三個(gè)批次的雞a-干擾素O.3萬單位、0.5萬單位、l萬單位、1.5萬單位、2.0萬單位、2.5萬單位、3.0萬單位，X8為接種病毒非治療對(duì)照組。各小組雞均分別隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14d。保護(hù)率=(AXB—C)/AXB，A為試驗(yàn)組雞，B為對(duì)照組死亡比例，C為試驗(yàn)組死亡雞數(shù)。表2各組試驗(yàn)雞干擾素注射量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以1.5萬單位/只以上劑量的雞a-干擾素肌肉注射治療，羅曼褐商品代蛋雞可獲得65%以上的保護(hù)率。雞基因工程a-干擾素可用于預(yù)防治療傳染性喉氣管炎病毒感染，治療時(shí)呈現(xiàn)相對(duì)的劑量依賴性。肌肉注射治療使用時(shí)以2萬單位/羽為宜。實(shí)施例6雞a-干擾素對(duì)病毒病的預(yù)防/治療應(yīng)用雞a-干擾素可用于各種病毒病的預(yù)防與治療。對(duì)商品代大肉食雞進(jìn)行預(yù)防控制時(shí)，做完21日齡免疫完后，從23日齡開始，以注射或飲水方式，每周使用2天，2-6萬U/羽，可有效預(yù)防病毒病的發(fā)生。對(duì)商品代大肉食雞進(jìn)行治療時(shí)，以注射或飲水方式，2-6萬U/羽，連用三天，并配以緩解癥狀或治療繼發(fā)或混合感染的藥物。出現(xiàn)呼吸道癥狀時(shí)，配以大環(huán)內(nèi)酯類藥物；出現(xiàn)腎腫時(shí)配以解腎腫類藥物；出現(xiàn)大腸種菌混合感染時(shí)，配以頭孢類或其他類廣譜抗生素。依據(jù)病情調(diào)整使用時(shí)間。對(duì)蛋雞或種雞進(jìn)行預(yù)防控制時(shí)，可根據(jù)季節(jié)每1-2周使用2天，用量為2-5萬U/羽。對(duì)蛋雞或種雞進(jìn)行治療的方法，同商品代大肉食雞。權(quán)利要求1、一種重組雞α-干擾素的注射液，其特征在于，組分如下，均為重量百分比黃芪多糖1％-5％，苯甲酸0.1‰-0.5‰，雞α-干擾素原液5％-20％，白蛋白0.1％-0.5％，余量為注射用水。2、如權(quán)利要求l所述重組雞a-干擾素的注射液，其特征在于，所述的白蛋白為雞血白蛋白或牛血白蛋白。3、一種如權(quán)利要求1所述的重組雞oc-干擾素注射液的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)將黃芪多糖、苯甲酸、白蛋白混勻，然后溶于注射用水并高壓滅菌處理，得注射溶劑；(2)將步驟(1)中制得的注射溶劑與雞a-干擾素原液混合并補(bǔ)加剩余注射用水，得注射液原液；(3)將步驟(2)制得的注射液原液調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0，得重組雞a-干擾素的注射液。4、如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的高壓滅菌處理可采用濕熱高壓蒸汽滅菌法滅菌。5、如權(quán)利要求3所述重組雞a-干擾素注射液的制備方法，其特征在于，步驟(3)中調(diào)節(jié)pH采用100mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)。6、如權(quán)利要求3所述重組雞oc-干擾素注射液的制備方法，其特征在于，所述歩驟(3)制得的重組雞a-干擾素的注射液在無菌條件下分裝成瓶。7、如權(quán)利要求6所述重組雞a-干擾素注射液的制備方法，其特征在于，分裝后每瓶注射液的活力為25008000萬活力單位。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組雞α-干擾素的注射液及其制備方法，屬于禽畜藥物生產(chǎn)
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。一種重組雞α-干擾素的注射液，其特征在于，組分如下，均為重量百分比黃芪多糖1％-5％，苯甲酸0.1‰-0.5‰，雞α-干擾素原液5％-20％，白蛋白0.1％-0.5％，余量為注射用水。注射用水為溶劑，單支干擾素制品體積為10ml。本產(chǎn)品使用時(shí)能夠節(jié)約養(yǎng)殖過程藥物成本10％-35％，并且本產(chǎn)品對(duì)雞輪狀病毒引起的腹瀉和腸炎亦有很好的療效，同時(shí)能降低雛雞階段因免疫抑制引起抵抗力下降而導(dǎo)致的死亡率。文檔編號(hào)A61P11/00GK101417122SQ20081023797公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年12月4日優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日發(fā)明者剛劉,劉璐璐,姜正軍,孫麗紅,崔麗萍,柳少杰,王茂超,蘇曉明,陳溥言申請(qǐng)人:山東華辰生物科技有限公司