專利名稱：流感病毒的檢測(cè)的制作方法
流感病毒的檢測(cè)與相關(guān)申請(qǐng)的交互參考本申請(qǐng)是2007年1月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/698, 798的部分連續(xù)案， 該申請(qǐng)為所有目的以其全文引為參考。
背景技術(shù)：
流感由正粘病毒科的RNA病毒引起。這些病毒有三種類型，它們引起三種不同類 型的流感:A型、B型和C型。A型流感病毒感染哺乳動(dòng)物(人類、豬、雪貂、馬)和鳥。它對(duì) 于人類是非常重要的，因?yàn)檫@種類型的病毒引起了世界范圍的大流行。B型流感病毒(也簡(jiǎn) 稱為B型流感病毒)只感染人類。它偶然引起局地流感爆發(fā)。C型流感病毒也是只感染人 類。它們感染的大多數(shù)是年輕人，很少引起嚴(yán)重疾病。目前用于流感病毒抗原的快速免疫診斷檢驗(yàn)例如“Binax NOffFluA和 FluB ” (Binax， Inc. ， Portland, ME)、“Directigen Flu A+B ” (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、“Flu ΟΙΑ ”(Biostar Inc. , Boulder, CO),"Quick Vue " (Quidel, Sand Diego，CA)、"Influ ABQuick ”(Denka Sieken Co. , Ltd. , Japan)和"Xpect Flu A&B” (Remellnc.，Lenexa, KS)，據(jù)報(bào)道能夠檢測(cè)A型流感病毒或區(qū)分A型和B型流感病 毒。檢驗(yàn)方式的復(fù)雜性可能需要專門訓(xùn)練。此外，為了獲得陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果，通常需要顯著 量的病毒毒粒子，這將它們的應(yīng)用限制到當(dāng)病毒以最高水平釋放的短時(shí)間窗內(nèi)。分析靈敏 度也是可變的，在目前非常關(guān)注的某些檢驗(yàn)分析中，假陰性檢驗(yàn)結(jié)果高達(dá)20% (參見例如 “WHO關(guān)于使用流感病毒診斷快速檢驗(yàn)的推薦意見”(WHOrecommendations on the use of rapid testing for influenza diagnosis)，2005 年 7 月)?；诜崔D(zhuǎn)錄酶 PCR 的診斷方 法(RT-PCR)導(dǎo)致性能進(jìn)步，但是費(fèi)力，并需要高度受過訓(xùn)練的人員，使得現(xiàn)場(chǎng)或野外檢驗(yàn) 變得困難。由于反轉(zhuǎn)錄酶相對(duì)低效，為了有效檢測(cè)病毒RNA，可能需要顯著量的病毒(例如 IO4個(gè)病毒粒子)和多達(dá)20種引物。不幸的是，RT PCR不容易適應(yīng)在流行情況下對(duì)對(duì)象的 高通量篩選，或在農(nóng)村或現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理(point-of-care)情況下的野外使用。此外，新流感病毒毒株的復(fù)雜性、多樣性和快速出現(xiàn)，使得高風(fēng)險(xiǎn)毒株的診斷變得困難，因此快速反應(yīng)在目前幾乎是不可能的。對(duì)于流行病學(xué)家來(lái)說，由高突變率和遺傳再 分配導(dǎo)致的多樣性，使得對(duì)于新毒株可能源自哪里的預(yù)測(cè)、以及及時(shí)作出反應(yīng)引入用于PCR 的新診斷引物，變得困難。結(jié)果是，(目前)流感病毒的多樣性要求多重PCR方法的必要性。 2006 年 10 月 21 日提交的 PCT/US06/41748，2006 年 4 月 14 日提交的 USSN 11/481,411、 60/792，274,2006 年 2 月 2 日提交的 60/765，292,2005 年 10 月 13 日提交的 60/726，377， 以及2005年7月1日提交的60/696，221，是針對(duì)相關(guān)的主題內(nèi)容，并出于所有目的以其全 文引為參考。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了檢測(cè)A型流感病毒的方法。方法包括將來(lái)自對(duì)象的樣品同與A型流感病毒致病毒株的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；檢測(cè)樣品中存在或不存 在PDZ結(jié)構(gòu)域與致病性A型流感病毒的NSl蛋白的特異性結(jié)合，以確定樣品中存在或不存 在致病性A型流感病毒；將患者樣品同與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；以及檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流感病毒季節(jié)性亞型 的NSl蛋白的特異性結(jié)合，以確定樣品中存在或不存在A型流感病毒季節(jié)性亞型。任選，與致病性A型流感病毒的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域是PSD95 結(jié)構(gòu)域。任選地，與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域是 INADL結(jié)構(gòu)域8。任選，樣品是從口腔獲得的樣品。任選，對(duì)象是顯示出流感癥狀 的人類。任 選，PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白的特異性結(jié)合通過夾心(sandwich)分析檢測(cè)，其中樣品 與結(jié)合NSl蛋白的抗體相接觸，并檢測(cè)PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域與抗體都與NSl蛋白特異性結(jié)合 的復(fù)合物。任選，INADL PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白的特異性結(jié)合通過夾心分析檢測(cè)，其中檢測(cè) 的是INADL PDZ結(jié)構(gòu)域與抗體都與NSl蛋白特異性結(jié)合的復(fù)合物。任選，PSD95的至少一 個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含PSD95的PDZ結(jié)構(gòu)域2。任選，至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含至少三個(gè)拷貝的 PSD95結(jié)構(gòu)域2。任選，至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含PSD95的結(jié)構(gòu)域1、2和3。任選，INADL的 至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含INADL的結(jié)構(gòu)域8。任選，INADL的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含三個(gè) 拷貝的INADL結(jié)構(gòu)域8。本發(fā)明還提供了檢測(cè)A型流感病毒的方法。方法包括將來(lái)自對(duì)象的樣品同與A型 流感病毒NSl蛋白的不同表位相結(jié)合的第一種和第二種泛(pan)特異性抗體相接觸；檢測(cè) 存在或不存在第一種和第二種抗體與NSl蛋白之間的復(fù)合物，以表明存在或不存在A型流 感病毒。任選，第一種和第二種抗體各與圖IA的8-21、9-20、29-38或45-49位殘基中的表 位結(jié)合。任選，第一種和第二種抗體與選自F64 3H3、F688E6、F64 6G12、F68 10A5、F80 7E8、 F80 8F6、F80 9BUF81 1C12、F81 1F3、F81 4D5 和 F64 IAlO 的不同抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。本發(fā)明還提供了檢測(cè)A型流感病毒的方法。方法包括將來(lái)自對(duì)象的樣品與至少一 個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和至少一種結(jié)合A型流感病毒NSl蛋白的泛特異性抗體相接觸；根據(jù)存在或 不存在至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和泛特異性抗體與NSl蛋白特異性結(jié)合的復(fù)合物，檢測(cè)樣品中 存在或不存在A型流感病毒的NSl蛋白。任選，泛特異性抗體是固定在固相上的捕獲抗體。 任選，泛特異性抗體是檢測(cè)抗體。任選，泛特異性抗體與圖IA中帶有9-20、29-38或45-49 位殘基的NSl蛋白的表位特異性結(jié)合。任選，泛特異性抗體是單克隆抗體。任選，泛特異 性抗體是兩種單克隆抗體的混合物。任選，泛特異性抗體是與選自F64 3H3、F68 8E6、F64 6G12、F68 10A5、F80 7E8、F80 8F6、F80 9B1、F81 1C12、F81 1F3、F81 4D5 和 F64 IAlO 的 抗體競(jìng)爭(zhēng)與NSl蛋白的特異性結(jié)合的單克隆抗體。任選，患者的樣品與連接到支持物不同 區(qū)域上的至少兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸。任選，所述至少兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域是PSD95結(jié)構(gòu)域和 INADL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了檢測(cè)B型流感病毒的方法。方法包括將樣品同與B型流感病毒 NSl蛋白的不同表位相結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體相接觸；檢測(cè)存在或不存在第 一種和第二種抗體與NSl蛋白之間的復(fù)合物的，以表明存在或不存在B型流感病毒。任選， 第一種和第二種抗體各與圖 2 的 10-28、40-45、50-57、67-74、84-100、154-159、169-173、 185-191、212-224、226-240位殘基中的表位結(jié)合。任選，第一種和第二種抗體與選自F89 1F4、F94 3A1和F89-1F8的不同抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。本發(fā)明還提供了檢測(cè)流感病毒的方法。方法包括將來(lái)自對(duì)象的樣品同與B型流感 病毒NSl蛋白的不同表位相結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體、以及與A型流感病毒NSl 蛋白的不同表位相結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體相接觸；測(cè)定存在或不存在B型流感病毒NSl蛋白與結(jié)合它的第一種和第二種泛特異性抗體之間形成的復(fù)合物，以表明樣品 中存在或不存在B型流感病毒，以及確定存在或不存在A型流感病毒NSl蛋白與結(jié)合它的 第一種和第二種泛特異性抗體之間形成的復(fù)合物，以表明樣品中存在或不存在A型流感病 毒。任選，方法還包括將患者的樣品與特異性針對(duì)來(lái)自A型流感病毒致病性毒株NSl蛋白的 PL的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；以及檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流感病毒致病性毒株的 NSl蛋白的特異性結(jié)合，以表明存在或不存在A型流感病毒的致病性毒株。任選，針對(duì)A型 流感病毒的第一種和第二種泛特異性抗體分別為捕獲和檢測(cè)抗體，PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白 特異性結(jié)合的存在通過檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域、NSl蛋白和檢測(cè)抗體之間形成的復(fù)合物來(lái)檢測(cè)。任 選，方法還包括將患者樣品與特異性針對(duì)A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL的PDZ 結(jié)構(gòu)域相接觸；以及檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白 的特異性結(jié)合，以表明存在或不存在A型流感病毒的季節(jié)性亞型。附圖簡(jiǎn)述

圖1A(SEQ ID NO 1)顯示了來(lái)自三種A型流感病毒亞型Hmi、H3N2和H5m的NSl 蛋白之間不變的氨基酸殘基。正如下面描述的，包含了不變的氨基酸殘基簇的NSl蛋白區(qū) 段被用于誘導(dǎo)泛特異性抗體。
圖IB(SEQ ID NO 2)顯示了的氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)于H5W的NSl蛋白中，但在H3N2 和Hmi中沒有發(fā)現(xiàn)。這些殘基的簇，特別是在21-28位和C-末端的簇被用于制備與H5m 結(jié)合而不與其它兩種亞型結(jié)合的抗體。圖2 (SEQ ID NO 3)顯示了來(lái)自A型流感病毒不同毒株的NSl蛋白殘基的共有序 列。圖3 (SEQ ID NO 4)顯示了來(lái)自B型流感病毒不同毒株的NSl蛋白殘基的共有序 列。下劃線的殘基在不同毒株之間是不變的。圖4顯示了來(lái)自6個(gè)人類A型流感陽(yáng)性樣品的鼻分泌物檢驗(yàn)結(jié)果。圖5顯示了在用A/PR/8/34感染的MDCK細(xì)胞中NSl的表達(dá)。圖6顯示了細(xì)胞中PDZ與NSl的相互作用。圖7顯示了細(xì)胞中INADL d8與H3N2 NSl的相互作用。圖8顯示了使用PDZ捕獲劑和單克隆抗體檢測(cè)劑AU-4B2進(jìn)行NSl診斷的側(cè)向流 形式。圖9顯示了使用單克隆抗體捕獲劑和單克隆抗體檢測(cè)劑AU-4B2的側(cè)向流形式。圖10A-F示例了側(cè)向流流感病毒檢驗(yàn)形式。圖11 使用各種捕獲和檢測(cè)抗體的組合，在側(cè)向流分析中檢測(cè)來(lái)自B型流感病毒 兩種毒株的重組NSl。圖12 在臨床樣品中檢測(cè)來(lái)自B型流感病毒的NS1。圖13 本圖顯示了適合檢測(cè)來(lái)自B型流感病毒的NSl的捕獲和檢測(cè)抗體的組合。圖14A、B和C 含有1個(gè)拷貝或3個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的肽與NSl蛋白的結(jié) 合。圖14A:含有3個(gè)拷貝PSD95結(jié)構(gòu)域2的GST融合肽序列(SEQ ID N0:11)。源于GST 的序列，包括GST肽序列和克隆接頭序列，為斜體(分別為1-242和243-244位氨基酸)。 天然的PSD95結(jié)構(gòu)域2序列為粗體(對(duì)應(yīng)于NCBI登記號(hào)No. AAC52113的197到288位氨 基酸)；結(jié)構(gòu)域2之外的天然的PSD95序列用正常的(即非粗體、非斜體的)字體表示(任何重復(fù)/重新定位的這樣的序列也被下劃線)。圖14B 檢測(cè)0、25、100或500pg的NSl肽 與含有單一拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的肽和含有三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的肽的結(jié)合的側(cè) 向流分析。圖14C 檢測(cè)0、25、100或500pg的含有PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域(1、2、3)的肽與NSl 的結(jié)合的側(cè)向流分析與含有單一拷貝的PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域的肽的結(jié)合進(jìn)行比較。定義"A型禽流感病毒”是指感染禽類對(duì)象并可以在禽類對(duì)象之間傳播的A型流感病毒 亞型。禽流感病毒血凝素亞型的代表性例子包括H5、H6、H7、H9和HlO，代表性的毒株包括 H5N1、H6N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N4和H10N5。某些禽流感病毒毒株也能夠感染人類?！扒蓊悓?duì)象”是指適合檢驗(yàn)或治療的對(duì)象，包括所有鳥類物種，包括野生鳥類(例如 野禽)和家養(yǎng)物種(例如家禽)。優(yōu)選，待檢驗(yàn)或治療的禽類選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕 鳥、鴯鹋和外來(lái)的鳥類例如鸚鵡、美冠鸚鵡和澳洲鸚鵡。更優(yōu)選，待檢驗(yàn)的禽類對(duì)象是雞、火 雞、鵝或鵪鶉。“A型流感病毒的致病性毒株”當(dāng)在區(qū)別不同流感病毒毒株的背景下使用時(shí)，是 指根據(jù)OIE世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0ΙΕ World Organizationfor Animal Health)、世界衛(wèi) 生組織(World Health Organization)或它們的指定代理提出的準(zhǔn)則，例如在OIE的《陸 生動(dòng)物的診斷檢驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》(第五版)(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals, 5th ed ition, 2004 (www, oie. int))中提出的準(zhǔn)則，是“法定的 禽流感病毒”(ΝΑΙ)。此外，目標(biāo)致病性毒株在代表性毒力檢驗(yàn)中具有“高度致病性”，或Η5 或Η7病毒，所述病毒與已經(jīng)在有毒力的病毒一一即由OIE或代表性的類似國(guó)內(nèi)或國(guó)際組織 或貿(mào)易聯(lián)合會(huì)所定義的病毒——中觀察到的任何一種相類似的A型流感病毒血凝素(HA) 前體蛋白HAO切割位點(diǎn)氨基酸序列。在A型流感病毒有毒力的Η5和Η7毒株中，HAO切割 位點(diǎn)氨基酸序列的代表性例子包括在病毒前體血凝素蛋白的切割位點(diǎn)處的多個(gè)堿性氨基 酸(精氨酸或賴氨酸)，例如，在低毒力的Η7病毒毒株具有PEIPKGR*GLF(SEQ IDNO 20)或 PENPKGR*GLF (SEQ ID NO 21)的位置，高致病性毒株具有 PEIPKKKKR*GLF (SEQ ID NO :22)、 PETPKRKRKR*GLSF(SEQID NO :23)、PEIPKKREKR*GLF(SEQ ID NO 24)或 PETPKRRRR*GLF(SEQ ID NO 25)。目前的代表性毒力檢驗(yàn)包括用傳染性病毒接種4-8周齡的雞，如果毒株在10天 內(nèi)導(dǎo)致超過75%的死亡率，和/或任何具有大于1. 2的靜脈內(nèi)致病性指數(shù)(IVPI)的病毒， 被認(rèn)為是高度致病性的；在后一種方法中，靜脈內(nèi)接種的鳥在10天時(shí)期內(nèi)每隔24小時(shí)進(jìn)行 檢查，正常的計(jì)分為“0”，患病為“1”，嚴(yán)重患病為“2”，死亡為“3”，平均分值計(jì)算為IVPI。 后面的高度致病性毒株被OIE稱為“高度致病性NAI病毒”(HPOTA)。目前，NAI的代表性例 子包括A型流感病毒的H5和H7毒株。目前，HPNIA的代表性例子包括H5W。"A型流感病毒的低致病性毒株”是指法定的A型禽流感病毒，即NAI分離株(同 上)，但是對(duì)于雞來(lái)說是非致病性的，并且不具有與在有毒力的病毒——即被OIE稱為“低 致病性禽流感病毒” (LPAI)的毒株——中觀察到的任何一種相類似的HAO切割位點(diǎn)氨基酸 序列。我們可以有低致病性毒株的例子。沒有被分類為高致病性或低致病性的A型流感病毒毒株被稱為季節(jié)性流感病毒。 A型流感病毒Hmi的大多數(shù)毒株是季節(jié)性流感病毒。但是，造成1918年西班牙流感的一種 毒株是高度致病性的。"PDZ結(jié)構(gòu)域”是指在大約90個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選大約80-90個(gè)、更優(yōu)選大約70-80個(gè)、更優(yōu)選大約50-70個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，與腦突觸蛋白PSD95、果蠅分隔連接蛋白 Discs-Large (DLG)和/或上皮緊密連接蛋白ZOl (ZOl)同源的氨基酸序列。PDZ結(jié)構(gòu)域的 代表性例子在本領(lǐng)域中也是已知的，為Discs-Large同源重復(fù)序列(“DHRs”)和“GLGF” 重復(fù)序列(SEQ ID N0:26)。PDZ結(jié)構(gòu)域的例子發(fā)現(xiàn)在各種膜相關(guān)蛋白中，包括鳥苷酸激 酶同系物MAGW(家族的成員、幾種蛋白磷酸酶和激酶、神經(jīng)元一氧化氮合成酶、腫瘤抑制蛋 白，以及幾種肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白結(jié)合蛋白，合稱為肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白(syntrophin)。本文的 PDZ結(jié)構(gòu)域包涵天然的和非天然的氨基酸序列。PDZ結(jié)構(gòu)域的代表性例子包括PDZ蛋白的 多態(tài)性變異體，以及含有兩種不同PDZ蛋白部分的嵌合PDZ結(jié)構(gòu)域等。優(yōu)選，本文的PDZ 結(jié)構(gòu)域含有與美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/485，788 (2004年2月3日提交)、國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/ US03/285/28508(2003 年 9 月 9 日提交)、國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/US01/44138 (2001 年 11 月 9 日提交)中所公開的基本上相同的氨基酸序列，這些專利申請(qǐng)?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖?。?表性的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域包括這樣的PDZ結(jié)構(gòu)域，其中氨基酸序列的相應(yīng)遺傳密碼已經(jīng)被 突變，以產(chǎn)生例如改變(強(qiáng)化或弱化)與PL的結(jié)合或結(jié)合特異性的氨基酸變化。任選，PDZ 結(jié)構(gòu)域或其變異體與來(lái)自腦突觸蛋白PSD95、果蠅分隔連接蛋白Discs-Large(DLG)和/或 上皮緊密連接蛋白ZOl (ZOl)以及動(dòng)物同系物中的至少一種的PDZ結(jié)構(gòu)域具有至少50、60、 70,80或90%的序列同一性。任選，天然PDZ結(jié)構(gòu)域的變異體與天然的PDZ結(jié)構(gòu)域具有至 少90%的序列同一性。PDZ結(jié)構(gòu)域的序列同一性在PDZ結(jié)構(gòu)域中至少70個(gè)氨基酸、優(yōu)選80 個(gè)氨基酸、更優(yōu)選80-90個(gè)或80-100個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)測(cè)出。當(dāng)類似物和人類序列進(jìn)行最 大比對(duì)時(shí)，類似物的氨基酸被指派的編號(hào)與天然人類序列中相應(yīng)的氨基酸相同。類似物通 常與天然存在的肽在一個(gè)、兩個(gè)或幾個(gè)位置上不同，通常是由于保守取代。術(shù)語(yǔ)“等位基因 變異體”被用于指相同物種中不同個(gè)體的基因之間的變異以及基因編碼的蛋白中的相應(yīng)變 異。所提供的PSD95d2的示例性PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ ID NO :1。 "PDZ蛋白”可以與“含有PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽”和“PDZ多肽”互換使用，是指具有 PDZ結(jié)構(gòu)域 (同上)的天然存在的或非天然存在的蛋白。PDZ蛋白的代表性例子以前已經(jīng)公 開(同上)，包括 CASK、MPP1、DLGl、DLG2、PSD95、NeDLG, TIP-33、TIP-43、LDP、LIM、LIMKl、 LIMK2、MPP2、AF6、GORASPU INADL、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1、MAST2、MINTU NSP, NOSl、 PAR3、PAR3L、PAR6 β、PICKU Shank 1、Shank 2、Shank 3、SITAC—18、TIPl 和 ZO-I0 本文 中在篩選分析中使用的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域多肽可以含有例如小于天然PDZ結(jié)構(gòu)域的PDZ 結(jié)構(gòu)域。例如，非天然的PDZ結(jié)構(gòu)域任選可以含有“GLGF”基序，即具有GLGF氨基酸序列 (SEQ ID NO 26)的基序，它通常位于PDZ結(jié)構(gòu)域附近，例如通常在N-末端大約10-20個(gè)氨 基酸內(nèi)。后面的GLGF基序(SEQ ID NO 26)以及緊靠GLGF基序(SEQ ID N0:26)N_末端的 3個(gè)氨基酸，通常是PDZ結(jié)合活性所必需的。同樣，可以構(gòu)建在PDZ結(jié)構(gòu)域的C-末端缺少 β -片層的非天然PDZ結(jié)構(gòu)域，即該區(qū)域通常可以從天然PDZ結(jié)構(gòu)域中被刪除，而不影響PL 的結(jié)合。提供了一些示例性的PDZ蛋白，并在括號(hào)中提供了 GI或登記號(hào)PSMD9 (9184389)、 af6 (430993)、AIPC (12751451)、ALP (2773059)、APXL-I (13651263)、MAGI2 (2947231)、 CARDIl (1282772)、CARDI4 (13129123)、CASK (3087815)、CNKl (3930780)、CBP (3192908)、 Densin 180 (16755892)、DLGl (475816)、DLG2 (12736552)、DLG5 (3650451)、DLG6 拼接 變異體 1 (14647140)、DLG6 拼接變異體 2 (AB053303)、DVLl (2291005)、DVL2 (2291007)、 DVL3 (6806886)、ELFIN 1 (2957144)、ENIGMA (561636)、ERBIN (8923908)、EZRIN 結(jié)合蛋白 50(3220018)、FLJ00011 (10440342)、FLJl 1215 (11436365)、FLJ12428 (BC012040)、 FLJ12615 (10434209)、FLJ20075 Semcap2 (7019938)、FLJ21687 (10437836)、 FLJ31349 (AK055911)、FLJ32798 (AK057360)、GoRASP 1 (NM031899)、GoRASP2 (13994253)、 GRIPl (4539083)、GTPase 活化酶(2389008)、鳥嘌呤交換因子(6650765)、HEMBA 1000505(10436367)、HEMBA1003117 (7022001)、HSPC227 (7106843)、HTRA3 (AY040094)、 HTRA4(AL576444)、 INADL(2370148)、 KIAAO147 Vartul(1469875)、 KIAA0303 MAST4 (2224546)、KIAA0313 (7657260)、KIAA0316 (6683123)、KIAA0340 (2224620)、 KIAA0380 (2224700)、KIAA0382 (7662087)、KIAA0440 (2662160)、KIAA0545 (14762850)、 KIAA0559 (3043641)、KIAA0561 MAST3 (3043645)、KIAA0613 (3327039)、KIAA0751 RIM2 (12734165)、KIAA0807 MAST2 (3882334)、KIAA0858 (4240204)、KIAA0902 (4240292)、 KIAAO967 (45895 77)、KIAA0973SEMCAP3 (5889526)、KIAA1202 (6 330421)、 KIAA1222 (6330610)、KIAA1284 (6331369)、KIAA1389 (7243158)、KIAA1415 (7243210)、 KIAAl5 26 (5817166)、KIAA1620 (10047316)、KIAA1634 MAG13 (10047 344)、 KIAA1719(1267982)、LIM Mystique(12734250)、LIM(3108092)、LIMKl(4587498)、 LIMK2 (1805593)、LIM-RI L(1085021)、LU-I(U52111)、MAGI 1 (3 3 7099 7)、 MGC5395 (BC012477)、MINTl (2625024)、MINT3 (3169808) MPPl (189785)、MPP2 (939884)、 MPP3(1022812)、 MUPPl(2104784)、 NeDLG(10853920)、 Neurabin II(AJ401189)、 NOSl (642525)、新的PDZ基因(7228177)、新的絲氨酸蛋白酶(1621243)、Numb結(jié)合蛋 白(AK056823)、夕卜膜蛋白(7023825)、p55T (12733367)、PAR3 (8037914)、PAR3 樣蛋白 (AF428250)、PAR6 (2613011)、PAR6 β (13537116)、PAR6 γ (13537118)、PDZ-73 (5031978)、 PDZKl (2944188)、PICKl (4678411)、PIST (98394330)、prIL16 (1478492)、PSAP (6409315)、 PSD95 (3318652)、PTN-3 (179912)、PTN-4 (190747)、PTPLl (515030)、RGS12 (3290015)、 RGS3 (18644735)、Rho-GAPlO (NM020824)、Rho 結(jié)合蛋白樣蛋白(14279408)、絲氨酸蛋白 酶(2738914)、Shank 2 (6049185)、Shank 3 (AC000036)、Shroom (18652858)、GRASP65 類 似物(14286261)、Numb px2 配體類似物(BC036755)、PTP 同系物類似物(21595065)、 SIPl (2047327)、SITAC-18 (8886071)、SNPCIIA (20809633)、Shank 1(7025450)、內(nèi)居 蛋白(Syntenin) (2795862)、肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白Ια (1 145727)、肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白 β 2(476700)、肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白Y 1(9507162)、肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白γ 2 (9507164)、ΤΑΧ2樣 蛋白(3253116)、TIAMl (4507500)、TIAM 2 (6912703)、TIP 1 (2613001)、TIP2 (2613003)、 TIP33 (2613007)、TIP43 (2613011)、X-Il β (3005559)、ZO-I (292937), Ζ0-2 (12734763)、 Ζ0-3(10092690)。"PDZ配體”，縮寫為“PL”，是指所具有的氨基酸序列與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合并形成分子相互作用復(fù)合物的天然存在的蛋白。PL的代表性例子已經(jīng)在先前的美國(guó)和國(guó)際專利申請(qǐng) (同上)中提供。A型流感病毒PL的其它例子提供在下面的實(shí)施例部分中。結(jié)合劑例如抗體或PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白之間的“特異性結(jié)合”是指捕獲或檢測(cè)劑 與不同病毒分析物的混合物中存在的特定病毒分析物優(yōu)先結(jié)合的能力。例如，在申請(qǐng)中描 述的某些抗體與來(lái)自B型流感病毒的NSl特異性結(jié)合，但是不與來(lái)自A型流感病毒的NSl特 異性結(jié)合，反之亦然。特異性結(jié)合也指解離常數(shù)(KD)小于大約IO-6M,優(yōu)選小于大約ΙΟΙ， 最優(yōu)選小于大約10_8M。在某些方法中，特異性結(jié)合相互作用能夠以大于大約10到100倍、優(yōu)選大于大約1000到大約10000倍的鑒別能力，分辨出具有或缺少PL的蛋白?！安东@劑/分析物復(fù)合物”是從捕獲劑與分析物例如流感病毒NSl蛋白的特異 性結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物。捕獲劑與被分析物特異性結(jié)合，即在適合特異性結(jié)合的條件下彼 此結(jié)合，其中這樣的物理化學(xué)條件便于根據(jù)例如鹽濃度、PH、去污劑濃度、蛋白濃度、溫度 和時(shí)間來(lái)表示。該主題條件適合允許結(jié)合在例如溶液中發(fā)生；或者，當(dāng)一種結(jié)合成員被固 定在固相上時(shí)發(fā)生。這樣合適的代表性條件描述在例如Harlow和Lane的《抗體實(shí)驗(yàn)手 冊(cè)》(Antibodies :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. (1989))中。適合的條件優(yōu)選導(dǎo)致結(jié)合相互作用具有小于大約10_6M、優(yōu)選小于 大約ΙΟ—、、和最優(yōu)選小于大約ICT8M的解離常數(shù)(KD)。“固相”是指一種或多種反應(yīng)物可以與之靜電、疏水或共價(jià)結(jié)合的表面。代表性的 固相包括例如尼龍6、尼龍66、聚苯乙烯、膠乳珠、磁珠、玻璃珠、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、 丁二烯-苯乙烯共聚物、硅橡膠、聚酯、聚酰胺、纖維素和衍生物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、 聚乙烯、氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚苯乙烯共聚物、硅膠、硅片玻璃、瓊脂糖、葡聚糖、月旨 質(zhì)體、不溶性蛋白金屬和硝酸纖維素。代表性的固相包括形成為珠子、管、條、盤、濾紙、板等 的固相。濾紙可用于捕獲分析物例如濾液，或通過截留起作用、或通過共價(jià)結(jié)合起作用。發(fā) 送給用戶的固相捕獲試劑可以由用“捕獲試劑”包被并包裝好的(例如在氮?dú)夥障?固相 構(gòu)成，以保存和/或最大化捕獲試劑與生物學(xué)樣品中流感病毒NSl分析物的結(jié)合。生物學(xué)樣品包括組織液、組織切片、生物材料等，所述生物材料是空氣或水中攜帶 的或從那里 通過例如過濾、離心等收集的，用于例如評(píng)估生物恐怖威脅等。其它生物學(xué)樣品 可以采自胎兒或卵、卵黃和羊水。代表性的生物流體包括尿液、血液、血漿、血清、腦脊液、精 液、肺灌洗液、糞便、痰液、粘液、帶有生物材料的水等。或者，生物樣品包括鼻咽或口咽拭 子、鼻灌洗液、來(lái)自氣管、肺、肺泡、腸、脾、腎、腦、肝和心臟的組織、痰液、粘液、帶有生物材 料的水、泄殖腔拭子、痰液、鼻和口腔粘液等。代表性的生物樣品也包括食品，例如肉類、力口 工過的食物、家禽、豬等的樣品。生物樣品也包括被污染的溶液(例如食品加工溶液等)， 來(lái)自門診地點(diǎn)、醫(yī)院、診所、食品制備機(jī)構(gòu)(例如餐館、屠宰室、儲(chǔ)存冷庫(kù)、超市包裝等)的拭 子樣品。生物樣品也可以包括原位的組織和體液(即不收集樣品用于檢驗(yàn))，例如，本方法 可用于例如使用直接施加到結(jié)膜上的滴眼液、試紙條來(lái)檢測(cè)眼睛中病毒感染的存在或嚴(yán)重 性；或通過例如將指示劑膠囊放置在檢驗(yàn)對(duì)象的口腔或鼻咽部中來(lái)檢測(cè)肺部感染的存在或 程度。或者，拭子或試紙條可以放置在口中。生物樣品可以源于對(duì)象的任何組織、器官或細(xì) 胞群。在某些實(shí)施方案中，從對(duì)象獲得刮屑、活體組織或灌洗液。生物樣品可以包括體液例 如血液、尿液、痰液和口腔液，以及樣品例如鼻腔洗液、拭子或吸出物、氣管吸出物、下疳拭 子和糞便樣品。適合檢測(cè)個(gè)體目標(biāo)病原體的生物樣本的收集方法對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人 員來(lái)說是已知的，例如在涉及呼吸道疾病的高風(fēng)險(xiǎn)A型流感病毒的情況下的鼻咽樣本例如 鼻拭子、清洗液或吸出物、或氣管吸出物，以及口腔拭子等。任選，生物樣品可以懸浮在含有 抗生素例如青霉素、鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素的等滲溶液中。術(shù)語(yǔ)“基本上一致”意味著兩個(gè)肽序列當(dāng)進(jìn)行優(yōu)化比對(duì)時(shí)，例如通過程序GAP或 BESTFIT使用缺省間隙權(quán)重(default gap weight)，享有至少65 %的序列同一性，優(yōu)選至 少80或90%序列同一性，更優(yōu)選至少95%序列同一性或以上(例如99%序列同一性或更 高)。優(yōu)選，不一致的殘基位置的差別在于保守氨基酸取代。
“分離的”或“純化的”一般是指物質(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽組合物) 的分離，使得物質(zhì)在其所在的樣品中占顯著的百分比(例如大于2%，大于5%，大于10%， 大于20%，大于50%或以上，通常高達(dá)大約90%-100%)。在某些實(shí)施方案中，基本上純的 成分占樣品的至少50 %、80 % -85 %或90-95 %。用于純化目標(biāo)多核苷酸和多肽的技術(shù)在本 技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的，包括例如離子交換層析、親和層析和根據(jù)密度的沉積。一般來(lái)說，當(dāng) 相對(duì)于樣品中的其它成分而言，在天然情況下不會(huì)發(fā)現(xiàn)物質(zhì)在樣品中的存在量時(shí)，物質(zhì)是 純化的。“對(duì)象”在本文中使用時(shí)，是指人類和馴養(yǎng)的動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物、魚、鳥、爬行動(dòng) 物、兩棲動(dòng)物等?！爱a(chǎn)生信號(hào)的化合物”，縮寫為“SGC”，是指某種分子，其能夠與PL或PDZ連接(例 如使用下面進(jìn)一步公開的化學(xué)連接方法)，并能夠反應(yīng)以形成在本公開內(nèi)容的分析方法中 可以檢測(cè)出的化學(xué)或物理實(shí)體(即反應(yīng)產(chǎn)物)。反應(yīng)產(chǎn)物的代表性例子包括沉淀、熒光信 號(hào)、具有顏色的化合物等。代表性的SGC包括例如生物發(fā)光化合物(例如螢光素酶)、熒 光團(tuán)(例如下面)、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化合物、放射性同位素(例如131i、125I、14C、3H、35S、 32P等)、酶(例如下面)、結(jié)合蛋白(例如生物素、親和素、鏈親和素等)、磁性顆粒、化學(xué)反 應(yīng)性化合物(例如有色著色劑)、標(biāo)記的寡核苷酸、分子探針(例如，Research Organics, Inc.的CY3)等。代表性的熒光團(tuán)包括熒光素異硫氰酸酯、琥珀?；鶡晒馑?、羅丹明B、麗 絲胺(lissamine)、9，10- 二苯基蒽、二萘嵌苯、紅熒烯、芘及其熒光衍生物例如異氰酸酯、 異硫氰酸酯、酰基氯或磺酰氯、傘形酮、鑭系元素例如銪(Eu)的稀土螯合物等。用于產(chǎn)生 信號(hào)的結(jié)合物中的代表性SGCs包括下列類別中的酶IUB1類，特別是1. 1. 1和1. 6(例如 醇脫氫酶、甘油脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶等)；IUB1. 11. 1類(例如過氧化氫酶、過氧化物酶、氨基酸氧化酶 、半乳糖氧化 酶、葡萄糖氧化酶、抗壞血酸氧化酶、硫辛酰胺脫氫酶、脲酶等)；IUB2類，特別是2. 7和 2.7. 1(例如己糖激酶等)；IUB 3類，特別是3. 2.1和3.1.3 (例如α-淀粉酶、纖維素酶、 β-半乳糖醛酸苷酶、淀粉葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等)；IUB 4類(例如裂合酶)；IUB 5類，特別是5. 3和5.4 (例如磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、trios磷酸酶 異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖變位酶等)。產(chǎn)生信號(hào)的化合物還包括其產(chǎn)物可以通過熒光和化學(xué)發(fā) 光波長(zhǎng)檢測(cè)的SGC，例如螢光素酶、發(fā)射熒光的金屬例如152Eu或鑭系系列的其它；化合物 例如魯米諾、異魯米諾、吖啶鹽等；生物發(fā)光化合物例如螢光素；熒光蛋白，等等。熒光蛋白 包括但不限于下列即，(i)綠色熒光蛋白(GFP)，即包括但不限于“人源化”版本的GFP， 其中天然存在的核苷酸序列的密碼子被更換，以更密切匹配人類密碼子偏倚性；(ii)源自 水母(Aequoriavictoria)的GFP及其衍生物，例如“人源化的”衍生物例如增強(qiáng)型GFP，它 可以從例如Clontech，Inc.商購(gòu)；(iii)來(lái)自其它物種例如海腎(Renillareniformis)、海 蝴蝶花(Renilla mulleri)或 Ptilosarcus guernyi 的 GFP，正如在例如 WO 99/49019 和 Peelle等(2001) J. Protein Chem. 20 507-519 中所描述；(iv)“人源化的，，重組GFP(hrGFP) (Stratagene)；以及(ν)來(lái)自珊瑚蟲物種的其它熒光和有色蛋白，例如在Matz等(1999) Nature Biotechnol. 17 :969_973中描述的那些；等等。產(chǎn)生信號(hào)的主題化合物可以與PL或 PDZ結(jié)構(gòu)域多肽連接。某些SGC與蛋白的連接，可以通過金屬螯合基團(tuán)例如EDTA來(lái)實(shí)現(xiàn)。 主題SGC具有的共同性質(zhì)是允許對(duì)檢驗(yàn)樣品中的流感病毒PL分析物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。主題SGC可以使用目測(cè)方法檢測(cè)，優(yōu)選情況下使用可以自動(dòng)化的方法，例如分光光度法，熒 光法，化學(xué)發(fā)光法，涉及例如電導(dǎo)、阻抗、電阻等的電納米方法，以及磁場(chǎng)方法。mAb的表位是其抗原與mAb結(jié)合的區(qū)域。如果一種抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制(阻斷)了限 定針對(duì)抗原(在下面的分析中是A型流感或B型流感病毒的NSl蛋白)的競(jìng)爭(zhēng)性組的原型 抗體的結(jié)合，那么兩種抗體與同樣的或交疊的表位結(jié)合。也就是說，當(dāng)在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析中 測(cè)定時(shí)，與缺少競(jìng)爭(zhēng)抗體的對(duì)照相比，一種抗體過量3倍或5倍將另一種抗體的結(jié)合抑制 了至少50%，但是優(yōu)選75%、90%或甚至99% (參見，例如Junghans等，Cancer Res. 50 1495，1990，在此引為參考)?；蛘撸绻乖袦p少或消除一種抗體結(jié)合的所有氨基酸突變 也減少或消除了另一種抗體的結(jié)合，那么兩種抗體具有同樣的表位。如果減少或消除一種 抗體結(jié)合的某些氨基酸突變也減少或消除了另一種抗體的結(jié)合，那么兩種抗體具有交疊的 表位。檢測(cè)分析物的“存在”或“不存在”包括只檢測(cè)分析物的存在或不存在的定量分析， 以及檢測(cè)分析物的存在以及存在的分析物的量的定量分析。發(fā)明詳述I、概述
共同擁有的申請(qǐng)PCT/US06/41748和USSN 11/481，411闡述了一般性概念，即流感 病毒蛋白的NSl蛋白在A型和B型流感病毒感染的對(duì)象中是豐富的蛋白，因此可用于檢測(cè) 這些病毒?！?11申請(qǐng)還顯示出A型流感病毒的NSl蛋白含有PL區(qū)域(盡管B型流感病 毒不含)。這些PL區(qū)域可以使用PDZ結(jié)構(gòu)域容易地檢測(cè)，因此為檢測(cè)A型流感病毒以及將 其與其它類型的流感病毒區(qū)分提供了基礎(chǔ)。此外，來(lái)自A型流感病毒致病性亞型的PL' s 與流感病毒季節(jié)性亞型中的不同。因此，使用不同PDZ結(jié)構(gòu)域進(jìn)行PL' s的差異檢測(cè)，為分 辨A型流感病毒的致病性和季節(jié)性亞型提供了基礎(chǔ)。本申請(qǐng)重申了上面提到的某些概念，并描述了用于檢測(cè)A型流感病毒及其亞型和 /或B型流感病毒的優(yōu)選形式。許多這些優(yōu)選的形式采用了泛特異性抗體(即與流感病毒 類型中的所有或至少多種毒株反應(yīng))。II.流感病毒及其NSl蛋白流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)在它們的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(Ml)中抗原性 差異分類為A、B和C型。將毒株進(jìn)一步分出亞型通常是基于對(duì)兩種毒粒糖蛋白中存在的 抗原類型進(jìn)行評(píng)估，這兩種糖蛋白是血凝素(HA ；H)和神經(jīng)氨酸酶(NA ；N)。HA和NP是介 導(dǎo)毒粒與宿主細(xì)胞表面結(jié)合的毒力因子。因此，H5Nl、Hmi和H3N2是A型流感病毒亞型的 例子。在每種亞型中有數(shù)百種毒株。Ml蛋白被認(rèn)為在病毒的裝配和芽生中發(fā)揮作用，而NP 在RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。除了這些毒粒蛋白之外，兩種其它的非結(jié)構(gòu)性、即非毒粒的 蛋白在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)，被稱為非結(jié)構(gòu)性蛋白1和2(NS1 ；NS2)。非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白 NSl具有多種功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞mRNAs的拼接和核輸出，刺激翻譯，以及抵消宿主干擾素 的能力。流感病毒中的NSl蛋白已經(jīng)被鑒定和測(cè)序，示例性的序列可以在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找 至IJ。來(lái)自A、B和C型流感病毒的NSl蛋白總的來(lái)說不顯示出抗原交叉反應(yīng)性。在類型(例 如A型流感病毒)中，亞型之間存在相當(dāng)多的序列變異，但是某些抗原的交叉反應(yīng)性取決 于所使用的抗體。某些來(lái)自A型流感病毒的HlNl、H3N2和H5W亞型的示例性NSl序列的GenBank登記號(hào)分別為CY003340、CY003324、DQ266101。某些來(lái)自B型流感病毒的示例性 NSl序列的GenBank登記號(hào)是AAA43690和BAD29872。A型、B型或C型流感病毒的其它流 感毒株中的NSl蛋白，是指與同樣亞型的已知流感病毒毒株中鑒定為NSl蛋白的蛋白之一 具有最高的序列相似性的蛋白，所述NSl蛋白作為例如上面給出的GenBank登記號(hào)之一的 序列使用。II.檢測(cè)A型流感病毒的PDZ結(jié)構(gòu)域下面的表1列出了 A型流感病毒H5N1、HlNl和H3N2亞型的PL區(qū)域。H5W是與 臨床最相關(guān)的致病性毒株的亞型。Hmi和H3N2是與臨床最相關(guān)的季節(jié)性A型流感病毒亞 型。表中還指出了各種PDZ結(jié)構(gòu)域是否與指定的PL結(jié)合。該表可用于選擇差異檢測(cè)A型 流感病毒的致病性和季節(jié)性亞型的PDZ結(jié)構(gòu)域。例如，PSD95結(jié)構(gòu)域可用于檢測(cè)A型流感 病毒的致病性亞型，INADL結(jié)構(gòu)域8可用于檢測(cè)A型流感病毒的季節(jié)性亞型。PSD95結(jié)構(gòu)域 可以是PSD95的PDZ結(jié)構(gòu)域1、2和3中的任何一個(gè)或其組合。優(yōu)選的檢測(cè)劑是從PSD95中 PSD95的三個(gè)拷貝結(jié)構(gòu)域2形成的蛋白。也就是說，由PSD95在其PDZ結(jié)構(gòu)域旁側(cè)的區(qū)段間 插隔開的三個(gè)串聯(lián)拷貝。在這樣的蛋白中，兩個(gè)拷貝的PSD95的結(jié)構(gòu)域2有效代替了 PSD95 的天然結(jié)構(gòu)域1和3。另一種優(yōu)選的檢測(cè)試劑是含有PSD95的PDZ結(jié)構(gòu)域1、2和3的蛋白。表 1 可以使用例如緩沖液和溫度的分析條件來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)合，以有利于檢測(cè)不同毒株之間 的特定毒株或差異。在表中使用的符號(hào)意義如下++相對(duì)強(qiáng)的結(jié)合，+可檢測(cè)到但是相對(duì)弱 的結(jié)合，+/"可檢測(cè)到但是相對(duì)弱的結(jié)合或不能檢測(cè)到的結(jié)合，“不能檢測(cè)到的結(jié)合?？蓹z 測(cè)到的結(jié)合意味著在含有指定亞型的NSl的樣品中，與缺少指定亞型的NSl的對(duì)照相比，在 考慮到了由于實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致的隨機(jī)變化后，結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)較高，達(dá)顯著的程度。不能檢測(cè) 到的結(jié)合意味著與含有指定亞型的NSl的樣品結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)，在缺少指定亞型的NSl的 對(duì)照產(chǎn)生的信號(hào)的誤差限之內(nèi)。對(duì)A型流感病毒分亞型的優(yōu)選形式使用了在表中顯示的來(lái)自PDS95的PDZ與 INDAL PDZ結(jié)構(gòu)域8的組合。作為一般的規(guī)律，可檢測(cè)到與PSD95結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而不是與 INDAL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，或與PSD95結(jié)構(gòu)域的結(jié)合比與INDAL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合明顯更強(qiáng)(即強(qiáng)得 超過實(shí)驗(yàn)誤差)，表明A型流感病毒的亞型是H5W (致病性)。相反，可檢測(cè)到INADL結(jié)構(gòu) 域與樣品的結(jié)合但是不能檢測(cè)到PDS95結(jié)構(gòu)域與樣品的結(jié)合，或INADL結(jié)構(gòu)域與樣品的結(jié) 合比PDS95與樣品的結(jié)合明顯更強(qiáng)，表明樣品含有A型流感病毒亞型是Hmi或H3N2 ( 二者都是季節(jié)性流感病毒)。如表中指出，PSD95結(jié)構(gòu)域2與樣品可檢測(cè)到的但是弱的結(jié)合，與 不能檢測(cè)到的結(jié)合相比，將Hmi與H3N2區(qū)分開來(lái)。PSD95結(jié)構(gòu)域1、2和3與樣品可檢測(cè)到 的但是相對(duì)弱的結(jié)合，與INADL與樣品的結(jié)合相比，也表明亞型是Hmi。III.檢測(cè)A型流感病毒和B型流感病毒的抗體本發(fā)明提供了檢測(cè)A型流感病毒的泛特異性抗體的集合。A型流感病毒的泛特異 性抗體與來(lái)自至少2、3或5或者所有或基本上所有已知的A型流感病毒毒株的NSl蛋白特 異性結(jié)合。同樣，B型流感病毒的泛特異性抗體與來(lái)自至少2、3、5或者所有或基本上所有 已知的B型流感病毒毒株的NSl蛋白特異性結(jié)合。泛特異性抗體可以參考用數(shù)字定義的表位或通過參考示例性抗體而定義的競(jìng)爭(zhēng) 性組來(lái)定義。對(duì)于A型流感病毒來(lái)說，泛特異性抗體優(yōu)選與圖IA或圖2中8-21、9-20、29-38 或45-49位殘基中的表位特異性結(jié)合。在該序列中的X可以是任何氨基酸，但優(yōu)選是在流 感病毒毒株的NSl蛋白中占據(jù)相應(yīng)位置的氨基酸，更優(yōu)選是在至少兩種或優(yōu)選所有A型流 感病毒的已知毒株中占據(jù)相應(yīng)位置的共有氨基酸。A型流感病毒的共有序列提供在圖2中。 某些泛特異性抗體與圖IA的9-11或13-16位殘基中的表位特異性結(jié)合。泛特異性抗體也可以通過競(jìng)爭(zhēng)性組來(lái)定義；競(jìng)爭(zhēng)性組內(nèi)的抗體彼此競(jìng)爭(zhēng)與同樣抗 原(即A型流感病毒或B型流感病毒的NSl蛋白)的特異性結(jié)合。表2顯示了與A型流感 病毒NSl蛋白結(jié)合的泛特異性抗體的競(jìng)爭(zhēng)性組。表 2抗A型流感病毒mAb 參比NSl競(jìng)爭(zhēng)性組F68A組注釋部分競(jìng)爭(zhēng)F64 3H3 4H9F80B組注釋輕微/部分競(jìng)爭(zhēng) F68 8E6 3D5每個(gè)組由原型抗體(第二列中)定義，組中的其它抗體(第三列)與其競(jìng)爭(zhēng)。A、B 和C組是優(yōu)選的。所有這些抗體與來(lái)自至少H5N1、HlNl和H3N2毒株的NSl蛋白結(jié)合。不 同組中的抗體彼此不競(jìng)爭(zhēng)。表3顯示了在H5W流感病毒致病性毒株的夾心檢測(cè)中使用的優(yōu)選抗體。在這樣 的分析中，優(yōu)選的捕獲劑是PSD95結(jié)構(gòu)域1、2和3，優(yōu)選的檢測(cè)劑是優(yōu)選來(lái)自A組、或C或D 組的抗體。表3 表4顯示了與B型流感病毒的NSl蛋白結(jié)合的泛特異性抗體的競(jìng)爭(zhēng)性組。表4 表5顯示了成對(duì)的競(jìng)爭(zhēng)捕獲和檢測(cè)抗體。檢測(cè)抗體顯示在表格的第一行中，捕獲 抗體顯示在第一列中。競(jìng)爭(zhēng)用C顯示。
B型流感病毒的泛特異性抗體也可以參考圖2中顯示的來(lái)自B型流感病毒毒株的 NSl蛋白的共有序列通過表位特異性來(lái)描述。優(yōu)選的抗體與圖2的10-28、40-45、50-57、 67-74、84-100、154-159、169-173、185-191、212-224、226-240 位殘基中存在的表位特異性 結(jié)合，特別是其下劃線的區(qū)域，它們指示了在B型流感病毒的不同毒株之間不變的殘基。在上述區(qū)域之一中包含的沒有下劃線的殘基(即在B型流感病毒毒株之間變化)，可以被圖2 中顯示的占據(jù)該位置的共有殘基、或在B型流感病毒的任何毒株中占據(jù)該位置的殘基所占 據(jù)。在夾心分析中使用的針對(duì)B型流感病毒的NSl的優(yōu)選抗體組合在圖13中用笑臉 指示。使用的抗體可以是非人類的、人源化的、嵌合的、鑲嵌的(veneered)或人類的。 使用這樣的抗體有利地避免由于樣品中存在HAMA或嗜異性抗體導(dǎo)致的假陽(yáng)性或陰性(US 6，680，209)。上面的表中列出的人源化、嵌合或鑲嵌版本的抗體是優(yōu)選的。這樣的抗體也 可以用作藥劑來(lái)治療A或B型流感?？贵w可以根據(jù)抗體的類型，從含有抗原的蛋白片段通 過標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)制造(參見例如Kohler等，Nature，256 :495，(1975)；以及Harlow&Lane，《抗 體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Antibodies, A LaboratoryManual (C. S. H. P.，NY, 1988) ；Queen 等，Proc. Natl Acad. Sci USA86 10029-10033(1989)和 WO 90/07861 ;Dower 等，WO 91/17271 和 McCafferty等，WO 92/0 1047，每篇都出于所有目的引為參考)。通過用A或B型流感病毒的多種毒株進(jìn)行免疫、或用一種毒株免疫并用另一種進(jìn) 行加強(qiáng)，可以使免疫偏離以產(chǎn)生泛特異性抗體?；蛘撸藗兛梢允褂脕?lái)自A型流感病毒NSl 的高度保守區(qū)域(例如SEQ IDNO 1的8-21、9-20、29-38或45-49位或任何這些中的至少 三個(gè)連續(xù)氨基酸)或B型流感病毒NS 1的高度保守區(qū)域(例如SEQ ID NO 4的10-28、 40-45、50-57、67-74、84-100、154-159、169-173、185-191、212-224 或 226-240 位或其至少 三個(gè)連續(xù)氨基酸的子片段)的片段作為免疫原。相反，為了產(chǎn)生單特異性抗體，優(yōu)選用單一 毒株的NSl或來(lái)自非保守區(qū)域(例如A型流感病毒的PL區(qū)域)的NSl片段進(jìn)行免疫。術(shù)語(yǔ)“抗體”或“免疫球蛋白”用于包括完整的抗體及其結(jié)合片段。通常，片段與 它們所源自的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)與抗原片段的特異性結(jié)合，所述抗體片段包括單獨(dú)的重鏈、輕 鏈Fab、Fab' F(ab' )2、Fabc和Fv。片段通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或通過完整免疫球蛋白 的酶法或化學(xué)分離來(lái)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括一條或多條與其它蛋白化學(xué)連接成或表達(dá) 為融合蛋白的免疫球蛋白鏈。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括雙特異性抗體。除非另外指明，在本申請(qǐng)中描述的抗體是從雜交瘤產(chǎn)生的小鼠抗體。IV.其它結(jié)合劑盡管泛特異性抗體優(yōu)選用于檢測(cè)NSl蛋白，但任何與流感病毒的NSl具有特異親 和性的結(jié)合劑也可以用作抗體的代用品。代用品包括從隨機(jī)的噬菌體展示文庫(kù)針對(duì)來(lái)自A 型或B型流感病毒的NSl篩選到的肽。代用品也包括適體(aptamer)。適體是從大群隨機(jī) 序列中體外篩選到的RNA或DNA分子，其通過形成結(jié)合袋來(lái)識(shí)別特異性配體。別構(gòu)核酶是 RNA酶，其活性受到效應(yīng)分子與適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的調(diào)節(jié)，適體結(jié)構(gòu)域位于活性位點(diǎn)之外。這 些RNAs作為由特異性效應(yīng)子的存在或不存在所控制的精確分子開關(guān)起作用。適體可以與 核酸、蛋白、甚至整個(gè)生物體結(jié)合。適體與抗體不同，但是它們?cè)诙喾N診斷形式中模擬了抗 體的性質(zhì)。因此，適體可以用作泛特異性抗體的代用品。同樣，盡管優(yōu)選PDZ結(jié)構(gòu)域來(lái)檢測(cè)NSl的PL區(qū)域，但與A型流感病毒的特定NSl蛋 白的PL區(qū)域特異性結(jié)合的抗體，也可以用作與該區(qū)域特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域的代用品。V.檢測(cè)方法1. A型流感病毒亞型的檢測(cè)
如上面所討論，本發(fā)明提供了辨別A型流感病毒的致病性和季節(jié)性亞型的方法。優(yōu)選的形式使用一個(gè)或多個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域作為捕獲試劑，一種或多種泛特異性抗體作為檢測(cè) 試劑。正如上面討論的，優(yōu)選使用PSD95的結(jié)構(gòu)域2或結(jié)構(gòu)域1、2和3和/或INADL的結(jié) 構(gòu)域8作為PDZ結(jié)構(gòu)域檢測(cè)試劑。與PDZ捕獲試劑一起使用的優(yōu)選泛特異性抗體是作為檢 測(cè)抗體的泛特異性抗體F68 8E6(或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)或F68 4B2 (或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)。 在同樣的分析中，對(duì)于不同的PDZ結(jié)構(gòu)域可以使用相同或不同的泛特異性抗體。2.使用泛特異件抗體檢測(cè)A型流感病毒本發(fā)明還提供了檢測(cè)A型流感病毒的方法，其方式不必需辨別A型流感病毒的亞 型，但是能夠辨別A型流感病毒與B型(或C型)流感病毒。這樣的方法使用至少兩種針對(duì) A型流感病毒的NSl蛋白的泛特異性抗體，它們與不同表位結(jié)合。兩種泛特異性抗體與如上 所述用數(shù)字定義的不同表位特異性結(jié)合，或者可以從不同的競(jìng)爭(zhēng)性組中選擇。檢測(cè)優(yōu)選使 用夾心或側(cè)向流形式進(jìn)行，它們將在下面更詳細(xì)描述。供檢測(cè)A型流感用的抗體的一個(gè)優(yōu) 選組合是F64 3H3(或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為捕獲抗體，F(xiàn)80 3D5 (或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為 檢測(cè)抗體。另一個(gè)優(yōu)選的組合是F68 4H9(或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為捕獲抗體，F(xiàn)688E6(或 與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為檢測(cè)抗體。使用兩種泛特異性抗體檢測(cè)A型流感病毒可以與上面(1)中描述的差異檢測(cè)A型 流感病毒亞型組合進(jìn)行。這樣的分析指示A型流感病毒是否存在，以及如果存在的話，存在 的是致病性還是季節(jié)性亞型。非亞型特異性和亞型特異性分析可以分別或組合進(jìn)行。組合 分析的一種適當(dāng)形式是將在差異分析中使用的PDZ結(jié)構(gòu)域連接在與非亞型特異性分析中 使用的抗體捕獲試劑相同的固相的不同區(qū)域上。PDZ結(jié)構(gòu)域與樣品中NSl蛋白的結(jié)合可以 使用泛特異性檢測(cè)抗體來(lái)檢測(cè)。用于檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白結(jié)合的泛特異性檢測(cè)抗體， 可以與用于非亞型特異性分析的泛特異性抗體相同或不同。因此，如上面所討論，在優(yōu)選的 形式中，PSD95結(jié)構(gòu)域、INADL結(jié)構(gòu)域8和用于A型流感病毒的泛特異性捕獲抗體被連接在 支持物的不同區(qū)域上，并使用共同的泛特異性檢測(cè)抗體(結(jié)合的表位與泛特異性捕獲抗體 不同)來(lái)檢測(cè)每種捕獲試劑與如果存在于樣品中的A型流感病毒NSl蛋白的結(jié)合。3.用泛特異性抗體檢測(cè)B型流感病毒B型流感病毒可以使用第一和第二種針對(duì)B型流感病毒的NSl蛋白的泛特異性抗 體，按照與上面描述的檢測(cè)A型流感病毒的NSl蛋白的分析類似的方式進(jìn)行檢測(cè)。這樣的方 法使用至少兩種針對(duì)B型流感病毒的NSl蛋白的泛特異性抗體進(jìn)行，所述抗體與不同表位 結(jié)合。兩種泛特異性抗體與如上所述用數(shù)字定義的不同表位結(jié)合，或者可以從不同的競(jìng)爭(zhēng) 性組中選擇。檢測(cè)優(yōu)選使用夾心或側(cè)向流形式進(jìn)行，它們將在下面更詳細(xì)描述。用于檢測(cè)B 型流感病毒的優(yōu)選抗體組合使用F896B5(或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為捕獲抗體，F(xiàn)94 3A1 (或 與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)或F94 1F9(或與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體)作為檢測(cè)或檢測(cè)抗體?？贵w的競(jìng)爭(zhēng)通 過與B型流感病毒的NSl蛋白的結(jié)合來(lái)測(cè)定。4. A型流感病毒和B型流感病毒的組合檢測(cè)上面描述的三種分析類型，每種都可以有效地組合，以提供能夠檢測(cè)A型流感病 毒(非亞型特異性)、B型流感病毒(非亞型特異性)、A型流感病毒(致病性亞型)和A型 流感病毒(季節(jié)性亞型)的分析方法。各種分析方法可以分開或一起執(zhí)行。組合分析的一 種適當(dāng)形式是將A型流感病毒NSl蛋白的泛特異性捕獲抗體、B型流感病毒NSl蛋白的泛特異性捕獲抗體、A型流感病毒致病性亞型的PL的PDZ結(jié)構(gòu)域(例如上面討論的PSD95結(jié) 構(gòu)域)和A型流感病毒季節(jié)性亞型的PL的PDZ結(jié)構(gòu)域(例如INADL 8結(jié)構(gòu)域)與單一支 持物相結(jié)合。將支持物與來(lái)自對(duì)象的樣品和至少兩種泛特異性檢測(cè)抗體相接觸。一種檢測(cè) 抗體與A型流感病毒的NSl蛋白特異性結(jié)合，其結(jié)合的表位不同于捕獲抗體與A型流感病 毒NSl蛋白結(jié)合的表位。另一種檢測(cè)抗體與B型流感病毒的NSl蛋白特異性結(jié)合，其結(jié)合 的表位不同于捕獲抗體與B型流感病毒NSl蛋白結(jié)合的表位。形成的復(fù)合物表明A型和/ 或B型流感病毒是否存在，以及如果存在A型流感病毒，A型流感病毒是致病性的還是季節(jié) 性的。VI.檢測(cè)形式本發(fā)明提供了在各種不同類型的生物樣品中鑒定A型和/或B型流感病毒的 分析方法中使用的診斷性捕獲和檢測(cè)試劑。這樣的形式包括免疫沉淀、Western印跡、 ELISA、放射性免疫分析、競(jìng)爭(zhēng)性和免疫測(cè)量分析。參見Harlow&Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》， Antibodies, ALaboratory Manual (CSHP NY, 1988)；美國(guó)專利 Nos. 3，791，932、3，839，153、 3，850，752、3，879，262、4，034，074、3，791，932、3，817，837、3，839，153、3，850，752、 3，850，578,3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533, 3，996，345,4, 034，074 和 4，098，876。免疫測(cè)量分析或夾心分析是優(yōu)選的形式(參見US 4, 376, 110,4, 486, 530, 5，914， 241和5，965，375)。這類分析使用固定在固相上的一種抗體或抗體群體或PDZ結(jié)構(gòu) 域作為捕獲劑，溶液中的另一種抗體或抗體群體或PDZ結(jié)構(gòu)域作為檢測(cè)劑。正如上面討論 的，優(yōu)選使用捕獲性PDZ結(jié)構(gòu)域和檢測(cè)抗體的組合、或相反的組合來(lái)檢測(cè)A型流感病毒。通 常，檢測(cè)劑被標(biāo)記。如果使用抗體群體，通常群體含有與靶抗原中不同表位特異性結(jié)合的抗 體。因此，捕獲劑和檢測(cè)劑均可使用同樣的群體。如果單克隆抗體用作檢測(cè)和檢測(cè)劑，固相 和溶液相使用具有不同結(jié)合特異性的第一種和第二種單克隆抗體。捕獲和檢測(cè)劑能夠以任 何次序或同時(shí)與靶抗原相接觸。如果捕獲劑首先接觸，分析被稱為正向分析。相反，如果檢 測(cè)劑首先接觸，分析被稱為是反向分析。如果靶與捕獲劑和檢測(cè)劑同時(shí)相接觸，分析被稱為 同時(shí)分析。在將樣品與捕獲和檢測(cè)抗體接觸后，將樣品溫育一段時(shí)間，通常在大約10分鐘 到大約24小時(shí)之間變化，通常為大約1小時(shí)。然后進(jìn)行清洗步驟，以除去樣品中沒有與檢 測(cè)劑特異性結(jié)合的成分。當(dāng)捕獲和檢測(cè)劑在分開的步驟中結(jié)合時(shí)，清洗可以在任一個(gè)或兩 個(gè)結(jié)合步驟后進(jìn)行。清洗后，對(duì)結(jié)合進(jìn)行定量，通常是檢測(cè)通過結(jié)合標(biāo)記的溶液抗體而與固 相連接的標(biāo)記物。通常，對(duì)于給定的捕獲和檢測(cè)劑對(duì)和給定的反應(yīng)條件來(lái)說，從含有已知濃 度靶抗原的樣品制備校正曲線。然后通過從校正曲線內(nèi)插，讀出被檢驗(yàn)的樣品中抗原的濃 度。從平衡時(shí)結(jié)合的標(biāo)記的溶液抗體的量、或通過在達(dá)到平衡之前的一系列時(shí)間點(diǎn)處對(duì)結(jié) 合的標(biāo)記溶液抗體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，可以測(cè)量分析物。這樣的曲線的斜率是樣品中靶濃度 的度量。也可以使用競(jìng)爭(zhēng)性分析。在某些方法中，樣品中的靶抗原與外源提供的標(biāo)記靶抗 原競(jìng)爭(zhēng)與抗體或PDZ檢測(cè)試劑的結(jié)合。與檢測(cè)試劑結(jié)合的標(biāo)記靶抗原的量與樣品中靶抗原 的量成反比。檢測(cè)試劑可以被固定，以便于在檢測(cè)前將結(jié)合的復(fù)合物與樣品分開(異相分 析)，或者當(dāng)在均相分析形式中操作時(shí)，分離可能是不必要的。在其它方法中，檢測(cè)試劑被標(biāo) 記。當(dāng)檢測(cè)試劑被標(biāo)記時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)與樣品中的靶抗原和外源提供的靶抗原形式結(jié)合，外源提供的靶抗原形式可以是例如固定在固相上的靶抗原。在另一種競(jìng)爭(zhēng)性形式中，標(biāo) 記的檢測(cè)試劑也可以用于檢測(cè)樣品中與標(biāo)記的檢測(cè)試劑結(jié)合相同的靶抗原結(jié)合的抗體。在 上述每種形式中，檢測(cè)試劑以有限量存在，大約與被分析的靶的濃度相同。側(cè)向流裝置是優(yōu)選的形式。與家庭妊娠檢驗(yàn)類似，側(cè)向流裝置通過將流體施加到 已經(jīng)用特定生物物質(zhì)處理過的試紙條上來(lái)工作。通過液體樣品攜帶，以相應(yīng)的生物物質(zhì)標(biāo) 記的磷光體流過試紙條，當(dāng)它們通過特定區(qū)時(shí)能夠被捕獲。在試紙條上發(fā)現(xiàn)的磷光體信號(hào) 的量與靶分析物的量成正比。將懷疑含有流感病毒的樣品加到側(cè)向流裝置上，使樣品通過擴(kuò)散進(jìn)行移動(dòng)，線或 有色的區(qū)表明流感病毒的存在。側(cè)向流通常含有固相支持物(例如硝酸纖維素膜)，其包 含三個(gè)特定區(qū)域加樣區(qū)，含有一種或多種針對(duì)NSl的抗體的捕獲區(qū)，以及含有一個(gè)或多個(gè) 區(qū)的讀出區(qū)，每個(gè)區(qū)含有一種或多種標(biāo)記物。側(cè)向流也可以包含陽(yáng)性和陰性對(duì)照。因此， 例如，側(cè)向流裝置可以如下使用通過將試樣量的生物樣品與試紙條的一端相接觸，然后 使蛋白通過例如毛細(xì)作用諸如側(cè)向流在試紙條上遷移，來(lái)將A型和/或B型流感病毒NSl 蛋白與生物樣品中的其它病毒和細(xì)胞蛋白分離開。包含一種或多種抗體和/或適體作為 捕獲和/或檢測(cè)試劑。用于側(cè)向流分離、檢測(cè)和定量的方法和裝置描述在例如美國(guó)專利 Nos. 5，569，608,6, 297，020和6，403，383中，在此以其全文引為參考。例如，試紙條可以含 有用于載樣的近端區(qū)域(載樣區(qū))，和含有針對(duì)NSl蛋白的抗體以及緩沖試劑和添加劑的 遠(yuǎn)端檢驗(yàn)區(qū)，所述緩沖試劑和添加劑適合在抗體和遷移的生物樣品中任何B型流感病毒的 NSl蛋白之間建立結(jié)合相互作用。在另一個(gè)例子中，試紙條含有兩個(gè)檢驗(yàn)區(qū)，它們含有針對(duì) B型流感病毒兩種不同亞型的NSl的不同抗體，即每種能夠與不同的B型流感病毒分析物特 異性相互作用。適合用于上述方法的可檢測(cè)標(biāo)記物包括任何可以通過分光光度學(xué)、光化學(xué)、生物 化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、化學(xué)或其它手段檢測(cè)的部分。例如，適合的標(biāo)記物包括用標(biāo)記 的鏈親和素結(jié)合物染色的生物素、熒光染料(例如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光 蛋白等)、放射性標(biāo)記物(例如3H、1251、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸 酶和其它在ELISA中常用的酶)，以及比色標(biāo)記物例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚 苯乙烯、聚丙烯、乳膠珠)。描述了這類標(biāo)記物的用途的專利包括美國(guó)專利Nos. 3，817，837、 3，850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149 和 4，366，241。也參見《熒光 探針和研究化學(xué)物質(zhì)手冊(cè)》(第六版)(Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed. ,Molecular Probes, Inc. ,Eugene Oreg.))。放射性標(biāo)記物可以使用照 相底片或閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，熒光標(biāo)記物可以使用檢測(cè)發(fā)射光的光探測(cè)器來(lái)檢測(cè)。酶標(biāo) 記物通常通過給酶提供底物、并檢測(cè)通過酶對(duì)底物的作用而產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)， 比色標(biāo)記物通過有色標(biāo)記物的簡(jiǎn)單目測(cè)來(lái)檢測(cè)。樣品中B型流感病毒NSl蛋白的水平可以被定量和/或與對(duì)照進(jìn)行比較。適合的 陰性對(duì)照樣品是例如從已知健康的個(gè)體、例如已知沒有感染流感病毒的個(gè)體獲得的。特異 性對(duì)照可以從患有已知A型流感病毒或C型流感病毒感染的個(gè)體、或感染了流感病毒之外 的病毒的個(gè)體收集。對(duì)照樣品可以來(lái)自與被檢驗(yàn)的對(duì)象遺傳相關(guān)的個(gè)體，但是也可以來(lái)自 遺傳上無(wú)關(guān)的個(gè)體。適合的陰性對(duì)照樣品也可以是在感染的較早期階段，即比獲取檢驗(yàn)樣 品的時(shí)間點(diǎn)更早的時(shí)間點(diǎn)，從個(gè)體收集的樣品。B型流感病毒的重組NSl可以用作陽(yáng)性對(duì)照。Western印跡顯示，生物樣品中NSl水平足以允許在各種不同的可能的免疫分析 形式中檢測(cè)這些抗原。但是，如果證實(shí)特定生物樣品中NSl的水平限制了在特定免疫分析 形式中的檢出，那么可以通過在體外感染細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增生物樣品中的活病毒，即病毒擴(kuò)增樣 品中的NSl蛋白將在大約6小時(shí)到大約12小時(shí)內(nèi)可測(cè)出。生物樣品和病毒擴(kuò)增樣品中NSl 抗原的產(chǎn)量也可以通過包含蛋白酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑來(lái)增加。VII.樣品可以使用含有或被認(rèn)為可能含有可檢測(cè)濃度的流感病毒蛋白并優(yōu)選為NSl的任 何來(lái)自于對(duì)象的生物樣品。例如，樣品通常從患有或懷疑患有流感或出于升高的流感風(fēng)險(xiǎn) (例如通過與患有流感的其它個(gè)體接觸)的人類獲得?？梢允褂玫臉悠返睦邮抢绶瘟?出物、細(xì)胞提取物(呼吸系統(tǒng)，上皮襯里的鼻腔)、血液、粘液和鼻腔拭子。在鼻腔拭子中可 以發(fā)現(xiàn)高濃度的NS1。因此，用于鑒定NSl的優(yōu)選樣品是鼻腔分泌物。NSl與抗體的結(jié)合在存在有高達(dá)0.05% SDS的情況下發(fā)生，包括0. 03 %和 0.01%。因此 ，當(dāng)鼻腔或其它身體分泌物不能容易地用于側(cè)向流形式時(shí)，可以用SDS對(duì)它進(jìn) 行處理。優(yōu)選，加入的SDS的量高達(dá)終濃度為0. 01 %，更優(yōu)選為0. 03%，更加優(yōu)選為0. 05%。VIII.診斷和治療試劑盒提供了試劑盒以執(zhí)行本發(fā)方法。試劑盒包含一種或多種結(jié)合劑，典型為與A型和 /或B型流感病毒的NSl特異性結(jié)合的抗體或PDZ結(jié)構(gòu)域。該試劑盒任選包含一種或多種 在實(shí)施例中公開的試劑、緩沖液或添加劑組合物或試劑。試劑盒還可以包含工具，例如裝置 和系統(tǒng)，用于將流感病毒NSl從生物樣品中其它可能的干擾性物質(zhì)中取出。如果需要，該試 劑盒還包含一種或多種可用于執(zhí)行分析方法的不同組件例如一個(gè)或多個(gè)分析容器，一種 或多種對(duì)照或校正試劑，一種或多種在其上進(jìn)行分析的固相表面，或一種或多種緩沖液、添 加劑或檢測(cè)試劑或抗體，一份或多份印刷說明書，詳細(xì)說明了如何使用試劑盒檢測(cè)A型和/ 或B型流感病毒，例如作為包裝插入物和/或容器標(biāo)簽，用于指示在執(zhí)行分析中相應(yīng)的成分 應(yīng)該使用的量，以及對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行評(píng)估的指導(dǎo)。該試劑盒可以含有用于進(jìn)行許多不同類 型的分析形式的組件，包括例如試紙條、夾心ELISA、Western印跡分析、乳膠凝集等。IX.抗體陣列本發(fā)明還提供了固定在不同區(qū)域上的抗體和/或PDZ結(jié)構(gòu)域的陣列。這樣的陣列 在陣列的不同區(qū)域中包含了多種不同的抗體和/或PDZ結(jié)構(gòu)域，每種對(duì)A型和/或B型流感 病毒的NSl具有特異性?？梢赃x擇對(duì)A型和/或B型流感病毒的不同亞型和/或毒株具有 特異性的不同抗體。也可以包含對(duì)A型和/或B型流感病毒的NSl具有泛特異性的抗體。 針對(duì)A型或C型流感病毒NSl蛋白的抗體也可以包括。這樣的陣列可用于檢測(cè)A型流感病 毒和/或B型流感病毒和/或C型流感病毒，并辨別這些病毒的亞型和毒株。大量用于陣列的形式已經(jīng)被提出。美國(guó)專利No. 5，922，615描述了利用固定在膜 上的抗體的多個(gè)離散區(qū)來(lái)檢測(cè)陣列中的多個(gè)靶抗原。美國(guó)專利Nos. 5，458，852,6, 019，944、 US 6，143，576和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No. 08/902, 775描述了具有固定在裝置中但是不在 膜上的多個(gè)離散抗體區(qū)的診斷裝置，用于分析多種靶抗原。WO 99/67641描述了微球陣列 的產(chǎn)生，在將微球固定在光學(xué)纖維的末端上之后，在個(gè)體微球上固定了能夠解碼和鑒定特 異性結(jié)合物(包括抗體)的標(biāo)簽。在美國(guó)專利5，981，180中，再次使用了微球來(lái)固定結(jié)合物(包括抗體)，通過檢測(cè)包含在微球中用于鑒定與微球結(jié)合的特異性結(jié)合物的兩種不同 熒光團(tuán)的相對(duì)量，可以無(wú)需將微球從樣品中分離就將微球彼此分辨開。所有在本說明書中引用的出版物和專利文獻(xiàn)在此引為參考，如同每個(gè)單個(gè)出版 物或?qū)＠粚ｉT并分別地指明被引為參考一樣。由Genbank身份(GID)或登錄號(hào)參考的 Genbank記錄，特別是任何多肽序列、多核苷酸序列或其注解，在此引為參考。如果在不同時(shí) 間有超過一個(gè)版本的序列與同樣的登記號(hào)相關(guān)聯(lián)，對(duì)保藏號(hào)的引用應(yīng)該被解釋為適用于回 溯到優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)時(shí)在申請(qǐng)的有效提交日存在的版本，如果在優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)中也引用了該保藏 的話。在不背離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種改變并可以進(jìn)行等效替 換。例如，盡管本發(fā)明主要描述的是針對(duì)A型流感病毒和B型流感病毒，但同樣的策略在進(jìn) 行必要的修改后可用于檢測(cè)C型流感病毒。除非從上下文顯然不是這樣，否則任何特點(diǎn)、步 驟或?qū)嵤┓桨缚梢耘c任何其它特點(diǎn)、步驟或?qū)嵤┓桨附M合使用。
實(shí)施例實(shí)施例1 :NS1蛋白表達(dá)在人類臨床樣本中 檢測(cè)人類鼻腔分泌物中來(lái)自A型流感病毒的NSl的存在和量。收集人類鼻腔吸 出物，并在M4病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基(Remel，Inc, Lenexa, KS)中儲(chǔ)存在_80°C。將儲(chǔ)存的材料 融化，并在10% SDS-PAGE上跑樣。使用針對(duì)NSl的單克隆抗體3H3和IAlO (Arbor Vita Corporation, Sunnyvale, CA.)進(jìn)行Western印跡分析。6個(gè)樣品的結(jié)果顯示在圖4中。結(jié) 果顯示出NSl在鼻腔分泌物中大量存在。為了研究A型流感病毒感染的細(xì)胞何時(shí)產(chǎn)生和分泌NSl的時(shí)間線，將MDCK細(xì)胞用 人類流感病毒A/PR/8以0. 1的MOI進(jìn)行感染。收集上清液和細(xì)胞，并在Triton X-100 中裂解，進(jìn)行SDS-PAGE，并用對(duì)NSl具有泛反應(yīng)性的單克隆抗體3H3進(jìn)行western分析。在 感染的細(xì)胞中，在感染后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到NSl，在感染細(xì)胞的上清液中，在48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到 NSl (參見圖5)。這表明基于NSl的診斷可能能夠在48小時(shí)內(nèi)、并且有可能在24小時(shí)內(nèi)檢 測(cè)A型流感病毒的感染。實(shí)施例2 =NSl與PDZ在細(xì)胞中相互作用為了證實(shí)NSl與PDZ蛋白在細(xì)胞中相互作用，進(jìn)行了一系列PDZ下拉(pull-down) 實(shí)驗(yàn)。將293HEK細(xì)胞用含有HA-NS1-H5N1B或HA-NS1-H3N2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。按照本文的描述 制備裂解液。如圖6和7所示，制備了谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(10yg DLGldl, 2, 10μ gNeDLGdl，2和10μ g PSD95dl，2，3)，并用于下拉150 μ g來(lái)自轉(zhuǎn)染的293ET細(xì)胞的裂解 液。在4°C溫育過夜后，用HNTG緩沖液清洗多次，使用下拉物制備膜。膜用F63-3G1上清液 (1 5)探測(cè)。所有3種檢驗(yàn)的PDZs都成功地下拉了來(lái)自表達(dá)HA-H5N1B的細(xì)胞的NSl (參 見圖6)。同樣地，制備了谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠-PDZ珠(40yg INADLdS)，并用于下拉 150 μ g來(lái)自用H3N2轉(zhuǎn)染的293ET細(xì)胞的裂解液。在4°C溫育過夜后，用PBS清洗多次，制 備了 western印跡并用a-HA探測(cè)(1 500) (Roche)。INADL d8成功地下拉了來(lái)自細(xì)胞裂 解液的 HA-H3N2 NSl (圖 7)。結(jié)論是，正如通過MATRIX分析所確定，NSl的PL在細(xì)胞內(nèi)是有功能的，并可以與 PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用。
實(shí)施例3 針對(duì)NSl的單克隆抗體制備與亞型NSl蛋白(例如H5N1)、NSl PL類別(例如ESEV)特異性結(jié)合的以及 具有泛特異性(A型流感病毒)的單克隆抗體。產(chǎn)生針對(duì)NSl的單克隆抗體的策略如下1.產(chǎn)生NSl的GST和MBP融合蛋白?？寺≥d體從Pharmacia (GST)或New England Biolabs(MBP)獲得。NSl編碼區(qū)使用交疊的寡核苷酸通過DNA 2. O (Menlo Park, CA)合成。2.將小鼠用MBP-NSl融合蛋白免疫，劑量范圍為每劑10-100 μ g，所述融合蛋白在 CFA中，然后在IFA和PBS中。3.在用相應(yīng)的GST-NSl融合蛋白最后一次強(qiáng)后3天，收獲脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并按 照Kohler和Milstein (Nature 1975)的方法與F0X-NY骨髓瘤細(xì)胞融合。
4.雜交瘤首先用MBP-NSl在ELISA中篩選。將陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆，并用MBP和GST NSl組重新篩選，并分類成泛反應(yīng)性的或亞型反應(yīng)性。
5.使用Western印跡進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以證實(shí)靶蛋白的分子量與NSl —致。6.使用S2分析形式(參見實(shí)施例4)進(jìn)行附加的篩選，篩選與PDZ捕獲的相容性。7.使用真核細(xì)胞表達(dá)的NSl以細(xì)胞裂解物的形式重復(fù)步驟5和6。8.檢查抗體與實(shí)施例4中描述的側(cè)向流形式的相容性。最后，檢查抗體在臨床樣本中檢測(cè)NSl的能力。實(shí)施例4:側(cè)向流用于檢測(cè)NSl的側(cè)向流形式的例子提供在圖8、9和IOA-F中。圖8提供了使用PDZ 捕獲、然后是單克隆抗體檢測(cè)的側(cè)向流。對(duì)于所有情況來(lái)說，使用卸料器(striper)將重組 PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或抗體沉積在RF 120 Millipore膜上。對(duì)于圖8來(lái)說，PDZ蛋白PSD95D1-3、 和INADL D8以0. 5mg/ml的濃度進(jìn)行沉積。由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成的對(duì)照條帶也以 0. 5mg/ml進(jìn)行沉積。將NSl蛋白與金結(jié)合的單克隆抗NSl抗體例如4B2在TBS-T緩沖液中 進(jìn)行混合成ΙΟΟμ 1體積。使用的NSl蛋白來(lái)自Hmi、H3N2、H5m97、H5Nl，對(duì)照道不含NS1。 在所有情況下，將人類鼻腔吸出物稀釋，按照指示儲(chǔ)存在鹽水或M4中。將樣品以下面描述 的量直接與金結(jié)合的抗體混合。將有PDZ條帶的膜插入到NSl/抗NSl蛋白溶液中，通過毛細(xì)作用和芯吸墊啟始流 動(dòng)。根據(jù)PDZ反應(yīng)性的樣式，對(duì)NSl分亞型；Hmi與PSD95和INADL d8都結(jié)合；H3N2只與 INADL d8結(jié)合；H5W只與PSD95結(jié)合。對(duì)A型流感病毒分亞型，根據(jù)NSl側(cè)向流的結(jié)果，使 用與PDZ的反應(yīng)性和使用金結(jié)合的泛反應(yīng)性抗NSl單克隆抗體的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行。在圖9中，13種不同的單克隆抗體被沉積在側(cè)向流裝置上。使用的13種抗體是 F64-1A0、F64-3H3、F64-6G12、F64-7A8、F64-7D1、F68-1D10、F68-4B2、F68-4H9、F68-6A12、 F68-6B7、F68-6D6、F68-7B10。將亞型特異性的金結(jié)合的泛NSl抗體加入到含有Hmi流感 病毒的樣品中。將樣品施加到側(cè)向流裝置上，結(jié)果顯示在圖9中。結(jié)果表明，泛特異性抗體 可用于檢驗(yàn)和分析，以鑒定哪個(gè)抗體與Hmi結(jié)合最好。結(jié)合強(qiáng)度使用下列符號(hào)進(jìn)行定量 (-)無(wú)結(jié)合，(+)弱結(jié)合，(+++)強(qiáng)結(jié)合，(++)中等結(jié)合。產(chǎn)生了在膜上沉積有泛特異性抗體的側(cè)向流分析，用于鑒定患者樣品中致病性A 型流感病毒。將患者的樣品與識(shí)別所有NSl PL’ s的金標(biāo)記的抗體的混合物混合。將樣品 施加到側(cè)向流檢驗(yàn)條上，如果存在A型流感病毒的致病性毒株，檢驗(yàn)條上會(huì)形成線。檢驗(yàn)條檢驗(yàn)使用下面的方案和材料來(lái)進(jìn)行之前用山羊抗小鼠/PSD95 dl，2，3/INADL d8 劃條的檢驗(yàn)條；TBST/2 % BSA/O. 25 % Tween20 緩沖液；NSl 蛋白 MBP-H1N1、 MBP-H3N2.MBP-H5N1A 和 MBP_H5mB “舊”(Jon' s)快速金結(jié)合的 F68-4B2 抗體的儲(chǔ)液；以 及Maxisorp ELISA板。程序如下進(jìn)行1)將 NSl 蛋白儲(chǔ)液在 TBST/2% BSA/O. 25% Tween 20 中稀釋到 IOOng/μ L(使用 不超過5μ L的蛋白進(jìn)行稀釋)2.)通過將 10 μ L 蛋白加入至Ij 10 μ L TBST/2% BSA/O. 25% Tween20 中，將 IOOng/ μ L稀釋液稀釋到50ng/ μ L3.)制備金結(jié)合的抗體在TBST/2% BSA/O. 25% Tween 20緩沖液中的儲(chǔ)存溶液。 在每100 μ L緩沖液中加入4 μ L抗體，為6個(gè)100 μ L的反應(yīng)準(zhǔn)備足夠的緩沖液(提供了額 外的死體積)4.)將98 μ L抗體/緩沖液混合物加入到ELISA板的獨(dú)立的孔中5.)將2 μ L NSl稀釋液加入到含有緩沖液的孔中(每孔一種NSl)6.)留下一個(gè)孔只含有抗體和緩沖液，用作陰性“無(wú)NS1”對(duì)照7.)將ELISA板輕叩幾次以混合孔中的內(nèi)含物8.)將預(yù)先劃條的檢驗(yàn)條加入到孔中，并在顯色過程中進(jìn)行觀察大約15分鐘后(當(dāng)所有的液體已經(jīng)被吸收，但試紙還沒有干燥時(shí))，將檢驗(yàn)條從孔 中取出，并掃描到計(jì)算機(jī)中。在圖10Α和10Β中提供的檢驗(yàn)如下制備對(duì)于禽類檢驗(yàn)來(lái)說，將GST-PSD95 dl，2， 3蛋白以3mg/mL在膜上形成條，或者，對(duì)于泛A型流感病毒檢驗(yàn)來(lái)說，可以使用兩種單克隆 抗體的混合物(1. lmg/mLF64-3H3和0. 075mg/mL F68-4H9)。lmg/mL的多克隆山羊抗小鼠 抗體的第二根線被用作檢驗(yàn)捕獲線。步驟闡述如下。1.制備帶有樣品膜和吸水墊的卡片。2.用PDZ蛋白和/或抗體在膜上劃條(參見上面的濃度)。3.將膜在56度干燥過夜，然后將卡片切割成4. 26mm寬的條。4.將玻璃纖維樣品墊連接到條底部，并將整個(gè)檢驗(yàn)條放置在用于檢驗(yàn)的盒子內(nèi) 部。5.將待測(cè)樣品融化，將80μ 1樣品加入到20μ 1緩沖液中。上下吹吸幾次以進(jìn)行
混合ο6.在樣品/緩沖液溶液中摻入8 μ 1金結(jié)合的(Au-)檢測(cè)物混合物。該檢測(cè)物混 合物是4μ1 Au-F68-4B2和4 μ 1 Au_F68_3D5。上下吹吸幾次以進(jìn)行混合。7.將100 μ 1制備的樣品加入到盒子上的樣品孔中。8.在加入樣品后15分鐘，讀取盒子上的檢驗(yàn)和對(duì)照線。對(duì)照線清晰可見，使得任 何檢驗(yàn)結(jié)果可以可靠地讀出。A型流感病毒陽(yáng)性樣品用(+)標(biāo)注。A型流感病毒陰性樣品 用(_)標(biāo)注。頂部的箭頭指向?qū)φ?，底部的箭頭指向檢驗(yàn)。在兩種情況下頂部的線是對(duì)照線(山羊抗小鼠mAb)，下方的第二根線是檢驗(yàn)線 (對(duì)于泛A型流感病毒(Pan-FluA)檢驗(yàn)來(lái)說是F64-3H3和F68-4H9 mAbs的混合物，對(duì)于禽 類檢驗(yàn)來(lái)說是PSD95 dl，2，3)。對(duì)于禽類檢驗(yàn)來(lái)說試驗(yàn)了2ng H5W蛋白。底部的圓點(diǎn)是樣 品孔。在圖10A中，兩種檢驗(yàn)都是陽(yáng)性的。圖10C顯示了使用圖10A和10B中所示的形式檢驗(yàn)的20個(gè)人類樣品中的3個(gè)。樣品顯示出了多變的結(jié)果，例如，樣品1對(duì)于A型流感是陽(yáng)性的，但是對(duì)于禽類A型流感(即 H5N1)是陰性的，樣品14對(duì)于二者(即A型流感和H5W)都是陰性的。圖IOD顯示了對(duì) H1NUH3N2和H5W重組蛋白的同樣檢驗(yàn)。對(duì)于所有3種來(lái)說泛A型流感檢驗(yàn)都是陽(yáng)性的。 禽類流感檢驗(yàn)只對(duì)H5W是陽(yáng)性的。在圖IOE中，使用了金結(jié)合的PDZs用作檢測(cè)物，單個(gè)或多個(gè)mAbs 被用于捕獲。 圖IOE具有液體金，以帶有F68-4B2 mAb捕獲物的Au_PSD95 dl，2，3形式加入。1. 7ng NSl H5N1蛋白的檢驗(yàn)為陽(yáng)性。這是禽流感(即H5N1)特異性檢驗(yàn)。在圖IOF中，使用了干燥的金方法?？ㄆ凑找后w金方案中制備，只是樣品墊在形 成條之前固著到卡片上。當(dāng)捕獲物成條后，將金結(jié)合的檢測(cè)物混合物(這里也含有結(jié)合物 稀釋劑)噴灑在卡片底部的樣品墊上。與液體檢驗(yàn)相同，將卡片干燥、切割并放置在盒子 中。當(dāng)制備人類樣品時(shí)，只用緩沖溶液處理它們，然后將100 μ 1在盒子上跑樣(不加入額 外的金結(jié)合的檢測(cè)物混合物)。A型流感陽(yáng)性樣品用(+)標(biāo)注，A型流感陰性樣品用(-)標(biāo) 注。這些盒子的設(shè)計(jì)和讀數(shù)與液體金盒子的方式相同。在圖IOF中，樣品7和9對(duì)于A型 流感和禽流感(即Η5Ν1)都是陽(yáng)性的，樣品12對(duì)于A型流感和禽流感(即Η5Ν1)都是陰性 的。實(shí)施例5 使用泛特異性抗體檢測(cè)B型流感病毒
使用按照上述方法產(chǎn)生的抗B型流感病毒NSl單克隆抗體，開發(fā)了側(cè)向流檢驗(yàn)來(lái) 檢測(cè)B型流感病毒的NSl。使用卸料器，將抗B型流感病毒NSl單克隆抗體以大約0. 7mg/ ml的濃度沉積在HF075 Millipore膜上。作為捕獲試劑沉積的抗體的一些例子在下述抗體 中F89 1F4、F94 3A1、F89 4D5。由山羊抗小鼠抗體(GAM)組成的對(duì)照條帶也以lmg/ml沉 積。將B型流感NSl蛋白與金結(jié)合的單克隆抗NSl抗體例如F94 3A1 (當(dāng)F94 3A1不被用 作捕獲物時(shí))在100 μ 1體積的AVC B型流感緩沖液中混合。使用的B型流感NSl蛋白是 重組 AVC ID 522 (B/BA/78 NSl)和 AVC ID 523 (Β/ΥΜ/222/2002)，或來(lái)自己知感染了 B 型流 感病毒的患者的臨床樣品。將有抗B型流感NSl抗體條的膜插入到B型流感NSl/抗NSl蛋白溶液中，通過毛 細(xì)作用和芯吸墊啟始流動(dòng)。在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用了抗B型流感NSl捕獲物和檢測(cè)劑的幾種組合。下面是一個(gè) 示例性的方案。使用先前形成了山羊抗小鼠/F89 1F4抗B型流感NSl單克隆抗體條的檢 驗(yàn)條；90%的Μ4病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基，10%的IOX AVC Flu B緩沖液；NSl蛋白MBP-B型流感 NSl (AVC 522和AVC 523)的儲(chǔ)液；金結(jié)合的F94 3Α1抗體；以及Maxisorp ELISA板，進(jìn)行 條檢驗(yàn)。程序如下進(jìn)行1)將NSl蛋白儲(chǔ)液在90% Μ4病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基、10%的10XAVCB型流感緩沖液中 稀釋。9.)將NSl的儲(chǔ)液用90%Μ4/10%的IOX AVC B型流感緩沖液稀釋到0. 5ng/μ L。10.)在每100 μ L緩沖液中加入4μ L金結(jié)合的抗體。11.)將98 μ L抗體/緩沖液混合物加入到ELISA板上分離的孔中。12.)將2 μ L的NSl稀釋液加入到含有緩沖液的孔中(每孔一種NSl)，以獲得所 需的終蛋白濃度(例如Ing B型流感NSl)。13.)留下一個(gè)孔只加入抗體和緩沖液，用作陰性“無(wú)NS1”對(duì)照。
14.)將ELISA板輕叩幾次以混合孔中的內(nèi)含物。15.)將預(yù)先劃條的檢驗(yàn)條加入到孔中，并在顯色過程中進(jìn)行觀察。大約15分鐘后(當(dāng)所有的液體已經(jīng)被吸收，但檢驗(yàn)條還沒有干燥時(shí))，將檢驗(yàn)條從 孔中取出，并掃描到計(jì)算機(jī)中。圖11顯示了各種的單克隆抗體作為捕獲和檢測(cè)試劑對(duì)，對(duì)兩株B型流感病毒毒株 B/BA78 (也稱為毒株522)和B/Yagamata\222\2002 (也稱為毒株523)的檢驗(yàn)結(jié)果。四個(gè) 不同的圖顯示了 4種抗體的組合。在每張圖中，第3和第6道是陰性對(duì)照。第1和2道是 來(lái)自毒株522的重組NS1，第4和5道是來(lái)自毒株523的重組NSl。在第一張圖的第4和5 道中存在而在第1和2道中不存在的附加條帶顯示出F89-F4捕獲抗體F89-4G12檢測(cè)抗體 組合檢測(cè)523毒株，但是不檢測(cè)522毒株。其它的圖能夠以同樣的方式進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn) 和其它類似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述在表13中。表13顯示了哪些抗體可以用作捕獲抗體，哪些可 以用作檢測(cè)抗體，以及抗體對(duì)于B型流感病毒的兩個(gè)毒株(522和523)是泛特異性的、或?qū)?522或523是單特異性的。例如，F(xiàn)89-1F4抗體可以用作捕獲或檢測(cè)抗體，是泛特異性的。 F94-4C10可以作為檢測(cè)抗體但是不能作為捕獲抗體工作，對(duì)B型流感病毒523是特異性的。 F89-1F4和F94-3A1是在側(cè)向流形式中使用的優(yōu)選抗體。產(chǎn)生了在膜上沉積有泛特異性抗體的側(cè)向流分析，用于在患者樣品中鑒定B型流 感病毒。將 患者的樣品與識(shí)別所有B型流感病毒NSl的金標(biāo)記抗體的混合物混合。將樣品 施加到側(cè)向流檢驗(yàn)條上。存在B型流感病毒將呈現(xiàn)為線，由條上形成的線顯示。圖12顯示 了來(lái)自患者樣品的不同稀釋液與陽(yáng)性和陰性對(duì)照比較的結(jié)果。圖的上部顯示了指示B型流 感病毒存在的線的實(shí)際外觀。圖的下部表明了條帶的相對(duì)強(qiáng)度。直至至少400倍稀釋時(shí)， B型流感病毒仍可以被容易地檢測(cè)到。實(shí)施例6 含有三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的多肽與NSl的結(jié)合使用側(cè)向流分析來(lái)檢測(cè)樣品中H5W蛋白的存在。對(duì)于所有情況來(lái)說，使用卸料 器，將重組PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白或抗體沉積在RF 120MiIlipore膜上。將含有單拷貝的PSD95 結(jié)構(gòu)域2的漸增量(0、25、100或500皮克)多肽作為條帶沉積在膜上。將含有三個(gè)拷貝的 PSD95結(jié)構(gòu)域2的等量多肽(其中PSD95的天然PDZ結(jié)構(gòu)域1和3各被PSD95PDZ結(jié)構(gòu)域2 代替(圖14A))也進(jìn)行沉積。圖14A也用斜體顯示了可用于固定的任選GST序列的序列。 同樣，等量的含有三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域1，2和3的多肽也被沉積。在所有三種情況下， 將3mg/ml蛋白溶液以0. 05 μ 1/mm檢驗(yàn)條進(jìn)行印刷，其中檢驗(yàn)條為4. 26mm寬。沉積山羊抗 小鼠抗體(GAM)作為對(duì)照條帶。將NSl蛋白與金結(jié)合的單克隆抗NSl抗體(小鼠序列的) 在100 μ 1體積緩沖液中進(jìn)行混合。將劃條的膜插入到NSl/抗NSl溶液中，通過毛細(xì)作用 和芯吸墊啟始流動(dòng)。正如在圖14Β中看到的，含有三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的多肽和含 有單個(gè)拷貝PSD95結(jié)構(gòu)域2的肽，當(dāng)與H5m NSl接觸時(shí)，都產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。但是，在給 定的H5m NSl濃度下，對(duì)于含有三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的多肽來(lái)說，信號(hào)較強(qiáng)。正如 在圖14C中看到的，在同樣的H5m NSl濃度下，含有PSD95結(jié)構(gòu)域1，2和3的多肽也產(chǎn)生 了可檢測(cè)的信號(hào)，盡管該信號(hào)不像含有三個(gè)拷貝PSD95結(jié)構(gòu)域2的多肽的信號(hào)那樣強(qiáng)。陰 性對(duì)照包括含有金結(jié)合的抗NSl抗體但是不含NSl分析物的緩沖溶液。陰性對(duì)照產(chǎn)生了暗 的GAM對(duì)照條帶線，表明金結(jié)合的抗NSl抗體過量，這表明未結(jié)合的金結(jié)合的抗NSl抗體確 實(shí)流過了對(duì)照條帶。
權(quán)利要求
檢測(cè)A型流感病毒的方法，包括(a)將來(lái)自對(duì)象的樣品同與A型流感病毒致病性亞型的NS 1蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；(b)檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與樣品中致病性A型流感病毒的NS1蛋白的特異性結(jié)合，以確定樣品中存在或不存在致病性A型流感病毒亞型；(c)將患者的樣品同與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NS1蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；以及(d)檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NS1蛋白的特異性結(jié)合，以確定樣品中存在或不存在A型流感病毒季節(jié)性亞型。
2.權(quán)利要求1的方法，其中與A型流感病毒致病性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的 PDZ結(jié)構(gòu)域是PSD95結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1的方法，其中與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的 PDZ結(jié)構(gòu)域是INADL結(jié)構(gòu)域8。
4.權(quán)利要求1的方法，其中樣品是由口腔獲得的樣品。
5.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)象是顯示出流感癥狀的人。
6.權(quán)利要求1的方法，其中PSD95PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白的特異性結(jié)合通過夾心分析 檢測(cè)，所述分析中樣品與結(jié)合NSl蛋白的抗體相接觸，并檢測(cè)PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域和抗體均與 NSl蛋白特異性結(jié)合的PSD95 PDZ結(jié)構(gòu)域和抗體的復(fù)合物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中INADLPDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白的特異性結(jié)合通過夾心分析 檢測(cè)，所述分析中檢測(cè)INADL PDZ結(jié)構(gòu)域和抗體均與NSl蛋白特異性結(jié)合的INADL PDZ結(jié) 構(gòu)域和抗體的復(fù)合物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中PSD95的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含PSD95的PDZ結(jié)構(gòu)域2。
9.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含至少三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2。
10.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含PSD95的結(jié)構(gòu)域1、2和3。
11.權(quán)利要求1的方法，其中INADL的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含INADL的結(jié)構(gòu)域8。
12.權(quán)利要求1的方法，其中INADL的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)拷貝的INADL的結(jié) 構(gòu)域8。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)或(d)中檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合的存在 包括檢測(cè)特異性結(jié)合的程度，并且特異性結(jié)合的程度是樣品中A型流感病毒致病性(步驟 b)或季節(jié)性(步驟d)亞型的量的指標(biāo)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中與A型流感病毒致病性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域是PSD95結(jié)構(gòu)域；與A型流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL特異性結(jié)合的PDZ結(jié)構(gòu)域是INADL結(jié)構(gòu) 域8;存在PSD95結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合和不存在INADL結(jié)構(gòu)域8的特異性結(jié)合，或PSD95結(jié) 構(gòu)域的特異性結(jié)合相對(duì)于INADL結(jié)構(gòu)域8的特異性結(jié)合較高，表明樣品含有致病性A型流 感病毒亞型H5m ；以及存在INADL結(jié)構(gòu)域8的特異性結(jié)合和不存在PSD95結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合，或INADL結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合相對(duì)于PSD95結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合較高，表明樣品含有季節(jié)性A型流感 病毒亞型H3N2或Hmi。
15.權(quán)利要求14的方法，其中PSD95結(jié)構(gòu)域是結(jié)構(gòu)域2，存在PSD95結(jié)構(gòu)域2的特異性 結(jié)合以及INADL結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合與PSD95結(jié)構(gòu)域2相比相對(duì)較高，表明樣品含有季節(jié) 性A型流感病毒亞型HlNl，而不存在PSD95結(jié)構(gòu)域2的特異性結(jié)合與存在INADL結(jié)構(gòu)域8 的特異性結(jié)合相組合，表明樣品含有季節(jié)性A型流感病毒亞型H3N2。
16.檢測(cè)A型流感病毒的方法，包括將來(lái)自對(duì)象的樣品同與A型流感病毒NS 1蛋白的不同表位結(jié)合的第一種和第二種泛 特異性抗體相接觸；檢測(cè)存在或不存在第一種和第二種抗體與NSl蛋白之間的復(fù)合物，以表明存在或不存 在A型流感病毒。
17.權(quán)利要求16的方法，其中第一種和第二種抗體各自與SEQIDNO 1的8_21、9_20、 29-38或45-49位殘基內(nèi)的表位結(jié)合。
18.權(quán)利要求16的方法，其中第一種和第二種抗體與選自F643H3、F688E6、F646G12、 F6810A5、F 807E8、F808F6、F809B1、F811C12、F811F3、F814D5 和 F641A10 的不同抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
19.檢測(cè)A型流感病毒的方法，包括將來(lái)自對(duì)象的樣品與結(jié)合A型流感病毒NSl蛋白的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和至少一種泛 特異性抗體相接觸；從存在或不存在與NSl蛋白特異性結(jié)合的至少一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和泛特異性抗體的復(fù)合 物，檢測(cè)樣品中存在或不存在A型流感病毒的NSl蛋白。
20.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體是固定在固相上的捕獲抗體。
21.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體是檢測(cè)抗體。
22.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體與SEQID NO 1的9_20、29_38或45-49位 殘基的NSl蛋白表位特異性結(jié)合。
23.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體是單克隆抗體。
24.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體是兩種單克隆抗體的混合物。
25.權(quán)利要求19的方法，其中泛特異性抗體是與選自F643H3、F688E6、F646G12、 F6810A5、F807E8、F808F6、F809B1、F811C12、F811F3、F814D5 和 F641A10 的抗體競(jìng)爭(zhēng)與 NSl 蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體。
26.權(quán)利要求19的方法，其中患者的樣品與連接到支持物不同區(qū)域上的至少兩個(gè)PDZ 結(jié)構(gòu)域相接觸。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述至少兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域是PSD95結(jié)構(gòu)域和INADL結(jié)構(gòu)域。
28.檢測(cè)B型流感病毒的方法，包括將樣品同與B型流感病毒NSl蛋白的不同表位結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體相 接觸；檢測(cè)存在或不存在第一種和第二種抗體與NSl蛋白之間的復(fù)合物，以表明存在或不存 在B型流感病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中第一種和第二種抗體各自與SEQIDNO :4的10-28、40-45、50-57、67-74、84-100、154-159、169-173、185-191、212-224 或 226-240 位殘基內(nèi)的表位結(jié)合。
30.權(quán)利要求28的方法，其中第一種和第二種抗體與選自F891F4、F943A1和F89-1F8 的不同抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
31.檢測(cè)流感病毒的方法，包括將來(lái)自對(duì)象的樣品同與B型流感病毒NS 1蛋白的不同表位結(jié)合的第一種和第二種泛 特異性抗體、以及與A型流感病毒NSl蛋白的不同表位結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗 體相接觸；測(cè)定存在或不存在B型流感病毒NSl蛋白同與其結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體 之間形成的復(fù)合物，以表明樣品中存在或不存在B型流感病毒，以及確定存在或不存在A型 流感病毒NSl蛋白同與其結(jié)合的第一種和第二種泛特異性抗體之間形成的復(fù)合物，以表明 樣品中存在或不存在A型流感病毒。
32.權(quán)利要求31的方法，還包括將患者的樣品與對(duì)來(lái)自A型流感病毒致病性亞型的 NSl蛋白的PL有特異性的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；以及檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流 感病毒致病性亞型的NSl蛋白的特異性結(jié)合，以表明存在或不存在A型流感病毒的致病性 亞型。
33.權(quán)利要求31的方法，其中針對(duì)A型流感病毒的第一種和第二種泛特異性抗體分別 為捕獲和檢測(cè)抗體，而存在PDZ結(jié)構(gòu)域與NSl蛋白的特異性結(jié)合通過檢測(cè)PDZ結(jié)構(gòu)域、NSl 蛋白和檢測(cè)抗體之間形成的復(fù)合物來(lái)檢測(cè)。
34.權(quán)利要求31的方法，還包括將患者樣品與對(duì)流感病毒季節(jié)性亞型的NSl蛋白的PL 有特異性的PDZ結(jié)構(gòu)域相接觸；以及檢測(cè)存在或不存在PDZ結(jié)構(gòu)域與A型流感病毒季節(jié)性 亞型的NSl蛋白的特異性結(jié)合，以表明存在或不存在A型流感病毒季節(jié)性亞型。
35.含有至少三個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2的多肽。
36.權(quán)利要求35的多肽，其是PSD95多肽，其中兩個(gè)拷貝的PSD95結(jié)構(gòu)域2代替PSD95 多肽的天然PDZ結(jié)構(gòu)域1和3。
37.權(quán)利要求36的多肽，其具有圖14A中顯示的序列，其中結(jié)合麥芽糖的蛋白部分可以 存在或可以不存在。
38.含有至少三個(gè)拷貝的INADL結(jié)構(gòu)域8的多肽。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于檢測(cè)A型流感病毒和/或B型流感病毒和/或辨別致病性和季節(jié)性A型流感病毒亞型的方法。這些優(yōu)選的形式中，許多使用了泛特異性抗體(即與流感病毒類型中的所有或至少多種毒株反應(yīng)的抗體)來(lái)檢測(cè)A型流感病毒和/或B型流感病毒的存在，并將PDZ結(jié)構(gòu)域與針對(duì)A型流感病毒的泛特異性抗體組合，來(lái)辨別致病性和季節(jié)性的A型流感病毒亞型。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101842497SQ200880008836
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者皮特·S·盧, 約恩·西爾弗, 約翰內(nèi)斯·施魏策爾, 邁克爾·P·貝爾馬雷什 申請(qǐng)人:阿波維塔公司