專利名稱：核酸適體及其衍生物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸適體及其衍生物的新用途。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物由于對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性不強(qiáng)，往往在殺死腫瘤細(xì)胞的同 時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，導(dǎo)致強(qiáng)的毒副作用。腫瘤細(xì)胞靶向給藥是提高腫瘤治療效果減 少毒副作用的有效途徑。將藥物偶聯(lián)于腫瘤細(xì)胞特異性配基是靶向給藥的主要方 法。例如將藥物共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體上，這些偶聯(lián)藥物的 單抗能選擇性結(jié)合腫瘤組織，從而提高抗腫瘤藥物的效果，減少毒副作用。將多個(gè) 不同作用機(jī)理的耙向治療藥物合用可得到更好的治療效果。很多這類藥物在臨床前 的試驗(yàn)中均取得了很好的效果，目前正在進(jìn)行相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)(Carter, P.丄； Senter， P. D. Cancer J. 2008， 14， 154—169. Chari, R. V. J. Acc. Chem. Res. 2008， 41， 98-107.)。例如人源化的CD33抗體-加里剎霉素偶聯(lián)物Mylotarg，已經(jīng) 被批準(zhǔn)用于急性骨髓系白血病(AMU的治療。用于藥物靶向輸送的抗體來(lái)源于動(dòng) 物或融合的單克隆細(xì)胞，是自然的產(chǎn)物，其制備繁瑣、穩(wěn)定性差、分子量大、易引 起免疫反應(yīng)以及難以進(jìn)行化學(xué)修飾和改造等，因此導(dǎo)致抗體偶聯(lián)物穩(wěn)定性差，成本 高，限制了其廣泛應(yīng)用。尋找新的特異性識(shí)別分子取代抗體是靶向藥物治療的一個(gè)
重要發(fā)展方向。
近年來(lái)一類新型的識(shí)別分子-核酸適體(Aptamer，適配體，適配子)以其優(yōu)越 的識(shí)別特性逐漸得到人們的重視。核酸適體是一段單鏈核酸分子(包括DNA、 RNA、 修飾后的核酸分子)。它們通過分子內(nèi)堿基堆積、疏水相互作用、氫鍵和靜電相互 作用折疊形成獨(dú)特的三維空間結(jié)構(gòu)，從而與靶分子特異性結(jié)合(Breaker RR, Nature 2004, 432:838-845)。核酸適體與靶分子結(jié)合的親和力與特異性與單克隆抗體相似， 甚至更強(qiáng)。與抗體相比，核酸適體具有較低的分子量(15-50 bases; 4-15kD)、 快速組織通透性、沒有免疫源性和毒性。核酸適體一旦篩選出來(lái)，就可以通過自動(dòng) 化的固相化學(xué)合成來(lái)制備，無(wú)需免疫動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)的過程以及后續(xù)繁瑣的分離純 化過程，價(jià)格大大降低。核酸適體很容易進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并標(biāo)記上各種分子，如放射 性元素、熒光染料等(NutiuR&Li Y, Angew Chem Int Ed Engl 2005， 44:1061-1065;
4Liu， J.W. & Lu， Y. Angew Chem Int Ed Engl 2006， 45:90-94)。核酸適體穩(wěn)定
性高，可以可逆的變性與復(fù)性，可在常溫下保存和運(yùn)輸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供核酸適體及其衍生物的新用途。 本發(fā)明提供了核酸適體和/或核酸適體衍生物在制備靶向藥物中的應(yīng)用。 所述核酸適體衍生物可為如下a)、 b)或c):
a) 將核酸適體的骨架部分或全部改造為硫代磷酸酯骨架或?qū)Σ糠只蛉抗羌?上的糖環(huán)進(jìn)行2' -F和2， - ^2修飾等得到的核酸適體衍生物；
b) 將核酸適體部分或全部改造為肽核酸得到的核酸適體衍生物；
c) 將核酸適體中的一個(gè)以上核苷酸替換為鎖核酸(Locked Nucleic Acid ， LNA) 和/或連接分子得到的核酸適體衍生物；所述連接分子為一個(gè)以上的六聚乙二醇-l-磷酸。
六聚乙二醇-1-磷酸的結(jié)構(gòu)式如式(I ):
o=X-o 6-式(I)。
如式(I )所示，六聚乙二醇-1-磷酸的骨架為6個(gè)乙二醇的聚合物，骨架一
端的氧連接一個(gè)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)。用六聚乙二醇-1-磷酸替代核酸適體中的核苷 酸時(shí)，通過骨架兩端的氧與兩端的核苷酸連接。
所述核酸適體為可與疾病相關(guān)分子特異結(jié)合的一段單鏈核酸分子或經(jīng)修飾的 核酸分子。
所述靶向藥物可為治療腫瘤的藥物、治療感染的藥物或治療炎癥的藥物。 所述治療腫瘤的藥物具體可為殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。
所述核酸適體可為含有核心序列的DNA。
所述核酸適體還可含有側(cè)翼序列。所述側(cè)翼序列可為5'端側(cè)翼序列和/或3' 端側(cè)翼序列。
所述腫瘤細(xì)胞具體可為白血病細(xì)胞。
當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞時(shí)所述核心序列可為序列表中的序列1、序列 2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11 中任意十個(gè)以上連續(xù)核苷酸所示的DNA序列；所述5'端側(cè)翼序列可為序列表中的 序列12中任意三個(gè)以上連續(xù)核苷酸所示的DNA序列；所述3'端側(cè)翼序列可為序列 表中的序列13中任意三個(gè)以上連續(xù)核苷酸所示的DNA序列。
當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞時(shí)所述核酸適體具體如下
5， -NTCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3，(序列表的序列14);
上述序列的5，末端為任意核苷酸，用于標(biāo)記用，如A。當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞時(shí)所述核酸適體衍生物具體如下
5 ' -NJLCJLAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTALGLAL-3 ';
上述核酸適體衍生物是將序列表的序列14所示的核酸適體的5'端的4個(gè)核苷 酸和3，端的3個(gè)核苷酸替換為相應(yīng)的鎖核酸單元，將自5 '末端第23至30位核 苷酸替換為所述連接分子得到的。
所述連接分子具體可為2至5個(gè)六聚乙二醇-1-磷酸，具體可為兩個(gè)六聚乙二 醇-l-磷酸。
所述腫瘤細(xì)胞具體可為淋巴瘤細(xì)胞。
當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞為淋巴瘤細(xì)胞時(shí)所述核心序列可為序列表中的序列15中任
意十個(gè)以上連續(xù)核苷酸所示的DNA序列。
當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞為淋巴瘤細(xì)胞時(shí)所述核酸適體具體如下
5' -CAC CGG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3' (序列表的序列15)。
本發(fā)明還保護(hù)一種藥物靶向輸送載體，它的活性成分為所述核酸適體和/或所 述核酸適體衍生物。
本發(fā)明還保護(hù)將藥物和所述藥物靶向輸送載體偶聯(lián)得到的靶向藥物。 本發(fā)明還保護(hù)所述核酸適體和/或所述核酸適體衍生物在藥物靶向輸送中的應(yīng)用。 所述藥物可為治療腫瘤的藥物、治療感染的藥物或治療炎癥的藥物。 所述治療腫瘤的藥物具體可為殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。 所述藥物可為常規(guī)的治療藥物、放射性元素、毒素等。
所述白血病細(xì)胞具體可為CCRF-CEM細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞具體可為Ramos細(xì)胞。 本發(fā)明首次將核酸適體及其衍生物應(yīng)用于制備靶向藥物。針對(duì)不同的目標(biāo)細(xì) 胞，可以篩選不同的核酸適體。將特異性核酸適體與現(xiàn)有的抑制目標(biāo)細(xì)胞的藥物偶 聯(lián)，可得到靶向藥物，增加藥物對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的特異性，提高藥物療效，降低藥物毒 性，降低藥物用量，從而避免毒副作用。
篩選核酸適體具體可采用如下方法以完整的疾病細(xì)胞為靶，通過與隨機(jī)的核 酸文庫(kù)結(jié)合，然后分離結(jié)合的核酸序列，再經(jīng)酶放大后重復(fù)結(jié)合的過程，如此循環(huán) 多次后得到多種能與相應(yīng)疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸適體。通常重復(fù)篩選5-20輪，能得 到3-20個(gè)能識(shí)別細(xì)胞表面不同分子核酸適體，更換不同的細(xì)胞種類可得到識(shí)別不 同疾病細(xì)胞的核酸識(shí)別分子。為了抵抗核酸適體受到核酸酶的降解，延長(zhǎng)其在生物 體或生物樣本中的半衰期，在應(yīng)用前可將核酸適體進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和/或修飾，得到 核酸適體的衍生物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要在于可以在預(yù)先不知道目標(biāo)細(xì)胞表面與疾病相關(guān)的分子變 化的情況下篩選和制備特異性的核酸適體分子(或核酸適體衍生物)；可以同時(shí)獲得多種細(xì)胞表面疾病相關(guān)分子的核酸適體(或核酸適體衍生物)；所得到的核酸適 體(或核酸適體衍生物)可以特異性與疾病細(xì)胞強(qiáng)力結(jié)合；核酸適體(或核酸適體 衍生物)可大規(guī)?；瘜W(xué)合成、易于與藥物分子連接，成本低；核酸適體(或核酸適 體衍生物)分子量相對(duì)較小，沒有免疫活性和毒性；核酸適體(或核酸適體衍生物) 穩(wěn)定性好，形成的靶向藥物穩(wěn)定。本發(fā)明的靶向藥物可以特異性結(jié)合靶細(xì)胞，明顯 降低藥物毒副作用、提高治療效果，具有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖1為與疾病相關(guān)核酸適體的篩選過程。 圖2為核酸適體與阿霉素偶聯(lián)示意圖 圖3為經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞活性分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊 說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買得到的。
結(jié)合緩沖液含4. 5g/L葡萄糖、5mM MgCl2、 lmM CaCl2、 2. 67raMKCl、 1. 47raM 磷酸二氫鉀、137. 93mM氯化鈉、8. 06raM磷酸氫二鈉、0. lmg/mL tRNA(Sigma)和lmg/mL 牛血清白蛋白(Fisher); pH 7.4。
實(shí)施例l、核酸適體I和核酸適體II的篩選、優(yōu)化和改造
篩選過程如圖1所示(cell A為靶細(xì)胞，cellB為反篩細(xì)胞，1表示隨機(jī)的DNA 文庫(kù)，2表示洗脫步驟，3表示PCR步驟，4表示富集的文庫(kù)，5表示克隆和測(cè)序， 6表示進(jìn)入下一輪篩選，7表示流式細(xì)胞分析步驟)，具體如下
一、白血病細(xì)胞CCRF-CEM核酸適體的篩選、優(yōu)化和改造 (一)核酸適體的篩選
1、 隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)與合成
設(shè)計(jì)合成兩端包含18個(gè)核苷酸、中間包括52個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸序列文庫(kù)如 下5' -ATA CCA GCT TAT TCA ATT- 52-nt -AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3，。
2、 核酸適體的篩選
將白血病細(xì)胞CCRF-CEM作為靶細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞Ramos作為反篩細(xì)胞。 (1)第一輪篩選
取5-lOnmol步驟l合成的隨機(jī)核酸文庫(kù)，溶于lmL結(jié)合緩沖液中，與lXl(f個(gè)白血病細(xì)胞CCRF-CEM (購(gòu)于ATCC， CCL-119)在冰上孵育30分鐘，離心去除上清液； 洗滌后將細(xì)胞懸浮于300 u L結(jié)合緩沖液中并加熱洗脫結(jié)合于細(xì)胞表面的核酸序列； 離心除去細(xì)胞，將溶液脫鹽，脫鹽后的溶液中的序列經(jīng)PCR放大(引物對(duì)熒光素 標(biāo)記的5， -ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3，;生物素標(biāo)記的5， -AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3，)后用鏈親和素包被的瓊脂糖微球(購(gòu)于GE公司)吸附，經(jīng)O. 15M的氫氧化 鈉溶液洗脫得到單鏈核酸序列文庫(kù)I，用于第二輪的篩選。
(2) 第二輪篩選
取200pmo1單鏈核酸序列文庫(kù)I ，溶于200-300wL結(jié)合緩沖液中，與1X106 個(gè)白血病細(xì)胞CCRF-CEM在冰上孵育30分鐘，離心去除上清液；洗滌后將細(xì)胞懸浮 于300u L結(jié)合緩沖液中并加熱洗脫結(jié)合于細(xì)胞表面的核酸序列；離心除去細(xì)胞后 的溶液中再加入5 X 106個(gè)淋巴瘤細(xì)胞Ramos (購(gòu)于ATCC， CRL-1596)于冰上孵育30分 鐘以除去與細(xì)胞非特異性結(jié)合的序列；離心除去細(xì)胞，將溶液脫鹽，脫鹽后的溶液 中的序列經(jīng)PCR放大(引物對(duì)同步驟(1))后用鏈親和素包被的瓊脂糖微球(購(gòu) 于GE公司)吸附，經(jīng)0. 15M的氫氧化鈉溶液洗脫得到單鏈核酸序列文庫(kù)II 。
(3) 重復(fù)篩選20輪，方法同步驟2，得到特異性結(jié)合于白血病細(xì)胞CCRF-CEM 的核酸文庫(kù)。
3、核酸適體分子的表征
將特異性結(jié)合于白血病細(xì)胞CCRF-CEM的核酸文庫(kù)進(jìn)行克隆和測(cè)序。文庫(kù)中的 各序列分別標(biāo)記熒光分子制成分子探針，分別取0.5、 1、 2、 4、 10、 40、 200、 500nM 的分子探針溶液，與5X10S個(gè)白血病細(xì)胞CCRF-CEM于冰上孵育20分鐘，用結(jié)合緩 沖液洗滌兩遍后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度，如細(xì)胞能結(jié)合熒光標(biāo)記的核 酸適體，則以熒光強(qiáng)度對(duì)探針濃度作圖，用公式Y(jié) = BmaxX / (Kd + X)計(jì)算核酸適 體的平衡解離常數(shù)Kd。
最終選擇的核酸適體序列如下
sgc3: 5' -ATACCAGCTTATTCAATTCCTGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAAT
AAGATGGCGGACTMTGTGTMGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列1。 sgc6: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCCTGTGGGMGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAAC
MGATGGTTGATCCGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列2。sgd3: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGGGGGAGCTTGCGCGCATCAAGGTGCTAAACGAAA GCCTCATGGCTTCTATAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列3。 sgc4: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCMACGCCAGACAGGGGGACAGGA
GATAAGMTAGCGTGATGAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列4。 sgc4a: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCAAACGCCAGACAGGGGGACAGG AGATAGTAAGTGCAATCT-3，；
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列5。 sgc5: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTACCGACGACGAACTATCTATCACTATCTTACACATC ATACCTCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3 ，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列6。 sgc7: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTACCGCAGCGACTATCTCGACTACATTACTAGCTTATA
CTCCGATCATCTCTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列7。 sgc8: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGTCACACTTAGAGTTCTAACTGCTGCGCCGCCGGGA
AAATACTGTACGGTTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列8。 sgal6: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGTCACACTTAGAGTTCTAGCTGCTGCGCCGCCGGG AAAATACTGTACGGATAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列9。 Sgd2: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTGAGTGMGCAAGGATGCAACCTCGGCTCCAACCCGT GAGAGTCGCGAAACTCAGATAGTAAGTGCAATCT-3，; 其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列10。 Sgd5: 5' -ATACCAGCTTATTCAATTATCGTGGGTCACAGCAGCGGTTGTGAGGAAGAMGGC GGATAACAGATMTAAGATAGTAAGTGCAATCT-3，; 其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列，見序列表的序列11。 (二)核酸適體分子的優(yōu)化和改造 步驟一得到的核酸適體較長(zhǎng)，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，設(shè)計(jì)并合成一系列經(jīng)截短的核酸 序列，以流式細(xì)胞儀表征序列的特異性與親和力(方法同步驟(一)的3)，挑選最優(yōu)化的結(jié)合序列用于進(jìn)一步的應(yīng)用，優(yōu)化后的序列的長(zhǎng)度可減少至原序列的三分
之一。核酸適體sgc8經(jīng)優(yōu)化后的序列(sgc8c)(見序列表的序列14)如下5， -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3，；
其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列。
sgc8c是從sgc8中選擇結(jié)合力好的短片段，在其5'末端添加一個(gè)用于標(biāo)記的A (也可為其它任意核苷酸)得到的。
將序列sgc8c的5，端的4個(gè)核苷酸和3，端的3個(gè)核苷酸替換為相應(yīng)的LNA(鎖核酸)單元(&、CuTV、GJ ，將其中序列AAAATACT替換為兩個(gè)六聚乙二醇-1-磷酸連接分子(DNA合成用的單體為Spacer Phosphoramidite 18，18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol, l-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropy1)]-phosphoramidite,10-1918-02， Glen Research) (peg)得修飾的序列AJ工JYAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTA^Au將其命名為核酸適體A。修飾前的序列在血漿中的半衰期為1. 5小時(shí)，修飾后為8小時(shí)。
二、淋巴瘤細(xì)胞Ramos核酸適體的篩選、優(yōu)化和改造
(一) 核酸適體的篩選
1、 隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)與合成
設(shè)計(jì)合成兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括45個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸序列文庫(kù)如下5' - AAG GAG CAG CGT GGA GGA TA - N45 - TTA GGG TGT GTC GTC GTG GT -3'。
2、 核酸適體的篩選
將淋巴瘤細(xì)胞Ramos作為靶細(xì)胞，作白血病細(xì)胞CCRF-CEM為反篩細(xì)胞。其它同步驟一的(一)的2。
3、 核酸適體分子的表征同步驟一的(一)的3。
(二) 核酸適體分子的優(yōu)化和改造同步驟一的(二)。最終得到的優(yōu)化的核酸適體序列如下
TD05: 5' -CAC CGG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3'(見序列表的序列15)。
實(shí)施例2、靶向藥物的制備和應(yīng)用一、 靶向藥物I的制備制備流程如圖2所示。
1、 阿霉素6-馬來(lái)酰亞胺己酰腙的制備
取鹽酸阿霉素(5mg， 8.62 (imol)和EMCH (N-e-(Maleiraidocaproic acid)hydrazide， N-e-馬來(lái)酰亞胺己酰肼)(Pierce Biotechnology) (10mg， 44. 4 pmol)溶于4 mL甲醇，加入3 pL三氟乙酸于室溫避光反應(yīng)24小時(shí)；然后室溫減壓濃縮至0.25 raL，加入2.5 mL乙腈于4 。C放置48小時(shí)重結(jié)晶；以甲醇-乙腈(1:10)混合液洗滌晶體，真空干燥得阿霉素6-馬來(lái)酰亞胺己酰腙(2.9 mg, 3.85 ,ol)。
2、 核酸適體與藥物的偶聯(lián)
取300nmo1 5'端二硫鍵修飾的核酸適體A溶于PBS緩沖液(pH 7. 4)中，在室溫下與TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羰基乙基)磷，20490，Thermo Fisher Scientific Inc.)反應(yīng)2小時(shí)以還原二硫鍵。通過S印hadex G-25柱(織？"-5， Amersham Pharmacia Biotech)除去過量的TCEP后與2 ,1阿霉素6-馬來(lái)酰亞胺己酰腙于50 DMF(富馬酸二甲酯)于冰上反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用高效液相色譜純化(140nmol)，即為靶向藥物I 。靶向藥物I中，核酸適體A與阿霉素的摩爾比為l: l。
二、 耙向藥物II的制備
1、 阿霉素6-馬來(lái)酰亞胺己酰腙的制備同步驟一的1
2、 核酸適體與藥物的偶聯(lián)
取300nmo15，端二硫鍵修飾的TD05序列，溶于PBS緩沖液(pH 7. 4)中，在室溫下與TCEP反應(yīng)2小時(shí)以還原二硫鍵。通過S印hadex G-25柱(NApTM-5， AmershamPharmacia Biotech)除去過量的TCEP后與2 pmol阿霉素6-馬來(lái)酰亞胺己酰腙于50 DMF于冰上反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用高效液相色譜純化(140nmol)，即為靶向藥物II。靶向藥物II中，TD05序列與阿霉素的摩爾比為1: 1。
三、 耙向藥物對(duì)CCRF-CEM的細(xì)胞毒性分析
細(xì)胞毒性分析于96孔板中進(jìn)行，2Xl(T個(gè)白血病細(xì)胞CCRF-CEM/孔。設(shè)置四組處理，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)
處理一加入阿霉素，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 nM;
處理二加入靶向藥物I，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 ^M;處理三加入靶向藥物II，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 ^lM;
處理四加入核酸適體A，每孔中核酸適體A的量分別為O至2.5 jjM。以未處理細(xì)胞作為對(duì)照。孵育兩小時(shí)后以新鮮培養(yǎng)基置換75%的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。于每孔中加入20 )iL CellTiter試劑(Promega， Madison, WI)。孵育2小時(shí)后以酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸收。以含未經(jīng)處理細(xì)胞的孔中的吸收度值為100%，細(xì)胞活性-含不同處理細(xì)胞的孔的吸收度/含未經(jīng)處理細(xì)胞的孔的吸收度X100%。
不同處理后細(xì)胞的活性分析結(jié)果如圖3所示。
靶向藥物II與核酸適體A未見明顯細(xì)胞毒性，說(shuō)明細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)核酸序列后，由于水溶液增大不能自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，因此偶聯(lián)物的非特異性細(xì)胞毒活性大大降低。靶向藥物I的細(xì)胞毒活性與阿霉素相似，說(shuō)明核酸適體具有耙向運(yùn)載藥物的功能，靶向藥物可以通過核酸適體與細(xì)胞結(jié)合后引起的相應(yīng)的內(nèi)化過程運(yùn)載藥物進(jìn)入細(xì)胞。
四、耙向藥物對(duì)Ramos的毒性分析
細(xì)胞毒性分析于96孔板中進(jìn)行，2Xl(T個(gè)淋巴瘤細(xì)胞Ramos/孔。設(shè)置四組處理，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)
處理一加入阿霉素，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 )iM;
處理二加入靶向藥物I，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 JlM;
處理三加入靶向藥物II，每孔中阿霉素的量分別為0至2.5 [lM;
處理四加入核酸適體A，每孔中核酸適體A的量分別為O至2.5 (iM。
以未處理細(xì)胞作為對(duì)照。孵育兩小時(shí)后以新鮮培養(yǎng)基置換75%的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。于每孔中加入20 CellTiter試劑(Promega， Madison， WI)。孵育2小時(shí)后以酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸收。以含未經(jīng)處理細(xì)胞的孔的吸收度值為100%，細(xì)胞活性^含不同處理細(xì)胞的孔的吸收度/含未經(jīng)處理細(xì)胞的孔吸收度X100%。
結(jié)果表明核酸適體A、靶向藥物I均未見明顯細(xì)胞毒性，說(shuō)明細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)核酸序列后，由于水溶液增大不能自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，因此偶聯(lián)物的非特異性細(xì)胞毒活性大大降低。而阿霉素與靶向藥物II有相似的細(xì)胞毒活性，因?yàn)榘蚁蛩幬颕I中的核酸適體可特異性識(shí)別Ramos細(xì)胞，因此導(dǎo)致耙向細(xì)胞毒活性，充分說(shuō)明核酸適體的靶向運(yùn)載功能。
12序列表
〈110〉譚蔚泓
〈120〉核酸適體及其衍生物的新用途
〈130〉 CGGNAY92235
<160> 15
<210> 1
<211> 57
〈212〉 DNA<213〉人工序列
〈220〉
〈223>
<400〉 1
cctgtgggaa ggctatagag gggccagtct atgaata卿tggcggacta atgtgta 57
<210> 2
<211> 52
<212〉 DNA〈213>人工序列
〈220〉
〈223〉〈400> 2
cctgtgggaa ggctatagag gggccagtct atgaacaaga tggttgatcc gt 52
〈210〉 3
〈211〉 52
〈212〉 腿〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉
<400〉 3
agggggagct tgcgcgcatc Eiaggtgctaa acgaaagcct catggcttct at 52
〈210〉 4
<211> 54
<212〉 DNA〈213>人工序列
〈220〉
<223>
〈400〉 4
cgagtgcgga tgcaaacgcc agacaggggg acaggagata agaatagcgt gatg 54
〈210〉 5
〈211〉 35<212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
<223>
<400> 5
cgagtgcgga tgcaaacgcc agacaggggg acagg 35
〈210〉 6
<211> 44
<212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
〈223〉
〈400〉 6
accgacgacg aactatctat cactatctta cacatcatac ctcg 44
〈210〉 7
<211〉 51
<212> DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉
15<400〉 7
accgcagcga ctatctcgac tacattacta gcttatactc cgatcatctc t 51
<210〉 8
〈211〉 52
<212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223〉
〈400〉 8
agtcacactt agagttctaa ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg tt 52
〈210〉 9
<211> 52
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
〈223〉
<400〉 9
agtcacactt agagttctag ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg at 52
〈210〉 10
〈211〉 52<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
〈223〉
<400〉 10
gagtgaagca aggatgcaac ctcggctcca acccgtgaga gtcgcgaaac tc 52
〈210〉 11
<211> 52
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉
<400〉 11
atcgtgggtc acagcagcgg ttgtgaggaa gaaaggcgga taacagat肌ta 52
<210〉 12
<211〉 18
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉
17<400> 12
ataccagctt attcaatt 18
<210> 13
〈211〉 18
<212> 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
<223>
〈400〉 13
agatagtaag tgcaatct 18
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
<220> 〈221〉 <222> <223〉
14 41 DNA
人工序列
misc—feature (1)
n= 3或c或g或
〈400〉 14
ntctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41 <210〉 15<211〉 45
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223>
〈400〉 15
caccgggagg由gttcggt ggctgttcag ggtctcctcc cggtg 4權(quán)利要求
1、核酸適體和/或核酸適體衍生物在制備靶向藥物中的應(yīng)用；所述核酸適體衍生物為如下a)、b)或c)a)將核酸適體的骨架部分或全部改造為硫代磷酸酯骨架或?qū)Σ糠只蛉抗羌苌系奶黔h(huán)進(jìn)行2’-F和2’-NH2修飾等得到的核酸適體衍生物；b)將核酸適體部分或全部改造為肽核酸得到的核酸適體衍生物；c)將核酸適體中的一個(gè)以上核苷酸替換為鎖核酸和/或連接分子得到的核酸適體衍生物；所述連接分子為一個(gè)以上的六聚乙二醇-1-磷酸。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述靶向藥物為治療腫瘤的藥物、 治療感染的藥物或治療炎癥的藥物；所述治療腫瘤的藥物為殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制 腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。
3、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞；所述 核酸適體為含有核心序列的DNA;所述核心序列可為序列表中的序列1、序列2、序列 3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11中任意十個(gè) 以上連續(xù)核苷酸所示的DNA序列。
4、 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸適體如序列表的序列14所 示；所述核酸適體衍生物為將序列表的序列14所示的核酸適體的5'端的4個(gè)核苷酸 和3'端的3個(gè)核苷酸替換為相應(yīng)的鎖核酸單元，將自5'末端第23至30位核苷酸 替換為所述連接分子得到的核酸適體衍生物；所述連接分子為兩個(gè)六聚乙二醇-l-磷 酸。
5、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為淋巴瘤細(xì)胞；所述 核酸適體為含有序列表的序列15的DNA。
6、 一種藥物靶向輸送載體，它的活性成分為核酸適體和/或核酸適體衍生物； 所述核酸適體衍生物為如下a)、 b)或c):a) 將核酸適體的骨架部分或全部改造為硫代磷酸酯骨架或?qū)Σ糠只蛉抗羌苌?的糖環(huán)進(jìn)行2' -F和2' -^12修飾等得到的核酸適體衍生物；b) 將核酸適體部分或全部改造為肽核酸得到的核酸適體衍生物；c) 將核酸適體中的一個(gè)以上核苷酸替換為鎖核酸和/或連接分子得到的核酸適體 衍生物；所述連接分子為一個(gè)以上的六聚乙二醇-1-磷酸。
7、 如權(quán)利要求6所述的藥物靶向輸送載體，其特征在于所述藥物為治療腫瘤 的藥物、治療感染的藥物或治療炎癥的藥物；所述治療腫瘤的藥物為殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。
8、 如權(quán)利要求7所述的藥物靶向輸送載體，其特征在于為如下l)或2):1) 所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞；所述核酸適體衍生物為將序列表的序列14所示 的核酸適體的5'端的4個(gè)核苷酸和3'端的3個(gè)核苷酸替換為相應(yīng)的鎖核酸單元， 將自5 '末端第23至30位核苷酸替換為所述連接分子得到的核酸適體衍生物；所述 連接分子為兩個(gè)六聚乙二醇-l-磷酸；2) 所述腫瘤細(xì)胞為淋巴瘤細(xì)胞；所述核酸適體為含有序列表的序列15的DNA。
9、 一種耙向藥物，是將藥物與權(quán)利要求6至8中任一所述的藥物耙向輸送載體 偶聯(lián)得到的。
10、 核酸適體和/或核酸適體衍生物在藥物靶向輸送中的應(yīng)用； 所述核酸適體衍生物為如下a)、 b)或c):a) 將核酸適體的骨架部分或全部改造為硫代磷酸酯骨架或?qū)Σ糠只蛉抗羌苌?的糖環(huán)進(jìn)行2' -F和2' ^^修飾等得到的核酸適體衍生物；b) 將核酸適體部分或全部改造為肽核酸得到的核酸適體衍生物；c) 將核酸適體中的一個(gè)以上核苷酸替換為鎖核酸和/或連接分子得到的核酸適體 衍生物；所述連接分子為一個(gè)以上的六聚乙二醇-l-磷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸適體及其衍生物的新用途。本發(fā)明提供的新用途是核酸適體及其衍生物在制備靶向藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)將藥物與核酸適體或其衍生物偶聯(lián)得到的靶向藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可在不知道目標(biāo)細(xì)胞表面與疾病相關(guān)的分子變化的情況下篩選和制備特異性的核酸適體或其衍生物；可同時(shí)獲得多種細(xì)胞表面疾病相關(guān)分子的核酸適體或其衍生物；所得到的核酸適體或其衍生物特異性與疾病細(xì)胞強(qiáng)力結(jié)合；核酸適體或其衍生物可大規(guī)?；瘜W(xué)合成、易于與藥物分子連接，成本低；核酸適體或核酸適體衍生物分子量相對(duì)較小，沒有免疫活性和毒性；核酸適體或其衍生物穩(wěn)定性好，形成的靶向藥物穩(wěn)定。本發(fā)明的具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101537189SQ200910083080
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者上官棣華, 譚蔚泓 申請(qǐng)人:譚蔚泓