專利名稱：用于治療過敏性疾病的石斛屬多糖提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于以自石斛屬(Dendrobium)單離的多糖治療過敏性疾病。
背景技術(shù)：
石斛屬隸屬熱帶蘭花屬，廣泛分布于亞洲、歐洲及澳大利亞。其中的某些品種在 用于提升膚質(zhì)及視力的中國(guó)傳統(tǒng)藥物中已具有長(zhǎng)期的歷史。也有報(bào)導(dǎo)說(shuō)石斛屬展現(xiàn)抗氧 化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。見 Satoh 等，Biochem. Pharmacol. 51 :339-343,1996 ；Yamaguchi 等，Cordyceps sinensis.Phytoher. Res. 14 :647-649,2000 ；Zhao 等，J.Biochem. Molecular Bio. 40(5) :670-677,2007 ；以及 US 20060251739。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于如下非預(yù)期的發(fā)現(xiàn)自石斛(Dendrobii Herba)(即石斛屬莖)制備的 多糖對(duì)于治療過敏性疾病如哮喘、花粉過敏及特應(yīng)性皮炎有效。據(jù)此，本發(fā)明提供一種向?qū)ο笸队?如經(jīng)口投予)有效量的自石斛制備的多糖來(lái) 治療過敏性疾病(如哮喘、花粉過敏、過敏性結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎(atopic determitis)) 的方法。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指向具有過敏性疾病、過敏性疾病癥狀、或過敏性疾 病傾向的對(duì)象施用或投予包括一種或多種活性劑的組合物，達(dá)到治愈0、醫(yī)治、緩解、減輕、 改變、矯正、改善、改進(jìn)或影響所述疾病、所述疾病的癥狀或所述疾病傾向的目的。本文中所 使用的“有效量”是指每種活性劑(單獨(dú)或與其他一種或多種活性劑組合)能賦予所述對(duì) 象治療效果所需的量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知者，有效量會(huì)根據(jù)投予途徑、賦形劑的使用及 與其他活性劑的共同使用而變化。在一個(gè)實(shí)例中，通過包括至少下述5個(gè)步驟的方法來(lái)制備用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的 多糖(i)將第一石斛制備物浸泡于第一醇(如甲醇、乙醇或其混合物)中；(ii)移除所述 第一醇以產(chǎn)生第二石斛制備物；(iii)用水(即純水或適當(dāng)?shù)暮軇?提取所述第二石 斛制備物以獲得水溶液；(iv)將所述水溶液與第二醇(如50體積％乙醇)混合，以使多糖 沉淀；以及(ν)收集所沉淀的多糖。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過向有需要的對(duì)象投予有效量的上述多糖，減少由炎癥導(dǎo)致 的氣道重塑的方法。將本文中揭示的多糖用以治療過敏性疾病或減少炎癥誘發(fā)的氣道重塑，或者，用 以制造用于這些治療的藥物的用途，也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。在下述說(shuō)明書中詳細(xì)敘述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施例。從說(shuō)明書及權(quán)利要求 書中可明顯獲知本發(fā)明的其他特征、目的及優(yōu)勢(shì)。


圖1是圖示實(shí)施例2中石斛對(duì)于小鼠的AHR測(cè)試效果，以pench相對(duì)水平(penchrelative level,Penh)來(lái)記錄，以Buxco XA系統(tǒng)作分析。陰性組(n = 6，□)為健康小鼠。 控制組(η=10，Θ)為以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理。以O(shè)VA致敏的處理組的喂食劑量為 10毫克(mg)/千克(kg)/天(n=8, Sl)、30mg/kg/天(η=8,逐)及90mg/kg/天(η=8, _)。 以pench記錄，以Buxco XA系統(tǒng)作分析*表示P < 0. 05。圖2是圖示實(shí)施例2中小鼠的BALF中計(jì)算出的總細(xì)胞數(shù)目。陰性組(n = 6，□) 為健康小鼠?？刂平M(η=10, Θ)為以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理。以O(shè)VA致敏的處理組 的喂食劑量為 10mg/kg/天(η=8,協(xié))、30mg/kg/天(η=8, 及 90mg/kg/天(η=8，國(guó))。 * 表示 P < 0. 05。圖3是圖示實(shí)施例2中小鼠的BALF中的白細(xì)胞百分比。圖3Α至圖3C分別表示 BALF中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的百分比結(jié)果。陰性組(n = 6，□)為健康小 鼠?？刂平M(η=10,國(guó))為以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理。對(duì)以O(shè)VA致敏的處理組的喂食
劑量為 10mg/kg/天(n=8, )、30mg/kg/天(η=8,逐)及 90mg/kg/天(η=8, _)。* 表示 P < 0. 05。圖4是圖示實(shí)施例2中小鼠肺切片的蘇木精素(Haematoxylin)及曙紅(Eosin) (服幻染色。自小鼠取出肺組織，隨后用10%福爾馬林固定。3天后，將肺埋入石蠟中并切 成5 □ m厚的切片。圖4A至圖4E分別表示實(shí)施例2中的5組正常組(作為陰性控制的 健康小鼠)、控制組(以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理的小鼠)、喂食劑量分別為10mg/kg/天 (n = 8)、30mg/kg/天(η = 8)和90mg/kg/天(η = 8)的以O(shè)VA致敏的處理組。放大倍數(shù) 為 IOOX。圖5是圖示實(shí)施例2中小鼠的腸固有層淋巴細(xì)胞中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比。 通過流式細(xì)胞儀分析⑶4+⑶25+細(xì)胞的比例。陰性組(n = 6，□)是健康小鼠?？刂平M (η= 10, Ξ)為以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理。以O(shè)VA致敏的處理組的喂食劑量為IOmg/ kg/天(n=8, )、30mg/kg/天(η=8,鬆)及 90mg/kg/天(η=8,國(guó))。* 表示 P < 0. 05。圖6是圖示實(shí)施例2中石斛對(duì)于小鼠的OVA特異性IgE水平的效果。圖6Α表示 血清水平的結(jié)果，而圖6Β表示BALF水平的結(jié)果。陰性組(n = 6，□)是健康小鼠?？刂?組(η=10,國(guó))為以O(shè)VA致敏但不進(jìn)行石斛處理。以O(shè)VA致敏的處理組的喂食劑量為IOmg/
kg/天(n=8, 30mg/kg/隠)及 90mg/kg/天(n=8, ■)。# 表示 P < 0. 01。圖7是圖示實(shí)施例2中小鼠整個(gè)肺組織的RT-PCR結(jié)果。圖7A至圖7E分別表示 IL-13、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1 (eotaxin-1)、3_ 加雙氧酶(3-dioxygenase) (IDO)、IL_17 和胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)的基因表達(dá)水平結(jié)果。全部的mRNA表達(dá)水平以β-肌動(dòng)蛋 白mRNA基準(zhǔn)化。陰性組(η = 6，□)是健康小鼠。控制組(η=10,國(guó))為以O(shè)VA致敏但不 進(jìn)行石斛處理。以O(shè)VA致敏的處理組的喂食劑量為10mg/kg/天(n=8, B2)、30mg/kg/天 (n=8,怒)及 90mg/kg/天(n=8,國(guó))。* 表示 P < 0· O5。圖8A是顯示未經(jīng)致敏的正常小鼠在刺激M小時(shí)后的發(fā)炎眼睛的照片。圖8B是顯示經(jīng)主動(dòng)免疫化(active immunize)但未經(jīng)多糖處理的控制小鼠在刺激M小時(shí)后的發(fā)炎眼睛的照片。圖8C是顯示以30mg/kg/天經(jīng)口投予自石斛提取的多糖的經(jīng)主動(dòng)免疫化的小鼠的 發(fā)炎眼睛的照片。圖8D是顯示以90mg/kg/天經(jīng)口投予自石斛提取的多糖的經(jīng)主動(dòng)免疫化的小鼠的 發(fā)炎眼睛的照片。圖9是圖示每組小鼠的眼淚產(chǎn)生，是通過測(cè)量濾紙記錄紙上顏色變化的長(zhǎng)度(毫 米(mm))而得。#表示P < 0.01。圖IOA是顯示正常小鼠中嗜酸性粒細(xì)胞浸滲入結(jié)膜的照片。圖IOB是顯示經(jīng)主動(dòng)免疫化但未經(jīng)多糖處理的控制小鼠中嗜酸性粒細(xì)胞浸滲入 結(jié)膜的照片。圖IOC是顯示以30mg/kg/天經(jīng)口投予自石斛提取的多糖的經(jīng)主動(dòng)免疫化小鼠中 嗜酸性粒細(xì)胞浸滲入結(jié)膜的照片。圖IOD是顯示以30mg/kg/天經(jīng)口投予自石斛提取的多糖的經(jīng)主動(dòng)免疫化小鼠中 嗜酸性粒細(xì)胞浸滲入結(jié)膜的照片。圖IOE顯示浸滲入結(jié)膜的嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)圖。*表示P < 0. 05 (與控制組相 比較)。圖11是圖示通過ELISA在第0、對(duì)和40天測(cè)量的血清中豚草花粉(Rawgeed pollen)特異性IgE的水平。正常組(口 )是健康小鼠?？刂平M為經(jīng)豚草花粉致敏但 未經(jīng)石斛處理。以豚草花粉致敏的處理組的喂食劑量為30mg/kg/天(路)和90mg/kg/天 (目表示 P < 0. 05，# 表示 P < 0.01。圖12A是圖示通過流式細(xì)胞儀分析的脾細(xì)胞中⑶4+⑶25+T細(xì)胞的數(shù)目。*表示P
<0. 05。圖12B是圖示通過流式細(xì)胞儀分析的血清中⑶4+⑶25+T細(xì)胞的數(shù)目。*表示P
<0. 05。圖13是圖示耳朵的厚度。正常組(口 )是健康小鼠。控制組(Θ)為經(jīng)奧扎佐 隆(ozazolone)致敏但未經(jīng)石斛處理。以1 %奧扎佐隆致敏的處理組的喂食劑量為IOmg/ kg/ 天(83)、30mg/kg/ 天(怒)和 90mg/kg/ 天(_)。表示 P < 0. 001。
具體實(shí)施例方式本文揭示石斛多糖用于治療過敏性疾病的用途?！岸嗵恰笔歉髯杂赏ㄟ^糖苷鍵結(jié)合 的一些單糖所組成的聚合物。一個(gè)多糖分子包括超過10個(gè)各種類型的單糖，如葡萄糖、果 糖、半乳糖、木糖或核糖。其可具有直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^任意傳統(tǒng)方法自石斛制備用以實(shí)施本發(fā)明的多糖。下述為一實(shí)例。收集石 斛植物(如美花石斛(Dendrobium loddigesii)、馬鞭石斛(Dendrobium fimbriatum var. oculatum)、束花石角斗(Dendrobium chrysanthum)、鐵皮石角斗(Dendrobium candidum ex Lindl)或金釵石斛(Dendrobium nobil))的莖，干燥，在醇(如甲醇、乙醇或其混合物)中 浸泡適當(dāng)時(shí)間(如1至12小時(shí))。通過諸如蒸發(fā)而移除醇之后，將所得石斛屬莖在純水或適當(dāng)?shù)暮軇┲薪葑銐虻臅r(shí)間(如12至16小時(shí))。所述含水溶劑可以是鹽(如NaCl 或KCl)的水溶液，或含有>70體積％ (如80體積％、90體積％或95體積％)的水及< 30 體積％的可與水混溶的溶劑(如甲醇或乙醇)的混合物。通過離心或過濾移除不溶物質(zhì)， 得到可溶部分。隨后將這一部分與醇(如30%至70%乙醇)混合以沉淀多糖。任選地，可 在與醇混合之前，令所述可溶于水的部分在溫水中稀釋，并在50°C至70°C保持20至60分 鐘。通過諸如離心來(lái)收集所沉淀物，并優(yōu)選地進(jìn)行干燥，以獲得用于本發(fā)明方法的多糖?？蓪⑸鲜鍪嗵桥c醫(yī)藥可接受的載劑混合，以及任選地可與其它治療活性劑混 合，形成醫(yī)藥組合物。醫(yī)藥組合物中的載劑必須是“可接受的”，這是表示它可與組合物中的 活性成分相容(且優(yōu)選地為能穩(wěn)定化該活性成分)，并且不危害治療對(duì)象?？墒褂靡环N或多 種增溶劑作為醫(yī)藥賦形劑，以輸送含有多糖的醫(yī)藥組合物。其它載劑的實(shí)例包括糊精、氧化 硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉、藥品與化妝品用黃色10號(hào)(D&C Yellow #10)、微晶 纖維素、甘露醇、葡萄糖、脫脂奶粉、聚乙烯基吡咯烷酮及淀粉，或其組合。這種醫(yī)藥組合物 可隨后以多種形式如片劑、膠囊、粉末、凝膠或液體形式存在。通過適當(dāng)?shù)耐緩饺缃?jīng)口投予、每天一次或多次或每隔幾天投予一次而向?qū)ο笸?予醫(yī)藥組合物。用于經(jīng)口投予的固體調(diào)配物可含有適當(dāng)?shù)妮d劑或賦形劑，如玉米淀粉、明 膠、乳糖、阿拉伯樹膠、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸二鈣、碳酸鈣、氯化鈉或藻 酸?？墒褂玫谋澜鈩┌?，但不限于，微乙醇酸鹽(microglycolate)及藻酸。可使用的 片劑粘合劑包括阿拉伯樹膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯基吡咯烷酮(聚維酮 3(P0vid0ne;3))、羥丙基甲基纖維素、蔗糖、淀粉及乙基纖維素?？墒褂玫臐?rùn)滑劑包括硬脂酸 鎂、硬脂酸、硅樹脂液、滑石、蠟、油和膠體氧化硅。這種固體調(diào)配物可經(jīng)設(shè)計(jì)以使組合物在場(chǎng)中釋放。例如，將組合物包在固體次單 元或膠囊分隔室中，固體次單元或膠囊分隔室分別具有含腸溶性聚合物(在小腸或大腸的 PH下溶解或分散以在腸中釋放藥物物質(zhì))的基質(zhì)或壁或密閉體。另一實(shí)例中，將上述多糖與一種或多種食用載劑混合以形成食物產(chǎn)品(如酸奶、 牛奶或豆奶)，或食物供給品(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)或草藥產(chǎn)物)。食用載劑的實(shí)例包括淀粉、 環(huán)糊精、麥芽糊精、甲基纖維素、羰甲氧基纖維素(carbonmethoxy cellulose)、黃原膠及其 水溶液?？赏ㄟ^食品工業(yè)中廣為人知的方法制備這些食物產(chǎn)品。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“食物” 是廣范的指用于對(duì)人類及動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)、用于維持正?；蚣铀偕L(zhǎng)或用于保持精力或機(jī)敏 性的任意種類的液體及固體/半固體材料。本文所揭示的多糖可用于治療過敏性疾病，如與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、趨化因子及/ 或Th2細(xì)胞因子的水平的增加有關(guān)的過敏性疾病。廣為人知的是過敏原觸發(fā)一連串免疫響 應(yīng)，包括T細(xì)胞分化為Th2效應(yīng)細(xì)胞(effector cell) ；Th2細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6 及IL-U)的釋放，IgE的產(chǎn)生；以及中性白細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞的活化。由過敏 原觸發(fā)的免疫響應(yīng)導(dǎo)致各種過敏性疾病，如哮喘、花粉過敏、過敏性結(jié)膜炎及特應(yīng)性皮炎。哮喘是涉及呼吸系統(tǒng)的慢性病。人類哮喘的主要特征是氣道發(fā)炎、高粘性粘液分 泌過多和支氣管收縮。這種氣道變窄造成如喘鳴、呼吸短促、胸悶和咳嗽的癥狀。這些特 征可通過下列事件觸發(fā)如暴露于環(huán)境刺激物(或過敏原)、冷空氣、暖空氣、濕空氣或情緒 壓力中。此外，過敏性致敏也通過對(duì)抗環(huán)境抗原的IgE的產(chǎn)生、將淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞 吸引至肺及血清中、和誘發(fā)Th2細(xì)胞因子或趨化因子的產(chǎn)生而定義。最近，發(fā)達(dá)世界中公
6眾的注意力聚焦在哮喘上，蓋因其患病率迅速增加，影響了高達(dá)四分之一的城市兒童。參見 Craig M. Lilly ￠: ((Journal of Allergy and Clinical Immunology〉〉第 115 卷，第 4 期， 2005年4月增刊1第S526頁(yè)至第S531頁(yè)。與哮喘相同，過敏性結(jié)膜炎和特應(yīng)性皮炎兩者是由對(duì)過敏原如花粉的過度敏感造 成的；然而，發(fā)炎區(qū)域及癥狀則有所不同。類似地，這些過敏性疾病也與Th2細(xì)胞因子或趨 化因子的過量，以及發(fā)炎區(qū)域中IgE水平與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目的比例有關(guān)。結(jié)膜是覆蓋眼睛的薄膜。當(dāng)過敏原刺激結(jié)膜時(shí)，在眼睛內(nèi)出現(xiàn)的一般癥狀包括眼 癢、眼皮浮腫、流淚、畏光、水性排出物和異物感。所述過敏原將觸發(fā)前述的典型過敏歷程。 研究顯示患者于某些活動(dòng)上受限，如室外活動(dòng)、閱讀、睡眠及駕駛。因此，治療患有過敏性結(jié) 膜炎的患者能提升他們每天的生活質(zhì)量。特異反應(yīng)性(atopy)或特應(yīng)性癥狀是影響不直接接觸過敏原的身體部分的過 敏性過度敏感。其可涉及濕疹(特應(yīng)性皮炎)、過敏性結(jié)膜炎、過敏性鼻炎和哮喘。存在 強(qiáng)烈的遺傳部分。對(duì)于經(jīng)歷嚴(yán)重過敏反應(yīng)如通過對(duì)食物或環(huán)境的反應(yīng)引起的過敏反應(yīng) (anaphylaxis)的人群，特應(yīng)性癥狀可能是致命的。盡管特異反應(yīng)性具有多種定義，其最一 致的定義是患者血清中呈現(xiàn)總IgE水平和過敏原特異性IgE水平的提高，導(dǎo)致對(duì)一般過敏 原的皮試測(cè)試(skin-prick)呈陽(yáng)性。自20世紀(jì)以來(lái)，多種粘膜炎病癥急劇地變得更加常 見；特異反應(yīng)性是此類疾病的經(jīng)典實(shí)例?，F(xiàn)在，在工業(yè)國(guó)家中，它影響10%至20%的兒童和 1 %至3%的成人，而且其患病率在過去30年中已經(jīng)增長(zhǎng)了超過一倍。本文所揭示的石斛多糖也可通過諸如經(jīng)口投予而用于增加腸固有層部位中調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞的群落量。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)性T細(xì)胞”指T細(xì)胞的特異化次群落，其作 用為抑制免疫系統(tǒng)的活化并因而保持免疫系統(tǒng)的恒定和對(duì)自身抗原的容忍度。有時(shí)，它也 被稱為抑制性τ細(xì)胞。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以多種形態(tài)出現(xiàn)，包括那些表達(dá)⑶8跨膜糖蛋白(⑶8+T 細(xì)胞)的，那些表達(dá)CD4、CD25和R)xp3 (CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或“Tregs”)的和其它具 有抑制功能的T細(xì)胞類型。在一具體實(shí)施例中，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞指表達(dá)CD4和CD25的群 落。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“腸固有層”指位于上皮細(xì)胞下方并且和上皮細(xì)胞一起構(gòu)成 粘膜的疏松連接組織薄層。這一區(qū)域中，有多種免疫細(xì)胞留在這里，例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞或肥大細(xì)胞等。另一實(shí)例中，也可向?qū)ο笸队瓒嗵且詼p少所述對(duì)象血清和BALF中的IgE水平。IgE 在過敏的發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。與其它免疫球蛋白相似，IgE是B-淋巴細(xì)胞暴露于來(lái) 自環(huán)境中的異質(zhì)抗原后產(chǎn)生的。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)鍵合至細(xì)胞表面的IgE分子同時(shí)鏈接至其特 異性過敏原時(shí)，細(xì)胞將立即釋放預(yù)先形成的包括組胺的炎性細(xì)胞因子，其誘發(fā)即時(shí)影響或 早期過敏。這些細(xì)胞因子將嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和更多嗜堿性粒細(xì)胞吸引至所述區(qū)域。 這些新合成的物質(zhì)和它們吸引的細(xì)胞在過敏響應(yīng)的晚期起關(guān)鍵作用。IgE、過敏與哮喘間的 密切關(guān)聯(lián)早已經(jīng)被認(rèn)知(Platts-Mills TAE，Am J Respir Crit Care Med, 164 :S 1-S5， 2001 ；MiIgrom H 等，N Eng J Med.，341 1966-73，1999)。一具體實(shí)施例中，以自石斛中提 取的多糖喂食的小鼠血清和BALF中具有較低的IgE水平。這些小鼠也具有更少的嗜酸性 粒細(xì)胞和細(xì)胞因子或吸引免疫細(xì)胞且刺激氣道上皮細(xì)胞的趨化因子。因此，自石斛中提取 的多糖能治療哮喘。
在又一實(shí)施例中，通過向?qū)ο蠼?jīng)口投予自石斛中提取的多糖，將所述多糖用于減 少炎癥導(dǎo)致的氣道重塑。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“氣道重塑”指與慢性氣道炎癥同時(shí)出現(xiàn)或由慢性氣道炎癥 造成的結(jié)構(gòu)改變。氣道重塑造成氣道上皮細(xì)胞、固有層和粘膜下層中的改變，導(dǎo)致氣道壁變 厚。哮喘中氣道重塑的后果包括不完全可逆的氣道變窄、支氣管高反應(yīng)性、氣道水腫和粘液 過度分泌。不進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于上述說(shuō)明以最全面的程度 使用本發(fā)明。因此，下述特定的具體實(shí)施例僅為例示性說(shuō)明用，而非意圖以任意方式限制公 開內(nèi)容的其它部分。本文所引用的全部出版物并入本文作為參考。實(shí)施例1自石斛制備多糖將2千克新鮮石斛干燥以形成干燥材料，隨后用20升(L)甲醇浸漬、處理以獲得 經(jīng)處理的植物。以去甲醇方法處理經(jīng)處理的植物，隨后在水中浸漬過夜(overnight)，以獲 得過夜水溶液。用24L溫度范圍為60°C的溫水提取所述過夜水溶液30分鐘，隨后通過離心 機(jī)(ER-RC 13 C-124，HITACH)以5，000轉(zhuǎn)/分(rpm)在10°C離心。離心之后，通過6微米 (μπι)濾紙以過濾上清液。用50% (w/v)乙醇沉淀濾液以獲得多糖。實(shí)施例2自石斛提取的多糖對(duì)哮喘的效果建立哮喘的動(dòng)物模型將BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為正常組(n = 6，作為陰性控制的健康小鼠)、控制組 (n = 10，以O(shè)VA致敏但未經(jīng)自石斛提取的多糖處理的小鼠)，喂食劑量分別為10mg/kg/天 (n = 8)、30mg/kg/天(η = 8)及90mg/kg/天(η = 8)的以O(shè)VA致敏的處理組。除了正 常組之外，在第1天和第14天分別以腹腔注射使用含有20及50微克(yg)/毫升(mL) OVA (Sigma, USA)及作為助劑的2mg及5mgAl (OH) 3的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)令全部小鼠免疫 化(immunize)。每次免疫化中，對(duì)陰性控制小鼠進(jìn)行IXPBS的腹腔注射。在第觀天、第四 天和第30天，通過超聲噴霧器(Buxco)令全部小鼠于含OVA的PBS中暴露20分鐘。在 第31天，以各種濃度的乙酰甲膽堿(methacholine)對(duì)全部小鼠進(jìn)行AHR(氣道高反應(yīng)性) 測(cè)試，并在次日犧牲小鼠(所述方法參見Charles Perkins等，J. Allergy Clin. Immunol.， 118(2)410-419)。在AHR測(cè)試后的第0天和第21天，從眼眶后靜脈叢(retro-orbital venous plexus)收集小鼠的血液。對(duì)血液樣品進(jìn)行OVA特異性抗體測(cè)試。對(duì)乙酰甲膽堿的氣道高反應(yīng)性測(cè)定將小鼠無(wú)拘束地置于圓筒形樹脂玻璃體積描記器腔(cylindrical plexiglass ρlethysmograph chamber)內(nèi)，所述體積描記器腔連接至Buxco霧化控制氣溶膠輸送系統(tǒng) 和Buxco Max II儀器，用于分析壓力型體積描記(Buxco Electronics，Sharon，Conn)。進(jìn) 行為時(shí)5分鐘的增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause) (Penh)的基線測(cè)量。Penh指氣流阻塞的 無(wú)單位測(cè)量(unit-less measure)其反應(yīng)與吸氣與呼氣之間即時(shí)量化差異及程度有關(guān)的肺 功能變化。具體地，Penh被認(rèn)為是反應(yīng)所測(cè)量的盒壓力信號(hào)(box pressure signal)波形 變化(支氣管收縮的結(jié)果)的參數(shù)，也是氣道阻塞的指數(shù)?？赏ㄟ^Penh水平來(lái)評(píng)估哮喘的 嚴(yán)重性(Zhang 等，J. Allergy Clin. Immunol.，F(xiàn)eb ；113(2) :320-6,2007)
隨后以吸入氣溶膠化的含β -乙酰甲膽堿的PBS (由霧化器(Buxco Electronics, Sharon, Conn)產(chǎn)生)的手段刺激小鼠3分鐘，起始的乙酰甲膽堿濃度為6. 25mg/mL。完全 暴露于氣溶膠化的乙酰甲膽堿3分鐘后，開始Penh測(cè)量，計(jì)算3分鐘期間的平均Penh值。 接著，連續(xù)地重復(fù)所述過程并將乙酰甲膽堿的濃度改變?yōu)?2. 5mg/mL和25mg/mL。將所記錄 的全部數(shù)據(jù)以基線測(cè)量基準(zhǔn)化，圖1中顯示每組的結(jié)果。AHR是導(dǎo)致氣道阻塞及哮喘的主要癥狀(如呼吸短促、胸悶、咳嗽和講話困難)的 主要成因。據(jù)此，抑制AHR可緩和哮喘的嚴(yán)重性。如圖1所示，與控制組相比，全部三個(gè)處 理組響應(yīng)氣溶膠化的25mg/mL乙酰甲膽堿，而展現(xiàn)顯著降低的Penh。這表明，自石斛提取的 多糖能抑制AHR，因此能治療哮喘。支氣管肺泡灌洗液(BALF)分析“支氣管肺泡灌洗液”是通過沖洗肺的肺泡區(qū)所獲得的液體。用以測(cè)定肺間質(zhì)組織 中的生物化學(xué)變化和炎性變化，從而核定本發(fā)明方法的功效。進(jìn)行頸脫位之后，暴露氣管并用聚乙烯導(dǎo)管培養(yǎng)。通過用ImL PBS通過灌洗所 述氣管以收集來(lái)自小鼠的BALF。將沖洗液離心之后，用上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，從離心沉 淀物獲得總細(xì)胞計(jì)數(shù)。制備Cytospin載玻片并通過劉氏染色法(Liu' s staining)將 其染色(Giemsa 染色法的改良(Sevens, M L. Fundamentals of clinical hematology., W.B.Saunders company,1997)。首先以30秒添加0. 5mL劉氏A溶液(制備方法將0. 18g Eosin Y和0. 05g亞甲 基藍(lán)溶解于IOOmL甲醇中，再用3號(hào)濾紙過濾所得溶液)將來(lái)自小鼠BALF的細(xì)胞染色。之 后，立即加入ImL劉氏B溶液(制備方法將0. 12g亞甲基藍(lán)、0. 14g天青B、2. 52g Na2HPO4 和1. 26g KH2HPO4溶解于IOOmL H2O中，之后用3號(hào)濾紙過濾所得溶液)與劉氏A染色溶液 混合。反應(yīng)60秒后，用水洗滌所述載玻片以清除染色溶液?？諝飧稍锼鲚d玻片，隨后在 光學(xué)相位顯微鏡下檢查，計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞之后獲得其差異。結(jié)果示于圖2和圖3。如圖2所示，與控制組相比，在90mg/kg/天的組中的總細(xì)胞數(shù)顯著降低。此外，圖 3顯示每種細(xì)胞類型(嗜酸性粒細(xì)胞、中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的百分比。與控 制組相比，以90mg/kg/天經(jīng)口給予石斛多糖的組中，嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比顯 著減少。不受理論所限，自石斛獲得的多糖額通過下述機(jī)制有效地治療哮喘。已有報(bào)導(dǎo) 指出，嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。見Walsh GM.，Curr Opin Hematol., 8(1) :28-33,2001 ；和 Menzies-Gow A 等，J Asthma.，38 (8) :605-13, 2001 如上所述，石斛 屬多糖減少BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目，從而緩解哮喘癥狀。自石斛提取的多糖對(duì)肺中嗜酸性粒細(xì)胞增多癥和氣道重塑的效果獲得BALF后，在10%中性緩沖福爾馬林中將肺組織固定M小時(shí)。將肺組織埋入 石蠟中，隨后切為5μπι厚的切片。用Η&Ε溶液(蘇木精素，Sigma MHS-16 ；和曙紅，sigma HTl 10-1-32將所述切片染色。拍攝結(jié)果照片并在圖4中顯示。哮喘的特征是氣道粘膜中炎癥的特異性模式，且涉及嗜酸性粒細(xì)胞的浸滲、TH2細(xì) 胞相對(duì)于ThI細(xì)胞的數(shù)目增加。此外，氣道具有特征性結(jié)構(gòu)變化，稱為重塑，某些重塑甚至 領(lǐng)先疾病的發(fā)展。見于哮喘患者體內(nèi)的這些結(jié)構(gòu)變化可包括氣道壁網(wǎng)狀基底膜變厚、非正 常彈性纖維網(wǎng)的形成、氣道軟骨結(jié)構(gòu)的改變、血管生成和氣道平滑肌質(zhì)量的增加。
本發(fā)明中，控制組明顯顯示氣道上皮細(xì)胞基底的變厚以及支氣管的狹窄。隨著石 斛多糖處理劑量的增加，氣道重塑的特征減少且支氣管的直徑變回正常。結(jié)合圖2中的結(jié) 果，本發(fā)明的特征是，降低嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目以及解除氣道重塑癥狀的方 法。自石斛提取的多糖的經(jīng)口處理能增加腸固有層中Treg的百分比通過頸脫位殺死小鼠。立即取出小腸，并在HBSS (具有HEPES，無(wú)Ca2+和Mg2+)中沖 洗。小心地剖開派伊爾淋巴結(jié)(Peyer' s patchs)并切成片段。令所述片段在ImM二硫蘇糖 醇溶液(DTT,Amresco,USA)和ImM乙二胺四乙酸(EDTA, Sigma,USA)中在37°C震蕩1小時(shí)， 以移除上皮細(xì)胞。如此培養(yǎng)后，將所述片段粉碎成Imm碎片，在含有30單位(imit)/mL I型 膠原酶(Sigma，USA)和 10unit/mL II 型膠原酶(Sigma，USA)的 RPMI 1640 (Gaithersburg, USA)以及10%胎牛血清中在37°C分解1小時(shí)。令分解后的組織通過尼龍篩(Small Parts, USA)，以獲得細(xì)胞。徹底洗滌后，通過在珀可(Percoll)上離心獲得單核細(xì)胞。將所述單核細(xì)胞調(diào)節(jié)為1 X IO6細(xì)胞/mL，加入試管中，使用FITC標(biāo)記的⑶4抗體 (BD Biosciences, USA)和 PE 標(biāo)記的 CD25 抗體(BD Biosciences, USA)在 4°C及黑暗中培 養(yǎng) 30 分鐘。樣品用冷 PBS 洗滌兩次，以使用 FAC^can (Becton Dickinson Bioscience, USA) 的雙色細(xì)胞儀來(lái)分析。⑶4+⑶25+細(xì)胞數(shù)目除以⑶4+細(xì)胞數(shù)目就是Treg的百分比。結(jié)果 在圖5中顯示。以90mg/kg/天喂食石斛多糖的小鼠的腸固有層中具有較多的Treg。自石斛中提取的多糖對(duì)以O(shè)VA致敏小鼠的血清及BALF中的OVA特異性IgE水平 的效果使用在第1天、第14天和犧牲前一天收集的血清和BALF，通過ELISA檢測(cè)OVA特 異性IgE。根據(jù)廠商說(shuō)明書實(shí)施所述分析。血清樣品的重復(fù)測(cè)定是稀釋至1 50，而BALF 則不稀釋。這里所使用的抗體是從Southern BioTech(USA)獲得的AP標(biāo)記的羊-抗-鼠 IgE。如圖6所示，90mg/kg/天石斛多糖組的血清IgE顯著降低。而且，同組中BALF的IgE 水平也存在下降趨勢(shì)?，F(xiàn)在，很多研究者已經(jīng)指出，IgE是立即過敏反應(yīng)中的關(guān)鍵分子，蓋因其可在過 敏原與中性白細(xì)胞問形成橋梁并觸發(fā)細(xì)胞脫粒(cellular degranulation)，同時(shí)釋放無(wú) 數(shù)預(yù)先形成的介質(zhì)和細(xì)胞因子(Holgate S 等，J. Allergy Clin. Immunol.，115 :459-465, 2005 ；Cooper PJ, Parasite Immunol. 26 :455-467,2004 ；Milgrom H 等，見前所述)。因 此，IgE合成的中和或抑制對(duì)于過敏性疾病的治療是合理的選擇(Sarinho E和Cruz AA, J Pediatr(Rio J),82(5 Suppl) :S 127-32,2006 ；Wagelie-Steffen AL 等，Clin Chest Med. ,27 :133-147,2006 ；Clark J 等，J Asthma, 43 :87-93,2006) 本發(fā)明中，90mg/kg/天 的石斛多糖能降低患哮喘小鼠血清和肺中的IgE水平。從這些數(shù)據(jù)來(lái)看，石斛多糖具有治 療過敏性疾病或哮喘的很大潛力。自石斛提取的多糖對(duì)以O(shè)VA致敏小鼠的肺組織中的基因表達(dá)的效果切除組織并將其切成片。隨后根據(jù)廠商說(shuō)明書以rareRNA總RNA分離試劑(Gsharp Corporation,臺(tái)灣)分離出總RNA。使用5 μ g RNA和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，USA)在40 微升(PL)總體積中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。所得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一部分(IyL)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。表1列出了用于IL-13、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1、ID0、IL-17和TSLP的引物 (primer)序列。
表權(quán)利要求
1.一種自石斛提取的多糖用于制造治療過敏性疾病的藥物的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述過敏性疾病與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、趨化因子及 /或Th2細(xì)胞因子的水平的增加有關(guān)。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述過敏性疾病為選自由哮喘、花粉過敏、過敏性 結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮炎及其任意組合所組成的群組中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述多糖是經(jīng)口投予的。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述多糖是通過包含下述步驟的方法制備的(a)將第一石斛制備物浸泡在第一醇中；(b)移除所述第一醇以產(chǎn)生第二石斛制備物；(c)用水或含水溶劑提取所述第二石斛制備物以獲得包含所提取的多糖的水溶液；(d)將所述包含所提取的多糖的水溶液與第二醇混合，以沉淀多糖；以及(e)收集沉淀的多糖。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述第一醇是選自由甲醇、乙醇及其任意組合所組 成的群組中的至少一種。
7.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，是用水提取所述第二石斛植物。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述第二醇是乙醇。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述乙醇具有自30%(w/v)至70% (w/v)的濃度 范圍。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中，所述乙醇具有至少50%(w/v)的濃度。
11.一種自石斛提取的多糖用于制造減少由炎癥造成的氣道重塑的藥物的用途。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述多糖是經(jīng)口投予的。
13.如權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述多糖是通過包含下述步驟的方法制備的(a)將第一石斛制備物浸泡在第一醇中；(b)移除所述第一醇以產(chǎn)生第二石斛制備物；(c)用水或含水溶劑提取所述第二石斛制備物以獲得包含所提取的多糖的水溶液；(d)將所述水溶液與第二醇混合，以沉淀多糖；以及(e)收集沉淀的多糖。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中，所述第一醇是選自由甲醇、乙醇及其任意組合所 組成的群組中的至少一種。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其中，是用水提取所述第二石斛植物。
16.如權(quán)利要求13所述的用途，其中，所述第二醇是乙醇。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其中，所述乙醇具有自30%(w/v)至70% (w/v)的濃 度范圍。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中，所述乙醇具有50%(w/v)的濃度。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于自石斛屬獲得的多糖，用于治療過敏性疾病及/或用于減少由炎癥造成的氣道重塑。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102105155SQ200980128681
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者吳榮燦 申請(qǐng)人:S·S·F·吳, 吳榮燦