TNFα抗體及另外一種藥物的用途的制作方法

文檔序號：992674閱讀：212來源：國知局

專利名稱：TNFα抗體及另外一種藥物的用途的制作方法
TNFa抗體及另外一種藥物的用途本申請是申請日為2003年4月24日、申請?zhí)枮?3809437. 1、發(fā)明名稱為“TNFa 抗體及另外一種藥物的用途”的發(fā)明專利申請的分案申請
背景技術：
腫瘤壞死因子a (TNFa)是一種細胞因子，可以由許多類型的細胞產生，包括單核細胞和巨噬細胞，最初鑒定這個因子是根據(jù)它能誘導某些小鼠腫瘤壞死的能力(參看Old，L.，1985，科學，230 :630-632)。隨后，一個和惡病質相關的名叫惡液質素的因子被顯示是和TNFa相同的分子。研究暗示TNFa可能參與介導休克(參看Beutler，B和 Cerami, A. (1988)生物化學年鑒(Annu. Rev. Biochem), 57 505-518 ；Beutler,B ^P Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7 :625_655)。此外，還暗示TNF α在別的各種人類疾病和代謝紊亂，包括敗血癥，傳染病，自身免疫病，移植排異反應以及移植物抗宿主疾病的病理生理學中發(fā)揮重要作用(例如參看 Vasilli，P. (1992)Annu. Rev. Immunol. 10 :411_452 =Tracey, K. J.和 Cerami, Α. (1994)Annu. Rev. Med. 45 :491_503)。因為人TNFa (hTNF a )在各種人類疾病都會產生有害的作用，因此設計了不同的治療策略去抑制或阻礙hTNFa的活性。具體而言，尋求能結合并中和hTNF α的各種抗體，使其成為抑制hTNFa活性的一種手段。最早的一些這樣的抗體是鼠源的單克隆抗體 (mAbs)，它是由小鼠淋巴細胞的雜交瘤分泌的，這種小鼠用hTNF α進行了免疫(參看Hahn， T 等人(1985) Proc Natl Acad Sci USA82 :3814_3818 ;Liang，C-M 等人(1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 847-854 ；Hirai, M 等人(1987) J. Immunol. Methods 96 57-62 ； Fendly, B. M.等人(1987)Hybridoma 6 :359_370 ;Moller，A 等人(1990)Cytokine2 162-169 ；Moeller 等人的美國專利 No. 5231024 ；ffallach, D 的歐洲專利申請 Nol86833 ；Old 等人的歐洲專利申請No218868 ；Moeller, A等人的歐洲專利申請No260610)。盡管這些小鼠抗hTNF α抗體經常表現(xiàn)出高的hTNF α親和力(例如Kd彡I(T9M)，而且能中和hTNF α活性，但是將這些抗體施用給人體時，伴隨出現(xiàn)的諸如短的血清半衰期，不能誘導人體效應蛋白發(fā)揮功能，以及在人體中誘導出不希望出現(xiàn)的抗小鼠抗體的免疫反應(“人抗鼠抗體”反應(HAMA))等問題限制了這些抗體在體內的使用。為了克服鼠源抗體在人體使用中出現(xiàn)的問題，通過基因工程將鼠源抗hTNF α 抗體變得更“類人”。例如，制備了一些可變區(qū)是鼠源的，而恒定區(qū)是人源的嵌合抗體 (Knight, D. M 等人(1993)Mol. Immunol. 30 1443-1453 ；Daddona, P. E.等人的 PCT 出版物 No. W092/16553)。此外，還制備了人源化抗體，在這種抗體中，可變區(qū)的高變區(qū)是鼠源的，而可變區(qū)的剩余部分以及恒定區(qū)則是人源的(Adair，J. R等人的PCT出版物No. W092/11383)。然而，由于這些嵌合以及人源化的抗體仍然有一些鼠源序列，因此，它們仍然能誘導一些不必要的免疫反應，即人抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其是當給藥時間延長，如對類風濕性關節(jié)炎這樣的慢性病給藥時便會誘導不必要的免疫反應(參看Elliott，Μ. J.等人(1994) Lancet344 :1125_1127 ；Elliot, Μ. J.等人(1994)Lancer344 :1105_1110)。較鼠源MAbs或其衍生物(如嵌合或人源化抗體)優(yōu)選的hTNF α抑制劑是完全的人抗hTNF α抗體，因為即便長期用這種試劑不會誘導HAMA反應。利用人雜交瘤技術已經制備出抗hTNFa的人單克隆自身抗體(Boyle,P.，等人(1993)Cell. Immunol 152 :556_568 ； Boyle, P.，等人(1993) Cell. Immuno 152 :569_581 ；Boyle 等人的歐洲專利申請 No614984)。然而，據(jù)報道，這些雜交瘤衍生的單克隆自身抗體對hTNF α所具有的親和力水平太低，用常規(guī)的方法估算不出來，這種抗體不能結合可溶性的hTNFa，而且也不能中和hTNFa誘導的細胞毒性(參看Boyle等人，同上)。而且，人雜交瘤技術的成功取決于人外周血中淋巴細胞的出現(xiàn)，淋巴細胞能產生hTNFa特異的自身抗體。某些研究在人受試者中發(fā)現(xiàn) 了抗 hTNF α 的血清自身抗體(Fomsgaard，A 等人(1989) Scand. J. Immunol. 30 :219_223 ； Bendtzen, K 等人，(1990) Prog. Leukocyte Biol. IOB :447_452)，而別的研究則沒發(fā)現(xiàn) (Leusch，H-G 等人(1991) J. Immunol. Methods 139 145-147)?？梢蕴娲烊坏娜丝筯TNF α抗體的是重組hTNF α抗體。能結合hTNF α的重組人抗體已經做過介紹，它的親和力相對低(即Kd I(T7M)，而快速解離率則很快(即K。ff KT2SecT1) (Griffiths, A. D.等人(1993)EMBO J. 12 :725_734)。然而，由于它們相對比較快的解離動力學，因此，這些抗體并不適合用于治療。此外，介紹了一種重組的人抗hTNFa 抗體，它不能中和hTNF α的活性，但卻能增強hTNF α結合到細胞表面，并增強hTNF α的內化(Lidbury, A.，等人(1994) Biotechnol. Ther. 5 :27_45 ；Aston 等人的 PCT 出版物 No. W092/03145)。也被介紹的是能結合可溶性hTNF α的重組人抗體，它具有高的親和力以及緩慢的解離動力學特征，并能中和hTNF α的活性，包括hTNFa誘導的細胞毒性(體外和體內) 和細胞激活(參看美國專利No6090382)。典型的靜脈內施用抗體是一周一次。然而，每周一劑的抗體及/或任何藥物既昂貴，又麻煩，而且由于給藥次數(shù)頻繁，導致副作用上升。靜脈內給藥也有限制，因為這種給藥必須由經過醫(yī)學訓練的人來執(zhí)行。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一些方法，這些方法通過施用抗hTNFa抗體和一或多種藥物來治療hTNFa相關疾病，如敗血癥，自身免疫病(如類風濕性關節(jié)炎，過敏癥，多發(fā)性硬化癥，自體免疫性糖尿病，自體免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征)，傳染病，惡性腫瘤，移植排異反應或移植物抗宿主病，肺部疾病，骨疾，腸道疾病，中樞神經系統(tǒng)疾病，心臟疾病。優(yōu)選治療的自體免疫性疾病是類風濕性關節(jié)炎。抗體可以在其他藥物給藥前，給藥后給藥，也可以和其他藥物一塊給藥。本發(fā)明的方法包括了抗體和其他藥物給藥的任何順序以及給藥的手段。治療TNFa相關疾病，抗體優(yōu)選的給藥方案是每兩周一劑，優(yōu)選的給藥途徑是皮下給藥。其他藥物優(yōu)選的是疾病改善抗風濕藥物(DMARD)或非留體抗炎藥(NSAID)或類固醇或其任意組合。優(yōu)選的DMARD是羥基氯喹，來氟米特，氨甲蝶呤，腸胃外給藥的金制劑，口服的金制劑以及柳氮磺吡啶。這些方法包括利用聯(lián)合療法，這種方法是將人抗體和另外一種治療劑施用給受試者，這種治療劑如一或多種能結合別的靶蛋白的抗體(如能結合別的細胞因子或細胞表面分子的抗體)，一或多種細胞因子，可溶性TNF α受體(參看PCT出版物No. W094/06476)，Immunex公司的依那西普(ENBREL )，Centocor公司的英夫利昔單抗(REMICADE )，及/或一或多種能抑制hTNF α產量或活性的化學試劑(如在PCT出版物 No. W093/19751中介紹的環(huán)己烷-亞基衍生物)。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥用組合物，它包括抗TNF α的抗體，以及一或多種
5用來治療自體免疫性疾病的藥物和藥用上可接受的載體。本發(fā)明的另一方面涉及試劑盒，該試劑盒包括一種包括抗TNFa抗體和藥用上可接受的載體的藥用組合物，以及一或多種藥用組合物，這些組合物中每種都包含用來治療自體免疫性疾病的藥物和藥用上可接受的載體。此外，該試劑盒還包括單一的藥用組合物，它包括抗TNFa抗體，一或多種用來治療自體免疫性疾病的藥物和藥用上可接受的載體。這些試劑盒還包括說明書，用來指導服用治療疾病的藥用組合物，施用抗TNFa抗體對諸如自體免疫性疾病，尤其是類風濕性關節(jié)炎這樣的疾病是有利的?？贵w或其抗原結合片段優(yōu)選重組人抗體，它們能特異地結合人TNF α?？贵w優(yōu)選能結合人TNFa的重組人抗體。本發(fā)明的抗體的特征是能結合hTNFa，具有高的親和力和低的解離動力學，并且能中和hTNF α活性，包括hTNFa誘導的細胞毒性(體外和體內)和細胞激活?？贵w或其抗原結合片段優(yōu)選的是從人TNFa中解離出來，TNFa的Kd是1X10_8M或更低，而K。ff速率常數(shù)為1 X ΙΟ—、—1或更低，這兩個參數(shù)都是由表面等離子共振確定的，在一個標準的體外L929實驗中，能中和人TNF α細胞毒性，IC5tl是1 X 10_7Μ或更低。更優(yōu)選的是，分離的人抗體，或其抗原結合片段是從人TNF α中解離出來的，TNFa的K。ff是5 X KT4S4 或更低，或者甚至更優(yōu)選的K。ff是1 X ΙΟ—、—1或更低。更優(yōu)選的是，分離的人抗體，或其抗原結合片段在一個標準的體外L929實驗中，能中和人TNF α細胞毒性，IC50為1 X 10_8Μ或更低，IC50是IX ICT9M或更低甚至更優(yōu)選，而IX ΙΟ,Μ或更低的IC50仍然是優(yōu)選的。抗體可以是全長的(例如IgGl或IgG4抗體)或只包括抗原結合片段(例如Fab，F(xiàn)(aF)2，scFv 片段或單一結構域)。本發(fā)明最優(yōu)選的重組抗體是D2E7，它的輕鏈CDR3結構域包括SEQ ID NO 3氨基酸序列，而重鏈⑶R3結構域包括SEQ ID NO 4氨基酸序列。優(yōu)選的是，D2E7抗體的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包括SEQ ID NO :1氨基酸序列，而重鏈可變區(qū)(HCVR)包括SEQ ID NO: 2氨基酸序列。這些抗體都在美國專利No. 6090382中介紹了，此處完整引用作為參考。優(yōu)選的抗體或抗原結合片段具有下列特征a)是從人TNFa中解離出來，TNFa的K。ff是1 X ΙΟ、—1或更低，它是由表面等離子共振確定的。b)它的輕鏈⑶R3結構域包括SEQ ID NO 3氨基酸序列，或者是SEQ ID NO 3氨基酸序列的如下修飾形式，在1，4，5，7或8位有單一的丙氨酸取代，或者在位置1，3，4，6，7， 8和/或9位有1-5個保守的氨基酸取代。c)重鏈⑶R3結構域包括SEQ ID NO 4氨基酸序列，或者是SEQID NO 4氨基酸序列的如下修飾形式，在2，3，4，5，6，8，9，10或11位有單一的丙氨酸取代，或者在位置2，3，4， 5，6，8，9，10，11和/或12位有1_5個保守的氨基酸取代。更優(yōu)選的是，分離的人抗體，或其抗原結合片段是從人TNFa中解離出來的， TNFa的1(。是5乂10_4工1或更低。分離的人抗體，或其抗原結合片段是從人TNF α中解離出來的，TNF α的K。ff是1 X IO-4S"1或更低，這仍然是更優(yōu)選的。優(yōu)選的抗體，或其抗原結合片段含有具有CDR3結構域的LCVR，該結構域包括SEQ ID NO: 3氨基酸序列，或者是SEQ ID NO :3氨基酸序列的修飾形式，在1，4，5，7或8位由單一的丙氨酸取代，它的HCVR含有⑶&結構域，該結構域包括SEQ ID NO :4氨基酸序列，或者是SEQ ID NO :4氨基酸序列的修飾形式，在2，3，4，5，6，8，9，10或11位由單一的丙氨酸取代，更優(yōu)選的是，LCVR進一步還包括⑶R2結構域，該結構域包括SEQ ID NO 5氨基酸序列，
6而HCVR進一步還包括⑶R2結構域，該結構域包括SEQ ID NO 6氨基酸序列。LCVR進一步還包括⑶Rl結構域，該結構域包括SEQ ID NO 7氨基酸序列，而HCVR進一步還包括⑶Rl 結構域，該結構域包括SEQ ID NO :g氨基酸序列，這仍然是更優(yōu)選的。優(yōu)選的抗體，或其抗原結合片段含有的LCVR包括SEQ ID NO 1氨基酸序列，它的 HCVR包括SEQ ID NO :2氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體有IgGl重鏈恒定區(qū)或IgG4 重鏈恒定區(qū)。在另外還有些實施方案中，抗體是Fab片段，F(xiàn)bbO2片段，或單鏈Fv片段。在另外一些實施方案中，本發(fā)明提供了一些治療疾病的方法，每兩周一次，通過皮下將一或多種抗TNF α抗體，或其抗原結合片段施用給受試者，這些抗TNF α抗體對疾病是有利的。優(yōu)選的抗體，或其抗原結合片段含有的LCVR包括CDR3結構域，該結構域包括的氨基酸序列選自 SEQ ID NO :3,SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO :14， SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16，SEQ ID NO :17，SEQID NO :18，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO 20，SEQ ID NO -.21, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，它的HCVR含有⑶R3結構域，該結構域包括的氨基酸序列選自SEQ IDNO 4, SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，SEQ ID NO :33，SEQ ID NO :34，SEQID NO :35。在本發(fā)明前述最優(yōu)選的實施方案中，抗體D2E7通過皮下注射，每兩周一次，每次劑量是40mg。一或多種藥物的劑量和它們的有效劑量一致。發(fā)明詳述在另外一些實施方案中，本發(fā)明提供了一些治療疾病的方法，在這些方法中，將分離的人抗體，或其抗原結合片段和一或多種其他藥物組合施用，這種抗體的給藥對治療疾病是有利的，它能結合人TNF α，親和力高，解離速率低，而中和能力高，因此能治療疾病。為了更容易地理解本發(fā)明，我們首先對某些術語進行定義。本發(fā)明使用的術語“給藥”指的是某種物質(例如抗TNFa抗體)的施用能達到治療目的(例如TNF α相關疾病的治療)。本發(fā)明使用的術語“每兩周給藥方案”，“每兩周給藥”以及“每兩周施用”指的是為了獲得治療目的(例如TNFa相關疾病的治療)，將物質(例如抗TNFa抗體)施用給受試者的時間過程。每兩周給藥方案并不包括一周一次的給藥方案。這種物質優(yōu)選的是每 9-19天給藥一次，更優(yōu)選的是11-17天，甚至更優(yōu)選的是13-15天，而最優(yōu)選的是每隔14天
給藥一次。本發(fā)明使用的術語“聯(lián)合治療”指的是施用兩或多種治療物質，如抗TNFa抗體和別的諸如DMARD或NSAID這樣的藥物。其他藥物可以和抗TNFa抗體共同給藥，也可以在它之前，之后給藥。本發(fā)明使用的術語“人TNFa ”(本發(fā)明縮寫成hTNF α，或簡寫成hTNF)指的是一種人細胞因子，它的分泌形式是17kDa，而膜結合形式是26kDa，它的活性形式是由17kDa 分子非共價結合形成的三聚體。例如，TNFa的結構在Pennica，D等人(1984)Nature312 724-729 ；Davis, J. M 等人(1987)Biochemistry26 1322-1326 及 Jones，Ε. Y 等人(1989) Nature338 :225-228中介紹了。術語人TNF α意思包括重組的人TNF α (rh TNF α )，它能通過標準的重組方法制備，或者通過商業(yè)途徑購買(R&D系統(tǒng)，目錄號是ΝΟ.210-ΤΑ， Minneapolis, MN)。
本發(fā)明使用的術語“抗體”指的是免疫球蛋白，它包括四條多肽鏈，兩條重鏈(H) 和兩條輕鏈(L)，它們通過二硫鍵相互連接。每條重鏈包括可變區(qū)(本發(fā)明簡寫成HCVR或 VH)和恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個結構域，CH1，CH2和CH3。每條輕鏈包括可變區(qū)(本發(fā) 明簡寫成LCVR或VL)和恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括CL 1個結構域。VH和VL能進一步分成許多高變區(qū)，即決定簇互補區(qū)(CDR)，它們散布在更保守的骨架區(qū)(FR)中。每個VH和VL包括三個⑶Rs和四個FRs，它們按下列順序排列，從氨基端到碳末端是FRl，⑶Rl，F(xiàn)R2，⑶R2， FR3, CDR3, FR4。本發(fā)明使用的術語抗體的“抗原結合片段”(或簡化成“抗體部分”)指的是一或多個抗體片段，它們仍然有特異結合抗原的能力(如hTNF α )。全長抗體的片段具有結合抗原的功能。包含在術語抗體的“抗原結合片段”中的結合片段實施例包括(i) Fab片段，單價片段，含有VL，VH, CL和CHl結構域；(ii) F (ab’)2片段，雙價片段，含有兩個Fab片段，在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵相連；(iii)Fd片段，含有VH和CHl結構域；(iv)Fv片段，含有抗體單臂的VL 和VH結構域；(v)dAb片段(Ward等人(1989) Nature341 :544_546)，它包括VH結構域；以及 (vi)單獨的決定簇互補區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但它們能通過重組技術合成的接頭連結成一條蛋白鏈，在這條單鏈蛋白鏈中，VL和VH 區(qū)配對形成單價分子(已知的單鏈Fv(scFv)，參看Bird等人(1988) Science242 :423_426 ；以及 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879_5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。別的形式的單鏈抗體，如雙價抗體也包括在這個術語之內。雙價抗體是二價的，雙特異性的抗體，在這個抗體中，VH和VL結構域表達成一條多肽鏈，但是得使用一個接頭，這個接頭太小而不能在同一條鏈的兩個結構域中配對，這樣迫使結構域和另一條鏈的互補結構域配對，從而創(chuàng)造出兩個抗原結合位點(參看Holliger，P.，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444_6448 ；Poljak, R. J 等人(1994) Structure〗 1121-1123)。更進一步，抗體，或其抗原結合片段是更大的免疫粘附分子的一部分，這種免疫粘附分子是由一或多個蛋白或肽共價或非共價將抗體或抗體部分連接在一起形成的。這種免疫粘附分子的實施例包括，利用鏈霉抗生物素核心區(qū)制造一個四聚體的scFv分子 (Kipriyanov, S. M 等人(1995)，Human Antibodies andHbridomas6 93-101)，以及利用一個半胱氨酸殘基，標記肽和C-末端多聚組氨酸標簽制造一個雙價的，生物素scFv分子 (Kipriyanov, S. M 等人(1994)，Mol. Immunol. 31 :1047_1058)。諸如 Fab 禾PF(ab，)2 這樣的抗體片段，可以利用常規(guī)技術從整個抗體中制備，如分別利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整個抗體。而且可以利用本發(fā)明介紹的標準重組DNA技術制備抗體，抗體部分以及免疫粘附分子。本發(fā)明使用的術語“人抗體”包括這樣的抗體，它的可變區(qū)和恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白胚系基因。本發(fā)明的人抗體還包括不是人免疫球蛋白胚系基因編碼的氨基酸序列 (如在體外通過隨機或定點突變產生的突變，以及在體內通過體細胞突變產生的突變)，例如在CDRs，尤其是CDR3中的氨基酸。然而，本發(fā)明使用的術語“人抗體”并不包括這樣的抗體，它們的CDR序列衍生自別的哺乳動物，如小鼠的胚系基因，然后嫁接到人骨架序列上。本發(fā)明使用的術語“重組人抗體”意思包括所有通過重組技術制備，表達，創(chuàng)造或分離的人抗體，如重組表達載體在轉化宿主細胞中表達的抗體(在下面II部分進一步介紹)，從重組的，組合的人抗體文庫中分離的抗體(在下面III部分進一步介紹)，從人免疫球蛋白基因的轉基因動物(如小鼠)中分離的抗體(如參看Taylor，L. D等人(1992)Nucl. Acids. Res20 =6287-6295)或通過任何別的技術制備，表達，創(chuàng)造或分離的抗體，這些技術涉及將人免疫球蛋白基因拼接到別的DNA序列上。這樣的人抗體包括的可變區(qū)和恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白胚系基因。在某些實施方案中，這種重組人抗體在體外很容易發(fā)生誘變 (或者當使用一種人Ig基因的轉基因動物時，在體發(fā)生體細胞突變)，因此，重組抗體的VH 和VL區(qū)的氨基酸序列衍生自人胚系VH和VL序列，但它在人胚系抗體庫中不是天然存在。本發(fā)明使用的“分離的抗體”指的是基本上沒有別的具不同抗原特異性的抗體的抗體(如一種能特異結合hTNFa的抗體，它基本上沒有能特異結合非hTNF α抗原的抗體)。然而，能特異結合hTNFa的分離抗體和別的抗原具有交叉反應活性，如別的物種的 hTNFa (在下面進一步詳細地討論)。而且分離的抗體基本上沒有別的細胞物質，和/或化學物質。本發(fā)明使用的“中和抗體”(或者叫“能中和hTNFa活性的抗體”)指的是能結合hTNF a，從而抑制hTNF α生物活性的抗體。hTNFa活性的抑制可以通過檢測一或多個 hTNFa生物活性的指標來評估，如hTNFa誘導的細胞毒性(體外或體內)，hTNF α誘導的細胞激活以及hTNFa和hTNFa受體的結合。這些hTNF α生物活性的指標可以用本領域已知的一或多種標準體外或體內試驗來評估(參看美國專利No. 6090382)。優(yōu)選的是，抗體中和hTNFa生物活性的能力可以通過L929細胞中的hTNFa誘導的細胞毒性來評估。作為hTNFa活性另外或替代的參數(shù)，抗體抑制hTNFa誘導的ELAM-1在HUVEC中的表達能力，可以作為hTNFa誘導的細胞激活的檢測工具，也可被評估。本發(fā)明使用的“表面等離子共振”指的是一種光學現(xiàn)象，通過檢測生理傳感器點陣中蛋白濃度的改變來分析實時的生物特異的相互作用，例如利用BIAcore系統(tǒng) (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 禾口 Piscataway, NJ)。進一步的介紹，請參考實施例 1 和 Jonsson, U.，等人(1993)Ann. Biol. Clin51 19-26 Jonsson, U 等人(1991) Biotechniquesll :620_627 Johnsson, B 等人(1995) J. Mol. Recognit，8 125-131 ；以及 Johnson, B 等人(1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。本發(fā)明使用的術語“K。ff”指的是抗體從抗體/抗原復合物中解離的速率常數(shù)。本發(fā)明使用的術語“Kd”指的是特定抗體抗原相互作用的解離常數(shù)。本發(fā)明使用的術語“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，但優(yōu)選的是雙鏈DNA分子。本發(fā)明使用的術語“分離的核酸分子”涉及的是編碼能結合hTNFa的抗體或抗體部分(例如VH，VL，CDR3)的核酸，它指的是核酸分子，在這種核酸分子中，編碼抗體和抗體部分的核苷酸序列中沒有別的能結合非hTNFa抗原的抗體或抗體部分的核苷酸序列。在這些核苷酸序列中，別的序列天然位于人基因組DNA的兩側。因此，本發(fā)明編碼抗hTNFa 抗體VH區(qū)的分離核酸不含別的結合非hTNF α抗原的抗體VH區(qū)序列。本發(fā)明使用的術語“載體”指的是一種核酸分子，它能將其連接的另一核酸分子進行轉移。一種類型的載體是“質?！?，它指的是一種環(huán)形的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片段可以連接到這個DNA環(huán)中。另外一種載體是病毒載體，在這種載體中，可以將另外的DNA片段連接到病毒基因組中。某些載體在其導入的宿主細胞中能自主復制(例如具有細菌復制起點
9的細菌載體和哺乳動物附加體載體)。別的載體(如哺乳動物非附加體載體)在導入宿主細胞后，能整合到宿主細胞基因組中，因此，它能和宿主基因組一起復制。而且，某些載體能指導與其可操作地連接的基因的表達。這種載體在本發(fā)明被稱作“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。總之，在重組DNA技術中使用的表達載體通常以質粒的形式存在。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以交互使用，因為質粒是載體最常用的形式。然而，本發(fā)明的意圖是還包括別的形式的表達載體，如病毒載體(如復制缺陷型逆轉錄病毒，腺病毒和腺病毒相關病毒)，它們的功能相同。本發(fā)明使用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)指的是重組表達載體導入的細胞。應該理解這些術語不僅指特定的供試細胞，而且指這些細胞的子代。由于突變或環(huán)境的影響，某些修飾可能在連續(xù)數(shù)代中出現(xiàn)，因此，事實上，這些細胞的子代不可能和母細胞完全一樣，但仍然包括在本發(fā)明術語“宿主細胞”的范圍之內。下面將進一步詳細說明本發(fā)明的不同方面。本發(fā)明提供了一些治療疾病的方法，在這些方法中，這種抗體的給藥對治療疾病是有利的。這些方法包括將分離的人抗體或其抗原結合片段以及一或多種其他藥物每兩周，皮下給藥，其中所述人抗體或其抗原部分能結合人TNF α，親和力高，解離速率低，而中和能力高，其他藥物用于治療自體免疫性疾病，尤其是類風濕性關節(jié)炎。本發(fā)明優(yōu)選的人抗體是重組的，中和性人抗TNF α抗體。本發(fā)明最優(yōu)選的重組中和抗體在本發(fā)明被稱作 D2E7 (D2E7VL的氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示，而D2E7VH的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示)，其給藥的劑量是40mg。D2E7的性質在Salfeld等人的美國專利No. 6090382中介紹了，這個專利被引入本發(fā)明作為參考。一個方面，本發(fā)明涉及治療疾病，用來治療自體免疫性疾病的抗TNFa抗體以及一或多種其他藥物的施用對治療疾病是有利的。這些治療包括每兩周，皮下施用D2E7及其抗體部分，D2E7相關抗體及其抗體部分，和別的抗體及其抗體部分，它們和D2E7的性質一樣，比方說高的親和力，能結合hTNFa，解離動力學低，并且具高的中和能力。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的人抗體或其抗原結合片段用于治療，該人抗體或其抗原結合片段是從人TNF α中解離的，Kd是1 X IO-8M或更低，而K。ff速率常數(shù)是1 X ΙΟ、—1或更低，這兩個參數(shù)都是由表面等離子共振確定的，并且在一個標準的體外L929實驗中，能中和人 TNFa細胞毒性，IC50是IX ICT7M或更低。更優(yōu)選的是，分離的人抗體，或其抗原結合片段是從人TNFa中解離出來的，TNFa的K。ff是5X ΙΟ、—1或更低，或者甚至更優(yōu)選的K。ff是 IXlO-4S-1或更低。更優(yōu)選的是，分離的人抗體，或其抗原結合片段在一個標準的體外L929 實驗中中和的人TNFa細胞毒性IC50是IX ICT8M或更低，IX ICT9M或更低的IC50甚至更優(yōu)選，而IX ΙΟ,Μ或更低的IC 50仍然是優(yōu)選的。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是分離的人重組抗體，或其抗原結合片段。本領域眾所周知，抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在抗體對抗原的結合特異性/親和力中發(fā)揮重要作用。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及治療疾病的方法，通過皮下施用的人抗體對疾病治療是有利的，人抗體和hTNF α結合的解離動力學慢，并且含有重鏈和輕鏈CDR3區(qū)，它們在結構上和D2E7的⑶R3區(qū)完全一樣，或者和它們相關。D2E7VL⑶R3的位置9可以由Ala或Thr占據(jù)，而基本上不會影響K。ff。因此，D2E7VL⑶R3的保守基元包括如下氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO :3)。此外，D2E7 VH CDR3 的位置 12 可以由Tyr或Asn占據(jù)，而基本上不會影響K。ff。因此，D2E 7VH⑶R3的保守基元包括如下氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ IDNO 4)。而且，如實施例 2 所述，D2E7 的重鏈和輕鏈的⑶R3結構域易于用單個丙氨酸殘基取代(在VL⑶R3的位置1，4，5，7或8，或者在VH 0 3的位置2，3，4，5，6，8，9，10或11)，而基本不會影響1(。。再進一步說，有經驗的技術人員將會意識到，假設D2E7VL和VH CDR3結構域易于被丙氨酸取代，那么CDR3結構域中別的氨基酸可能被取代，具體而言，被保守的氨基酸取代，但是抗體的解離速率常數(shù)仍然低。本發(fā)明使用的“保守的氨基酸取代”指的是用另一個具相似側鏈的氨基酸取代一個氨基酸。具相似側鏈的氨基酸家族本領域已有定義，包括堿性側鏈(如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側鏈(如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側鏈(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側鏈(如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-支鏈側鏈(如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)，以及芳香側鏈(如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。優(yōu)選的，在D2E7VL和/或VH CDR3結構域中的保守氨基酸取代不超過1-5個。更優(yōu)選的，在D2E7VL和/或VH CDR3結構域中的保守氨基酸取代不超過1-3個。此外，對結合TNF α關鍵的氨基酸位置不應該發(fā)生保守氨基酸取代。D2E7 VL⑶R3的位置2和5以及D2E7VH⑶R3的位置1和7在和TNF α相互作用中是關鍵的，因此，在這些位置不發(fā)生氨基酸取代是優(yōu)選的(盡管如上述那樣，在D2E7 VL⑶R3的位置5用丙氨酸取代也是可接受的)(參看美國專利No. 6090382)。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案申，提供了治療疾病的方法，在這些方法中，每兩周，皮下施用抗TNF α抗體或其抗原結合片段和一或多種其他藥物對治療疾病是有利的，所述其他藥物用于治療自體免疫疾病。優(yōu)選的抗體或抗原結合片段具有下列特征a)是從人TNFa中解離出來，TNFa的K。ff是1 X ΙΟ、—1或更低，它是由表面等離子共振確定的。b)它的輕鏈CDR3結構域包括SEQ ID NO 3氨基酸序列，或者是SEQ ID NO 3氨基酸序列的修飾形式，在1，4，5，7或8位有單一的丙氨酸取代，或者在位置1，3，4，6，7，8和 /或9位有1-5個保守的氨基酸取代。c)重鏈CDR3結構域包括SEQ ID NO 4氨基酸序列，或者是SEQID NO 4氨基酸序列的修飾形式，在2，3，4，5，6，8，9，10或11位有單一的丙氨酸取代，或者在位置2，3，4，5，6， 8，9，10，11和/或12位有1-5個保守的氨基酸取代。更優(yōu)選的是，抗體，或其抗原結合片段是從人TNF α中解離出來的，TNFa的K。ff 是5X ΙΟ、—1或更低。抗體，或其抗原結合片段從人TNF α中解離出來的，TNFa的K。ff是 IXlO-V或更低，這甚至更優(yōu)選。在另外一個實施方案中，抗體，或其抗原結合片段含有的輕鏈可變區(qū)(LCVR)含有 ⑶R3結構域，該結構域包括SEQ ID NO 3氨基酸序列，或者是SEQ ID NO :3氨基酸序列的修飾形式，在1，4，5，7或8位有單一的丙氨酸取代，它的重鏈可變區(qū)(HCVR)含有⑶R3結構域，讀結構域包括SEQ ID NO :4氨基酸序列，或者是SEQ ID NO :4氨基酸序列的修飾形式，在2，3，4，5，6，8，9，10或11位有單一的丙氨酸取代。優(yōu)選的是，LCVR進一步還包括⑶R2結構域，該結構域包括SEQ ID NO 5氨基酸序列(即D2E7 VL⑶R2)，而HCVR進一步還包括 ⑶R2結構域，該結構域包括SEQ ID NO :6氨基酸序列(即D2E7 VH⑶R2)。LCVR進一步還包括⑶Rl結構域，該結構域包括SEQID NO 7氨基酸序列(即D2E7 VL⑶Rl)，而HCVR進一步還包括⑶Rl結構域，該結構域包括SEQ ID NO 8氨基酸序列(即D2E7 VH⑶Rl)，這甚至更優(yōu)選。VH骨架區(qū)優(yōu)選的是來自人VH3胚系基因家族，更優(yōu)選的是來自人DP-31胚系 VH基因，而最優(yōu)選的是來自D2E7 VL骨架序列，這段序列如美國專利No. 6090382圖2A和 2B所示。仍然在另外一個實施方案中，優(yōu)選的抗體，或其抗原結合片段含有的輕鏈可變區(qū) (LCVR)包括SEQ ID NO 1氨基酸序列(即D2E7 VL)，它的重鏈可變區(qū)(HCVR)包括SEQ ID NO :2氨基酸序列(即D2E7 VH)。在某些實施方案中，抗體包括重鏈恒定區(qū)，如IgGl，IgG2， IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)優(yōu)選的是IgGl重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)。此外，抗體包括輕鏈恒定區(qū)，可以是K輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。抗體輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選的是K輕鏈恒定區(qū)。此外，抗體部分可以是諸如Fab片段或Fc片段這樣的片段。仍然在另外一個實施方案中，優(yōu)選的抗體，或其抗原結合片段含有D2E7相關的VL 和VH CDR3結構域，例如，含有輕鏈可變區(qū)(LCVR) CDR3結構域的抗體，或其抗原結合片段，該結構域包括的氨基酸序列選自SEQ ID NO :3,SEQ ID NO :11,SEQ ID NO 12, SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :16，SEQ ID NO :17，SEQID NO :18，SEQ ID NO :19, SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO -.21, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO :26，它的重鏈可變區(qū)(HCVR)含有⑶R3結構域，該結構域包括的氨基酸序列選自 SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :28，S EQ ID NO :29，SEQ ID NO :30， SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，SEQ ID NO :33，SEQID NO :34，SEQ ID NO :35。本發(fā)明的抗體，或其抗原結合片段可以衍生化，或連接到別的功能分子上(如別的肽或蛋白)。因此，本發(fā)明的抗體，或其抗原結合片段包括本發(fā)明介紹的人抗TNFa抗體的衍生化以及別的修飾形式，包括免疫粘附分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以功能性地連接到(化學耦合，基因融合，非共價結合或其他)一或多個其他分子，如別的抗體 (如雙特異性抗體或雙價抗體)，檢測試劑，細胞毒性藥物，藥用試劑，及/或蛋白或肽上，它們能介導抗體或抗體部分和其他分子(如鏈霉抗生物素核心區(qū)或多聚組氨酸標簽)偶聯(lián)。一種類型的衍生化抗體是將兩或多個抗體交聯(lián)而成(同一類型或不同類型，從而獲得雙特異的抗體)。合適的交聯(lián)接頭包括那些具異種雙活性的接頭，這些接頭有兩個不同的反應基團，基團被合適的間隔序列(如馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺脂)隔開，或者是具同種雙活性(如二琥珀酰辛二酸)的接頭。這樣的接頭可以從PierceChemical Company, Rockfort，IL 0本發(fā)明的抗體，或其抗原結合片段可以和包括熒光化合物在內的有用檢測試劑一起衍生化。熒光檢測試劑包括熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻紅蛋白等。抗體也可用可檢測的酶，如堿性磷酸酶，辣根過氧化酶，葡萄糖氧化酶等衍生化。當抗體用可檢測的酶衍生化時，可以通過添加別的試劑來檢測，可檢測的酶利用這些試劑來產生可檢測的反應產物。例如，當可檢測的酶是辣根過氧化酶時，添加過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺能產生有色的反應產物，它可以檢測到?？贵w也可以用生物素衍生化，并通過抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合進行間接檢測。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈來制備。為了表達重組的抗體，用一或多個含有抗體輕鏈和重鏈編碼DNA片段的重組表達載體轉化宿主細胞，致使抗體輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達，優(yōu)選的是分泌到宿主細胞的培養(yǎng)基中，然后從宿主細胞培養(yǎng)基中回收抗體。用標準的重組DNA方法來獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因整合到重組表達載體中，并導入宿主細胞，這在Sambrook， Fritsch 和 Maniatis (編輯)，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning :A Laboratory Mannual)，第二版，冷泉港實驗室，N. Y (1989)，Ausubel，F(xiàn). M等人(編輯)，分子生物學最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene 出版公司(1989)以及 Boss 等人的美國專利No4816397中介紹了。為了表達D2E7或D2E7相關抗體，首先獲得編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA片段。這些DNA片段可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和修飾胚系輕鏈和重鏈可變區(qū)序列獲得。人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的胚系DNA序列是本領域眾所周知的(參看“Vbase”人胚系序列數(shù)據(jù)庫；也可參看Kabat，E. A等人(1991)免疫目的蛋白序列(Sequenceof Protein of Immunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH出版號No. 91-3242 ； Tomlinson, L. M 等人(1992) “TheRepertoire of Human Germline VH Sequence Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different HypervariableLoops" J. Mol. Biol. 227 776-798 ；以及 Cox，J. P. L 等人(1994) "ADirectory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a StrongBias in their Usage，，Eur. J. Immunol. 24 :827-836 ；這些文獻表示的內容整體被引作參考)。為了獲得編碼D2E7或D2E7相關抗體重鏈可變區(qū)的DNA 片段，用標準PCR擴增人胚系VH基因的VH3家族成員。擴增DP-31 VH胚系序列是最優(yōu)選的。適合擴增DP-31胚系VH和A20胚系VL序列的PCR引物可以根據(jù)上面引用的參考文獻中公開的核苷酸序列進行設計，采用的是標準方法。一旦獲得胚系VH和VL片段，這些序列可以突變成本發(fā)明公開的D2E7或D2E7相關氨基酸序列。首先將胚系VH和VL DNA序列編碼的氨基酸序列和D2E7或D2E7相關VH和 VL氨基酸序列比較，確定D2E7或D2E7相關序列與胚系序列不同的氨基酸殘基。然后利用遺傳密碼確定哪個核苷酸應該改變，突變胚系DNA序列中合適的核苷酸，使得突變胚系DNA 序列能編碼D2E7或D2E7相關氨基酸序列。用標準的方法，如PCR介導的突變(在這種突變方法中，突變的核苷酸包含在PCR引物中，因此PCR產物中含有突變)和定點突變對胚系序列進行突變。一旦獲得D2E7或D2E7相關VH和VL片段的編碼DNA序列(通過對胚系VH和VL 基因進行擴增和突變，如上所述)，便可以用標準的DNA重組技術對這些DNA進行進一步的操作，例如，將可變區(qū)基因轉化成全長抗體鏈基因，F(xiàn)ab片段基因或scFv基因。在這些操作中，VL或VH編碼DNA可操作地連接到另外一個編碼別的蛋白的DNA上，如抗體恒定區(qū)或可彎曲的接頭。上下文使用的術語“可操作地連接”指的是兩段DNA連接在一起，以便這兩段 DNA編碼的氨基酸序列在一個閱讀框內。將VH編碼DNA可操作地連接到編碼重鏈恒定區(qū)(CHl，CH2，CH3)的DNA分子上，從而將編碼VH區(qū)的分離DNA轉變成全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因序列是本領域眾所周知的(參看Kabat，Ε·Α等人(1991)，免疫目的蛋白序列(Sequence of Protein oflmmunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH出版號No. 91-3242)，而包括這些區(qū)域的DNA序列可以通過標準的PCR擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl，IgG2， IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選的是IgGl和IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，VH編碼DNA可操作地連接到只編碼重鏈恒定區(qū)CHl的DNA分子上。
將VL編碼DNA可操作地連接到編碼輕鏈恒定區(qū)CL的DNA分子上，從而將編碼VL 區(qū)的分離DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因序列是本領域眾所周知的(參看Kabat，Ε·Α等人(1991)，免疫目的蛋白序列(Sequence of Protein oflmmunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH出版號No. 91-3242)，而包括這些區(qū)域的DNA序列可以通過標準的PCR擴增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或λ恒定區(qū)，但最優(yōu)選的是K恒定區(qū)。為了創(chuàng)造scFv基因，將VH和VL編碼DNA可操作地連接到編碼可彎曲接頭，如氨基酸序列(Gly4-Ser)3的編碼DNA上，使得VH和VL序列能被表達成一個連續(xù)的單鏈蛋白，而VL和VH區(qū)通過可彎曲的接頭連接在一起(參看Bird等人(1988) Science242 423-426 ；Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879_5883 ；McCafferty 等人， Nature(1990) 348 :552_554)。為了表達本發(fā)明的抗體，或抗體片段，用上述的方法獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，然后插入表達載體，使得這些基因可操作地連接到轉錄和翻譯控制序列上。此處“可操作地連接”指的是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉錄和翻譯控制序列能發(fā) 揮調節(jié)抗體基因轉錄和翻譯的功能。選擇和使用的宿主細胞相容的表達載體和表達控制序列?？贵w輕鏈和重鏈基因可以插入單獨的載體中，或者更典型的是插入同一個載體中。通過標準的方法將抗體基因插入表達載體中(如連接抗體基因和載體上互補的限制性酶切位點，如果沒有酶切位點，則進行鈍末端連接)。在將D2E7或D2E7相關輕鏈或重鏈基因插入載體之前，表達載體已經攜帶有抗體恒定區(qū)序列。例如，一種將D2E7或D2E7相關VH或 VL序列轉變成全長抗體基因的方法就是將它們插入分別攜帶有重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū) 的表達載體中，使得VH片段可操作地連接到載體的CH片段上，而VL片段可操作地連接到載體的CL片段上。此外，或者說另一種選擇，重組表達載體編碼一段信號肽，它有助于抗體鏈從宿主細胞中分泌出來?？贵w鏈基因可以克隆到載體中，使得信號肽按閱讀框連接到抗體基因的氨基端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽，也可以是異源信號肽(即非免疫球蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明重組表達載體攜帶的調節(jié)序列能調控抗體鏈基因在宿主細胞中的表達。術語“調控序列”包括啟動子，增強子以及別的表達控制元件(如多聚腺苷酸信號)，它們能控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯。這些調控序列在諸如Goeddel的“基因表達技術酶學方法” 185，Academic出版社，San Diego, CA(1990)這樣的文獻中介紹了。本領域的技術人員應該意識到表達載體的設計，包括調控序列的選擇依賴于所選擇轉化的宿主細胞，所需蛋白的表達水平等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調控序列包括病毒元件，它能指導蛋白在哺乳動物中高水平的表達，如衍生自巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子 /增強子)，猿病毒40 (SV40)(如SV40啟動子/增強子)，腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動子和/或增強子。對于病毒調控元件及其序列的進一步介紹參看Stinski的美國專利No5168062，Bell等人的美國專利No4510245以及Schaffnet 等人的美國專利No. 4968615。除了抗體鏈基因和調控序列，本發(fā)明的重組表達載體可以攜帶別的序列，如調控載體在宿主細胞中復制的序列(如復制起點)以及選擇標記基因。選擇標記基因有助于載體導入的宿主細胞的選擇(參看美國專利No4399216，4634665和5179017，所有的專利都是Axel等人的)。例如，典型的選擇標記基因使得載體導入的宿主對藥物如G418，潮霉素或氨甲蝶呤有抗性。優(yōu)選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用氨甲蝶呤在dhfr-宿主細胞中選擇/擴增)和neo基因(用G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，用標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉入宿主細胞。不同形式的術語“轉化”包括范圍廣的通用技術，這些技術將外源DNA導入原核或真核宿主細胞，如電穿孔，磷酸鈣沉淀，DEAE葡聚糖轉染等。盡管從理論上說，本發(fā)明的抗體可以在原核或真核宿主細胞中表達，但在真核細胞，尤其是哺乳動物宿主細胞中表達抗體是最優(yōu)選，因為真核細胞，尤其是哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配和分泌正確折疊并具有免疫活性的抗體。據(jù)報道抗體基因在原核細胞中不能有效地表達高產量有活性的抗體(Boss，M.A 和 Wood，C. R(1985)，Immunology Today6 12-13)。表達本發(fā)明重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)(包括在 Urlaub 和 Chasin(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216_4220 中介紹的 dhfr-細胞，它和DHFR選擇標記一塊使用，這和R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 601-621中介紹的一樣)，NSO骨髓細胞，COS細胞和SP2細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞時，培養(yǎng)宿主細胞一段時間，使得抗體在宿主細胞中表達，從而產生抗體，或者更優(yōu)選的是將抗體分泌到宿主細胞生長的培養(yǎng)基中。通過標準的方法從培養(yǎng)基中回收抗體。宿主細胞也能被用來產生完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子。應該可以理解上述方法的修改也在本發(fā)明的范圍之內。例如，用編碼本發(fā)明抗體輕鏈或重鏈(但不是一起)的DNA轉染宿主細胞是所需的。也可利用重組DNA技術來去掉輕鏈或重鏈或兩者編碼DNA中對結合hTNF α沒必要的部分或所有DNA。這些截短DNA表達的分子也包括在本發(fā) 明的抗體范圍之內。此外，利用標準的化學交聯(lián)方法將本發(fā)明的抗體和第二個抗體交聯(lián)，就能形成雙價的抗體，在這種抗體中，一條重鏈和一條輕鏈是本發(fā)明的抗體，而另外一條重鏈和輕鏈對非hTNF α抗原特異。在一個抗體或其抗原結合片段重組表達的優(yōu)選系統(tǒng)中，通過磷酸鈣介導轉染將編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體導入dhfr-CHO細胞中。在這個重組表達載體中，抗體重鏈和輕鏈每一條都可操作地連接到CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件上，驅動基因轉錄產物高水平表達。重組表達載體也攜帶有DHFR基因，使得能利用氨甲蝶呤來選擇/擴增轉染了載體的CHO細胞。培養(yǎng)選擇的轉化細胞，使得抗體重鏈和輕鏈表達，而后從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標準的分子生物學技術來制備重組表達載體，轉染宿主細胞，選擇轉化子，培養(yǎng)宿主細胞并從培養(yǎng)基中回收抗體。除了本發(fā)明公開的D2E7或其抗原結合片段或D2E7相關抗體，本發(fā)明的重組人抗體可以通過篩選重組組合抗體文庫進行分離，優(yōu)選的是scFv噬菌體展示文庫，利用人 VL和VH cDNAs制備，人VL和VHcDNAs是從人淋巴細胞mRNA中制備來的。制備和篩選這樣的文庫的方法是本領域眾所周知的。除了商業(yè)上購買的產生噬菌體展示文庫的試劑盒(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體文庫，目錄號No27-9400_01 ；以及Stratagene 的SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號No240612)，特別容易用來產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑可以在諸如Ladner等人的美國專利No. 5223409 ；Kang等人的PCT出版物No. W092/18619 ；Dower等人的PCT出版物No91/17271 ；Winter等人的PCT出版物
15No92/20791 ；Markland 等人的 PCT 出版物 No. W092/15679 ；Breitling 等人的 PCT 出版物 No. W093/01288 ；McCafferty 等人的 PCT 出版物 No. WO 92/01047 ；Garrard 等人的 PCT 出版物 No. W092/09690 ；Fuch 等人(1991) Bio/Technology9 1370-1372 ；Hay 等人(1992) HumAntibod Hybridomas 3 :81_85 ；Huse 等人(1989) Science246 1275-1281 ；McCafferty 等人，Nature(1990)348 :552_554 ；Griffiths 等人(1993)EMBO J12:725_734 ；Hawkins 等人(1992)J. Mol.Biol226 :889-896 ;ClackSon 等人(1991)Nature352624-628 ；Gram 等人(1992)PNAS89 :3576-3580 ;Garrard 等人(1991)Bio/Technology9 1373-1377 ； Hoogenboon 等人(1991)Nuc AcidResl9 :4133_4137 以及 Barbas 等人(1991)PNAS88 7978-7982這些文獻中找到。在一個優(yōu)選的實施方案中，為了分離對hTNFa具高親和力和低解離常數(shù)的人抗體，首先通過表位印記法，利用對hTNF α具高親和力和低解離常數(shù)的鼠源抗hTNF α抗體 (如ΜΑΚ195，雜交瘤，它的存貯號是ECACC87050801)來篩選具相似hTNFa結合活性的人重鏈和輕鏈序列，該方法在Hoogenboom等人的PCT出版物No. W093/06213中介紹了。這個方法中使用的抗體文庫優(yōu)選的是scFv文庫，它制備和篩選的方法和McCafTerty等人的PCT 出版物 No. W092/01047,McCafferty 等人 Nature (1990) 348 :552_554 以及 Griffiths 等人， (1993)EMB0J12 :725-734等文獻中介紹的一樣。scFv抗體文庫優(yōu)選的是用重組人TNF α做抗原進行篩選。一旦最初的人VL和VH片段被篩選出來，利用“混合與匹配”試驗來選擇優(yōu)選的 VL/VH配對組合物，在這個試驗中，通過和TNF α結合，選擇出不同對初篩的VL和VH片段。此外，為了進一步改善TNF α結合的親和力以及/或降低解離速率常數(shù)，優(yōu)選的VL/VH對中的VL和VH片段被隨機突變，優(yōu)選的是在VH和/或VL的CDR3區(qū)發(fā)生突變，突變過程和體內體細胞突變過程類似，體細胞突變是在天然免疫反應中，負責抗體親和力成熟的。利用和VH CDR3或VL CDR3分別互補的PCR引物，擴增VH和VL區(qū)，在體外完成親和力成熟，在 PCR引物的某些位置引入四種核苷酸的隨機混合物，使得產生的PCR產物能編碼VH和VL片段，在這些片段的⑶R3區(qū)，已經導入了隨機的突變。這些隨機突變的VH和VL片段能通過和hTNFa結合重新篩選，而那些對hTNFa結合表示出高的親和力和低的解離速率的序列能被選擇出來。從重組的免疫球蛋白展示文庫篩選和分離本發(fā)明的抗hTNFa抗體后，編碼選擇的抗體的核苷酸能從展示包裝(如噬菌體基因組)中回收，并通過標準的重組DNA技術亞克隆到別的表達載體中。如果有需要，可以對這些核酸作進一步操作，創(chuàng)造本發(fā)明別的抗體形式(如連接到編碼別的免疫球蛋白結構域的核酸上，如別的恒定區(qū))。為了表達通過篩選組合文庫獲得的重組的人抗體，編碼抗體的DNA被克隆到重組的表達載體，并導入哺乳動物宿主細胞，進一步詳細地介紹如上面的II部分。本發(fā)明的抗體和抗體部分以及用來治療自體免疫疾病的藥物可以分別混合，或混合成適合在本發(fā)明介紹的方法中施用給受試者的藥用組合物。典型的藥用組合物包括本發(fā) 明的抗體(或抗體部分)和/或一或多種藥物，這些藥物用來治療自體免疫性疾病，還包括藥用上可接受的載體。如本發(fā)明使用的那樣，“藥用上可接受的載體”包括任何以及所有溶劑，分散介質，涂層，抗細菌和抗真菌的試劑，等滲試劑以及吸收延遲試劑等，它們在生理上相容，并適合在本發(fā)明介紹的方法中施用給受試者。藥用上可接受的載體包括一或多種水，鹽，磷酸緩沖鹽，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它們的組合。在許多情況下，優(yōu)選的組合物中包括等滲試劑，例如，蔗糖，諸如甘露醇和山梨糖醇這樣的多元醇，或氯化鈉。藥用上可接受的載體可以進一步包括微量的輔助試劑，如潤濕劑或乳化劑，防腐劑或緩沖液，它們能增強抗體或抗體部分的貨架期或有效性。本發(fā)明的組合物可以有多種形式。這些形式包括液體，半固體，和固體劑型，如液體溶液(如注射和灌注液)，或分散性粉劑或懸浮液，藥片，藥丸，粉末，脂質體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于給藥的方式和治療應用。典型的優(yōu)選組合物形式是注射液或灌注液，如那些與別的抗體對人進行被動免疫的組合物一樣。優(yōu)選的給藥方式是腸胃外給藥方式(如靜脈內給藥，皮下給藥，腹膜內給藥，肌內給藥)。在一個優(yōu)選的實施方案中，含有抗體的組合物通過注射給藥。在另一個實施方案中，抗體通過肌內注射給藥。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，抗體通過皮下注射給藥。藥用組合物典型的是應該滅菌，并且在制造和貯存的條件下保持穩(wěn)定。組合物可以配制成溶液，微乳液，分散相，脂質體，或別的適合高藥濃度的規(guī)則結構。滅菌的注射液通過如下方式制備將溶解在合適溶劑中的活性化合物(抗體或抗體部分)按所需量和上面列舉的一種成份，或成分的組合物混合，然后進行過濾滅菌?？傊?，分散相的制備是將活性化合物混合到滅菌的載體中，該載體含有基本的分散介質，以及上面列舉的別的必需成分。為了制備用于配置滅菌注射液的滅菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這樣能從以前過濾滅菌的溶液中獲得活性成份粉末以及任何別的必須成份?？梢酝ㄟ^一些方法來保持溶液的流動性，如利用注入卵磷脂這樣的涂層，保持分散相中必須粒子的大小，以及利用表面活性劑。在注射組合物中添加能延長吸收的試劑，可以延長注射組合物的吸收，這樣的試劑如單硬脂酸鹽和明膠。本發(fā)明的抗體和抗體部分能通過各種本領域已知的方法施用，盡管有很多的治療用處，但優(yōu)選的給藥途徑/方式是皮下注射。熟練的技術人員將會意識到，給藥路線/方式是根據(jù)所需目的而變化的。在某些實施方案中，活性化合物和載體一塊制備，這樣就能防止化合物被快速降解，這樣制備如可釋劑型，包括植入物，穿透皮膚藥貼以及微膠囊傳輸系統(tǒng)?？梢允褂蒙锝到獾?，生物適合的多聚體，如乙烯-醋酸乙烯共聚物，聚乙二醇(PEG)，聚酸酐，聚羥基乙酸，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。許多制備這種制劑的方法都是專利，或一般是本領域的技術人員所已知的。參看“緩釋和控釋藥物傳輸系統(tǒng)”，J. R. Robinson編輯， Marcel Dekker 公司，紐約，1978。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以口服，例如，和惰性稀釋液，可同化的食用載體一起口服。也可將化合物(如果有必要的話，和別的成分)裝入一個硬或軟的貝殼明膠膠囊中，壓縮成藥片，或直接摻入受試者的食物中。對于口服治療，化合物可以和賦形劑混合在一起，使用的形式有可消化藥片，口含片劑，片劑，膠囊，酏劑，混懸劑，糖漿劑，糯米紙囊劑等。如果用非腸胃外方法施用本發(fā)明化合物，有必要用抑制化合物失活的物質包被化合物或和化合物一塊施用。也可在組合物中加入補充的活性化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分和一或多種別的治療試劑共同配制和/或共同施用。例如，本發(fā)明抗hTNFa抗體或抗體部分可以和一或多種DMARD，或一或多種NSAID，或一或多種別的能結合其它靶蛋白的抗體(如能結合其他細胞因子和細胞表面分子的抗體)，一或多種細胞因子，可溶性TNF α受體(參看PCT出版物No. W094/06476)，和/或一或多種能抑制hTNF α產量或活性(如在PCT出版物No. W093/19751中介紹的環(huán)己胺-ylidene衍生物)的化學物質或它們的任何組合物共同配制和/或共同施用。此外，本發(fā)明一或多種抗體可以和兩或多種前述的治療試劑組合使用。這種組合治療可以有利地施用更低劑量的治療試劑，這樣就能避免在患者中伴隨單一制劑治療出現(xiàn)的可能的副作用，并發(fā)癥或低水平反應。本發(fā)明的藥用組合物還包括“治療效應數(shù)量”或“預防效應數(shù)量”的本發(fā)明抗體或抗體部分和/或其他藥物?！爸委熜獢?shù)量”指的是在必要的劑量和時期中，數(shù)量能有效地達到所需的治療效果。治療效應數(shù)量可以根據(jù)諸如疾病狀態(tài)，年齡，性別和個體重量以及抗體或抗體部分或別的用來治療自體免疫疾病的藥物在個體中誘導所需反應的能力等因素而變化。治療效應數(shù)量也是這么一種數(shù)量，在這種數(shù)量上，抗體或抗體部分或其他藥物的副作用被有利的作用超過?！邦A防效應數(shù)量”指的是在必要的劑量和時期中，數(shù)量能有效地達到所需的預防效果。典型地，因為預防劑量是在疾病的更早期或之前施用給受試者，因此，預防效應數(shù)量要小于治療效應數(shù)量。調整劑量方案，提供最優(yōu)的所需反應(例如治療或預防反應)。例如，可以一次施用大丸劑，可以在一段時間內施用若干次劑量，也可以根據(jù)治療狀態(tài)的情況按比例減少或增加劑量。把腸胃外組合物配制成劑量單位形式是特別有利的，給藥簡單，劑量一致。本發(fā) 明使用的劑量單位形式指的是生理上不連續(xù)的單位，它適合作為要治療的受試者的單一劑量，每個單位含有預定數(shù)量的活性化合物，計算它能和必需的藥用載體產生所需的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格是根據(jù)和直接依賴于(a)活性化合物的唯一特征和將要達到的特定治療或預防效果而規(guī)定的，(b)混合這種活性化合物領域的內在限制，這種化合物能治療個體的敏感性。本發(fā)明抗體或抗體部分的示范性，沒有限制的治療或預防效應數(shù)量范圍是 IO-IOOmg,更優(yōu)選的是20-80mg，最優(yōu)選的是40mg。應該注意到劑量值是隨著狀態(tài)減輕的類型和嚴重性而變化的。應該進一步理解，對于任何特定的目的，一段時間內根據(jù)個體的需要和控制或監(jiān)督組合物的施用的人的職業(yè)判斷，可以調整特定的劑量方案，而且本發(fā)明提出的劑量范圍只是示范性的，并不打算限制本發(fā)明聲稱權力要求的組合物的范圍和實踐。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以結合的治療類風濕性關節(jié)炎的試劑包括如下非類固醇類抗炎藥(NSAIDs)，細胞因子抑制抗炎藥(CSAIDs) ；CDP-571/BAY-10-3356 (人源抗 TNFa 抗體，Ce 11 tech/Bayer) ； cA2 (嵌合的抗 TNF α 抗體，Centocor) ； 75kdTNFR_IgG (75kDa TNF ^ # -IgG ^ S S ；Immunex ；參 # Arthritis & Rheumatism(1994) Vol 37, S295 J Invest. Med(1996)Vol 44，235A) ；55kd TNFR-IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ； IDEC-CE9. 1/SB210396 (非損耗性靈長源抗 CD4 抗體；IDEC/ SmithKline ；參看 Arthritis & Rheumatism(1995)Vol38, S185) ；DAB486-IL-2 和 / 或 DAB389-IL-2 (IL-2 ^ S S ；Seragen ；參 # Arthritis & Rheumatism(1993)Vol36， 1223) ；Anti-Tac (人源抗-IL-2R α ；Protein Design Labs/Roche) ；IL_4(抗炎性細胞因子；DNAX/Schering) ； IL-10 (SCH52000，重組 IL-10，抗炎性細胞因子，DNAX/Schering)； IL-4 ；IL-IO和/或IL-4激動劑(激動劑抗體)；IL-1RA(IL_1受體激動劑；Synergen/ Amgen) ；TNF_bp/s_TNFR(可溶性的 TNF 結合蛋白；參看 Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39, No9( ±曾干Ij )， S284 ；Amer. J. Physiol-Heart and CirculatoryPhysiology (1995)
18Vol26837-42 頁)；R973401 (磷酸二酯酶 IV型抑制劑，參看Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39, No9(增刊)，S282)；氨甲蝶呤；沙利度胺(參看 Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39, No9(增刊)，S282)以及沙利度胺相關藥物(如Celgen)；來氟米特(抗炎癥和細胞因子抑制劑，參看 Arthritis & Rheumatism (1996) Vol 39，No9 (增刊)，S131 ； Inflammation Research (1996) 45卷，103-107頁)；氨甲環(huán)酸(纖溶酶原激活抑制劑，參看 Arthritis &Rheumatism(1996) Vol 39，No9 (增刊)，S284) ；T-614 (細胞因子抑制劑，參看 Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39，No9 (增刊)，S282)；前列腺素 El (參看 Arthritis & Rheumatism(1996)Vol39，No9(增刊)，S282)；替尼達普(非類固醇類抗炎藥，參看 Arthritis & Rheumatism(1996)Vol39, No9(增刊)，S280)；萘普生(非類固醇類抗炎藥，參看NeuroR印ort (1996)第7卷，1209-1213頁)；美洛昔康(非類固醇類抗炎藥)；布洛芬 (非類固醇類抗炎藥)；吡洛昔康(非類固醇類抗炎藥)；雙氯芬酸(非類固醇類抗炎藥)；吲哚美辛(非類固醇類抗炎藥)；柳氮磺吡啶(參看Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39， No9(增刊)，S281)；硫唑嘌呤參看 Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39，No9 (增刊)， S281) ；ICE抑制劑(白介素1 β轉化酶抑制劑)；zap-70和/或Ick抑制劑(酪氨酸激酶 zap-70或Ick抑制劑)；VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑(血管內皮細胞生長因子或血管內皮細胞生長因子受體抑制劑；血管生成抑制劑)；皮質類固醇抗炎藥(如SB203580)； TNF 轉換酶抑制劑；抗 IL-12 抗體；白介-11 (參看 Arthritis &Rheumatism(1996) Vo 139, Νο9(增刊)，S296)；白介-13 (參看 Arthritis & Rheumatism (1996) Vol39，No9 (增刊)， S308)；白介-17 抑制劑(參看 Arthritis & Rheumatism(1996) Vol39，No9 (增刊)，S120)；金，青霉胺，氯喹，羥化氯喹，苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢霉素，全淋巴照射，抗胸腺細胞球蛋白，抗CD4抗體，CD5毒素，口服肽和膠原蛋白，氯苯扎利鈉，細胞因子調節(jié)試劑(CRAs) HP228和HP466 (Houghten Pharmaceuticals公司)；ICAM-I反義硫代磷酸酯寡核苷酸 (ISIS 2302 ；Isis Pharmaceuticals 公司)；可溶性補體受體 KTPlO ；T Cell Science 公司)；強的松；奧古蛋白，氨基葡聚糖聚硫酸，二甲胺四環(huán)素，抗IL2R抗體，魚油和植物油 (魚和植物種子脂肪酸，參看 Deluca 等人(1995) Rheum. Dis. Clin. North Am21 759~777)；金諾，，苯基丁氮酮，甲氯滅酸，氟滅酸，靜脈注射免疫球蛋白，齊留通，霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(Π(-506)；西羅莫司(雷帕霉素)；安普立糖(therafectin)；克拉屈濱(2_氯脫氧腺苷)以及阿扎立平。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以結合的治療炎癥性腸病的試劑包括如下布地奈德，表皮生長因子，皮質類固醇；環(huán)孢素；柳氮磺吡啶，對氨基水楊酸，6-巰基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂氧合酶抑制劑，美沙拉嗪，奧沙拉秦，巴柳氮，抗氧化劑，血栓烷抑制劑， IL-I受體拮抗物，抗-IL-I β單克隆抗體；抗-IL-6單克隆抗體，生長因子；彈性蛋白酶抑制劑，吡啶基咪唑化合物，CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNFa抗體，Celltech/ Bayer) ；cA2 (嵌合的抗 TNF α 抗體，Centocor) ；75kdTNFR_IgG (75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Immunex ；參看 Arthritis & Rheumatism(1994) Vol37, S295 ;J Invest. Med (1996) Vol44,235A) ；55kd TNFR-IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；白介素-10(SCH52000 ;Schering Plough) ；IL-4 ;IL_10 和 / 或 IL-4激動劑(激動劑抗體)；白介素-11 ；葡萄糖醛酸甙或右旋糖苷交聯(lián)的潑尼松龍前藥，地塞米松或布地奈德，ICAM-I反義硫代磷酸酯寡核苷酸(ISIS 2302 ；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性補體受體1 (TP10 ；T Cell Science公司)；緩慢釋放的美沙拉嗪，血小板激活因子(PAF)拮抗物，環(huán)丙沙星和利諾卡因。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以結合的治療多發(fā)性硬化癥的試劑包括如下皮質類固醇，潑尼松龍，甲潑尼龍，硫唑嘌呤，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢(菌)素，氨甲蝶呤，4-氨基吡啶，替扎尼定，干擾素- β la(Avonex , Biogen)；干擾素- β lb (Betaseron , Chiron/Berlex)；共
1 (Cop-1 ；CopaxoneTM,Teva Pharmaceutical Industries ^W]) ; i^J￡fl，身寸;^貞王求蛋白，克拉屈濱，CDP-571/BAY-10-3356 (人源化的抗 TNF α 抗體，Celltech/Bayer) ；cA2 (嵌合的抗 TNFa 抗體，Centocor) ；75kdTNFR_IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Immunex ；參看Arthritis & Rheumatism(1994) Vol37,S295 ;J Invest. Med (1996) Vol44, 235A) ；55kd TNFR-IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ；IL-10 ;IL_4 ;IL_10 和 / 或 IL-4激動劑(激動劑抗體)。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以結合的治療敗血癥的試劑包括如下高滲鹽溶液，抗生素，靜脈注射r-免疫球蛋白，持續(xù)血液過濾，卡巴培南類藥物(美羅培南)，諸如TNF α， IL-β，IL-6和/或IL-8這樣的細胞因子的拮抗物，CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗 TNFa 抗體，Celltech/Bayer) ；cA2 (嵌合的抗TNF α 抗體，Centocor) ；75kdTNFR_IgG (75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Immunex;參看 Arthritis & Rheumatism(1994)Vol37， S295 J Invest.Med(1996)Vol44,235A) ；55kd TNFR-IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；細胞因子調節(jié)試劑(CRAs) HP228 和 HP466 (Houghten Pharmaceuticals 公司)；SMFlO7M7 (低分子量肽，SmithKline Beecham)；四價脈基腙 CNI-1493 (Picower研究所)，組織因子通路阻抑因子(TFPI，Chiron) ；PHP (化學修飾的血色素；APEX Bioscience)；鐵結合劑和螯合物，包括二乙烯三胺五乙酸鐵(III)復合物(DTPA 鐵(III) ；Molichem Medicines)；利索茶堿(合成的小分子甲基黃嘌呤；Cell Therapeutic 公司)；PGG葡聚糖(水溶性的β1，3葡聚糖，α-β技術)；脂質重構的載脂蛋白Α-1，抗內毒素抗體，Ε5531 (合成的脂質A拮抗物，Eisai America公司)；rBPI21 (人殺菌/通透性增加蛋白重組的N末端片段)；以及合成的抗內毒素肽(SAEP5BiosYnth Research實驗室)。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可以結合的治療成人呼吸窘迫綜合征的試劑包括如下抗IL-8抗體，表面活性劑補充療法，⑶P-571/BAY-10-3356 (人源化的抗TNF α 抗體，Celltech/Bayer) ；cA2(嵌合的抗 TNF α 抗體，Centocor) ；75kdTNFR_IgG (75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白；Immunex ；參看 Arthritis & Rheumatism(1994)Vol37，S295 ； J Invest. Med(1996)Vol44,235A) ；55kd TNFR-IgG(75kDa TNF 受體-IgG 融合蛋白； Hoffmann-LaRoche)?？筎NF α抗體和一或多種其他藥物紐合物的施用取決于疾病是否被TNF α抑制所影響。本發(fā)明使用的術語“抗TNFa抗體的施用對其有利的疾病”包括疾病和別的代謝紊亂，在這些疾病和代謝紊亂中，有證據(jù)顯示或猜測代謝紊亂的供使者中的TNFa對疾病的病理生理學發(fā)揮作用或是使疾病惡化的因素，另外一種抗TNF α抗體或其聚生物活性部分成功地用來治療這種疾病。因此，在TNFa活性被損害的疾病中，抑制TNF α活性能減緩疾病的癥狀或進展，或兩種情況都能減緩。這樣的疾病很明顯，例如，在患疾病的受試者生物流體中，TNFa的濃度上升(例如，受試者血清，血漿，關節(jié)液等中的TNF α的濃度上升)，這可以檢測到，例如，如上面所述利用抗TNFa抗體。這種疾病的例子很多，在這些疾病中，TNFa的活性被削弱了。A.敗血癥腫瘤壞死因子在敗血癥病理生理學中的作用已經得到公認，它的生理學效果包括血壓過低，心肌抑制，血管滲出癥，器官壞死，刺激有毒刺激介質的釋放和凝血瀑布反應的激活(參看，Tracey, K. J.和 Cerami，Α. (1994)Annu. Rev. Med. 45 :491_503 ；Russell, D 和 Thompson, R. C (1993) Curr. Opin. Biotech4 :714_721)。因此，本發(fā)明的人抗體及抗體部分可以用來治療任何臨床環(huán)境下的敗血癥，包括敗血癥休克，內毒素性休克，革蘭氏陰性敗血癥，中毒性休克綜合征。優(yōu)選的是抗體和抗體部分與用在治療敗血癥中的其他藥物一起使用。更優(yōu)選的是其中的抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為 40mg，和別的用于治療敗血癥的藥物一起使用。此外，為了治療敗血癥，本發(fā)明的抗TNF α的抗體或抗體部分可以和一或多種別的治療試劑一起給藥，可以進一步減緩敗血癥，別的治療試劑如白介素-1抑制劑(如那些在PCT出版物No. W092/16221和W092/17583中介紹的)，細胞因子白介素_6 (參看PCT出版物No. W093/11793)或血小板激活因子拮抗物(參看歐洲專利申請出版物No. ΕΡ374510)。此外，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗TNFa的抗體或抗體部分施用給敗血癥患者亞群中的受試者，這些患者在治療時IL-6的血清或血漿濃度高于500pg/ml，而更優(yōu)選的是1000pg/ml (參看Daum，L等人的PCT出版物No. W095/20978)。B.自體免疫性疾病已經暗示腫瘤壞死因子在不同的自體免疫性疾病的病理生理中發(fā)揮了作用。例如，已經暗示TNFa在類風濕性關節(jié)炎中能引起組織炎癥壞死和關節(jié)破壞(參看Tracy 和 Cerami，同上，Arend，W. P.和 Dayer，J-M(1995) Arth. Rheum. 38 151-160 ；Fava, R. A 等人(1993)Clin. Exp. Immunol94 :261-266)。此外，也暗示TNFa能促進胰島細胞死亡和介導糖尿病中胰島素的抗性(參看Tracy和Cerami，同上，PCT出版物No. W094/08609)。此外，還暗示TNFa能介導對少突膠質細胞的細胞毒性，并且在多發(fā)性硬發(fā)癥中的誘導炎癥病斑(參看Tracy和Cerami，同上)。對嵌合和人源化的鼠源抗hTNF α抗體是否能治療類風濕性關節(jié)炎已經進行了臨床試驗(參看，Elliott, Μ. J等人(1994)Lancet 344 1125-1127 ；Elliot, Μ. J 等人(1994)Lancet344 :1105_1110 ；Rankin, Ε. C 等人(1995) Br.J. Rheumatol. 34 :334_342)。本發(fā)明的抗體，或抗體部分能被用來治療自體免疫性疾病。這些抗體或抗體部分和別的用來治療自體免疫性疾病的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療自體免疫性疾病的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。尤其是那些伴隨有炎癥的自體免疫性疾病，包括類風濕性關節(jié)炎，類風濕性脊椎炎，骨性關節(jié)炎和痛風性關節(jié)炎，過敏癥，多發(fā)性硬發(fā)癥，自體免疫性糖尿病，自體免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征。典型的，抗體或抗體部分是系統(tǒng)性給藥，盡管對于某些疾病，在炎癥位點局部施用抗體或抗體部分是有利的(如在類風濕性關節(jié)炎中局部施用到關節(jié)上，或局部施用給糖尿病潰瘍，單獨施用或和環(huán)己胺-ylidene衍生物組合施用，它在PCT出版物NO.W093/19751中介紹了)。C.傳染病暗示腫瘤壞死因子參與介導不同傳染病中的各種生物學效應。例如，暗示TNFa能介導大腦炎癥，以及微血管血栓和瘧疾中梗塞形成(參看Tracy和Cerami，同上)。也暗示TNFa能介導大腦炎癥，血腦屏障的崩潰，引發(fā)敗血癥休克癥狀以及激活腦膜炎的靜脈梗塞(參看Tracy和Cerami，同上)。也暗示TNFa能誘導惡病質，刺激病毒擴增以及介導獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)中中樞神經系統(tǒng)損傷(參看Tracy和Cerami，同上)。因此，本發(fā)明的抗體，抗體部分能用來治療傳染病?？贵w或抗體部分優(yōu)選的是能和別的用在傳染病治療上的藥物組合施用。更優(yōu)選的是其中的抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療傳染病的藥物一起使用。具體而言，細菌性腦膜炎(參看歐洲專利申請出版物No. EP585705)，腦型瘧疾，AIDS和AIDS相關復合物(ARC)(參看歐洲專利申請出版物No. EP230574)，以及移植后出現(xiàn)的巨細胞病毒感染(參看Fietze， E等人(1994)Transplantati0n58 :675_680)。本發(fā)明抗體，和抗體部分也能用來減緩伴隨傳染病的癥狀，包括有感染而引發(fā)的發(fā)燒和肌肉疼痛(如流行性感冒)和感染后出現(xiàn)的惡病質(如AIDS或ARC后)。D.移植暗示腫瘤壞死因子是同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的關鍵介質，還介導當大鼠抗體0KT3被用來抑制腎移植的排斥反應時出現(xiàn)的不利反應，0KT3 抗T細胞受體CD3復合物(參看，Tracey和Cerami同上，Eason, J. D等人(1995) Transplantation59 :300_305 ；Suthanthiram，M 禾口 Strom，T. B (1994) New Engl. J. Med. 331 365-375)。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分能用來抑制移植排斥反應，包括同種異體移植排斥和異種移植排斥以及抑制移植物抗宿主疾病。這些抗體或抗體部分和別的用來治療移植排斥的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療移植排斥的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與0KT3組合施用去抑制0KT3 誘導的反應。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分和一或多種抗體組合施用，這些抗體定向別的靶蛋白，參與調節(jié)免疫反應，如細胞表面分子CD25(白介素2α受體)， CDlla(LFA-I)，CD54 (ICAM-I)，CD4，CD45, CD28/CTLA4, CD80 (Β-7)和 / 或 CD86 (Β7-2)。還是在另外一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分和一或多種一般的免疫抑制劑，如環(huán) 孢素A或Π(506組合施用。Ε.惡性腫瘤暗示腫瘤壞死因子能誘導惡病質，刺激腫瘤生長，增強轉移的潛力以及介導惡性腫瘤的細胞毒性(參看Tracy和Cerami，同上)。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長或轉移，或減緩惡性腫瘤引發(fā)的惡病質，或兩者都能達到。這些抗體或抗體部分和別的用來治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長或轉移，或減緩惡性腫瘤引發(fā) 的惡病質，或兩者都能達到的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中 D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長或轉移，或減緩惡性腫瘤引發(fā)的惡病質，或兩者都能達到的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu) 選的。抗體或抗體部分可以系統(tǒng)性地或局部地施用到腫瘤位點。F.肺部疾病暗示腫瘤壞死因子在成人呼吸窘迫綜合征發(fā)揮作用，包括刺激白細胞內皮細胞激活，產生對肺泡細胞的細胞毒性，以及誘導血管滲出綜合征(參看Tracy和Cerami，同上)。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療不同的肺部疾病。這些抗體或抗體部分和別的用來治療肺部疾病的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療肺部疾病的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。具體而言，成人呼吸窘迫綜合征(參看PCT出版物NO.W091/04054)，休克肺，慢性肺部炎癥疾病，肺類肉瘤病，肺纖維化和硅肺病?？贵w或抗體部分可以系統(tǒng)性地或局部地施用到肺表面，例如可以以氣霧劑的形式施用。G.消化腸道的病癥暗示腫瘤壞死因子在炎癥性腸病病理生理學中發(fā)揮作用(參看Tracy，K. J等人(1986)，Science234:470_474 ；Sun, X-M 等人(1988)J. Clin. Invest81 1328-1331 ； MacDonald, Τ· T.，等人(1990) Clin. Exp. Immunol81 :301_305)。對嵌合鼠源抗 hTNF α 抗體是否能治療克隆氏癥已經進行了臨床試驗(van Dullemen, H. M等人(1995) Gastroenterologyl09 129-135)。本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療消化腸道的病癥。這些抗體或抗體部分和別的用來治療消化腸道的病癥的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu) 選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療消化腸道的病癥的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。具體而言，原發(fā)性發(fā)炎性腸道疾病，這種病包括兩種綜合癥克隆氏癥和潰瘍性結腸炎。H.心臟疾病本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療不同的心臟疾病，包括心臟缺血(參看歐洲專利申請出版物NO.EP453898)以及心臟功能不全(心肌削弱)(參看PCT出版物 No. W094/20139)。這些抗體或抗體部分和別的用來治療心臟疾病的藥物一起使用，這是優(yōu) 選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療心臟疾病的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。I.神經疾病本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療神經疾病。這些抗體或抗體部分和別的用來治療神經疾病的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療神經疾病的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。實驗證據(jù)表明神經元組織的受損會釋放過多的TNF。因此，使用TNF拮抗物將會導致這些神經狀態(tài)的改善。由髓鞘脫失性疾病(如多發(fā)性硬發(fā)癥)，免疫疾病，炎癥，損傷或壓迫癥而引發(fā)的神經疾病發(fā)生的臨床形式不一樣，這取決于解剖部位，病因以及生理問題發(fā) 生的自然史。所有這些疾病共同的特征是他們能引起持久的神經損傷，這種損傷發(fā)生的很快，并且不可逆，而且目前對這些疾病的治療并不理想，通常需要手術或使用藥物，或兩種都需要，而這經常并不是完全成功的。這些神經疾病包括急性脊髓外傷，脊髓壓迫，脊髓血腫，脊髓挫傷(這些病例通常是外傷造成的，如車禍或運動傷害造成的)，神經壓迫，最普遍的是椎間盤突出引起的坐股神經壓迫，神經病和疼痛；也包括頸椎間盤突出，它能引起頸部神經壓迫，腕管綜合癥(無RA的)；由癌癥引發(fā)的急性或慢性脊髓壓迫(通常是因為轉移到了脊柱，例如從前列腺癌，乳癌或肺癌)；神經系統(tǒng)自體免疫性疾病，以及髓鞘脫失性疾病，最常見的情況是多發(fā)性硬發(fā)癥。別的用于治療神經疾病的藥物有類固醇類藥物，如可的松，它用來治療前述的神經問題和狀態(tài)。進一步的用來治療神經疾病，創(chuàng)傷，損傷以及壓迫的藥用化學物質，化合物以及試劑，具有不同的有機結構和代謝功能，它們在諸如美國專利No5756482和5574022這樣的文獻中公開了，它們整體被引作本發(fā)明的參考，它們公開了一些方法，這些方法通過共同使用固醇類激素或諸如孕烯醇酮和硫酸孕烯醇酮這樣的類固醇前體物質與諸如吲哚美辛這樣的非固醇類抑炎藥物來削弱對損傷對神經系統(tǒng)和脊髓的生理傷害。J.別的疾病本發(fā)明的抗體或抗體部分被用來治療別的不同的疾病，在這些疾病中，TNFa的活性是有害的。別的由TNFa參與了病理生理學，因此用本發(fā)明的抗體或抗體部分進行治療的疾病和代謝紊亂包括發(fā)炎性骨病和骨骼溶蝕疾病(參看Bertoline，D. R等人(1986) Nature319 516-518 ；Konig, k 等 J^ (1988) J. Bone. Miner. Res. 3 621-627 ；Lerner, U. H 和 Ohlin, A(1993)J. Bone. Miner. Res. 8 :147_155 ；和 Shankar, G 和 Stern, P. H(1993) Bonel4 :871_876)，肝炎，包括酒精性肝炎(參看 McClain, C. J 和 Cohen, D. A (1989) H印atology9 :349_351 ；Felver, Μ· E 等人(1990)Alcohol. Clin. Exp. Resl4 :255_259 和 Hansen, J 等人(1994)H印atology20 :461_474)和病毒性肝炎(Sheron, N.等人(1991) J. Hepatol. 12 :241_245 ；和 Hussain, Μ. J 等人(1994) J. Clin. Pathol47 :1112_1115)，凝血紊亂(參看 vander Poll, T 等人(1990)N. Engl. J. Med322 :1622_1627 ；和 van der Poll, T 等人(1991)Prog. Clin. Biol. Res 367 :55_60)，燒傷(參看 Giroir, B. P 等人(1994) Am. J. Physiol. 267 :H118_124 ；禾口 Liu, X. S 等人(1994) Burns20 40-44)，再灌注損傷(參看 Scales, W. E 等人(1994)Am. J. Physiol. 267 :G1122_1127，Serrick, C 等人(1994) Transplantation58 1158-1162 ；和 Yao. Y. M 等人(1995) Resuscitation29 157-168)，形成疤痕(參看McCauley，R. L等人(1992) J. Clin. Immunol 12 :300_308)，疤痕組織形成和發(fā) 熱。這些抗體或抗體部分和別的用來治療各種紊亂和疾病的藥物一起使用，這是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是抗體是D2E7。其中D2E7通過皮下給藥，每兩周一次，每次劑量為40mg，和別的用于治療各種紊亂和疾病的藥物一起使用，這甚至是更優(yōu)選的。本發(fā)明可以通過下列實施例進一步例證，這些實施例不是一種限制。本申請通篇都引用的參考文獻，專利和出版的專利申請整體被引作本發(fā)明的參考。前述和下列公開內容都能應用，并且是可能的，在這種情況下，這種組合在本發(fā)明的范圍之內，即便這種組合沒有被陳述。
實施例設計并實施研究來調查D2E7的安全性和效力，每隔一周給RA患者施用一次D2E7，這些患者的疾病用目前的抗風濕治療藥(包括已經接受的DMARDs，NSAIDs或類固醇類藥物)不足以治療，而且這個研究是多中心的，隨機的，雙盲的，有安慰劑控制的研究，在這個研究中，D2E7每隔一周施用給患類風濕性關節(jié)炎的患者，每次劑量40mg，持續(xù)多達24周，這些患者的疾病用目前的抗風濕治療藥不足以治療。研究中允許使用的抗風濕治療藥包括已經接受的疾病改善抗風濕病藥物(DMARDs)，非類固醇類的消炎藥(NSAIDs)，或類固醇。盡管使用了抗風濕治療藥，但患者在篩選和基礎訪視時，都必須記錄到活動性疾病。DMARDs以及并行施用的潑尼松(每天彡IOmg)和NSAIDs在篩選前至少28天內必須是穩(wěn)定施用的。此外，使用硫唑嘌呤或環(huán)孢素，或兩種藥都使用的患者應該終止這些療法，并在篩選前經過28天的未用藥期。在基預訪視時，患者隨機施用D2E7或安慰劑，這意味著開始了 24天的安慰劑控制的時期。在研究的第2，4，8，12，16，20和24周檢查患者。不能滿足或保持美國風濕病學會20%改善標準(ACR20)反應的患者允許在DMARD或類固醇治療藥或者兩種藥物的劑量上有一次增長，在參與研究后3個月用另外一種DMARD進行治療，或在咨詢Knoll醫(yī)療監(jiān)護后作進一步的調整。750位患者參予登記，隨機選擇636位患者，578位患者完成研究，分析636位患者的結果。相反，所有隨機挑取的患者均包括在人口統(tǒng)計學和安全分析中?；颊咭呀洿_切診斷患RA至少3個月(根據(jù)1987年修訂的ACR標準進行定義)處于ACR功能I類，II類或III類。這些患者的疾病用目前的抗風濕治療藥不足以治療，且患者具有活動性RA，腫脹關節(jié)數(shù)>6，觸痛關節(jié)數(shù)>9。此外，如果劑量與每天彡IOmg潑尼松相當，并且至少28天保持不變，那么使用糖皮質激素的患者也被考慮進行本研究。D2E7用2ml的玻璃瓶提供(每個玻璃瓶中D2E7的濃度是25mg/mL(即 40mg/l. 6mL))，每個玻璃瓶中含有1. 6mL用于注射的溶液，其中含有40mgD2E7。D2E7是由在奧地利的 Unterach 的 EbeweArzneimittel GmbH 制造和提供。美國 MD，Rockvile HBOC Bioscience的McKesson負責D2E7的包裝，貼標簽，貯存并把D2E7分發(fā)給每個地方參與這項研究的研究者。D2E7可以由受試者自己施用，每隔一周通過皮下一次注射40mg，持續(xù)24 周。研究藥物的濃度是25mg/mL。安慰劑/1. 6mL (不含D2E7的枸椽酸鹽-磷酸鹽緩沖液) 由受試者自己施用，每隔一周皮下注射一次，持續(xù)24周?；颊叱掷m(xù)接受研究前的抗風濕治療藥物劑量。研究中允許使用的抗風濕治療藥包括DMARDs (羥基氯喹，來氟米特，氨甲蝶呤，腸胃外用的金，口服的金以及柳氮磺吡啶或者這些藥物的組合以及與其他DMARDs的組合)，NSAIDs及類固醇。DMARDs以及并行施用的潑尼松(每天彡IOmg)和NSAIDs在篩選前至少28天內必須是穩(wěn)定的。盡所有的努力讓患者能完成24周安慰劑控制期間的研究。因為這個方案是設計來反映目前臨床的實踐，因此，下列附加的治療和劑量調整是允許的在研究的最初3個月，可以允許最多3次關節(jié)內注射類固醇類藥物，在每次注射后 28天的關節(jié)檢查期內，不對注射的關節(jié)進行評估。因為耐受性，因此在研究中背景DMARDs和/或類固醇或NSAID治療藥可以調整一次，進一步的劑量調整只有在咨詢Knoll醫(yī)療監(jiān)護后才能開始。如果記錄到了效力缺乏(即和基礎訪視比較后，不能達到ACR20反應)，可進行下列步驟背景DMARD和/或類固醇治療藥(假設潑尼松的劑量保持彡IOmg/天)的劑量會
有一次增加。在3個月時，或3個月后，開始上列別的DMARD治療。背景抗風濕藥物進一步的劑量調整只有在咨詢Knoll醫(yī)療監(jiān)護后才能開始。使用硫唑嘌呤或環(huán)孢(菌)素，或兩種藥都使用的患者應該終止這些治療藥，并在篩選前進行28天的不用藥期。在研究中不能使用這些治療藥。并行施用的治療藥的定義是那些在研究之前使用，并在研究中持續(xù)施用的治療藥，或在研究中開始施用的治療藥。對所有隨機的患者在優(yōu)選的時期，由治療小組提出并行施用的治療藥。根據(jù)CRF研究者的說明提示，并行施用的治療藥被分成“RA特異的”和“非RA特異的”。在研究中，所有的患者都并行施用了某種形式的RA特異藥物(DMAR或非DMAR)。RA特異的并行DMARD治療藥對所有的隨機患者以優(yōu)選的方式及治療小組描述并行DMARD治療，結果示于表1中。表1隨機治療小組中用最頻繁報道*的RA特異的DMARD并行治療的患者數(shù)目(％ ) a在全部的彡5%的患者中出現(xiàn)b惡者可出現(xiàn)于一個以上組別在研究中，大多數(shù)隨機挑取的患者(636個人中有531個[83. 5% ])使用了一或多種并行DMARD治療藥物(318個D2E7治療的患者中有261個[82. 1% ],318個安慰劑治療的患者中有270個[84. 9% ])?？倲?shù)為105的患者沒有使用DMARDs(318個D2E7治療的患者中有57個[17.9% ]，318個安慰劑治療的患者中有48個[15. ])，356(636的 56.0%)個患者施用一種DMARD (318個D2E7治療的患者中有184個[57. 9% ],318個安慰劑治療的患者中有172個[54. 1% ])，而175個患者(636的27. 5%)使用了 2_4種不同的 DMARDs (318個D2E7治療的患者中有77個[24. 2% ],318個安慰劑治療的患者中有98個 [30. 8% ])。在研究中，D2E7治療組使用了平均1. 10種的DMARDs，而安慰劑治療組使用了平均 1. 21種不同的DMARDs。最頻繁報道的并行DMARD治療藥是氨甲蝶蛉，636個患者中的377個使用 (59. 3%) (318個D2E7治療的患者中有178個[56.0%]，318個安慰劑治療的患者中有199 個[62.6%]) 了這種藥物。另外三個最常用的并行DMARD治療藥是抗瘧藥(即氯喹，羥基氯喹)(59. 3% ) (636個患者中的24. 7% :318個D2E7治療的患者中的23.6%，318個安慰劑治療的患者中的25.8% )，來氟米特(636個患者中的13.8%:318個D2E7治療的患者中的13. 2%，318個安慰劑治療的患者中的14.5%),以及柳氮磺吡啶(636個患者中的9. 7% 318個D2E7治療的患者中的9. 1 %，318個安慰劑治療的患者中的10. 4% )。在使用RA特異的并行DMARD治療藥的頻率方面，D2E7治療和安慰劑治療的患者沒有相應的差異。RA特異的非DMARD并行治療藥對所有的隨機患者以優(yōu)選的方式及治療小組描述RA特異的非DMARD并行治療，結果示于表2中。表2隨機治療小組中用最頻繁報道*的RA特異的非DMARD并行治療的患者數(shù)目 (%)
26
至少一種相關IU特異的并行非DMARD治療
潑尼松
葉酸
塞來考昔羅非考昔對乙酰氨基酚萘普生布洛芬曱潑尼龍曲馬多 Di-gesic 雙氯盼酸唯寇錠曲安西龍利多卡因
m141BB77艄9 S32BM1717 14W10
SSSS1S3SII
棚 W S S s 3 5 27Μ11 Ε S 1522
a在全部的> 5%的患者中出現(xiàn) b患者可出現(xiàn)于一個以上組別
在研究中，636個隨機患者中總數(shù)為619的患者(97. 3% )使用了-
-或多種并行非
DMARD治療藥物(318個D2E7治療的患者中有315個[99. 1% ],318個安慰劑治療的患者中有 304 個[95. 6% ])。最頻繁報道的并行非DMARD治療藥是潑尼松，636個患者中的287個使用 (45. 1%) (318個D2E7治療的患者中有141個[44. 3%]，318個安慰劑治療的患者中有146 個[45.9% ])這種藥物。另外一個最常用的并行非DMARD治療藥是葉酸(636個患者中的 27. 4%:318個D2E7治療的患者中的27. 7%, 318個安慰劑治療的患者中的27. 0% )。(葉酸被歸類為RA特異的非DMARD并行治療藥或非RA特異的治療藥，取決于它在CRF記錄的含義，對于所有不是RA的用藥而言，葉酸被歸類為非RA特異的治療藥)。塞來考昔(636 個患者中的25. 2 % 318個D2E7治療的患者中的24. 2 %，318個安慰劑治療的患者中的 26. )，和羅非考昔(636個患者中的13. 2%:318個D2E7治療的患者中的14. 2%，318個安慰劑治療的患者中的12. 3%)是另外兩種最常用的RA特異的并行非DMARD治療藥。在使用RA特異的并行非DMARD治療藥的頻率方面，D2E7治療和安慰劑治療的患者沒有相應的差異。非RA特異的并行治療藥對所有的隨機患者以優(yōu)選的方式和治療小組描述非RA特異的并行治療藥。636個隨機患者中總數(shù)為614個的患者(96. 5% )使用了一或多種非RA特異的并行治療藥(318個D2E7治療的患者中有306個[96. 2% ]，318個安慰劑治療的患者中有308 個[96.9% ])。最頻繁報道的非RA特異的并行治療藥是多種維生素，636個患者中的166個使用 (26. 1% ) (318個D2E7治療的患者中有78個[24. 5% ]，318個安慰劑治療的患者中有88 個[27. 7% ]) 了這種藥物。另外三個最常用的非RA特異的并行治療藥是鈣(636個患者中的24. 4%318個D2E7治療的患者中的23. 6%, 318個安慰劑治療的患者中的25. 2% )，葉酸(636個患者中的22. 2%:318個D2E7治療的患者中的21. 4%，318個安慰劑治療的患者中的23. 0% )，和流感病毒多價疫苗(636個患者中的14. 2%:318個D2E7治療的患者中的 14. 2%, 318個安慰劑治療的患者中的14. 2% )。葉酸被歸類為RA特異的非DMARD并行治療藥或非RA特異的治療藥，取決于在CRF記錄的用藥指示，對于所有不是RA的用藥指示，
27葉酸被歸類為非RA特異的治療藥)。在使用非RA特異的并行治療藥的頻率方面，D2E7治療和安慰劑治療的患者沒有相應的差異。療效指標包括在第24周的ACR20反應；在第24周的ACR50和ACR70反應；從研究開始時到第24周的ACR20，ACR50，ACR70的AUG(曲線下的面積)；首次出現(xiàn)ACR20，ACR50， ACR70的時間；ACR數(shù)(ACR-N)；從研究開始時到第24周，ACR反應標準內容的變化(觸痛關節(jié)計數(shù)[TJC]，腫脹關節(jié)計數(shù)[SJC]，患者疼痛評估，患者和醫(yī)師對疾病活動力的整體評估， HAQ和C-反應蛋白[CRP])；用SF-36，健康利用指數(shù)(HUI)，慢性病治療(FACIT)疲勞評分檢測到的從研究開始時到第24周生理功能的變化；Euro-QoL問卷，多重疲勞評分(MAF)，受試者調查結果概況；背景DMARD和/或類固醇治療藥物劑量增長的方式和時間；對沒有臨床反應的開始新的DMARD治療藥；類風濕因子(RF)；和晨僵現(xiàn)象。根據(jù)每1，00人-年所發(fā)生的頻率，百分比以及比率概括不良反應。利用Pearson 卡方檢驗對D2E7和安慰劑組進行統(tǒng)計比較。體格檢查，實驗室參數(shù)和胸部X光的變化根據(jù) 統(tǒng)計特性以及異常值的頻率進行描述。還提供了轉換表。根據(jù)統(tǒng)計特征描述生命體征。在第24周的ACR20(從研究開始時變化)被定義為初級效應變量。利用卡方檢驗和α =0.05 的雙尾顯著性比較D2E7和安慰劑組的ACR20反應速率。對所有別的效應變量分別說明(統(tǒng) 計特性，頻率，百分比，可信區(qū)間)，并通過探查的(exploratory)雙尾統(tǒng)計測試進行分析。對于離散數(shù)據(jù)，使用Pearson's卡方檢查，而對于連續(xù)數(shù)據(jù)使用協(xié)方差分析模型(ANCOVA)，在這個模型中，治療組作為因子，而各自的研究開始時數(shù)值作為共變量。比較了 D2E7和安慰劑組的人口統(tǒng)計特征和基本特征，利用Wilcoxon等級和檢驗連續(xù)變量，卡方檢驗離散變
Mo療效結果比較目前現(xiàn)有的抗風濕冶法中加入D2E7的患者與加入安慰劑的患者，發(fā)現(xiàn)其主要的療效指標(ACR20)統(tǒng)計上明顯改善(D2E7為53. 0%對安慰劑的34. 9% )。ACRD2E7安慰齊[J(N =315)(N = 315)N(% )N(% )ACR20167(53.0)110(34.9)ACR5092(29.2)35(11.1)ACR7047(14.9)10(3.2)在次要的療效指標ACR50，ACR70，ACR-N，觸痛關節(jié)數(shù)，腫脹關節(jié)數(shù)，患者和醫(yī)師對疾病活動度的整體評估，患者的疼痛評估，HAQ的殘疾指數(shù)，C-反應蛋白，晨僵現(xiàn)象，晨僵現(xiàn) 象的持續(xù)時間，F(xiàn)ACIT疲勞評分，SF-36 10個范疇中的9個，以及HUI16個范疇中的7個中，以D2E7治療均在統(tǒng)計上具有顯著改善。就ACR20, ACR50 和 ACR70 反應時間終點，ACR20, ACR50, ACR70 和 ACR-N 的 AUC， Euro-QoL, RF和MAF評分而言，也證明D2E7較安慰劑在治療反應上有改善。亞組分析證明和安慰劑組相比，用D2E7治療，同時并行施用氨甲蝶呤，抗瘧治療藥，柳氮磺吡啶，別的DMARDs或并行DMARDs的數(shù)目(即0，1，2或彡3)治療的患者，ACR20， ACR50,ACR70, ACR-N參數(shù)以及ACR20，ACR50，ACR70和ACR-N值的AUC有顯著改善。而對所有測試的參數(shù)，并行施用來氟米特和用安慰劑治療的組相似。
表3在第24周時亞組進行ACR20分析
抗瘧藥(如HCG，氯喹)
表4ACR50，ACR70和ACR—N反應速率隨機挑取的治療組中患者在第24周的反應
*與安慰劑相比，在統(tǒng)計意義上有顯著差異(P<0．001)。
表5在第24周對亞組進行ACR50，ACR70和ACR—N分析
抗瘧藥(如HCG，氯喹)
表6ACR20，ACR50，ACR70的反應時間隨機治療小組產生第一次反應的患者數(shù)(％)(全樣本分析，排除#7位點) 結論當D2E7加入患者正在用的DMARD治療藥(如氨甲蝶蛉，抗瘧藥[氯喹/羥基氯喹]，來氟米特和柳氮磺吡啶)中時，它的耐受性一般好。D2E7的添加和任何不良反應的發(fā)生或方式不相關。此外，這些不良反應數(shù)據(jù)不會因患者施用的并行DMARDs (即0，1，2，或彡3)的總數(shù)而受影響。總之，一劑40mg的D2E7單獨使用或和別的DMARDs組合使用時是安全的。D2E7治療和患者中RA的顯著改善相關，這些患者的疾病用目前的DMARD治療藥不能完全治愈。當和氨甲蝶蛉，抗瘧治療藥，柳氮磺吡啶，別的DMARDs，或并行DMARDs的數(shù)目 (即0，1，2或彡3)組合使用時，和安慰劑相比，D2E7的反應更大。最后，反應速率的改善不依賴使用的DMARDs的數(shù)目或種類。等同方案本領域的技術人員通過使用常規(guī)實驗方法，應該能獲得本發(fā)明介紹的特定實施方案的等同實施方案。這樣的等同方案也包括在下面的權利要求書中。
權利要求
一種治療人受試者的疾病的方法，所述疾病可以用TNFα抗體或其抗原結合片段治療，所述方法包括采用每兩周給藥的劑量方案給需要的受試者施用一種組合物，所述組合物包含抗TNFα抗體或其抗原結合部分，以及施用一種或多種其他藥物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中含抗TNFα抗體或其抗原結合部分的組合物的施用是通過皮下注射進行的。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結合部分是人抗 TNFa抗體。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述人抗體是D2E7。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中施用了40mg的D2E7。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述疾病是自體免疫性疾病。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述自體免疫性疾病是類風濕性關節(jié)炎。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述其他藥物是疾病改善抗風濕藥物(DMARD)、非甾體抗炎藥(NSAID)、類固醇或其任意組合。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述DMARD是羥基氯喹、來氟米特、氨甲蝶呤、腸胃外給藥金制劑、口服金制劑、柳氮磺吡啶或其任意組合。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述NSAID是潑尼松、葉酸、塞來考昔、羅非考昔、對乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、甲潑尼龍、曲馬多、Di-gesic、雙氯酚酸、唯寇錠、曲安西龍、利多卡因或其任意組合。
11.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述其他藥物是多種維生素、鈣、葉酸、流感病毒多價疫苗或其任意組合。
12.一種藥用組合物，其含有40mg D2E7、一種或多種其他藥物及藥用上可接受的載體。
13.根據(jù)權利要求12所述的藥用組合物，其中所述其他藥物是疾病改善抗風濕藥物 (DMARD)、非留體抗炎藥(NSAID)、類固醇或其任意組合。
14.根據(jù)權利要求13所述的藥用組合物，其中所述DMARD是羥基氯喹、來氟米特、氨甲蝶呤、腸胃外給藥金制劑、口服金制劑、柳氮磺吡啶或其任意組合。
15.根據(jù)權利要求13所述的藥用組合物，其中所述NSAID是潑尼松、葉酸、塞來考昔、羅非考昔、對乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、甲潑尼龍、曲馬多、Di-gesic、雙氯酚酸、唯寇錠、曲安西龍、利多卡因或其任意組合。
16.根據(jù)權利要求12所述的藥用組合物，其中所述其他藥物是多種維生素、鈣、葉酸、流感病毒多價疫苗或其任意組合。
17.—種試劑盒，其包括含有下述物質的組成a)一種藥用組合物，含有抗TNF α抗體和藥用上可接受的載體；b)一種或多種藥用組合物，每種組合物含有一種或多種其他藥物和藥用上可接受的載體；和c)指導每兩周施用一次藥用組合物來治療疾病的說明書，所述疾病能用抗TNFa抗體或其抗原結合部分有效地治療。
18.根據(jù)權利要求17所述的試劑盒，其中所述組合物中含有的抗體是40mgD2E7，以及所述說明書涉及治療類風濕性關節(jié)炎。
19.根據(jù)權利要求18所述的試劑盒，其中所述一種或多種其他組合物包括疾病改善抗風濕藥物(DMARD)、非留體抗炎藥(NSAID)、類固醇或其任意組合。
20.根據(jù)權利要求19所述的試劑盒，其中所述DMARD是羥基氯喹、來氟米特、氨甲蝶呤、腸胃外給藥金制劑、口服金制劑、柳氮磺吡啶或其任意組合。
21.根據(jù)權利要求19所述的試劑盒，其中所述NSAID是潑尼松、葉酸、塞來考昔、羅非考昔、對乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、甲潑尼龍、曲馬多、Di-gesic、雙氯酚酸、唯寇錠、曲安西龍、利多卡因或其任意組合。
22.根據(jù)權利要求18所述的試劑盒，其中所述其他藥物是多種維生素、鈣、葉酸、流感病毒多價疫苗或其任意組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，這種方法是通過每兩周一次的，皮下施用人抗體以及另外一種用于治療疾病的藥物來治療因TNF有害活性而導致的疾病，其中所述人抗體優(yōu)選重組人抗體，這些抗體能特異地結合人腫瘤壞死因子α(hTNFα)，而另外一種藥物是用來治療這種疾病的。本發(fā)明抗體可以是全長抗體，也可以是其抗原結合片段。含有藥用組合物和給藥說明書的試劑盒也包括在本發(fā)明中。
文檔編號A61K45/00GK101890163SQ20101014804
公開日2010年11月24日申請日期2003年4月24日優(yōu)先權日2002年4月26日
發(fā)明者埃利奧特·查塔斯, 斯蒂芬·費施科夫申請人:艾博特生物技術有限公司

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