專利名稱：柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化合物柯里拉京(Corilagin)，尤其是涉及一種柯里拉京在制備 抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤(tumor)是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤(Malignant Tumor, cancer) 是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。根據我國衛(wèi)生部公布的資料，2006年我國惡性腫 瘤在農村和城市人口中死亡率均居第一位。并且惡性腫瘤的危害性還在日益增加。目前， 我國常見的10大惡性腫瘤為肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、惡性 淋巴瘤、鼻咽癌。在諸多惡性腫瘤中，肝癌、卵巢癌是最難治療的一類，患者的死亡率常年居 高不下，5年存活率很低，因此它們都成為了抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。肝癌(hetatocellular carcinoma, HCC)禾口卵巢癌(Ovarian cancer)均是臨床 上治療難度大的惡性腫瘤，迄今仍缺乏理想的治療藥物。其早期一般無臨床癥狀，很難發(fā) 現，而一旦出現典型的臨床表現，通常已經屬于中晚期，發(fā)生了侵襲轉移，患者死亡率非常 高。其中，肝癌，俗稱“癌中之王”，屬于中醫(yī)肝積、肥氣、癥積、膨脹、癖黃等范疇，惡性程度 高，發(fā)展迅速，自然生存期短，5年生存率僅為14% 30%。全世界每年新發(fā)現的惡性腫瘤 病人42. 5%發(fā)生在中國，且年齡多為40 50歲。而卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之 一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和乳腺癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤 的首位，對婦女生命造成嚴重威脅。到目前為止，就國內外臨床資料統計，其5年生存率僅 25% 30%。柯里拉京又稱訶子次鞣素、鞣料云實素等，化學名為1-0-沒食子酰-3，6-0-六羥 基聯苯二甲酰-D-葡萄糖，是從大戟科葉下株屬植物中分離一種鞣質，由于鞣質在早 些年代常被看作是植物中的無效成份，因而在天然藥物研發(fā)過程中，都希望去除得越徹底 越好，導致迄今國內外對柯里拉京的而研究較少，主要集中在抗病毒、抗血脂、抗血壓、抗 凝血等方面。目前，國內僅有的7個公開專利(CN101461816A、CN1709901A、CN1695647A、 CN1695627A、CN1197641A、CN101461831A、CN101613382A)涉及到柯里拉京的制備、抗乙型肝 炎、胃酸過多等方面的研究；且在抗腫瘤藥物的研究方面，未見關于藥理學和分子機制的國 內專利。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述柯里拉京又稱訶子次鞣素、鞣料云實素等，是從大戟科葉下株屬植物中分離 出的一種鞣質，所述柯里拉京(Corilagin)的化學名為1_0_沒食子酰-3，6_0_六羥基聯苯 二甲酰-3 -D-葡萄糖，其分子式為C27H22018，結構式如下 所述抗腫瘤藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉移方面的藥物等。所述抗腫瘤藥物可為口服藥劑或注射藥劑等。所述注射可為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。本發(fā)明所述柯里拉京可以采用中國專利CN1197641A或CN1709901A中公開的方法 制備。實驗表明，柯里拉京具有很好的抗腫瘤效果，不管是在體外腫瘤細胞實驗，還是對 體內腫瘤動物模型都有很好的療效。所述柯里拉京是一種具有抗腫瘤藥效的新化合物，可 用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明以肝癌和卵巢癌為模型，研究柯里拉京在體外的細胞水平、分子水平上 對肝癌細胞Be 17402、SMMC7721及卵巢癌細胞Hey、SK0V3ip的增殖，凋亡、細胞周期阻滯 和相關信號傳導通路中蛋白的分泌情況等作用效果，以及在裸鼠體內對高轉移肝癌細胞 MHCC97-H的生長、轉移的作用效果，揭示柯里拉京干預腫瘤侵襲轉移和血管生成的信號傳 導機制，確定抗腫瘤的作用靶點，建立柯里拉京作為藥物治療惡性腫瘤生長和侵襲轉移的 有效策略。本發(fā)明所涉及的抗腫瘤藥物，可以是柯里拉京按照常規(guī)的藥物制劑工藝，制備成 一種適合臨床上使用的藥物制劑，并具備良好的抗腫瘤生長和侵襲轉移療效。


圖 1 為本發(fā)明 MTT 測定 72h柯里拉京 Chang-liver、Bel7402、SMMC7721、Hey 細胞增 殖的抑制效果。在圖1中，橫坐標為柯里拉京濃度(P g/mL)，縱坐標為細胞抑制率(％ ) ;A 柯里拉京對Chang-liver、Bel7402、SMMC772172h的細胞增殖的抑制效果； Chang-liver， ■ Bel7402，▲ SMMC7721 ；B 柯里拉京72h對N0E001細胞增殖的抑制效果；C 柯里拉京72h 對Hey細胞增殖的抑制效果。圖2為本發(fā)明所述柯里拉京對卵巢癌細胞Hey的細胞周期阻滯作用。在圖2中縱 坐標Number為檢測器所檢測到的細胞數量，橫坐標Channel (FL2-A)為檢測器中細胞DNA 含量；圖(a)、(b)、(c)分別為對照組中24h、48h、72h流式結果；圖(A)、(B)、(C)分別為柯 里拉京處理細胞24h、48h、72h后的流式結果。圖3為本發(fā)明所述柯里拉京對SK0V3ip細胞中TGF-0 /PI3K/Akt/Snail信號通 路的影響。在圖3中，A 柯里拉京對SK0V3ip細胞內AKT和pAKT的作用；No treat 沒有 藥物處理；A-treated 短葉蘇木酚酸乙酯處理《-treated 柯里拉京處理；B 柯里拉京對SK0V3ip細胞內TGF-3的作用；C 柯里拉京對SK0V3ip細胞內Snail的作用。圖4為本發(fā)明柯里拉京對裸鼠體內腫瘤生長的抑制作用。在圖4中，(a)為陰性對 照組，(b)為陽性對照組，(A)為10mg/kg柯里拉京組，⑶為20mg/kg柯里拉京組，(C)為 30mg/kg柯里拉京組。
具體實施例方式以下實施例通過柯里拉京在體內外對肝癌和卵巢癌的抑制效果，以及在分子水平 上闡述的抗腫瘤機理來說明本發(fā)明，但并不代表本發(fā)明只限于該實施例。對福建閩南地區(qū)的民間偏方和中醫(yī)驗方中涉及的45科114種南藥，通過活性跟 蹤進行大規(guī)模的篩選，最終篩選出8科12種具有明顯抗癌效果的中草藥，通過綜合評價發(fā) 現葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)和珠子草(Phyllanthus niruri L.)兩種大戟科 植物最具潛力。繼續(xù)對該兩種植物中抗癌活性成分進一步研究發(fā)現，其中主要的抗腫瘤 活性成分為單一化合物，呈白色針晶狀粉末，從質譜和元素分析推出該化合物為柯里拉京 (Corilagin,分子式為 C27H22018)。實施例1柯里拉京在體外對肝癌細胞和卵巢癌細胞以及正常細胞的抑制效果實驗材料細胞株、培養(yǎng)液、藥品人肝癌細胞Be 17402、SMMC7721、人卵巢癌細胞 Hey、人正常肝細胞Chang-liver以及人正常卵巢上皮細胞N0E001購自中國科學院上海細 胞生物學研究所；培養(yǎng)基RPMI 1640購自GIBC0公司，胎牛血清購自Hyclone公司，青霉 素、鏈霉素購自上海生工公司；3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱為 MTT)、二甲基亞砜(簡稱為DMS0)等購自Sigma公司或國內其他公司。實驗方法將一組濃度為0、6. 25、12. 5,25,50,100,200 u g/mL的柯里拉京分別作 用細胞 Bel7402、SMMC7721、Hey、Chang-liver 和 N0E00172h，再用 MTT 法測定。具體方法 如下(1)取對數生長期細胞，0. 25%胰酶消化，用細胞培養(yǎng)液制成5 X 104個/mL單細胞懸 液接種于96孔板，每孔100 y L ；⑵培養(yǎng)24h后，吸去細胞培養(yǎng)液，分別加入100 u L對照 組培養(yǎng)液及含柯里拉京的實驗組培養(yǎng)液，每組4個重復孔；(3)繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸去培養(yǎng) 液，每孔加人200 u L MTT (0. 5mg/ml)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h ； (4)吸去上清，加200 u L DMS0,振蕩 lOmin，使結晶充分溶解，在酶標儀上讀取490nm處吸光度(0D)值。根據光吸收值計算人參 皂苷IH901處理后的細胞相對存活率。結果表明，柯里拉京對腫瘤細胞Bel-7402、SMMC7721和Hey的抑制作用都極為顯 著(圖 1)。其 72h 的 IC5Q 分別達到 19. 67 u g/mL、17. 0 u g/mL、13. 56 u g/mL,且呈現濃度-效 應依賴關系。而對正常細胞Chang-liver、N0E001的毒副作用很低，IC5(1達到100. g/mL， 92. 22y g/mL。實施例2柯里拉京對卵巢癌細胞Hey的細胞周期的阻滯作用將Hey細胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，加入17 i g/ml柯里拉京共同培養(yǎng)24h、48h、 72h(方法同實施例1)，并做好對照。經過含0. 1 % RNaseA的5mg/ml PI避光處理lOmin 后，用流式細胞儀檢測。結果表明，在24h至72h，對照組的G0/G1期從48. 88%下降到39. 29%，而柯里拉 京組從54. 85%上升到71. 75% (圖2)。由此可見，柯里拉京能夠使得卵巢癌細胞Hey的細 胞周期阻滯在G0/G1期，并且呈時間-效應依賴性。柯里拉京對卵巢癌細胞Hey的細胞周
5期阻滯作用參見表1。表 1 實施例3柯里拉京對SK0V3ip細胞中TGF_ ^ /PI3K/Akt/Snail信號通路的影響細胞接種將人卵巢癌細胞SK0V3ip混勻于10% FBS RPMI 1640接種于60mm培 養(yǎng)皿中，每個皿的細胞數為3.5 X105個。加藥將細胞依次加入32iig/mlA藥，17iig/ml C藥。12h后饑餓將培液換成RPMI 1640無FBS，藥濃度同前。36h后將每組的兩皿細胞中的一皿分別加入表皮生長因子EGF(濃度為20 y g/ ml)，作用lOmin后提蛋白。Western blot檢測pAkt及Akt 用Bradford法蛋白定量法使每孔蛋白總量為 20 u g，分別用pAkt (p473)和Akt抗體檢測(CST公司，兔抗，抗體濃度1 1000)。結果表明，柯里拉京能夠通過對TGF-0 /PI3K/Akt/Snail這一個與腫瘤生長和侵 襲轉移密切相關的信號通路的研究發(fā)現，柯里拉京能夠明顯抑制SK0V3ip細胞內TGF-3 / PI3K/Akt/Snail信號通路，其主要是抑制TGF-0 1的分泌，并呈劑量效應(圖3A)，還能 明顯降低Akt的磷酸化(圖3B)，進而降低卵巢癌細胞中Snail的表達(圖3C)，這樣就 能夠通過TGF-0/PI3K/Akt/Snail的信號通路，下調E鈣粘蛋白(E-cadherin)的分泌。 而 E-cadherin 能夠加快上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的過程，使得細胞失去細胞極性和細胞間連接，細胞外基質成分發(fā)生降解，細胞變得具 有遷移性，能夠從上皮游離下來并遷移到不同的部位，最終促進腫瘤侵襲轉移。因此降低 TGF-^/PI3K/Akt/Snail蛋白的表達，就能夠抑制腫瘤的侵襲轉移。實施例4柯里拉京對BALB/c裸鼠體內成瘤實驗的抑制效果BALB/c裸鼠25只，4_ 6周，體重20 25g，雌雄約各一半，分為5組，每組5只。 每只裸鼠右側背部皮下注射0. 2mL的1 X 107個/mL MHCC97-H單細胞懸液。腹腔注射給藥， 0. 2mL/次，隔天注射一次，共計12次。以生理鹽水為陰性對照，環(huán)磷酰胺CTX為陽性對照，肝癌MHCC97-H裸鼠模型結果 顯示，在抑制腫瘤生長方面，柯里拉京與陽性對照的CTX的效果相當，30mg/kg柯里拉京抑 制效果為35. 19%，而25mg/kg CTX的抑制效果為32. 01% (圖4)；而在抑制腫瘤侵襲轉移 方面，柯里拉京用藥組中，只有20mg/kg柯里拉京用藥組中有2只裸鼠發(fā)生輕微轉移，其他 13只沒有發(fā)現肝轉移，侵襲轉移的抑制效果高達86. 7%，相對于陰性對照組和陽性對照組都100%發(fā)生肝轉移?？吕锢β闶篌w內腫瘤生長和侵襲轉移的抑制作用參見表2。表 2 與陰性對照組比較，*P < 0. 05/*P < 0. 01 ；+表示有肝轉移現象發(fā)生，/表示無肝 轉移現象發(fā)生。
權利要求
柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述柯里拉京的化學名為1-O-沒食子酰-3，6-O-六羥基聯苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式為C27H22O18，其結構式如下FSA00000187995300011.tif
2.如權利要求1所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述抗腫瘤 藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉移方面的藥物。
3.如權利要求1所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述抗腫瘤 藥物為口服藥劑或注射藥劑。
4.如權利要求3所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述注射為 靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
全文摘要
柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應用，涉及一種化合物柯里拉京。所述柯里拉京的化學名為1-O-沒食子酰-3，6-O-六羥基聯苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式為C27H22O18。所述抗腫瘤藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉移方面的藥物等。所述抗腫瘤藥物可為口服藥劑或注射藥劑等。所述注射可為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。實驗表明，柯里拉京具有很好的抗腫瘤效果，不管是在體外腫瘤細胞實驗，還是對體內腫瘤動物模型都有很好的療效。所述柯里拉京是一種具有抗腫瘤藥效的新化合物，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P35/00GK101879173SQ20101022572
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權日2010年7月9日
發(fā)明者吳美愛, 明艷林, 童慶宣, 郁茵華, 鄭國華, 鄭志忠, 金鴻雁, 陳良華 申請人:廈門華僑亞熱帶植物引種園