專利名稱：一種氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑的制備及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤以及腫瘤的性質(zhì)(良性或惡性)的早期診斷，對腫瘤的治療具有重要的意義。 目前，惡性腫瘤的臨床檢測主要依靠免疫生化檢測，并輔以電子計算機X射線斷層掃描 (CT)、磁共振成像(MRI)等物理手段。生物學(xué)的組織化學(xué)檢測雖然具有較高的檢測靈敏度和特異性，但需組織切片，只能局限于離體檢測，并且耗時較長。MRI對診斷顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤、原發(fā)性肝癌等疾病的診斷優(yōu)于CT?，F(xiàn)有技術(shù)MRI診斷中主要通過釓類造影劑進行，但臨床應(yīng)用的釓類MRI造影劑如釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)的敏感性較低(微克分子水平)， 在體內(nèi)的分布無組織特異性，滯留時間很短。為了達(dá)到靶向分子顯影，需要對造影劑進行表面修飾，使其主動靶向腫瘤細(xì)胞。目前已有報道使用脂質(zhì)體、納米粒包載臨床上使用的MRI 造影劑Gd-DTPA，提高其靶向性和檢測靈敏度。研究公開了多肽的修飾能提高納米載藥系統(tǒng)腫瘤組織的識別能力，已被廣泛用于抗腫瘤研究。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一段由36個氨基酸殘基組成的多肽——氯代毒素 (chlorotoxin，簡稱CTX)。該CTX具有良好的腫瘤靶向性，能夠特異性結(jié)合多種腫瘤細(xì)胞， 如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性肉瘤、腸癌以及前列腺癌等。研究表明，CTX通過基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)介導(dǎo)進入腫瘤細(xì)胞，而MMP-2只在腫瘤細(xì)胞表面高量表達(dá)，正常細(xì)胞表面不表達(dá)， 這就解釋了 CTX特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的原因。同時，研究顯示CTX雖然對無脊椎動物有強烈毒性，卻對哺乳動物無毒。目前已有利用CTX修飾的放射治療藥物131I-TM-601，正在接受FDA審批，并已進入II期臨床試驗階段。還有有研究將CTX與熒光染料連接用于手術(shù)過程的腫瘤顯像等。因此，CTX可能成為一種腫瘤特異性非常高的靶向頭基。樹狀大分子是近年合成的一類納米尺度的新型水溶性聚合物，其典型特征是高分枝并帶有許多重復(fù)的、高密度的端基活性基團，這些結(jié)構(gòu)對藥物和靶向頭基具有較強的結(jié)合能力，進而與細(xì)胞膜相互作用增加藥物的靶向性和攝取量。使用樹狀大分子作為藥物載體近年研究較多，但是作為釓類MRI造影劑載體用于腫瘤診斷藥物研發(fā)的報道較少。陽離子樹狀大分子表面具有許多主胺基團，單個分子可能連接多個Gd3+，從而提高MRI診斷的信號強度，減小診斷藥物用量，若再連接有效的靶向頭基，有望較大程度提高該MRI造影劑的腫瘤靶向診斷效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有用于腫瘤診斷的MRI造影劑的不足，提供一種新的腫瘤靶向MRI造影劑。尤其涉及一種氯代毒素(chlorotoxin，簡稱CTX)修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑。
本發(fā)明還提供了所述氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑的制備方法和應(yīng)用， 尤其是在制備表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的腫瘤診斷制劑中的用途。本發(fā)明的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，由腫瘤靶向載體、 Gd螯合劑和Gd3+構(gòu)成，所述的腫瘤靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和CTX 組成。本發(fā)明中，采用氯代毒素CTX作為腫瘤靶向頭基，陽離子樹狀大分子為載體材料， 通過親水性聚合物連接CTX構(gòu)建新的腫瘤靶向載體。本發(fā)明在所述的腫瘤靶向載體上連接多個Gd螯合劑，再通過該螯合劑螯合多個 Gd3+，可明顯提高腫瘤部位的MRI信號，并延長該信號的可觀察時間，有利于更確切的腫瘤診斷。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
以陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和CTX為組分，三者以共價方式連接制備CTX 修飾的樹狀大分子腫瘤靶向載體。其中，親水性聚合物與陽離子樹狀大分子材料的分子比是廣20 1，CTX與陽離子樹狀大分子材料的分子比為廣10 1 ； 本發(fā)明所述的腫瘤靶向載體按下述方法制備
陽離子樹狀大分子材料和親水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于PH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應(yīng)60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為PH值 6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，CTX與巰基化試劑反應(yīng)后引入巰基，以1 10:1的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物-CTX，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX ；
腫瘤靶向載體通過共價方式連接Gd螯合劑，再通過該螯合劑螯合Gd3+，制備腫瘤靶向造影劑。其中，腫瘤靶向載體與Gd螯合劑的分子比是1:10(Γ120，腫瘤靶向載體與Gd3+的分子比是1:70 90;
本發(fā)明所述的腫瘤靶向造影劑按下述方法制備
將制備的腫瘤靶向載體和功能化的Gd螯合劑分別溶于ρΗ值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中配制成所需濃度的溶液，適量飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)ρΗ至8. 8 9. 2 ；將兩種溶液混合(腫瘤靶向載體和Gd螯合劑的分子比是1:10(Γ120)，室溫攪拌反應(yīng)M 72小時，兩種材料中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成腫瘤靶向載體-Gd螯合劑，超濾法除去未反應(yīng)的Gd螯合劑并更換為ρΗ值5. 8 6. 2的草酸鹽緩沖液；將Gd3+溶于ρΗ值5. 8 6. 2的草酸鹽緩沖液，以與腫瘤靶向載體的分子比是7(Γ90:1的量，4 °C攪拌反應(yīng)M 72小時后生成腫瘤靶向造影劑，超濾法除去未反應(yīng)的Gd3+并更換為ρΗ值7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液； 本發(fā)明所述的腫瘤靶向造影劑，其使用的靶向頭基是氯代毒素CTX ； 本發(fā)明所述的陽離子樹狀大分子材料選自樹枝狀聚賴氨酸(dendrigraft poly-L-lysines DGL,簡稱 DGL)和聚酰胺-胺(polyamidoamine，簡稱 PAMAM)； 所述親水性聚合物為聚乙二醇(polyethyleneglycol，簡稱PEG)和聚氧乙烯； 所述Gd螯合劑選自二乙三胺五乙酸(DTPA)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷 _1，4，7，10-四乙酸(DOPA)； 所述 GcT 為 GdCl3 · 6H20。
本發(fā)明所制備的腫瘤靶向造影劑適用于所有表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的腫瘤診斷；
本發(fā)明采用氫核磁共振技術(shù)對腫瘤靶向載體的中間產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果顯示，樹狀大分子與含有雙功能基團的PEG (琥珀酰亞胺-PEG3400-馬來酰亞胺)反應(yīng)后在3. 5 ppm 處出現(xiàn)PEG的特征吸收峰，并在6. 7 ppm處出現(xiàn)馬來酰亞胺的特征吸收峰，說明PEG已經(jīng)修飾到樹狀大分子上，樹狀大分子-PEG合成成功；樹狀大分子-PEG進一步與功能化的DTPA 反應(yīng)后在7. 2 ppm處出現(xiàn)DTPA苯環(huán)的特征吸收峰，說明樹狀大分子表面成功連接上DTPA ； 本發(fā)明采用Ellman法鑒定CTX是否修飾到PEG末端，結(jié)果顯示，巰基化的CTX和樹狀大分子-PEG反應(yīng)之后，反應(yīng)溶液中巰基的數(shù)目明顯降低，說明腫瘤靶向載體——樹狀大分子-PEG-CTX合成成功；
本發(fā)明同時采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-OES)檢測腫瘤靶向造影劑中 Gd3+的含量，結(jié)果顯示，經(jīng)過純化后的腫瘤靶向造影劑中可檢測到預(yù)期量的Gd3+，說明腫瘤靶向造影劑——樹狀大分子-PEG-CTX/DTPA-Gd合成成功；
通過使用熒光標(biāo)記的CTX分別與腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞孵育，結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞對于 CTX的攝取非常明顯，而正常細(xì)胞幾乎不攝取，說明CTX是一種腫瘤細(xì)胞選擇性非常強的靶向頭基；
本發(fā)明所制備的腫瘤靶向載體分別與腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞孵育，結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞對于CTX修飾的腫瘤靶向載體的攝取顯著高于正常細(xì)胞，說明CTX的修飾可顯著提高腫瘤細(xì)胞攝取載體的效率；
本發(fā)明小動物活體成像定位儀考察所制備的腫瘤靶向載體的腫瘤靶向特性，分別通過荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠和荷皮下移植肝腫瘤裸鼠尾靜脈注射所制備的腫瘤靶向載體，結(jié)果顯示， CTX修飾的腫瘤靶向載體在腫瘤部位的蓄積顯著高于未經(jīng)CTX修飾的載體，在動物水平上說明腫瘤靶向載體的腫瘤靶向性強；
本發(fā)明使用MRI儀考察腫瘤靶向造影劑的腫瘤診斷效果，結(jié)果顯示，CTX修飾的腫瘤靶向造影劑在腦膠質(zhì)瘤和肝腫瘤裸鼠模型上的腫瘤顯像效果較未修飾組和市售組明顯，且腫瘤信號維持時間較長；
本發(fā)明使用MTT法考察腫瘤靶向造影劑的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，細(xì)胞毒性隨著造影劑濃度加大而增加，CTX修飾的腫瘤靶向造影劑的細(xì)胞毒性略低于未經(jīng)CTX修飾的造影劑；
本發(fā)明使用綿羊血考察腫瘤靶向造影劑的溶血性，結(jié)果顯示，是否經(jīng)CTX修飾的造影劑均無明顯的溶血性；
本發(fā)明使用蘇木精-伊紅染色法考察腫瘤靶向造影劑的體內(nèi)毒性，石蠟切片結(jié)果顯示，CTX修飾的腫瘤靶向造影劑在小鼠主要器官上未顯示任何毒性，石蠟切片與正常組無明顯區(qū)別；
本發(fā)明的突出優(yōu)點及有益效果在于
利用陽離子樹狀大分子材料的高度分枝特性，在其表面連接較大數(shù)量的Gd3+，提高MRI 診斷的信號強度，減小診斷藥物用量，同時使用極具臨床應(yīng)用潛力的腫瘤靶向頭基——CTX 修飾陽離子樹狀大分子材料，增加Gd3+在腫瘤部位的富集，增強腫瘤部位的MRI信號，提高腫瘤診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明所制備的腫瘤靶向造影劑與現(xiàn)有商用小分子釓類造影
6劑比較，馳豫率高，使用劑量小，可靶向性增強腫瘤部位MRI信號，提高腫瘤部位和正常組織的信號對比度，同時可有效延長腫瘤部位MRI信號的可觀察時間，有利于更確切地診斷腫瘤，在腫瘤診斷應(yīng)用上具有更高的價值。


圖1核磁共振圖譜其中，A :DGL-PEG1(1
a.溶劑重水特征峰
b.樹狀大分子中賴氨酸單元上的亞甲基峰
c.PEG特征峰
B =DGL-PEG10-DTPAm
a.溶劑重水特征峰
b.樹狀大分子中賴氨酸單元上的亞甲基峰
d.DTPA分子中苯環(huán)特征峰。圖2 腫瘤造影載體經(jīng)CTX修飾前后在人胚腎細(xì)胞(293細(xì)胞)、大鼠腦膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(Bel-7402細(xì)胞)的攝取情況比較(DGL濃度為2 mM,bar = 100 mm)
其中，A =DGL-PEG在293細(xì)胞的攝取圖 B =DGL-PEG在C6細(xì)胞的攝取圖 C =DGL-PEG在Bel-7402細(xì)胞的攝取圖 D :DGL-PEG-CTX在293細(xì)胞的攝取圖 E :DGL-PEG-CTX在C6細(xì)胞的攝取圖 F :DGL-PEG-CTX 在 Bel-7402 細(xì)胞的攝取圖。圖3腫瘤造影載體經(jīng)CTX修飾前后在荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的分布情況比較其中，A 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)1 h后的活體成像圖 B 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)4 h后的活體成像圖
C 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)4 h后的全腦成像圖 D 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)4 h后的各主要器官成像圖。圖4腫瘤造影載體經(jīng)CTX修飾前后在荷皮下移植肝腫瘤裸鼠的分布情況比較其中，A 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)1 h后的活體成像圖
B 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)4 h后的活體成像圖 C 荷皮下移植肝腫瘤裸鼠的明場圖
D 尾靜脈注射DGL-PEG (左)和DGL-PEG-CTX (右)4 h后的各主要器官及腫瘤的成像圖。圖5腫瘤造影劑經(jīng)CTX修飾前后的體外毒性考察其中，A =MTT法測試一系列濃度造影劑在C6細(xì)胞上的毒性 B 體外測試一系列濃度造影劑對綿羊血的溶血毒性。圖6 腫瘤造影劑經(jīng)CTX修飾前后在荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的磁共振成像效果比較，以市售DTPA-Gd造影劑為對照
其中，A-G 尾靜脈注射市售DTPA-Gd造影劑0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h和24h后的磁共振成像圖
H-N 尾靜脈注射 DGL-PEG/DTPA-Gd 造影劑 0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h 和 24 h后的磁共振成像圖
O-U 尾靜脈注射DGL-PEG-CTX/DTPA-Gd造影劑 0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h和 24 h后的磁共振成像圖
V尾靜脈注射上述三種造影劑后不同時間點的腫瘤相對信號增強定量結(jié)果。圖7腫瘤造影劑經(jīng)CTX修飾前后在荷皮下移植肝腫瘤裸鼠的磁共振成像效果比較，以市售DTPA-Gd造影劑為對照
其中，A-G 尾靜脈注射市售DTPA-Gd造影劑0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h和24 h后的磁共振成像圖
H-N 尾靜脈注射 DGL-PEG/DTPA-Gd 造影劑 0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h 和 24 h后的磁共振成像圖
O-U 尾靜脈注射 DGL-PEG-CTX/DTPA-Gd造影劑 0 h、5 min、10 min、30 min、l h、3 h和 24 h后的磁共振成像圖
V尾靜脈注射上述三種造影劑后不同時間點的腫瘤相對信號增強定量結(jié)果。
具體實施例方式實施例1.
DGL (第二代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:2溶于pH 8. 0的磷酸鹽緩沖液 (簡稱PBS)中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為 pH 7.0&PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑1Traut’ s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與 DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)24小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得 DGL-PEG-CTX。實施例2.
DGL (第二代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:5溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例3.
DGL (第二代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1 10溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例4.
DGL (第二代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1 10溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 5分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例5.DGL (第三代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:2溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例6.
DGL (第三代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:5溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例7.
DGL (第三代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1 10溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例8.
DGL (第三代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1 10溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 5分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例9.
DGL (第三代)和含有雙功能基團的PEG按照分子比1 10溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)2 h，生成DGL-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，CTX與巰基化試劑Traut，s reagent反應(yīng)后引入巰基基團，與DGL-PEG按照1 10分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)M小時，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX即得DGL-PEG-CTX。實施例10.
將實施例 制備的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1 226溶于pH 9. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超濾除去未反應(yīng)的DTPA并將反應(yīng)產(chǎn)物溶于PH 6. 0的醋酸鈉緩沖液。與此同時，GdCl3 · 6H20溶于pH 6. 0的醋酸鈉緩沖液，與DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1 170混合，4 ！攪拌反應(yīng)M h，超濾除去未反應(yīng)的 Gd 即得 Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。實施例11.
將實施例8制備的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1 226溶于pH 9. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超濾除去未反應(yīng)的DTPA并將反應(yīng)產(chǎn)物溶于PH 6. 0的醋酸鈉緩沖液。與此同時，GdCl3 · 6H20溶于pH 6. 0的醋酸鈉緩沖液，與DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1 170混合，4 ！攪拌反應(yīng)M h，超濾除去未反應(yīng)的 Gd 即得 Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。實施例12.
將實施例9制備的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1 226溶于pH 9. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超濾除去未反應(yīng)的DTPA并將反應(yīng)產(chǎn)物溶于PH 6. 0的醋酸鈉緩沖液。與此同時，GdCl3 · 6H20溶于pH 6. 0的醋酸鈉緩沖液，與DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1 170混合，4 ！攪拌反應(yīng)M h，超濾除去未反應(yīng)的 Gd 即得 Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。實施例13.
將實施例8制備的DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影載體使用紅色熒光染料BODIPY標(biāo)記，載體濃度為2 mM，和293細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取載體的情況，結(jié)果顯示，293細(xì)胞攝取DGL-PEG-CTX不明顯，且與未修飾的DGL-PEG 沒明顯區(qū)別，見附圖2A和2D。實施例14.
將實施例8制備的DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影載體使用紅色熒光染料BODIPY標(biāo)記， 載體濃度為2 mM，和C6細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取載體的情況，結(jié)果顯示，C6細(xì)胞攝取DGL-PEG-CTX明顯，且顯著高于未修飾的 DGL-PEG，見附圖 2B 和 2E。實施例15.
將實施例8制備的DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影載體使用紅色熒光染料BODIPY標(biāo)記，載體濃度為2 mM，和Bel-7402細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取載體的情況，結(jié)果顯示，Bel-7402細(xì)胞攝取DGL-PEG-CTX明顯，且顯著高于未修飾的DGL-PEG，見附圖2C和2F。實施例16.
將實施例8制備的DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影載體使用紅色熒光染料BODIPY標(biāo)記，荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠尾靜脈注射，劑量為50 yg DGL/裸鼠，分別于給藥后1 h和4 h將裸鼠麻醉， 使用小動物成像儀觀察腫瘤靶向載體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況，在4 h時處死裸鼠，分別取腦、心、肝、脾、肺和腎，置于小動物成像儀觀察腫瘤靶向載體的器官分布情況。成像結(jié)果顯示，DGL-PEG-CTX在腦腫瘤的蓄積量顯著高于未修飾的DGL-PEG，在肝臟的蓄積量相對減少，說明CTX的修飾具有腦腫瘤靶向效果，見附圖3。實施例17.
將實施例8制備的DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影載體使用紅色熒光染料BODIPY標(biāo)記，荷肝腫瘤裸鼠尾靜脈注射，劑量為50 yg DGL/裸鼠，分別于給藥后1 h和4 h將裸鼠麻醉， 使用小動物成像儀觀察腫瘤靶向載體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況，在4 h時處死裸鼠，分別取腫瘤、腦、心、肝、脾、肺和腎，置于小動物成像儀觀察腫瘤靶向載體的分布情況。成像結(jié)果顯示，DGL-PEG-CTX在肝腫瘤的蓄積量顯著高于未修飾的DGL-PEG，在肝臟的蓄積量相對減少，說明CTX的修飾具有肝腫瘤靶向效果，見附圖4。實施例18.
使用實施例11制備的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影劑，在一系列濃度與C6細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，更換為的3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)溶液繼續(xù)孵育2 h，二甲基亞砜(簡稱DMS0)溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，以未經(jīng)處理的細(xì)胞組為對照，計算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，造影劑濃度在10 mM以下時無明顯細(xì)胞毒性，見附圖5A。實施例19.使用實施例11制備的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影劑，在一系列濃度與經(jīng)處理的無菌脫纖維綿羊血(含洲紅細(xì)胞)于37 °C水浴孵育1 h，3000 rpm離心15 min，光度計檢測上清液中的血紅蛋白含量，以生理鹽水為陰性對照(不溶血)，以雙蒸水為陽性對照(100% 溶血)，計算溶血百分率。結(jié)果顯示，在測試的所有濃度，造影劑的溶血百分率均小于5%，見附圖5B。實施例20.
使用實施例11制備的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影劑，荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠尾靜脈注射，分別于給藥前以及給藥后5 min、10 min,30 min、l h、3匕和對h使用4. 7 T Bruker Biospec磁共振掃描儀進行檢測。結(jié)果顯示，CTX修飾的腫瘤靶向造影劑于各測定時間點時在腫瘤部位的信號增強均高于市售組和未修飾組，且經(jīng)CTX修飾后，腦腫瘤部位MRI信號增強持續(xù)時間最長，見附圖6。實施例21.
使用實施例11制備的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX腫瘤靶向造影劑，荷皮下移植肝腫瘤裸鼠尾靜脈注射，分別于給藥前以及給藥后5 minUO min,30 minU h、3 11和對h使用4. 7 T Bruker Biospec磁共振掃描儀進行檢測。結(jié)果顯示，CTX修飾的腫瘤靶向造影劑于各測定時間點時在腫瘤部位的信號增強均高于市售組和未修飾組，且經(jīng)CTX修飾后，肝腫瘤部位MRI 信號增強持續(xù)時間最長，見附圖7。本發(fā)明上述實驗中采用的第二代和第三代DGL均購自COLCOM公司，氯代毒素 CTX序列為MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQ，購自北京中昊時代生物有限公司，雙功能PEG購自北京鍵凱公司，功能化的DTPA購自Macrocyclics公司，GdCl3 ·6Η20購自Sigma 公司。
權(quán)利要求
1.一種氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，由腫瘤靶向載體、Gd螯合劑和Gd3+構(gòu)成，所述的腫瘤靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和氯代毒素CTX組成；所述的親水性聚合物與陽離子樹狀大分子材料的分子比是廣20:1，CTX與陽離子樹狀大分子材料的分子比為廣10:1 ；所述的CTX修飾的腫瘤靶向載體與Gd螯合劑的分子比是1:10(Γ120，腫瘤靶向載體與 Gd3+的分子比是1:70 90。
2.按權(quán)利要求1所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，所述的氯代毒素為腫瘤靶向頭基。
3.按權(quán)利要求1所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，所述的陽離子樹狀大分子材料選自樹枝狀聚賴氨酸或聚酰胺-胺。
4.按權(quán)利要求1所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，所述的親水性聚合物為聚乙二醇PEG或聚氧乙烯。
5.按權(quán)利要求1所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，所述的 Gd螯合劑選自二乙三胺五乙酸或1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
6.按權(quán)利要求1所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑，其特征在于，所述的 Gd3+ 為 GdCl3 · 6H20o
7.權(quán)利要求1的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑的制備方法，其特征在于，用氯代毒素CTX為靶向頭基，通過親水性聚合物修飾于樹狀大分子表面制得腫瘤靶向載體， 制得的腫瘤靶向載體連接Gd螯合劑，再通過Gd螯合劑螯合Gd3+，制成氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑。
8.按權(quán)利要求7的方法，其特征在于，其中陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和 CTX通過共價方式連接；腫瘤靶向載體與Gd螯合劑通過共價方式連接；Gd螯合劑與Gd3+通過螯合作用配位。
9.按權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述的腫瘤靶向載體通過下述步驟制備陽離子樹狀大分子材料和親水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應(yīng)60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為PH值 6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，CTX與巰基化試劑反應(yīng)后引入巰基，以1 10:1的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物-CTX，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的CTX。
10.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑通過述步驟制備將權(quán)利要求9制得的腫瘤靶向載體和功能化的Gd螯合劑分別溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中配制成所需濃度的溶液，適量飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 8 9. 2 ；將兩種溶液混合，其中腫瘤靶向載體和Gd螯合劑的分子比為1:10(Γ120，室溫攪拌反應(yīng)M 72小時，生成腫瘤靶向載體-Gd螯合劑，超濾法除去未反應(yīng)的Gd螯合劑并更換為pH值5. 8 6. 2的草酸鹽緩沖液；將Gd3+溶于pH值5. 8 6. 2的草酸鹽緩沖液，其與腫瘤靶向載體的分子比是7(Γ90:1的量，4 °C攪拌反應(yīng)M 72小時后生成腫瘤靶向造影劑，超濾法除去未反應(yīng)的Gd3+并更換為pH值7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液。
11.權(quán)利要求1的氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑在制備表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的腫瘤診斷制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及氯代毒素修飾的腫瘤靶向磁共振造影劑的制備及其在腫瘤診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明利用陽離子樹狀大分子材料的高度分枝特性，在其表面連接較大數(shù)量的Gd3+，提高MRI診斷的信號強度，減小診斷藥物用量，同時使用極具臨床應(yīng)用潛力的腫瘤靶向頭基——氯代毒素CTX修飾陽離子樹狀大分子材料，增加Gd3+在腫瘤部位的富集，增強腫瘤部位的MRI信號，提高腫瘤診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明的腫瘤靶向造影劑與現(xiàn)有商用小分子釓類造影劑比較，馳豫率高，使用劑量小，可靶向性增強腫瘤部位MRI信號，提高腫瘤部位和正常組織的信號對比度，同時可有效延長腫瘤部位MRI信號的可觀察時間，有利于更確切地診斷腫瘤。
文檔編號A61K49/14GK102552943SQ20101061772
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉書環(huán), 李劍鋒, 蔣晨, 韓亮, 黃容琴 申請人:復(fù)旦大學(xué)