專利名稱：具有靶向mr顯像和光熱療性能的納米復合物粒子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測試劑技術領域，尤其涉及一種納米材料復合物粒子及其制備方法，具體是將殼聚糖包覆在超順磁性的四氧化三鉄納米晶簇表面，然后再利用殼聚糖表面的氨基來固定生長納米金殼，進一步接上靶向腫瘤的抗體后，可應用于腫瘤的磁共振顯像和光熱消融治療。
背景技術：
癌癥是嚴重影響人類健康的常見病和多發(fā)病，對癌癥的早期診斷和高效治療一直是研究的難點和熱點。納米材料有很好的生物膜穿透能力，具有光、磁等特性的納米材料已成為最有潛力的癌癥診斷和治療手段之一。超順磁氧化鐵(Superparamagnetic iron oxide，SPI0)納米顆粒在磁共振造影成像、腫瘤的熱療、靶向藥物輸送和釋放、生物活性蛋白和DNA/RNA的分離等方面都有著廣泛的應用。用作磁造影劑的氧化鐵納米顆粒要求具有高飽和強度的超順磁性和高的T2弛豫率，以保證較少的使用量就可以達到較好的造影效果。其中，最近報道的由20nm以下的超順磁性氧化鐵納米單晶團聚而成的氧化鐵納米晶簇(colloidal nanocrystal clusters, CNCs)能表現(xiàn)出更高的磁飽和強度和T2弛豫率，可望用作高效磁造影劑(Ge JP, Hu YX, Biasini M, et al. Superparamagnetic magnetite colloidal nanocrystal clusters. Angew. Chem. Int. Ed. 2007,46(23) :4342-4345 ；Hu FQ, MacRenaris KW，Waters EA, et al. Highlydispersible, superparamagnetic magnetite nanoflowers for magnetic resonanceimaging. Chem. Commu. 2010,46(1) :73-75.)。另外，為了 降低氧化鐵納米顆粒的毒性，通常需要用生物相容性的材料對氧化鐵納米顆粒進行包覆改性，值得注意的是， 有報道還證明包覆層因為能降低周圍水的擴散能力，還能顯著增強納米顆粒的T2弛豫率(LaConte LEW, Nitin N, Zurkiya 0, et al. Coating thickness ofmagnetic iron oxide nanoparticles affects R-2relaxivity. J. Magn. Reson. Imaging,2007,26(6) 1634-1641 ；Daou TJ,Greneche JM,Pourroy G,et al. Coupling agenteffect on magnetic properties of functionalized magnetite-based nanoparticles. Chem. Mater. 2008, 20(18) :5869-5875.)。納米金(gold nanoparticles)具有獨特的表面等離子共振吸收 (Sur-facePlasmon Resonance, SPR)現(xiàn)象，可以將吸收的光有效地轉(zhuǎn)化為熱，而且吸收波長具有顯著的尺寸和形貌依賴性。幾個納米的球形納米金的SI3R吸收在520nm附近，而隨著尺寸或長徑比的逐漸增大，SI3R吸收會向紅外方向移動。例如，納米金棒或納米金殼的SI3R吸收可以達到近紅外(NIR)區(qū)域。而人體對800nm附近的OTR光吸收最少，因此將金納米棒或納米金殼送達腫瘤后，OTR激光可穿透人體組織被這些納米金有效吸收后轉(zhuǎn)化為熱，可起到光熱消融腫瘤(PTA Photothermalablation therapy)的治療作用(Lal S, Clare SE, Halas NJ. Nanoshell-EnabledPhotothermal Cancer Therapy Impending Clinical Impact. Acc.Chem. Res. 2008,41(12) :1842-1851.)。另外，金有很好的生物相容性，而且容易通過化學修飾接上各種靶向分子。目前對于不規(guī)則或彌散型的腫瘤不僅難以被早期診斷發(fā)現(xiàn)，而且對治療的效果難以直接評估，復發(fā)率很高。也尚無文獻報道一種既具有靶向MR顯像又具有光熱療性能的納米復合物粒子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種具有靶向MR顯像和光熱療性能的納米復合物粒子及其制備方法。本發(fā)明是將具有造影診斷功能的氧化鐵納米粒子、具有光消融熱療作用的納米金和腫瘤靶向分子結合在一起，制備一類集腫瘤造影診斷和靶向治療于一體的多功能納米材料復合物，能同時滿足腫瘤診斷和治療的需要。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的由于目前報道的高質(zhì)量!^e3O4表面大都含有憎水配體，不能直接用于生物領域，因此我們首先用水熱法合成具有高飽和強度的超順磁性I^e3O4CNCs,其表面包覆的殼聚糖使得產(chǎn)物具有良好的水分散性和易于表面修飾等特點。采用種子生長的方法將金納米粒子負載在CNCs表面形成納米殼層，用含羧基的硫醇分子作為連接的“橋梁”，可以把EFRF抗體通過縮合反應固定在金殼表面，就得到我們所要的多功能納米復合物粒子，如圖1所示。^lJ ffi /Jc Λ ^ 夕去(Ge JP, Hu YX, Biasini Μ, et al. Superparamagnetic magnetitecolloidal nanocrystal clusters.Angew. Chem. Iht.Ed.2007,46(23) 4342-4345.)在殼聚糖溶液中分解FeCl3 · 6H20制備由R3O4單晶取向附著生長 (oriented-attached)組成的 Fe3O4 晶族(Colloidal nanocrystal clusters，CNCs)，由于 CNCs表面附著的殼聚糖含有大量的極性基團和正電荷，使得CNCs具有較好的水分散性。它將提供MR顯像造影功能。殼聚糖表面的氨基具有很好的結合過渡金屬的能力，通過種子生長的方法可以在 CNCs表面生長納米金殼，通過調(diào)控CNCs的直徑和納米金殼的厚度，可以使金殼對808nm附近的OTR激光具有很好的光熱轉(zhuǎn)化功能，它將提供熱消融治療功能。進一步地，為增加對腫瘤的靶向性，我們選擇內(nèi)皮生長因子(EGFR)作為靶向目標，一方面是由于這種抗體比較成熟，有商業(yè)化產(chǎn)品，另一方面是由于EGFR在肝癌內(nèi)高表達，具有一定的普遍性，應用范圍比較廣。將EGFR分子靶向探針通過化學鍵接在納米金殼表面不僅能提高納米復合物的水分散性，還能提高對腫瘤分子的識別能力，順磁性納米核和光熱轉(zhuǎn)化的納米金殼進行整合后，再結合EGFR分子靶向探針，它將提供靶向選擇功能。本發(fā)明提供了一種具有靶向MR顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，該方法包括以水熱合成法在殼聚糖溶液中分解!^Cl3 · 6H20制備由!^e3O4單晶取向附著生長(oriented-attached)組成的!^e3O4CNCs ；用種子生長的方法在!^e3O4CNCs表面生長金納米殼；在金殼表面修飾抗體分子。上述方法的具體步驟如下步驟a 將1重量份的氯化鐵溶解到10-100重量份多元醇中攪拌，然后加入1_10 重量份的乙酸鈉和0. 1-5重量份的殼聚糖，經(jīng)150-250°c水熱反應1 12小時，經(jīng)外磁場分離，得到表面有殼聚糖包覆的四氧化三鐵納米晶簇；步驟b 將1重量份步驟a所得的四氧化三鐵納米晶簇與0. 1 5重量份的氯金酸混合，通過超聲處理后，再加入過量的強還原劑溶液，繼續(xù)反應10 60min后，經(jīng)外磁場分離，得到表面長有納米金晶種的四氧化三鐵納米晶簇；步驟c 將1重量份步驟b中所得的長有納米金晶種的四氧化三鐵納米晶簇和1 20重量份的氯金酸混合，加入適量的堿將反應液pH調(diào)至10以上，加入氯金酸量的1 20 倍的弱還原劑，繼續(xù)室溫下反應10 60min后，經(jīng)外磁場分離，得到表面長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇；步驟d 將步驟c中制得的1重量份的長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇和 0. 001 0. 5重量份的2-巰基乙酸在極性溶劑中室溫混合攪拌30 200min，經(jīng)外磁場分離，將產(chǎn)物與0.001 0. 1重量份的抗體分子、縮合劑在極性溶劑中共混進行縮合反應，經(jīng)多次外磁場分離提純后，得到具有腫瘤靶向的表面長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇。所述的殼聚糖包括分子量2-30萬的任意產(chǎn)品。步驟a中，所述的多元醇是乙二醇、二乙二醇或丙三醇，以及乙二醇、二乙二醇或丙三醇任意比例的混合物。步驟b中，所述的強還原劑是硼氫化鈉、硼氫化鉀、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。步驟b中，所述的超聲處理是指采用1 IOOkHz頻率的超聲波處理1 100min ；步驟c中，所述的堿是碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀。步驟c中，所述的弱還原劑是甲醛、乙醛、葡萄糖含有醛基的化合物、甲醇、乙醇或
丙三醇。步驟d中，所述的抗體分子是內(nèi)皮生長因子、抗壞血因子、AFP_McAb、PHC細胞膜抗體、chTNT 或 HBs-McAb 等。步驟d中，所述的縮合劑是1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或二環(huán)
己基碳二亞胺。所述的極性溶劑是指水、氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中的一種。所述的攪拌處理是指在0 50°C的環(huán)境下攪拌反應0. 1 50h。本發(fā)明還提供了以上述方法制備得到的一種具有靶向MR顯像和光熱療性能的納米復合物粒子。這樣就合成我們所需要的既有光熱轉(zhuǎn)化功能又有MR成像功能的納米復合物粒子，理論上可以達到靶向顯像和光熱消融治療一體化。一方面，它作為靶向熱療藥在腫瘤治療方面有著廣泛的應用前景，不僅熱療殺傷腫瘤效果明確，而且綠色環(huán)保，無輻射，無化療毒副作用；另一方面，可以作為靶向造影劑， 利用MR的高敏感性，對小病灶進行顯示。造影劑是影像學必不可少的藥物，MR造影劑多為進口，不僅需求量大，價格昂貴，而且從長遠來看，分子靶向造影劑會取代現(xiàn)有的常規(guī)造影劑，因此發(fā)展分子靶向造影劑具有很重要的經(jīng)濟價值。我們所研究的靶向多功能納米粒子除了有造影劑的功能外，最主要的還兼有光熱消融治療的功能，比一般的靶向造影劑在功能上更有優(yōu)勢，更符合臨床工作以及患者的需要，因此對此進行研究有著很廣泛的社會需求，有著重大社會效益。本發(fā)明的技術價值主要有三點一、研制EGRF單抗的金/Fe3O4納米復合物粒子，研究其在體內(nèi)外對腫瘤細胞株增殖及活性的抑制作用，將腫瘤分子靶向及納米粒子光熱治療有機結合，實現(xiàn)腫瘤的選擇性綠色治療；二、靶向多功能納米粒子用于術中術后的監(jiān)測和顯示，為靶向光熱療選擇適合的治療時間提供影像學依據(jù)；三、提供了可供分子影像學的監(jiān)測的靶向造影劑。影像學在腫瘤的診斷、分期、治療計劃以及療效評價方面都有必可替代的作用。使用MRI對靶向納米復合物粒子進行顯示，這樣使早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、早期治療腫瘤有機的結合在一起，并能進一步評價指導下一步治療。本發(fā)明提供的制備方法簡便高效、可控性強。根據(jù)本發(fā)明方法所得產(chǎn)品水溶性和生物相容性較好，而且可以根據(jù)需要調(diào)控納米復合物粒子的尺寸，可作為進入腫瘤細胞或結合在腫瘤細胞表面。這對于磁共振靶向造影劑和光熱治療領域具有很大的實際應用意義。


圖1是具有腫瘤靶向MR顯像和光熱療性能的CNCs@Au@EGRF的制備工藝流程。圖2是具有腫瘤靶向MR顯像和光熱療性能的CNCs@Au@EGRF的結構示意圖。其中1是抗體分子，提供腫瘤靶向性能；2是納米金殼，提供光熱轉(zhuǎn)化功能；3是殼聚糖；4是 !^e3O4CNCs,提供MR造影功能。
具體實施例方式下面結合本發(fā)明的實施例和附圖對本發(fā)明的實施作詳細說明，以下實施例是在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 以水熱合成法在殼聚糖溶液中分解FeCl3 · 6H20制備由!^e3O4單晶取向附著生長 (oriented-attached)組成的!^e3O4晶簇(CNCs)，由于表層殼聚糖富含氨基，對過渡金屬有良好的配位能力，用種子生長的方法在CNCs表面生長金納米殼，進而在金殼表面修飾抗體分子，最終制得具有腫瘤靶向MR顯像和光熱療性能的納米復合物粒子(CNCsOAuOEGRF)。具體步驟如下步驟(a)Fe3O4納米晶簇(colloidal nanocrystal clusters，CNCs)的制備將氯化鐵(1. 35g，5mmol)溶解到40mL乙二醇中攪拌得到澄清溶液，然后加入3. 6g 乙酸鈉和Ig殼聚糖(分子量5000)，攪拌30min后密封于50mL帶有聚四氟乙烯襯套的反應釜中在200 □ C下反應他。反應液冷卻到室溫后，離心并用乙醇洗滌得到黑色產(chǎn)物，得到直徑為165nm左右的CNCs。步驟(b)CNCs@Auseeds 的制備將2. 5mL HAuCl4 (20mM)溶液加到 IOmL CNCs (lmg mL)中，室溫下超聲 30min，然后快速加入3倍過量的NaBH4并劇烈攪拌3min，經(jīng)外磁場分離洗滌，制得CNCsOAu seeds,并重新稀釋成lmg mL的溶液待用。步驟(c)CNCs@Aushells 的制備將CNCsOAu seeds (ImL)，HAuCl4 (20mM, ImL)溶液和 K2CO3 (20mM, 5mL)溶液放在 25mL的燒瓶內(nèi)，磁力高速攪拌均勻。5分鐘后，加入還原劑甲醛溶液(0. 05mL, 37wt. % )。在緊接著的15分鐘內(nèi)，溶液的顏色從最初的淡淡的粉紅色逐漸變?yōu)樗{黑色。最后，經(jīng)外磁場分離洗滌，得到CNCsOAu shells。步驟(d)CNCs@Au@EGRF 的制備在IOmL CNCsiPZSiAu shells (lmg mL)中加入 0. 2mL 2-巰基乙酸，然后加入 5mg EGRF和0. 5mL縮合劑EDC，EFRF上的氨基可以和金殼表面的羧基發(fā)生縮合并固定在金殼表面，離心得到CNCs@Au@EGRF.產(chǎn)物在MR各序列掃描呈低信號，在808nm激光輻射下具有強烈的光熱轉(zhuǎn)化能力。實施例2 步驟(a)將氯化鐵(1. 35g，5mmol)溶解到40mL乙二醇中攪拌得到澄清溶液，然后加入3. 6g乙酸鈉和2g殼聚糖(分子量10000)，攪拌30min后密封于50mL帶有聚四氟乙烯襯套的反應釜中在220 □ C下反應他。反應液冷卻到室溫后，離心并用乙醇洗滌得到黑色產(chǎn)物，得到直徑為90nm左右的CNCs。步驟(b)將2. 5mL HAuCl4 (20mM)溶液加到 IOmL CNCs (lmg mL)中，室溫下超聲 30min,然后快速加入3倍過量的KBH4并劇烈攪拌3min，經(jīng)外磁場分離洗滌，制得CNCsOAu seeds，并重新稀釋成lmg mL的溶液待用。步驟(c)將CNCsOAu seeds (ImL), HAuCl4 (20mM, 2mL)溶液和 Nei2CO3 (20mM，5mL) 溶液放在25mL的燒瓶內(nèi)，磁力高速攪拌均勻。5分鐘后，加入還原劑甲醛溶液(0. lmL， 37wt. % )。在緊接著的15分鐘內(nèi)，溶液的顏色從最初的淡淡的粉紅色逐漸變?yōu)樗{黑色。最后，經(jīng)外磁場分離洗滌，得到CNCsOAu shells。步驟(d)在IOmL CNCsiPZSiAu shells (lmg mL)中加入 0. 2mL 2-巰基乙酸，然后加入5mg EGRF和0. 5mL縮合劑EDC，EFRF上的氨基可以和金殼表面的羧基發(fā)生縮合并固定在金殼表面，離心得到CNCs@Au@EGRF.產(chǎn)物在MR各序列掃描呈低信號，在808nm激光輻射下具有強烈的光熱轉(zhuǎn)化能力。
權利要求
1.一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于該方法包括以水熱合成法在殼聚糖溶液中分解FeCl3 · 6H20制備由!^e3O4單晶取向附著生長組成的狗304晶簇；用種子生長的方法在!^e3O4晶簇表面生長金納米殼；在金殼表面修飾抗體分子。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟步驟a 將1重量份的氯化鐵溶解到10-100重量份多元醇中攪拌，然后加入1-10重量份的乙酸鈉和0. 1-5重量份的殼聚糖，經(jīng)150-250°C水熱反應1 12小時，經(jīng)外磁場分離， 得到表面有殼聚糖包覆的四氧化三鐵納米晶簇；步驟b 將1重量份步驟a所得的四氧化三鐵納米晶簇與0. 1 5重量份的氯金酸混合，通過超聲處理后，再加入過量的強還原劑溶液，繼續(xù)反應10 60min后，經(jīng)外磁場分離， 得到表面長有納米金晶種的四氧化三鐵納米晶簇；步驟c 將1重量份步驟b中所得的長有納米金晶種的四氧化三鐵納米晶簇和1 20 重量份的氯金酸混合，加入適量的堿將反應液PH調(diào)至10以上，加入氯金酸量的1 20倍的弱還原劑，繼續(xù)室溫下反應10 60min后，經(jīng)外磁場分離，得到表面長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇；步驟d 將步驟c中制得的1重量份的長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇和0. 001 0. 5重量份的2-巰基乙酸在極性溶劑中室溫混合攪拌30 200min，經(jīng)外磁場分離，將產(chǎn)物與0. 001 0. 1重量份的抗體分子、縮合劑在極性溶劑中共混進行縮合反應，經(jīng)外磁場分離，得到具有腫瘤靶向的表面長有納米金殼的四氧化三鐵納米晶簇。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟a中，所述的多元醇是乙二醇、二乙二醇或丙三醇，以及乙二醇、二乙二醇或丙三醇任意比例的混合物。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟b中，所述的強還原劑是硼氫化鈉、硼氫化鉀、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。
5.根據(jù)權利要求2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟b中，所述的超聲處理是指采用1 IOOkHz頻率的超聲波處理1 IOOmin。
6.根據(jù)權利要求2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟c中，所述的堿是碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀。
7.根據(jù)權利要求2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟c中，所述的弱還原劑是甲醛、乙醛、葡萄糖含有醛基的化合物、甲醇、乙醇或丙三醇。
8.根據(jù)權利要求2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于步驟d中，所述的縮合劑是1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或二環(huán)己基碳二亞胺。
9.根據(jù)權利要求1、2或3所述的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子的制備方法，其特征在于，所述的抗體分子是內(nèi)皮生長因子、抗壞血因子、AFP-McAb、PHC細胞膜抗體、chTNT或HBs-McAb。
10.根據(jù)權利要求1-9任一方法制備得到的一種具有靶向磁共振顯像和光熱療性能的納米復合物粒子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米技術領域的具有可磁共振造影成像和近紅外光熱消融治療雙重功能的靶向金屬納米復合物粒子的制備方法。通過水熱法制備出具有高磁飽和強度和超順磁特性Fe3O4納米晶簇，由于表面有殼聚糖的包覆，使得其具有很好的水分散性和可再修飾性。然后采用種子生長的方法將金納米粒子負載在Fe3O4納米晶簇上形成納米金殼，最后通過化學鍵將EFRF抗體固定在金殼表面，制得多功能的靶向納米粒子復合物。它不僅具有MR顯像作用，同時還具有光熱消融腫瘤的作用，可望廣泛應用于腫瘤早期診斷，腫瘤的治療等領域，還可行治療前后評估，術中檢測等，具有可重復利用、無化療毒性等優(yōu)點。
文檔編號A61K49/16GK102172411SQ201110053260
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權日2011年3月4日
發(fā)明者孟令杰, 孟小茜, 董生, 袁正 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學