專利名稱：特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物制劑及其制備。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)50年代美國、英國、加拿大等國」L科協(xié)會在加拿大召開的國際聯(lián)合會議上，首次命名致病性大腸桿菌以來(ΑΜΑ Am J Dis Child. 1955 ； 90 (5) 491-650.)，有關(guān)致病性大腸桿菌導(dǎo)致人和動物腹瀉的報道及其相關(guān)研究經(jīng)久不衰。致病性大腸桿菌與作為腸道正常菌群的大腸桿菌有相同的形態(tài)染色和生化反應(yīng)特征，但其致病性和菌體0抗原各不相同。作為腸道正常菌群的大腸桿菌是條件致病菌，主要引起腸道外感染，而致病性大腸桿菌，可在人和動物的腸道內(nèi)，引起嚴(yán)重腹瀉。目前，已經(jīng)確定的致病性大腸桿菌主要包括產(chǎn)腸毒型大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲型大腸桿菌(EIEC)、腸致病型大腸桿菌(EPEC)、腸出血型大腸桿菌(EHEC)、腸集聚型大腸桿菌(EAEC)等。其中，EHEC是一種重要的人畜共患病原，主要經(jīng)動物源性食物或被動物排泄物污染的食物感染人，導(dǎo)致人和動物感染性食物中毒，表現(xiàn)為嚴(yán)重的出血性腸炎。EHEC中的0157:H7血清型是上世紀(jì)80年代新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病原，所致的食物中毒，除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥(HUQ、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴(yán)重的并發(fā)征，后者病情兇險，病死率高。 而ETEC是引起幼畜幼禽(初生仔豬、犢牛、羔羊、小雞鴨鵝)腹瀉的重要病原菌，初生幼畜被 ETEC感染后，常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌也是仔豬腹瀉最重要的病原之一，邱素君報道，由ETEC引起的仔豬黃、白痢發(fā)生率，以及混合感染的死亡率均高達(dá)60% (邱素君，呂春華，楊冬梅.產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的研究進(jìn)展[J].草食家畜，2009,144 (3):12-15.)。用疫苗對母豬進(jìn)行免疫對于仔豬斷奶后腹瀉并無效果，斷奶仔豬的大腸桿菌腹瀉通常發(fā)生在斷奶后斷奶后1-3 周內(nèi)，且這些大腸桿菌分離株常常對多種抗菌藥具有抗藥性，需要采用其它方法來防制仔豬斷奶后腹瀉。(唐文淵.仔豬大腸桿菌性腹瀉的防制[J].國外畜牧學(xué)——豬與禽，2005， 25 (3):46-47.)。相對于仔豬腹瀉得到有效控制的豬場而言，仔豬出生后不久就發(fā)生腹瀉的豬場會有較高的斷奶死亡率和治療成本，并且斷奶體重通常較輕(吳黎明.仔豬早期腹瀉是一個艱難的挑戰(zhàn)[J].國外畜牧學(xué)——豬與禽，2010,30 (4):^-31.)?？傊?，大腸桿菌性腹瀉發(fā)病率高、死亡率高、難于治愈、極易復(fù)發(fā)等臨床特點，長期困擾著基層廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者，給動物養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失。目前，通過在飼料中添加抗生素依然是國內(nèi)防治大腸桿菌性腹瀉的最主要方法。 其不良后果，一是影響腸道正常菌群，導(dǎo)致菌群失調(diào)癥；二是造成動物性產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)，影響出口產(chǎn)品質(zhì)量；三是加速動物源性耐藥菌產(chǎn)生，不利于動物和人類感染性疾病的防治。隨著抗生素使用帶來的耐藥性及安全性等問題日趨嚴(yán)峻，世界上很多國家都對飼料中添加抗生素實行了禁用或限用。因此，采用疫苗預(yù)防，以及采用微生態(tài)等生物制劑治療大腸桿菌性腹瀉越來越引起關(guān)注。我國目前批準(zhǔn)的可直接飼喂動物的微生態(tài)活菌有12種干酪乳酸菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌、屎鏈桿菌、乳酸片球菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、乳鏈球菌、啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、沼澤紅假單孢菌等。另外，利用大腸桿菌甲醛滅活疫苗預(yù)防禽獸大腸桿菌病，以及研究噬菌體代替抗生素治療動物大腸桿菌病，均可見報道。關(guān)于致瀉性大腸桿菌疫苗，除了滅活疫苗、減毒疫苗、結(jié)合多糖疫苗、菌毛疫苗和亞單位疫苗外，還有新近出現(xiàn)的DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、遺傳缺失突變活大腸桿菌疫苗和ghost疫苗技術(shù)等等。國外藥訊(2006年)根據(jù)在華盛頓召開的第45屆抗微生物藥和化療國際泛科學(xué)大會上公布的一項大規(guī)模研究的結(jié)果，口服大腸桿菌疫苗[ETEC / rCTBKD 可減少中到重度侵入毒素E. coli (ETEC)疾病和旅游者的ETEC疾病發(fā)病率。這項雙盲、 隨機研究納入1458名到危地馬拉和墨西哥的美國成年游客，他們在出發(fā)前一周和接近三周時接受兩劑疫苗或安慰劑。產(chǎn)生強大免疫應(yīng)答和保護(hù)作用的受試者中有84%可抵抗中至重度ETEC相關(guān)的旅客腹瀉。而且，疫苗組與安慰劑組比較，由ETEC引起的旅客腹瀉也顯著輕微。說明疫苗能有效地保護(hù)大腸桿菌性腹瀉。雖然疫苗種類很多，但是真正上市使用者卻寥寥無幾，而大腸桿菌疫苗在國內(nèi)養(yǎng)殖動物市場有很大需求量，地域性的自制疫苗很受歡迎，其主要原因是針對地方流行菌株，預(yù)防效果好。楊蓮如等(2008年)用自制大腸桿菌甲醛苗預(yù)防仔豬黃白痢不僅控制了該場仔豬黃白痢的發(fā)生，而且可使仔豬增重及成活率明顯提高。孫剛采用大腸桿菌病(本地株)多價滅活苗對仔豬的保護(hù)率達(dá)95. 03%，可以顯著減少仔豬的發(fā)病和死亡(孫剛，賁百靈，孫廣力等.豬大腸桿菌病多價滅活疫苗的應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005，2:67.)。關(guān)于噬菌體抗菌作用的研究和應(yīng)用，由于噬菌體是一類能夠感染和殺死細(xì)菌的病毒，一般只裂解相應(yīng)的宿主細(xì)菌，而不裂解其它細(xì)菌，噬菌體治療的特異性非常強，不會引起體內(nèi)菌群失調(diào)或?qū)е履繕?biāo)菌群出現(xiàn)耐藥性，因此噬菌體治療是安全、特異的。噬菌體的增殖速度快，生產(chǎn)成本低，噬菌體制劑的研發(fā)周期短，對動物細(xì)菌病的防治針對性強，動物體無獸藥殘留，對環(huán)境無污染，因此噬菌體制劑的開發(fā)前景一片光明。近年來國內(nèi)外屢見有關(guān)致病性大腸桿菌噬菌體療法的研究報道，治療性實驗均顯示出良好的抗菌效果，但至今尚未見成熟產(chǎn)品上市。瑞士科學(xué)家(2005年)對15名健康成人志愿者，飲水服用大腸埃希菌噬菌體T4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T4噬菌體在志愿者腸道中成功復(fù)制，糞便排除水平隨服用劑量提高， 血清中無T4噬菌體及相關(guān)抗體檢出。實驗期間，腸道中普通大腸桿菌數(shù)量依然保持正常。 該實驗為噬菌體治療致病性大腸桿菌腹瀉提供了有益的探索。在動物性疾病治療方面，國外可見噬菌體防治雞、豬、牛、羊、魚等動物性疾病的探索性研究報道，英國Houghton動物疾病研究院的Smith和同事們成功地應(yīng)用噬菌體治療感染了大腸埃希菌的小鼠。在隨后的研究中，Smith發(fā)現(xiàn)利用專一性噬菌體可治療由大腸埃希菌引起的豬、牛和羊的腹瀉，所有經(jīng)噬菌體治療的動物都存活下來。Bar row等在Smith的研究基礎(chǔ)上用大腸埃希菌Kl 噬菌體治療該菌感染的雞。還有用當(dāng)?shù)亓餍芯攴蛛x病原性大腸桿菌噬菌體，以噴霧法治療雞呼吸道大腸桿菌病，也收到良好的效果。Park等和Nakai等探索了運用噬菌體來控制和治療特定魚類的病原體。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實驗室經(jīng)氣囊途徑給雛雞接種大腸桿菌噬菌體，雛雞的死亡率由90%降至20% (任慧英.肉雞大腸桿菌病的噬菌體治療[J]. 中國動物保健，2008，116 (10) :52-53.)。這些實驗表明了噬菌體治療的有效性，以及對動物性疾病治療的可行性。
目前，雖然有各種微生態(tài)制劑及生物療法的廣泛研究和逐步使用，也可見聯(lián)合使用多種益生菌的復(fù)方微生態(tài)制劑，但是，尚未見聯(lián)合應(yīng)用致病性大腸桿菌毒性噬菌體、死菌苗，以及腸道益生菌，開發(fā)具有針對性治療和特異性預(yù)防，并重塑腸道正常微生態(tài)環(huán)境的復(fù)合性微生態(tài)制劑的研究和應(yīng)用報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種，防控畜禽類養(yǎng)殖動物的大腸桿菌性腹瀉，能建立一種特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的微生態(tài)防控體系，能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產(chǎn)品抗菌藥物殘留；減緩動物源性耐藥菌的產(chǎn)生，避免耐藥性細(xì)菌在動物間或動物與人之間傳播的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑及其制備。本發(fā)明的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑是這樣實現(xiàn)的，包括致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體的有效成分為IO3—gXK^pfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。用于預(yù)防乳幼動物大腸桿菌腹瀉時，添加于雌性成年動物妊娠后期(臨產(chǎn)前1個月)到整個哺乳期、幼年動物出生到斷奶后3個月以內(nèi)的飼料或飲水中；用于治療動物大腸桿菌腹瀉時，直接灌服或添加于動物飼料或飲水中服用，直至動物痊愈。
致病性大腸桿菌的毒性噬菌體以及作為保證致病性大腸桿菌的毒性噬菌體活性的宿主——致病性大腸桿菌的保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址中國武漢的武漢大學(xué)；保藏日期為2011年3月16日；保藏編號為M2011068;致病性大腸桿菌的毒性噬菌的分類命名為 Enterotoxigenic Ε. coli virulent phage P3。這里，為了進(jìn)一步提高使用效果，還含有腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌， 腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分為IO3—gXK^pfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為 1:1:1:1。本發(fā)明的有益效果是多種成分同時使用所發(fā)揮的聯(lián)合效果毒性噬菌體針對性殺滅致病性大腸桿菌，滅活菌苗刺激腸道建立特異性抵抗致病性大腸桿菌的免疫力，腸道益生菌有助于調(diào)整腸道正常的微生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備是這樣實現(xiàn)的，針對導(dǎo)致動物腹瀉的大腸桿菌流行菌株，分離治療用毒性噬菌體，毒性噬菌體有效成分為IO3—QXK^pfu/mL，并同時制備成預(yù)防用滅活菌苗，用于制備菌苗和分離噬菌體的致病性大腸桿菌，為腹瀉動物現(xiàn)場所分離；菌苗的滅活方法是不添加化學(xué)消毒劑的熱力滅活法，以免消毒劑影響組方中噬菌體和益生菌的生物學(xué)活性，熱力滅活菌苗的有效成分為IO3—QXlOuiPfVmL,化學(xué)消毒劑包括甲醛；配制方法采用保護(hù)噬菌體活性的給藥方法(如發(fā)明專利201010253208. 6所公開的)，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。這里，配制時添加腸道益生菌，配成包含針對性治療和特異性預(yù)防的復(fù)方微生物制劑，腸道益生菌包括糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分都是 IO3—gXK^pfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為1:1 :1:1。(1)致病性大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)將腹瀉動物糞便標(biāo)本分段劃線接種于 SS培養(yǎng)基，37 °C 18-24h,挑選菌落呈粉紅色、鏡檢為G—桿菌、IMViC生化試驗為++—的大腸桿菌，做0血清型鑒定，確認(rèn)為致病性大腸桿菌的血清型后，轉(zhuǎn)種營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面， 370C 18-24h增菌和純培養(yǎng)，4°C備用。(2)致病性大腸桿菌毒性噬菌體分離和純化以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為宿主菌，采用單層瓊脂法分離污水中的大腸桿菌毒性噬菌，再以雙層瓊脂試驗篩選裂菌性能好的噬菌體，并進(jìn)行純化和擴增。具體方法本發(fā)明人在申請?zhí)?01010253208. 6的發(fā)明專利 “一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法及其應(yīng)用”已詳細(xì)描述。(3)致病性大腸桿菌熱力滅活疫苗(0抗原)制備以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為疫苗候選株，配制成IO4-IOuiPfuAiL菌液，80-100°C水浴Ih加熱滅活大腸桿菌，但不影響0 抗原活性，取滅活后的菌液接種于營養(yǎng)瓊脂，370C 18-24h,無任何細(xì)菌生長，為無菌試驗合格。由于大腸桿菌有菌體抗原(0)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，其中，0抗原為細(xì)胞壁脂多糖最外層的特異性多糖，為重復(fù)的多糖單位組成，性質(zhì)穩(wěn)定，能耐100°C數(shù)小時，故80°C Ih 不影響其抗原性，H和K抗原對熱均不穩(wěn)定，60°C 30min即可破壞其抗原性，并可滅活大腸桿菌。(4)添加益生菌等配制成特異性復(fù)合微生態(tài)制劑滅活菌液里加入30%鋁膠鹽水，噬菌體液里加入30%甘油鹽水，充分搖勻，再按組方比例添加糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌， 將制好的復(fù)合微生態(tài)制劑分裝于滅菌瓶內(nèi)，4°C冰箱保存1年以上。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有防控畜禽類養(yǎng)殖動物的大腸桿菌性腹瀉，能建立一種特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的微生態(tài)防控體系，能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產(chǎn)品抗菌藥物殘留；減緩動物源性耐藥菌的產(chǎn)生，避免耐藥性細(xì)菌在動物間或動物與人之間傳播的優(yōu)點。
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述
本發(fā)明的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑實施例1是這樣實現(xiàn)的，包括致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體的有效成分為IO3—gXK^pfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。本發(fā)明的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑實施例2 在實施例1的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高使用效果，還含有腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分為IO3—9X KTpfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為 1:1:1:1。本發(fā)明的實施例1的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備是這樣實現(xiàn)的，針對導(dǎo)致動物腹瀉的大腸桿菌流行菌株，分離治療用毒性噬菌體，毒性噬菌體有效成分為IO3—QXK^pfu/mL，并同時制備成預(yù)防用滅活菌苗，用于制備菌苗和分離噬菌體的致病性大腸桿菌，為腹瀉動物現(xiàn)場所分離；菌苗的滅活方法是不添加化學(xué)消毒劑的熱力滅活法，熱力滅活菌苗的有效成分為103_9乂10、偽/!^，化學(xué)消毒劑包括甲醛，以免后者影響組方中噬菌體和益生菌的生物學(xué)活性；配制方法采用保護(hù)噬菌體活性的給藥方法(如發(fā)明專利201010253208. 6所公開的)，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。(1)致病性大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)將腹瀉動物糞便標(biāo)本分段劃線接種于 SS培養(yǎng)基，37 °C 18-24h,挑選菌落呈粉紅色、鏡檢為G—桿菌、IMViC生化試驗為++—的大腸桿菌，做0血清型鑒定，確認(rèn)為致病性大腸桿菌的血清型后，轉(zhuǎn)種營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面， 370C 18-24h增菌和純培養(yǎng)，4°C備用。(2)致病性大腸桿菌毒性噬菌體分離和純化以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為宿主菌，采用單層瓊脂法分離污水中的大腸桿菌毒性噬菌，再以雙層瓊脂試驗篩選裂菌性能好的噬菌體，并進(jìn)行純化和擴增。具體方法本發(fā)明人在申請?zhí)?01010253208. 6的發(fā)明專利 “一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法及其應(yīng)用”已詳細(xì)描述。(3)致病性大腸桿菌熱力滅活疫苗(0抗原)制備以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為疫苗候選株，配制成IO4-IOuiPfuAiL菌液，80-100°C水浴Ih加熱滅活大腸桿菌，但不影響0 抗原活性，取滅活后的菌液接種于營養(yǎng)瓊脂，370C 18-24h,無任何細(xì)菌生長，為無菌試驗合格。由于大腸桿菌有菌體抗原(0)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，其中，0抗原為細(xì)胞壁脂多糖最外層的特異性多糖，為重復(fù)的多糖單位組成，性質(zhì)穩(wěn)定，能耐100°C數(shù)小時，故80°C Ih 不影響其抗原性，H和K抗原對熱均不穩(wěn)定，60°C 30min即可破壞其抗原性，并可滅活大腸桿菌。本發(fā)明的實施例2的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備是這樣實現(xiàn)的，配制時添加腸道益生菌，配成包含針對性治療和特異性預(yù)防的復(fù)方微生物制劑，腸道益生菌包括糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分都是IO3—gXKTpfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為1:1 :1:1。(4)添加益生菌等配制成特異性復(fù)合微生態(tài)制劑滅活菌液里加入30%鋁膠鹽水，噬菌體液里加入30%甘油鹽水，充分搖勻，再按組方比例添加糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌， 將制好的復(fù)合微生態(tài)制劑分裝于滅菌瓶內(nèi)，4°C冰箱保存1年以上。使用效果如下
應(yīng)用實施例1豬場頻發(fā)仔豬腹瀉的治療。1.復(fù)合微生物制劑的制備詳見上述實施例1的方法步驟，用于制備疫苗及分離噬菌體的致病性大腸桿菌，來源于自場仔豬的腹瀉標(biāo)本。2.腹瀉仔豬的選擇和分組某豬場某時期內(nèi)，出現(xiàn)單純性腹瀉癥狀(無高燒和器官衰竭)的新生仔豬及斷乳仔豬共138頭，按出現(xiàn)腹瀉的次序編號，5號及5的倍數(shù)共27頭為實驗組，111頭為對照組。3.治療方法實驗組采用復(fù)合微生物制劑(四種效成分的含量分別為 2. 5Xl(fpfu/mL，各占1/4)治療，新生仔豬直接灌服50mL/頭/日，斷乳仔豬IOOmL/頭/日添加于飲水中；對照組灌服氟呱酸、痢菌凈等抗菌消炎藥物。兩組治療均至動物痊愈，記錄治療所用時間、治療效果，以及1個月內(nèi)的腹瀉復(fù)發(fā)情況，進(jìn)行Chi-Square Tests統(tǒng)計學(xué)分析，P ^ 0. 05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4.結(jié)果(1)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)仔豬腹瀉停止、飲食和整體狀態(tài)恢復(fù)正常者為治愈；治療3d腹瀉依然無改觀或加重者，視為治療無效(可換用其它方法治療)。(2)具體結(jié)果見表1。(3)結(jié)果討論用自場流行菌種制備疫苗和噬菌體，配制成復(fù)合微生物制劑，治療豬場頻發(fā)性仔豬大腸桿菌腹瀉，實驗治療結(jié)果與抗菌藥對照組比較，兩者治愈率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0. 05)，實驗組比對照組1個月近期腹瀉復(fù)發(fā)率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0. 05)。結(jié)果提示，對大腸桿菌導(dǎo)致的單純性腹瀉，該復(fù)合微生物制劑具有良好的治療效果和較低的近期復(fù)發(fā)率。表1.復(fù)合微生物制劑對仔豬腹瀉的治療情況
權(quán)利要求
1.一種特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑，其特征在于包括致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體的有效成分為IO3—9X KTpfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑，其特征在于含有腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，腸道益生菌中的糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分為IO3—9 X lOlfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為1:1 :1:1。
3.一種特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備，其特征在于針對導(dǎo)致動物腹瀉的大腸桿菌流行菌株，分離治療用毒性噬菌體，毒性噬菌體有效成分為IO3—gXK^pfu/mL，并同時制備成預(yù)防用滅活菌苗，用于制備菌苗和分離噬菌體的致病性大腸桿菌，為腹瀉動物現(xiàn)場所分離；菌苗的滅活方法是不添加化學(xué)消毒劑的熱力滅活法，熱力滅活菌苗的有效成分為IO3—gXKTpfu/mL，化學(xué)消毒劑包括甲醛，以免后者影響組方中噬菌體和益生菌的生物學(xué)活性；配制方法采用保護(hù)噬菌體活性的給藥方法(如發(fā)明專利201010253208. 6所公開的)，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備，其特征在于(1)致病性大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)將腹瀉動物糞便標(biāo)本分段劃線接種于SS培養(yǎng)基，37°C 18-Mh，挑選菌落呈粉紅色、鏡檢為G—桿菌、IMViC生化試驗為++—的大腸桿菌， 做0血清型鑒定，確認(rèn)為致病性大腸桿菌的血清型后，轉(zhuǎn)種營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面，37°C 18-24h 增菌和純培養(yǎng)，4°C備用；(2)致病性大腸桿菌毒性噬菌體分離和純化以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為宿主菌， 采用單層瓊脂法分離污水中的大腸桿菌毒性噬菌，再以雙層瓊脂試驗篩選裂菌性能好的噬菌體，并進(jìn)行擴增、純化；(3)致病性大腸桿菌熱力滅活疫苗(0抗原)制備以(1)所述純培養(yǎng)大腸桿菌為疫苗候選株，配制成IO4-IOuiPfuAiL菌液，80-100°C水浴Ih加熱滅活大腸桿菌，但不影響0抗原活性，取滅活后的菌液接種于營養(yǎng)瓊脂，37°C 1814h，無任何細(xì)菌生長，為無菌試驗合格。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備，其特征在于配制時添加腸道益生菌，配成包含針對性治療和特異性預(yù)防的復(fù)方微生物制劑，腸道益生菌包括糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分都是IO3—gXKTpfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗、毒性噬菌體、腸道益生菌中的糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌的重量含量比為1:1 :1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑的制備，其特征在于(4)添加益生菌等配制成特異性復(fù)合微生態(tài)制劑滅活菌液里加入30%鋁膠鹽水，噬菌體液里加入30%甘油鹽水，充分搖勻，再按組方比例添加糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，將制好的復(fù)合微生態(tài)制劑分裝于滅菌瓶內(nèi)，4°C冰箱保存1年以上。
全文摘要
特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的復(fù)方微生物制劑及其制備，其特征在于包括致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體的有效成分為103—9×1010pfu/mL，致病性大腸桿菌的熱力滅活菌苗和毒性噬菌體重量含量比為1:1。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有防控畜禽類養(yǎng)殖動物的大腸桿菌性腹瀉，能建立一種特異性防治畜禽類養(yǎng)殖動物大腸桿菌性腹瀉的微生態(tài)防控體系，能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產(chǎn)品抗菌藥物殘留；減緩動物源性耐藥菌的產(chǎn)生，避免耐藥性細(xì)菌在動物間或動物與人之間傳播的優(yōu)點。
文檔編號A61P1/12GK102266552SQ20111007550
公開日2011年12月7日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者萬學(xué)勤, 崔志新, 李宏鳴, 段穗芳 申請人:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院