專(zhuān)利名稱(chēng)：一種引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其是指一種引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
引導(dǎo)組織再生膜(guidedtissue regeneration membrane, GTRM)是指應(yīng)用膜屏障技術(shù)阻止結(jié)締組織和上皮細(xì)胞長(zhǎng)入骨缺損區(qū)，引導(dǎo)成骨細(xì)胞占據(jù)成骨空間，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。GTRM通過(guò)外科手術(shù)將其置于骨缺損上方，與軟組織接觸的一面能將上皮細(xì)胞和成維細(xì)胞阻擋于缺損外，與骨組織接觸的一面能引導(dǎo)來(lái)源自骨膜骨髓的骨生成細(xì)胞在其表面貼附，進(jìn)而增值分化其分化為成骨細(xì)胞。GTRM為新生骨組織提供一個(gè)相對(duì)封閉的組織環(huán) 境，起到選擇性組織再生的作用。根據(jù)在體內(nèi)被吸收降解性能，GTRM可分為不可吸收性膜和可吸收性膜。常用的不可吸收性膜有膨體聚四氟乙烯膜、鈦膜等等。在臨床應(yīng)用中顯示了比較好的引導(dǎo)組織再生作用。但是該類(lèi)材料不可降解，需要二次手術(shù)取出，這不但增加了患者的痛苦和感染的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)了治療時(shí)間，增加了花費(fèi)，也可能引起組織的再次損傷，且不可吸收膜使用后常有傷口裂開(kāi)和膜暴露的并發(fā)癥，限制了不可吸收GTRM應(yīng)用，這為可吸收材GTRM材料的發(fā)展提供了廣闊的空間。GTRM材料最大優(yōu)點(diǎn)是不需二次手術(shù)去除?？晌誈TRM被應(yīng)用和研究最多是膠原材料，如Bio-Gide 就是非交聯(lián)的純I型和III型豬膠原構(gòu)建的。國(guó)內(nèi)外采用膠原成分構(gòu)建引導(dǎo)膜也有一些報(bào)道，如國(guó)內(nèi)專(zhuān)利公開(kāi)第CN1586637A號(hào)張其清等采用I型膠原為主要原料，制備出一種雙層復(fù)合引導(dǎo)組織再生膜，其中致密層由膠原經(jīng)壓制而成、疏松層由膠原和透明質(zhì)酸或其鈉鹽組成，該雙層復(fù)合膜通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)、清洗凍干處理制備成成品，但是該方法制備引導(dǎo)膜還需要機(jī)械加壓成型，不是直接工藝成型，而且僅采用化學(xué)交聯(lián)。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第US 2004/0214991A1號(hào)通過(guò)膠原膜在I型膠原和糖胺聚糖混合溶液浸潰、冷凍、真空冷凍干燥、擠壓和交聯(lián)，形成膠原和糖胺聚糖的復(fù)合物用于引導(dǎo)組織再生。Liu Sung-Tsuen等PCT申請(qǐng)國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 01/15711A1還通過(guò)磷酸I丐在膠原上的礦化制備出一種均勻的礦化膠原膜，來(lái)用于引導(dǎo)組織再生。Matsuda等歐洲專(zhuān)利號(hào)第EP1022031B1制備出由膠原纖維的非織層、膠原海綿層、明膠或透明質(zhì)酸的涂層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜膜，其中膠原纖維是由膠原交聯(lián)制備得到的，該引導(dǎo)再生膜具備足夠的縫合強(qiáng)度和良好的生物相容性。Geistlic公司的專(zhuān)利國(guó)際公開(kāi)號(hào)第WO 99/19005構(gòu)建了一種基質(zhì)層和隔離層組成的引導(dǎo)膜，其中基質(zhì)層主要是由II型膠原構(gòu)成，并具有海綿狀質(zhì)地結(jié)構(gòu)，隔離層主要由I型和III膠原組成，是一層致密的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，該引導(dǎo)膜特別適用于骨和軟骨的再生修復(fù)。Geistlic公司專(zhuān)利國(guó)際公開(kāi)號(hào)第WO 2010/082138 A2以膠原為主要原料，制備一種由光滑面、纖維面以及與附著纖維面的膠原海綿層構(gòu)成的一種多層結(jié)構(gòu)的膜，其中膠原海綿層還含有殼聚糖、彈性蛋白或透明質(zhì)酸成分。同時(shí)該膜還可載入生長(zhǎng)因子緩釋微球?？傮w來(lái)講，膠原材料具有無(wú)抗原性，生物相容性好，可參與組織愈合過(guò)程，降解速率可根據(jù)需要調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，在阻止上皮遷移和促進(jìn)新的結(jié)締組織形成過(guò)程中同樣有效，在肌腱、韌帶、牙周組織及腹膜的修復(fù)等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。膠原膜作為引導(dǎo)組織再生膜的研究還有一些問(wèn)題亟待改進(jìn)首先是體內(nèi)降解速度過(guò)快；其次是相對(duì)于引導(dǎo)組織再生膜的要求，膠原膜的抗張強(qiáng)度較小，在應(yīng)用過(guò)程中容易發(fā)生塌陷和移位而失去空間維持能力，再次由于材料制備工程中要通常冷凍干燥的方法，由于液體結(jié)冰時(shí)候體積的膨脹，制備質(zhì)地均勻、大尺寸的的膠原膜的工藝還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種引導(dǎo)組織再生膜(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為引導(dǎo)膜)，以解決現(xiàn)有技術(shù)中引導(dǎo)組織再生膜降解速度過(guò)快、強(qiáng)度較低、操作不方便的問(wèn)題，同時(shí)解決了大尺寸、膠原膜的工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)材料的均勻性的問(wèn)題。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種引導(dǎo)組織再生膜，包括致密層和疏松層，所述致密層由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的透明質(zhì)酸組成；疏松層是由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的鈣鹽組成。
優(yōu)選地，致密層由I型膠原復(fù)合透明質(zhì)酸組成時(shí)，I型膠原與透明質(zhì)酸的質(zhì)量份數(shù)分別為0.1-1以及0. 01-1 ;所述疏松層由I型膠原復(fù)合鈣鹽組成時(shí)，I型膠原和鈣鹽質(zhì)量份數(shù)分別為0. 1-1以及0. 1-2。疏松層呈海綿狀、平均的孔徑為100-250微米，厚度為1-2毫米；致密層相對(duì)致密，無(wú)微孔的存在，光滑呈半透明，厚度為0. 3-1毫米。所述的再生膜，其制備方法包括以下步驟
1)用醋酸溶劑來(lái)配制膠原溶液，或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液；
2)將步驟I所得的溶液通過(guò)展開(kāi)器注入到自行設(shè)計(jì)的模具中，模具進(jìn)行適當(dāng)控溫加熱，在空氣中干燥，制備致密層；
3)待致密層制備好后，通過(guò)另外一個(gè)展開(kāi)器在其上面注入步驟I制備的膠原溶液，或注入步驟I制備的膠原溶液并加入鈣鹽的混合液，然后將其鋪展開(kāi)，放置約1-5小時(shí)；
4)然后把模具進(jìn)行冷凍，冷凍干燥，制備出有致密層和疏松層結(jié)構(gòu)引導(dǎo)膜；
5)將步驟4制備的引導(dǎo)膜進(jìn)行真空高溫交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)；
6)進(jìn)行清洗，預(yù)冷凍、然后冷凍干燥從而制備得到由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜；引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌等工藝制備出引導(dǎo)膜產(chǎn)品。所用模具是針對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利工藝自行設(shè)計(jì)加工而成，實(shí)質(zhì)包括一大面積的長(zhǎng)方形平板，具備自動(dòng)控溫加熱和烘干的功能，溫度控制范圍為0-80°C。溶液在致密層上均勻展開(kāi)使用的展開(kāi)器具也是自行加工設(shè)計(jì)的，模具和展開(kāi)器一起使用時(shí)，可一次性制備大尺寸的(長(zhǎng)寬大于I米)均勻膜。展開(kāi)器是一個(gè)內(nèi)裝有溶液的微孔滾軸，微孔孔徑為150，溶液從進(jìn)料管流入滾軸內(nèi)，并在一定壓力下從微孔中緩慢流出，并隨自動(dòng)控制的滾軸不斷來(lái)回滾動(dòng)，這樣均勻把溶液均勻鋪展開(kāi)。優(yōu)選地,步驟I中所述醋酸的pH=l_3,所述溶液中膠原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1-1%,透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01-1%。所述步驟2中進(jìn)行控溫加熱到0_80°C。步驟3中，所述混合液中鈣鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1_2%，鈣鹽顆粒度為納米或微米級(jí)，選自羥基磷灰石、3 -磷酸三鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、硫酸鈣等中一種或多種。所述步驟4中，把模具放入超低溫冰箱，在零下80-100°C超低溫下冷凍兩個(gè)小時(shí)，冷凍后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在零下40-60°C條件下冷凍干燥24小時(shí)。
所述步驟5中，真空高溫交聯(lián)是在80_130°C下交聯(lián)反應(yīng)8-30小時(shí)；進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)時(shí)，是在交聯(lián)劑中浸泡6-24小時(shí)，交聯(lián)劑的濃度為0. 1-1. 2%，交聯(lián)劑選自戊二醛、京尼平、碳化二亞胺中的一種或多種。所述步驟6中，還進(jìn)一步包括把清洗完的樣品在零下20-40°C冷凍，然后在零下40-60°C條件下冷凍干燥，再將引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌的工藝從而制備出由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜；所述清洗是待引導(dǎo)膜化學(xué)交聯(lián)完后，向模具中加入生理鹽水，并不斷清洗，然后浸泡三天，除去樣品中殘留的交聯(lián)劑，并將樣品中的低分子物水洗掉。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明制備的引導(dǎo)組織再生膜具備良好的組織相容性，抗原性低、良好的力學(xué)強(qiáng)度、易于操作，引導(dǎo)組織再生能力強(qiáng)。該引導(dǎo)組織再生膜在體內(nèi)降解的速度為3-8個(gè)月。采用GB/T 528來(lái)測(cè)試，本發(fā)明的引導(dǎo)膜比現(xiàn)有引導(dǎo)膜產(chǎn)品具有更好的力學(xué)性能，斷裂拉伸強(qiáng)度大于 IOMPa0采用GB/T16886. 5和GB/T16886. 12中規(guī)定的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明引導(dǎo)膜的細(xì)胞毒性為0級(jí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)合掃描電鏡圖顯示成纖維細(xì)胞在致密層上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，成骨細(xì)胞在疏松層上生長(zhǎng)狀態(tài)良好。該引導(dǎo)膜適合用于牙種植體周?chē)侨睋p修復(fù)，牙周骨缺損修復(fù)、延期種植骨增高術(shù)、牙槽嵴的擴(kuò)展和重建治療、上頜竇提升術(shù)、截根術(shù)、囊腫切除和根尖切除術(shù)后的骨缺損充填、填充新鮮拔牙窩，以保持牙槽嵴頂?shù)男螒B(tài)、牙槽突裂等癥狀。該引導(dǎo)再生膜更適合與自體骨、各種可注射骨修復(fù)材料、或各種顆?；驂K體骨修復(fù)填充物、各種其他骨修復(fù)材料產(chǎn)品相結(jié)合引導(dǎo)骨組織損傷和缺損的再生修復(fù)。其適用范圍廣泛。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，同時(shí)解決了大尺寸、膠原膜的工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)材料的均勻性的問(wèn)題。


圖I是用于制備本發(fā)明引導(dǎo)膜組織再生膜的模具和展開(kāi)器示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例的引導(dǎo)組織再生膜的疏松層的掃描電鏡圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例的引導(dǎo)組織再生膜的致密層的掃描電鏡圖。圖4是本發(fā)明引導(dǎo)膜的致密層在創(chuàng)傷修復(fù)早期形態(tài)掃描電鏡圖。圖5是本發(fā)明引導(dǎo)膜的致密層開(kāi)始出現(xiàn)降解的形態(tài)掃描電鏡圖。圖6是本發(fā)明又一實(shí)施例的引導(dǎo)組織再生膜的疏松層的掃描電鏡圖。圖7是本發(fā)明又一實(shí)施例的引導(dǎo)組織再生膜的致密層的掃描電鏡圖。圖8是本發(fā)明實(shí)施例3T3成纖維細(xì)胞在致密層上的生長(zhǎng)形貌的掃描電鏡圖。圖9是本發(fā)明實(shí)施例MC3T3-E1成骨細(xì)胞在致密層上的生長(zhǎng)形貌的掃描電鏡圖。具體實(shí)施實(shí)例
本發(fā)明是以I型膠原為主要原料，制備出一種由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜，其中致密層由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的透明質(zhì)酸組成；疏松層主要是由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的鈣鹽組成。其中疏松層呈海綿狀、平均的孔徑為100-250微米(如圖2和6)，厚度為1_2毫米；致密層相對(duì)致密，無(wú)微孔的存在，比較光滑(如圖3和7)，呈半透明，厚度為0. 3-1毫米。
該引導(dǎo)膜適合用于多種骨修復(fù)或與其他骨修復(fù)材料產(chǎn)品相結(jié)合引導(dǎo)骨組織損傷和缺損的再生修復(fù)。利用本發(fā)明的引導(dǎo)膜進(jìn)行骨缺損修復(fù)時(shí)，通過(guò)外科手術(shù)將其置于骨缺損上方，與軟組織接觸的致密層能將上皮細(xì)胞和成維細(xì)胞阻擋于缺損外，與骨缺損組織接觸的疏松層能引導(dǎo)來(lái)源自骨膜和骨髓的骨生成細(xì)胞在其表面貼附，進(jìn)而增值分化其分化為成骨細(xì)胞。本發(fā)明制備的引導(dǎo)膜在臨床上修復(fù)骨缺損時(shí)，當(dāng)遇到較小缺損時(shí)，可以直接將引導(dǎo)膜置于缺損部位上方進(jìn)行使用；當(dāng)遇到較大骨缺損時(shí)，可以先采用自體骨、各種可注射骨修復(fù)材料、或各種顆?；驂K體骨修復(fù)填充材料、以及其他的骨修復(fù)材料等產(chǎn)品對(duì)骨缺損進(jìn)行填充或塑性，然后再將引導(dǎo)膜置于缺損部位上方，來(lái)阻礙軟組織的長(zhǎng)入，引導(dǎo)骨組織的正常生長(zhǎng)，促進(jìn)骨修復(fù)。本引導(dǎo)組織再生膜具備良好的組織相容性，抗原性低、良好的力學(xué)強(qiáng)度、易于操作，引導(dǎo)組織再生能力強(qiáng)。本發(fā)明制備的引導(dǎo)膜的拉伸強(qiáng)度采用GB/T 528來(lái)測(cè)試斷裂拉伸 強(qiáng)度大于lOMPa。體外細(xì)胞毒性采用GBT16886. 5和GBT16886. 12中規(guī)定的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明引導(dǎo)膜的細(xì)胞毒性為0級(jí)。本發(fā)明制備的引導(dǎo)膜在體內(nèi)降解的速度為3-8個(gè)月，降解速度取決于產(chǎn)品制備工藝和手術(shù)植入的部位，如該引導(dǎo)膜在牙種植體周?chē)侨睋p修復(fù)，牙周骨缺損修復(fù)、延期種植骨增高術(shù)、牙槽嵴的擴(kuò)展和重建治療、上頜竇提升術(shù)、截根術(shù)、囊腫切除和根尖切除術(shù)后的骨缺損充填、填充新鮮拔牙窩，以保持牙槽嵴頂?shù)男螒B(tài)、牙槽突裂等臨床應(yīng)用時(shí)，最快降解周期為3個(gè)月，最慢為8個(gè)月。與骨修復(fù)的周期對(duì)應(yīng)。為制備出上述引導(dǎo)再生膜，請(qǐng)同時(shí)參照?qǐng)D1，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案利用自行設(shè)計(jì)的模具和展開(kāi)器先制備出致密層，然后在致密層上制備疏松層，最后進(jìn)行交聯(lián)。本發(fā)明的模具I有較大尺寸，底部為平板，優(yōu)選大致呈長(zhǎng)方形，也可根據(jù)引導(dǎo)再生膜的形狀要求設(shè)計(jì)成不同形狀。模具I具有自動(dòng)控溫加熱和烘干的功能，溫度控制范圍為0-200°C，一般在0-80°C;可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施方式進(jìn)行配置，以利于保證再生膜的質(zhì)量均勻性。模具I內(nèi)配套設(shè)置有展開(kāi)器2，模具和展開(kāi)器一起使用時(shí)，可一次性制備大尺寸(長(zhǎng)寬大于I米)的均勻膜。展開(kāi)器2是一個(gè)內(nèi)部可盛裝溶液的微孔滾軸，微孔3的尺寸為150微米(但不限于150微米)，滾軸內(nèi)的溶液在一定壓力下從微孔中緩慢流出，并隨自動(dòng)控制的滾軸不斷來(lái)回滾動(dòng)，這樣便可均勻地將溶液在模具I內(nèi)鋪展開(kāi)。溶液通過(guò)連續(xù)進(jìn)料管4注入展開(kāi)器2的滾軸內(nèi)。具體制備方法包括以下步驟
(I)用一定酸度的醋酸溶液作為溶劑來(lái)配制膠原溶液，或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液；其中醋酸溶液的pH為1-3,膠原溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1-1%,透明質(zhì)酸的溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01-1%。I型膠原選自提取于牛跟腱、豬跟腱天然I型膠原、重組人類(lèi)I型膠原中一種或多種，透明質(zhì)酸采用藥用注射級(jí)透明質(zhì)酸或其鈉鹽(透明質(zhì)酸鈉)。膠原、或膠原與透明質(zhì)酸溶解后，離心，取膠原溶液或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液的上清液待用。(2)將離心的膠原溶液或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液通過(guò)展開(kāi)器2注入到模具I中，并展開(kāi)，模具進(jìn)行控溫加熱，溫度控制在0-80°C下，更優(yōu)選地控制在0_45°C下，在空氣中干燥兩天，制備致密層；其中致密層可通過(guò)控制注入溶液的量來(lái)控制厚度的制備得到不同厚度。
(3)待致密層制備好后，通過(guò)展開(kāi)器2在其上面注入步驟I制備的膠原溶液，或注入步驟I制備的膠原溶液并加入鈣鹽的混合液，然后將其鋪展開(kāi)，并優(yōu)選放置約I小時(shí)；其中混合液中鈣鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1-2%;鈣鹽顆粒度為納米或微米級(jí)，選自羥基磷灰石、3 -磷酸三鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、硫酸鈣等中一種或多種。(4)然后把模具放入超低溫冰箱，在零下80-100°C超低溫下冷凍兩個(gè)小時(shí)，冷凍后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在零下40-60°C條件下冷凍干燥24小時(shí)，制備出有致密層和疏松層結(jié)構(gòu)引導(dǎo)膜。(5)把裝有引導(dǎo)膜的模具放入真空干燥機(jī)內(nèi)，在抽真空的狀態(tài)下，高溫交聯(lián)8-30小時(shí)；高溫交聯(lián)的溫度為80-130°C。然后向模具內(nèi)加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑是一次性加入，將高溫交聯(lián)后的引導(dǎo)膜浸泡一段時(shí)間以進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。交聯(lián)劑的濃度為0. 1-1. 2%，選自戊二醛、京尼平、碳化二亞胺等交聯(lián)劑中的一種或多種。(6)把化學(xué)交聯(lián)完的引導(dǎo)膜用生理鹽水不斷清洗，然后浸泡三天，除去樣品中殘留 的交聯(lián)劑，并將樣品中的低分子物以水清洗，以除去如醋酸及剩余的鹽等。把清洗完的樣品在零下20-40°C冷凍，然后在零下40-60°C條件下冷凍干燥，制備得到由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜。引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌等工藝制備出引導(dǎo)膜產(chǎn)品。設(shè)置一卷軸將引導(dǎo)膜從模具內(nèi)取出，重復(fù)步驟1-6進(jìn)行新的生產(chǎn)，這樣便可實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)再生膜的全自動(dòng)化連續(xù)規(guī)?；a(chǎn)和成型工藝。下面通過(guò)具體實(shí)例并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，以下所述的實(shí)例僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。例I
本發(fā)明制備的引導(dǎo)膜的具體制備方法如下
1)用0.5%的醋酸溶液PH=2-3范圍內(nèi)，配制濃度為0. 6%的膠原溶液；
2)待膠原溶解后，以轉(zhuǎn)速為4400rp/min離心；
3)把一定量離心好的膠原通過(guò)展開(kāi)器2注入到模具I中，模具加熱到45°C，在空氣中干燥兩天，制備致密層；
4)待致密層制備好后，通過(guò)展開(kāi)器2在其上面注入一定量的離心好的膠原溶液并均勻展開(kāi)，放置I小時(shí)；
5)在放置后把模具放入_86°C的超低溫冰箱冷凍兩個(gè)小時(shí)，冷凍后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷干24小時(shí)，制備得到雙層結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)膜；
6)把制備的引導(dǎo)膜放入真空干燥機(jī)內(nèi)，在抽真空的狀態(tài)下，90°C交聯(lián)24小時(shí)；
7)待引導(dǎo)膜高溫交聯(lián)后，向模具中一次性加入0.5%戊二醛溶液進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，浸泡交聯(lián)8小時(shí)；
8)待化學(xué)交聯(lián)完后，向模具中加入生理鹽水并不斷清洗，然后浸泡三天，置換樣品中殘留的戊二醛，并用水進(jìn)一步清洗；
9)把清洗完的樣品冷凍2小時(shí)，然后冷凍干燥24小時(shí)，制備得到雙層引導(dǎo)膜。引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌等工藝制備出引導(dǎo)膜產(chǎn)品。所制得的引導(dǎo)膜，參照?qǐng)D2和3，其疏松層呈海綿狀、平均的孔徑為100-250微米(如圖2)，厚度為1-2毫米；致密層相對(duì)致密，無(wú)微孔的存在，比較光滑(如圖3)，呈半透明，厚度為0.3-1毫米。本實(shí)例制備的引導(dǎo)膜的拉伸強(qiáng)度采用GB/T 528來(lái)測(cè)試斷裂拉伸強(qiáng)度16.7 Mpa0進(jìn)行體外降解實(shí)驗(yàn)，參照?qǐng)D4-5，2個(gè)月時(shí)，引導(dǎo)膜致密層還能維持良好致密性，如圖4所示，在創(chuàng)傷修復(fù)早期維持致密層的良好致密性將能隔離軟組織的長(zhǎng)入骨缺損內(nèi)，有利于骨組織的修復(fù)；致密層3個(gè)月時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)降解，如圖5所示；7個(gè)月左右基本完全降解。例2
本發(fā)明制備的引導(dǎo)膜的具體制備方法如下
1)用0.5%的醋酸溶液PH=2-3范圍內(nèi)，配置濃度為1%的I膠原溶液；
2)待膠原溶解好，用轉(zhuǎn)速為4400rp/min離心；
3)把一定量離心好的膠原通過(guò)展開(kāi)器2注入到模具I中，模具加熱到45°C，在空氣中干燥兩天，制備致密層；
4)在離心好的膠原溶液中，加入￠-磷酸三鈣攪拌均勻，￠-磷酸三鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.5% ;待步驟3中的致密層制備好后，通過(guò)展開(kāi)器2在其上面注入含0. 5% P -磷酸三鈣的膠原溶液，并均勻鋪展開(kāi)，放置I小時(shí)；
5)在放置后把模具放入_86°C的超低溫冰箱冷凍兩個(gè)小時(shí)，冷凍后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷干24小時(shí)，制備得到雙層結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)膜；
6)把制備的引導(dǎo)膜放入真空干燥機(jī)內(nèi)，在抽真空的狀態(tài)下105°C交聯(lián)24小時(shí)；
7)待引導(dǎo)膜高溫交聯(lián)后，向模具中一次性的加入0.5%京尼平溶液進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，浸泡8小時(shí)；
8)待化學(xué)交聯(lián)完后，向模具中加入生理鹽水不斷清洗，然后浸泡三天，置換樣品中殘留的京尼平；
9)把清洗完的樣品冷凍2小時(shí)，然后冷凍干燥24小時(shí)，制備得到雙層引導(dǎo)膜；引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌等工藝制備出引導(dǎo)膜產(chǎn)品。本實(shí)例制備的引導(dǎo)膜是由致密層和疏松層構(gòu)成的雙層結(jié)構(gòu)，其中疏松層，如圖6，呈海綿狀、平均的孔徑為100-250微米，厚度為1-2毫米。致密層，如圖7，其相對(duì)致密，無(wú)微孔的存在，比較光滑，呈半透明，厚度為0.3-1毫米。本實(shí)例制備的引導(dǎo)膜的拉伸強(qiáng)度采用GB/T 528來(lái)測(cè)試斷裂拉伸強(qiáng)度為12. 5MPa。體外細(xì)胞毒性采用GB/T16886. 5和GB/T16886. 12中的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明引導(dǎo)膜的細(xì)胞毒性為0級(jí)。將3T3成纖維細(xì)胞接種在本實(shí)例制備的引導(dǎo)膜的致密層進(jìn)行培養(yǎng)，請(qǐng)參照?qǐng)D8，圖8是3T3成纖維細(xì)胞在致密層上的生長(zhǎng)形貌的掃描電鏡圖，成纖維細(xì)胞在致密層上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，致密層具有很好細(xì)胞相容性。將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在疏松層上進(jìn)行培養(yǎng)，請(qǐng)參照?qǐng)D9，圖9是MC3T3-E1成骨細(xì)胞在疏松層上的生長(zhǎng)形貌的掃描電鏡圖(如箭頭所示)，疏松層能促進(jìn)成骨細(xì)胞在其表面貼附和生長(zhǎng)，成骨細(xì)胞在疏松層上生長(zhǎng)狀態(tài)良好。例3
將本發(fā)明例I和例2制備的引導(dǎo)膜，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，用于狗的牙種植體周?chē)侨睋p模型的修復(fù)，將引導(dǎo)膜置于缺損部位上方，引導(dǎo)膜的致密層超上放置，與軟組織接觸，避免軟組織長(zhǎng)入骨缺損部位；引導(dǎo)膜的疏松層朝下，與骨缺損組織面接觸的，引導(dǎo)來(lái)源自骨膜和骨髓的骨生成細(xì)胞在其表面貼附，進(jìn)而增值分化其分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。本應(yīng)用實(shí)例中，引導(dǎo)膜在體內(nèi)降解的周期為6個(gè)月。
權(quán)利要求
1.一種引導(dǎo)組織再生膜，包括致密層和疏松層，其特征在于所述致密層由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的透明質(zhì)酸組成；疏松層是由I型膠原，或I型膠原復(fù)合一定量的鈣鹽組成。
2.如權(quán)利要求I所述的再生膜，其特征在于所述致密層由I型膠原復(fù)合透明質(zhì)酸組成時(shí)，I型膠原與透明質(zhì)酸的質(zhì)量份數(shù)分別為0. 1-1以及0. 01-1 ;所述疏松層由I型膠原復(fù)合鈣鹽組成時(shí)，I型膠原和鈣鹽質(zhì)量份數(shù)分別為0. 1-1以及0. 1-2 ;疏松層呈海綿狀、平均的孔徑為100-250微米，厚度為1-2毫米；致密層相對(duì)致密，無(wú)微孔的存在，光滑呈半透明，厚度為0. 3-1毫米。
3.如權(quán)利要求I所述的再生膜，其特征在于1型膠原選自提取于牛跟腱、豬跟腱天然I型膠原、重組人類(lèi)I型膠原中至少一種；透明質(zhì)酸采用藥用注射級(jí)透明質(zhì)酸或其鈉鹽；鈣鹽顆粒度為納米或微米級(jí)，選自羥基磷灰石、3 -磷酸三鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、硫酸鈣等中一種或多種。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的再生膜，其制備方法包括以下步驟 1)用醋酸溶劑來(lái)配制膠原溶液，或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液； 2)將步驟I所得的溶液通過(guò)展開(kāi)器注入到模具中并展開(kāi)，模具進(jìn)行控溫加熱，在空氣中干燥，制備致密層； 3)待致密層制備好后，通過(guò)展開(kāi)器在其上面注入步驟I制備的膠原溶液，或注入步驟I制備的膠原溶液并加入鈣鹽的混合液，然后將其鋪展開(kāi)，放置一定時(shí)間； 4)把模具進(jìn)行超低溫預(yù)冷凍，冷凍干燥，制備出有致密層和疏松層結(jié)構(gòu)引導(dǎo)膜； 5)將步驟4制備的引導(dǎo)膜進(jìn)行真空高溫交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)； 6)進(jìn)行清洗，冷凍干燥，從而制備得到由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜。
5.如權(quán)利要求4所述的再生膜制備方法，其特征在于所述模具實(shí)質(zhì)包括一大面積的長(zhǎng)方形平板，模具可自動(dòng)控溫加熱和烘干，溫度控制范圍為0-80°C ;所述模具內(nèi)配套設(shè)置有展開(kāi)器，模具和展開(kāi)器一起使用時(shí)，可一次性制備大尺寸的均勻膜；展開(kāi)器是一個(gè)內(nèi)部可盛裝溶液的微孔滾軸，滾軸內(nèi)的溶液在一定壓力下從微孔中緩慢流出，并隨自動(dòng)控制的滾軸不斷來(lái)回滾動(dòng)，均勻地將溶液在模具內(nèi)鋪展開(kāi)；溶液通過(guò)連續(xù)進(jìn)料管注入展開(kāi)器的滾軸內(nèi)。
6.如權(quán)利要求4所述的再生膜制備方法，其特征在于步驟I中所述醋酸的pH=l-3，所述溶液中膠原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1_1%，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-1%;所述步驟2中進(jìn)行控溫加熱到0-80°C;步驟3中，所述混合液中鈣鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1_2%，鈣鹽顆粒度為納米或微米級(jí)，選自羥基磷灰石、3 -磷酸三鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、硫酸鈣等中一種或多種。
7.如權(quán)利要求4所述的再生膜制備方法，其特征在于步驟3中放置一定時(shí)間為1-5小時(shí)；所述步驟4是在零下80-100°C超低溫下冷凍，然后在零下40-60°C條件下冷凍干燥。
8.如權(quán)利要求7所述的再生膜制備方法，其特征在于所述步驟I中還進(jìn)一步包括將溶液或混合溶液進(jìn)行離心；所述步驟2，是進(jìn)行空氣中干燥兩天；所述步驟4中，把模具放入超低溫冰箱，在零下80-100°C超低溫下冷凍兩個(gè)小時(shí)，冷凍后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在零下40-60°C條件下冷凍干燥24小時(shí)。
9.如權(quán)利要求4所述的再生膜制備方法，其特征在于所述步驟5中，真空高溫交聯(lián)是在80-130°C下交聯(lián)反應(yīng)8-30小時(shí)；進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)時(shí)，是在交聯(lián)劑中浸泡6-24小時(shí)，交聯(lián)劑的濃度為0. 1-1. 2%，交聯(lián)劑選自戊二醛、京尼平、碳化二亞胺中的一種或多種。
10.如權(quán)利要求4述的再生膜制備方法，其特征在于所述步驟6中，還進(jìn)一步包括把清洗完的樣品在零下20-40°C冷凍，然后在零下40-60°C條件下冷凍干燥，再將引導(dǎo)膜直接從模具中取出，進(jìn)行裁剪、包裝和滅菌的工藝從而制備出由致密層和疏松層構(gòu)成的引導(dǎo)再生膜；所述清洗是待引導(dǎo)膜化學(xué)交聯(lián)完后，向模具中加入生理鹽水，并不斷清洗，然后浸泡三天，除去樣品中殘留的交聯(lián)劑，并將樣品中的低分子物水洗掉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種引導(dǎo)組織再生膜，包括致密層和疏松層，致密層由I型膠原，或I型膠原復(fù)合透明質(zhì)酸組成；疏松層由I型膠原，或I型膠原復(fù)合鈣鹽組成。其制備方法為用醋酸配制膠原溶液或膠原與透明質(zhì)酸混合溶液；將溶液注入自制模具，空氣中干燥以制備致密層；在致密層上注入膠原溶液，或膠原溶液與鈣鹽混合液，并鋪展均勻；再對(duì)模具進(jìn)行超低溫預(yù)冷凍，然后冷凍干燥，制備有致密層和疏松層結(jié)構(gòu)引導(dǎo)膜；并進(jìn)行真空高溫交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)；最后清洗。本發(fā)明再生膜具備良好的組織相容性和力學(xué)強(qiáng)度，抗原性低、引導(dǎo)組織再生能力強(qiáng)，體內(nèi)降解速度為3-8月。該方法易于操作，適于自動(dòng)化連續(xù)規(guī)模生產(chǎn)，解決膠原膜大尺寸、工業(yè)生產(chǎn)時(shí)材料均勻性的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61L31/12GK102716517SQ20111007884
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者佘振定 申請(qǐng)人:深圳蘭度生物材料有限公司