專利名稱：一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染pmma骨水泥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用骨水泥復(fù)合材料，具體地說，是一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染PMMA骨水泥。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)老齡人口的增加、期望壽命延長及生活質(zhì)量的提高，全膝及全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)及治療骨質(zhì)疏松性脊柱壓縮骨折的PVP(PKP)技術(shù)在骨科臨床的應(yīng)用日益廣泛。在這些手術(shù)中，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)是最為常用的植入固定材料，可以達(dá)到關(guān)節(jié)假體及骨折斷端的即刻可靠固定。與其他的內(nèi)植物材料一樣，PMMA也將會(huì)因細(xì)菌侵入和生物膜在其表面的形成而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上初次全髖及全膝置換術(shù)后，深部感染的發(fā)生率達(dá) 1%-2%，而因松動(dòng)進(jìn)行的關(guān)節(jié)翻修術(shù)有更高的感染率，達(dá)到初次關(guān)節(jié)置換的2-3倍。骨關(guān)節(jié)感染可能造成災(zāi)難性的后果(如截肢)，并常需要取出內(nèi)植物進(jìn)行二次手術(shù)，給患者和社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此預(yù)防和治療感染意義重大。全身及局部抗生素應(yīng)用是預(yù)防骨關(guān)節(jié)術(shù)后感染的有效途徑。局部負(fù)載抗生素的 PMMA骨水泥有較好的抗菌效果，目前已成為骨關(guān)節(jié)手術(shù)預(yù)防感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，全身及局部抗生素的使用已導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌菌株出現(xiàn)(如耐藥金黃色葡萄球菌MRSA、耐藥表皮葡萄球菌MRSE等)，難以再應(yīng)用常規(guī)植入的抗生素骨水泥，因此發(fā)展新的抗感染植入和固定材料有迫切的臨床需求。殼聚糖是從甲殼類生物體內(nèi)提取出的天然無毒可吸收的有機(jī)物，大量的文獻(xiàn)證明其具有良好的生物相容性和一定抑菌能力。然而，殼聚糖因其溶解性差而使其抗感染的應(yīng)用受到限制。殼聚糖衍生物是目前抗菌材料的研究熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)具有比殼聚糖更有效的抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖季銨化以后，其抗菌性能增強(qiáng)。Tsurugai等發(fā)現(xiàn)N，N，N-三甲基殼聚糖季銨鹽有抗大腸桿菌ATCC 25922和葡萄球菌屬ATCC 149909的活性。含有N-長鏈烷基殼聚糖的季銨鹽對(duì)芽孢子菌、大腸桿菌有抗菌作用。中國專利申請(qǐng)?zhí)?00910195678.9公開了一種殼聚糖季銨鹽及其應(yīng)用，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6%-44%，還提供了殼聚糖季銨鹽的新用途，可望在骨科關(guān)節(jié)假體、釘板及髓內(nèi)釘?shù)雀鞣N金屬內(nèi)植物表面涂層發(fā)揮其抗感染作用，另外也可作為骨的替代材料、傷口敷料等發(fā)揮作用。中國專利文獻(xiàn)02125614. 4公開了一種骨修復(fù)材料，提供了一種機(jī)械強(qiáng)度較高的骨修復(fù)材料0. 01-10%的甲殼素衍生物以溶液形式或復(fù)合到骨水泥系統(tǒng)、聚乳酸等合成高分子材料中，該發(fā)明的甲殼素衍生物可以是磷酸化甲殼素、磷酸化殼聚糖、羧丁基殼聚糖及羧基化硫酸酯化殼聚糖。但是關(guān)于復(fù)合殼聚糖季銨鹽(HACC)的抗感染PMMA骨水泥目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染 PMMA骨水泥。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染PMMA骨水泥的制備方法本發(fā)明的另一的目的是，提供一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染PMMA骨水泥的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染 PMMA骨水泥，所述的復(fù)合骨水泥由HACC、PMMA和骨水泥單體混合制成，所述的HACC與PMMA 的質(zhì)量比為15-30%。所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20-30%。所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20%。所述的骨水泥單體與HACC和PMMA的混合物的液/粉比為1. 5ml /2mg。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的制備方法為將質(zhì)量比 15-30%的HACC與PMMA粉劑均勻混合，然后以1. 5ml/2mg的液/粉比加入骨水泥單體。所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20-30%。所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20%。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的復(fù)合骨水泥在制備骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、復(fù)合HACC的PMMA可替代目前常用的PMMA抗生素珠鏈，應(yīng)用于骨缺損充填并預(yù)防感染、治療慢性骨髓炎以及骨質(zhì)疏松的椎體增強(qiáng)，達(dá)到與抗生素骨水泥類似的抗菌能力，同時(shí)避免對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生，并可用于已對(duì)抗生素耐藥的病人，具有較大的的臨床應(yīng)用價(jià)值；
2、彈性模量的適當(dāng)降低也有助于減少治療椎體與臨近節(jié)段椎體的應(yīng)力分布不均，減緩臨近椎間盤的過早退變及臨近椎體骨折。


附圖IA和附圖IB是抗壓與抗彎強(qiáng)度及模量分析。HACC及殼聚糖以20%的質(zhì)量比與PMMA復(fù)合，其生物力學(xué)性能有所降低，但仍高于國際ISS05833 2002確定的丙烯酸類骨水泥所達(dá)到的最低力學(xué)強(qiáng)度。附圖2是細(xì)菌黏附的定量與定性分析。培養(yǎng)4h后，對(duì)于S.印idermidis及ATCC 35984兩菌株，PMMA-G及PMMA-H表面黏附的細(xì)菌數(shù)明顯的低于PMMA及PMMA-C。對(duì)于MRSE， PMMA-H表面黏附的細(xì)菌數(shù)明顯的低于PMMA、PMMA_G及PMMA-C。上述比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。S. epidermidis在四種材料表面黏附4h后的CLSM (共聚焦激光掃描顯微鏡)也顯示出同樣的趨勢(活菌染色為綠色，死菌染色為紅色)。附圖3是24h細(xì)菌生物膜形成分析。培養(yǎng)24h時(shí)，S. epidermidis, ATCC35984 及MRSE均在材料表面形成生物膜，但從生物膜結(jié)晶紫(0. P/oCV)染色的OD值分析對(duì)于 S. epidermidis及ATCC35984兩菌株，PMMA-G及PMMA-H表面生物膜OD值明顯的低于PMMA 及PMMA-C ；對(duì)于MRSE，PMMA-H表面生物膜OD值明顯低于PMMA、PMMA_G及PMMA-C。上述比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。MRSE在四種材料表面12h后生物膜SEM也顯示同樣的趨勢。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。 實(shí)施例一、材料與方法
(一)實(shí)驗(yàn)材料及儀器
材料普通骨水泥聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及負(fù)載慶大霉素的骨水泥(PMMA-G， DePuy International Ltd. WO，含有粉劑40g，液體20ml ；負(fù)載慶大霉素的骨水泥每40g粉劑含慶大霉素2g。HACC(殼聚糖季銨鹽)。高純度殼聚糖(脫乙酰度91. 83%，粘均分子量20 萬，購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司)。TSB(TSA)培養(yǎng)基或板。Live/Dead染液(LIVE/DEAD Baclight bacteria viability kits, Molecular probes, L13152)將 SYT09 和 PI 各取 1 支混合后加入5ml無菌dh2o水中，混勻后-20°C保存。磷酸鹽緩沖液。實(shí)驗(yàn)菌株表皮葡萄球菌菌株(S.印idermidi S)、甲氧西林耐藥的表皮葡萄球菌菌株(MRSE)及購自美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌庫的表皮葡萄球菌菌株(ATCC 35984)。甲氧西林耐藥的表皮葡萄球菌菌株(MRSE)同時(shí)對(duì)慶大霉素(Gentamicin)耐藥。其他試劑均為市售分析純?cè)噭?。儀器超凈工作臺(tái)(BIO-HAZARD，VCM-420，中國臺(tái)灣)，電子分析天平(METTLER TOLEDO, AB204-E，瑞士)，電磁攪拌器(STUART，SM24，英國)，低溫離心機(jī)(UNIVERSAL，32R， HETTICH，德國)。激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2; Leica Microsystems, Heidelberg, Germany)及掃描電鏡(Joel JSM-6310LV, JEOL Ltd. , Tokyo, Japan)。(二)實(shí)驗(yàn)材料的制備
殼聚糖與PMMA粉劑以不同質(zhì)量比均勻混合(設(shè)為15%、20%、25%、30%、40%)，再加入骨水泥聚合液體(1. 5ml/2g)。上述骨水泥混合加入相應(yīng)模具，制備抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)樣品，制備 12mmX6mm圓柱體、75mmX 3mmX IOmm矩形片進(jìn)行生物力學(xué)測試，6mmX 3mm盤狀片用于細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)?？箟簶悠愤M(jìn)行相應(yīng)的力學(xué)實(shí)驗(yàn)，目的為選擇理想的材料混合質(zhì)量比(見圖1)，結(jié)果顯示20%的質(zhì)量比較理想，因此質(zhì)量比復(fù)合入較多HACC，提高試件的抑菌抗菌效果，同時(shí)其力學(xué)強(qiáng)度仍高于丙烯酸樹脂類骨水最低的國際標(biāo)準(zhǔn)(IS05833 2002)。殼聚糖季銨鹽 (HACC)則也以20%的質(zhì)量比與PMMA復(fù)合。實(shí)驗(yàn)分4組PMMA、PMMA-Gentamicin (PMMA-慶大霉素，簡稱 PMMA-G)、PMMA-Chitosan (PMMA-殼聚糖，簡稱 PMMA-C)及 PMMA-HACC (殼聚糖季銨鹽)(簡稱PMMA-H)。(三)生物力學(xué)測試
骨水泥抗壓強(qiáng)度及模量本實(shí)驗(yàn)每組測定5套骨水泥試條，試條制備見前述。力學(xué)實(shí)驗(yàn)在(23士 1) °C環(huán)境下進(jìn)行，將制備的圓柱體放在試驗(yàn)機(jī)內(nèi)，開動(dòng)試驗(yàn)機(jī)以20mm/min恒定的十字頭速率作形變對(duì)負(fù)荷的曲線。當(dāng)圓柱體破裂或已過上屈服點(diǎn)時(shí)停機(jī)。對(duì)于每個(gè)圓柱體，記錄最先出現(xiàn)的引起圓柱體破裂所施加的力并計(jì)算抗壓強(qiáng)度。計(jì)算5個(gè)圓柱體的平均抗壓強(qiáng)度。(四)抗菌抑菌性能研究
將低溫下凍存的上述細(xì)菌取出并立即侵入38°C水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化， 再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。并在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種。在無菌環(huán)境下，取單克隆菌落于TSB培養(yǎng)液內(nèi)于培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩過夜培養(yǎng)(37 °C )。傳代2次后，在細(xì)菌處于對(duì)數(shù)期生長期，以麥?zhǔn)媳葷嵊?jì)將菌液的懸浮濃度調(diào)整至IXlO6 CFUs/ml。將 骨水泥試樣置入48孔培養(yǎng)板內(nèi)，每一骨水泥試樣重復(fù)3孔。每孔滴加Iml的上述細(xì)菌懸液，在37°C孵育箱中靜態(tài)孵育4h后取出，用無菌PBS輕柔清洗3次。試件置入培養(yǎng)液中，以超聲洗脫5-7分鐘，然后倍稀鋪板計(jì)細(xì)菌數(shù)(CFUs/mm2)。Live/Dead染液含有兩種熒光染液SYST09和PI，前者使活細(xì)菌發(fā)出綠色熒光，而后者使死細(xì)菌發(fā)出紅色熒光，從而可以在鏡下區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌。按說明書的比例將兩種染料振蕩混勻備用。四種骨水泥材料放入48孔板孔底，每孔加Iml上述細(xì)菌懸液，密度為1 X IO6 CFUs/ml，放入培養(yǎng)箱有氧37°C培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌3次，在各標(biāo)本表面滴加200ul上述配制好的染液，鋁箔包裹避光室溫孵育15min后，標(biāo)本于激光共聚焦顯微鏡下觀察。材料消毒后放入48孔板孔底，每孔加Iml上述細(xì)菌懸液，放入培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng) 4h，棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌3次，試件用2. 5%戊二醛初始固定，存放4°C冰箱2h。PBS漂洗lh，放入0. 1%鋨酸固定lh，梯度酒精脫水(30%，50%，70%，80%，90%，95%及100%)各 IOmin0臨界點(diǎn)干燥，噴金。在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌黏附。二、結(jié)果
(一)四種材料生物力學(xué)強(qiáng)度比較
PMMA-C及PMMA-H生物力學(xué)性能有所降低，與PMMA及PMMA-G相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0. 05)。但仍高于國際ISS05833 :2002確定的丙烯酸類骨水泥所達(dá)到的最低力學(xué)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(抗壓彡70Mpa，抗彎彡50Mpa)(見圖1)。(二)熒光顯微鏡觀察材料表面對(duì)細(xì)菌黏附及形成生物膜的影響
經(jīng)過與TSB細(xì)菌培養(yǎng)基4h共培養(yǎng)，在四種材料表面上3種細(xì)菌都有一定的黏附生長，經(jīng)live/dead baclight kit熒光染液染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)于ATCC 35984、 S. epidermidis, PMMA-G,PMMA-H表面黏附的細(xì)菌數(shù)量較PMMA及PMMA-C表面顯著減少且呈散在分布；PMMA及PMMA-C表面黏附菌數(shù)量差別不顯著且成致密分布(見圖2)。對(duì)于耐藥菌MRSE，只有PMMA-H表面黏附的細(xì)菌量較PMMA、PMMA_C及PMMA-G表面顯著減少。據(jù)此可知負(fù)載HACC的PMMA表面具有抑制細(xì)菌黏附增殖的性能。在6h、12h及24h時(shí)，通過涂板計(jì)數(shù)、熒光顯微鏡及SEM觀察分析對(duì)于ATCC 35984、S. epidermidis, PMMA-G, PMMA-H表面細(xì)菌生物模形成較PMMA及PMMA-C表面顯著減少且細(xì)菌呈散在分布；PMMA及PMMA-C表面生物膜活菌數(shù)量差別不顯著且成致密分布，大量的葡萄球菌聚集在一起，形成典型立體突起的蘑菇狀生物膜(見圖3)。對(duì)于耐藥菌MRSE， PMMA-H表面的細(xì)菌生物膜量較PMMA、PMMA_C及PMMA-G表面顯著減少，細(xì)菌呈平鋪生長，少見蘑菇狀突起的生物膜形成。表明負(fù)載HACC的PMMA表面具有抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的特性。本發(fā)明特色在于復(fù)合HACC的PMMA對(duì)上述3個(gè)細(xì)菌具有較明顯抑制作用，表現(xiàn)出一定的抗菌抑菌性能。彈性模量的適當(dāng)降低也有利于在進(jìn)行骨質(zhì)疏松椎體增強(qiáng)時(shí)刻減少治療椎體與臨近節(jié)段椎體的應(yīng)力分布不均，減緩臨近椎間盤的過早退變及臨近椎體骨折。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍?！?br> 權(quán)利要求
1.一種復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染PMMA骨水泥，其特征在于，所述的復(fù)合骨水泥由 HACC, PMMA和骨水泥單體混合制成，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為15_30%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨水泥，其特征在于，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為 20-30%ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨水泥，其特征在于，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨水泥，其特征在于，所述的骨水泥單體與HACC和PMMA 的混合物的液/粉比為1. 5ml /2mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨水泥的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為將質(zhì)量比15-30%的HACC與PMMA粉劑均勻混合，然后以1. 5ml/2mg的液/粉比加入骨水泥單體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為 20-30%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為20%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的復(fù)合骨水泥，其特征在于，所述的復(fù)合骨水泥在制備骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)合殼聚糖季銨鹽的抗感染PMMA骨水泥，所述的復(fù)合骨水泥由HACC、PMMA和骨水泥單體混合制成，所述的HACC與PMMA的質(zhì)量比為15-30%。本發(fā)明還提供這種復(fù)合骨水泥的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1、復(fù)合HACC的PMMA可替代目前常用的PMMA抗生素珠鏈，應(yīng)用于骨缺損充填并預(yù)防感染、治療慢性骨髓炎以及骨質(zhì)疏松的椎體增強(qiáng)，達(dá)到與抗生素骨水泥類似的抗菌能力，同時(shí)避免對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生，并可用于已對(duì)抗生素耐藥的病人，具有較大的的臨床應(yīng)用價(jià)值；2、彈性模量的適當(dāng)降低也有助于減少治療椎體與臨近節(jié)段椎體的應(yīng)力分布不均，減緩臨近椎間盤的過早退變及臨近椎體骨折。
文檔編號(hào)A61L27/20GK102218158SQ20111015158
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者彭兆祥, 湯亭亭, 譚紅略, 郭圣榮 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院