專利名稱：microRNA-26在制備預(yù)防和治療房顫藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸類物質(zhì)在制備治療疾病藥物中的應(yīng)用，特別涉及 microRNA-沈在制備治療房顫藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
房顫(AF)是最常見的心律失常之一，其危害嚴(yán)重，可引起血管栓塞，增加患者的死亡率。房顫與心力衰竭密切相關(guān)，它可引起心衰，還可加重心衰患者的左室功能異常。心衰患者中房顫發(fā)病率高達(dá)10-50%。房顫發(fā)病率隨著年齡增長明顯上升，在55歲以下人群， AF發(fā)病率為0. 1 %，而80歲以上人群則高達(dá)9%。目前，房顫的防治效果并不理想，傳統(tǒng)藥物治療常導(dǎo)致更嚴(yán)重的心律失常發(fā)生，射頻消融術(shù)復(fù)發(fā)的幾率較高。因此，急需研發(fā)新的房顫治療藥物，改善目前的治療現(xiàn)狀。microRNA(小RNA、miRNA)是一類對基因表達(dá)起調(diào)控作用的約22個核苷酸長的內(nèi)源性非編碼小核苷酸，成熟miRNAs通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)部分互補結(jié)合進而抑制其蛋白質(zhì)翻譯。miRNAs占人類基因組的3%，大約參與調(diào)控30%蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。研究表明，miRNAs廣泛參與了不同生理以及病理過程的調(diào)節(jié)，如發(fā)育、凋亡、分化、增殖、代謝、應(yīng)激等。近幾年，miRNAs在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控作用不斷得到闡明，已成為心血管疾病的研究熱點。miRNAs是調(diào)控心律失常、心力衰竭、心肌肥厚以及動脈粥樣硬化等心血管疾病的關(guān)鍵調(diào)控分子?；趍icroRNA靶點的藥物在心血管疾病中的應(yīng)用不斷獲得實驗成功，從而心血管疾病的防治帶來新的希望，因此發(fā)現(xiàn)不同病理生理情況下起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的microRNA亞型變化，并闡明其功能，將會對該疾病的治療帶來新的靶標(biāo)和產(chǎn)生新的干預(yù)策略。盡管越來越多的microRNAs作為心血管疾病的決定因素和治療靶點被發(fā)現(xiàn)，但在心房顫動中的關(guān)鍵microRNA亞型仍沒有確定，其所發(fā)揮的功能仍是對該領(lǐng)域科研人員的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用多種技術(shù)手段證明了 micr0RNAj6(miRj6) 在心房顫動中的改變及其對房顫的治療作用，最終確定microRNA-沈可以作為制備治療心房顫動的防治藥物。本發(fā)明的microRNA-沈在制備治療房顫藥物中的應(yīng)用，所述的microRNA-沈序列如下所示miR-26a :5，-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，；及 / 或miR-26b :5， -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。本發(fā)明的microRNA-沈在制備預(yù)防房顫藥物中的應(yīng)用，所述的microRNA-沈序列如下所示miR-26a 5， -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。本發(fā)明的microRNA-沈在制備預(yù)防和治療房顫藥物中的應(yīng)用，制備的藥物可以只含microRNA-26，也可通過制成一種藥物組合物的方式實現(xiàn)，其特征在于包含以上所述的有效劑量的microRNA-沈及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的載體為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成miR-沈并與上述的適當(dāng)載體連接形成藥物，可制成注射制劑等，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療
心房顫動。例如將microRNA-26與膽固醇連接制備相應(yīng)的藥物，其制備方法可采用首先化學(xué)合成microRNA-沈序列，在其尾端連接膽固醇的常規(guī)核酸制劑的方法；例如將microRNA-26與納米顆粒連接制備相應(yīng)的藥物，其制備方法可采用化學(xué)合成microRNA-沈序列，將其與適宜的納米顆粒混合，制成連有microRNA-沈納米顆粒，用于房顫藥物的制備中。為了增加核酸試劑的使用效果，還可輔以專用的穩(wěn)定劑和特異性免疫增強劑精制而成。


圖 1 為 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 載體圖譜；圖2為pD0NR221載體圖譜；圖 3 為 pAD/CMV/V5_DEST 載體圖譜；圖4為腺病毒載體構(gòu)建的檢測；圖4A為穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后GFP的表達(dá)；4B為病毒液接種HEK-293細(xì)胞后GFP的表達(dá)；圖5為利用心電監(jiān)測儀檢測注射腺病毒miR-沈后小鼠房顫的發(fā)生率(A)與持續(xù)時間(B)；圖6為利用realtime PCR檢測在體注射腺病毒表達(dá)載體后小鼠心房肌miR-沈的表達(dá)水平。圖7為AF模型的建立；圖7A為犬心電圖；圖7B為AF發(fā)生率和持續(xù)時間；圖8為miR-沈在A-TP犬㈧和房顫患者⑶中的表達(dá)變化；
具體實施例方式下面通過藥理性及臨床觀察實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例lmiR-沈?qū)Ψ款澋闹委熥饔?、構(gòu)建miR-沈的腺病毒表達(dá)載體將mmu-miRj6a-l 的成熟形式(mmu-mirj6a-lMI00005735，-AAGGCCGUGGCCUCGUU CMGUAAUCCAGGAUAGGCUGUGCAGGUCC CAAGGGGCCUAUUCUUG⑶UACUUGCACGGGGACGCGGGCCUG-3 ’) 轉(zhuǎn)換成適于表達(dá)的前體序列miR46a :5，-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3，，設(shè)計合成0LIG0， 并退火連接到pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR載體中。將構(gòu)建好的mmu-miRj6a-l表達(dá)載體(載體圖譜見圖1所示)和PD0NR221載體(載體圖譜見圖2所示)進行BP重組反應(yīng)，以獲得穿梭載體。將穿梭載體和腺病毒表達(dá)的骨架載體pAD/CMV/V5-DEST(載體圖譜見圖3所示) 進行共轉(zhuǎn)染，發(fā)生LR重組反應(yīng)，穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后GFP的表達(dá)如圖4A所示，以獲得對應(yīng)的腺病毒表達(dá)載體。將病毒載體用限制性內(nèi)切酶I^acI單酶切，用酚氯仿抽提及紫外分光光度計測定濃度。經(jīng)病毒載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，GFP的表達(dá)如圖4B所示，換液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；擴大至2 X IOcm培養(yǎng)皿再培養(yǎng)10-13天，收集病毒原液，濃縮100倍。采用免疫法檢測腺病毒滴度，通過抗腺病毒的多抗與感染了腺病毒的細(xì)胞結(jié)合，再用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)顯色液顯色，計算被感染細(xì)胞，從而確定病毒滴度。2、腺病毒miR-沈?qū)Ψ款澋闹委熥饔眠x用體重20_25g成年健康C57/B6小鼠，分為3組(1)正常組；⑵空載體組(Adv-pDC316) ； (3)腺病毒注射組(Adv-pre-miR-26) 0經(jīng)尾靜脈將IO9pFU的腺病毒以及空載體分別注入兩組小鼠體內(nèi)。三天后，將小鼠麻醉，仰臥位固定，經(jīng)頸外靜脈將含4對電極(SCIsense)的小鼠電極導(dǎo)管逆行插至右心房和右心室內(nèi)，電極尾端連電刺激儀，給予程序性電刺激，觀察房顫的誘發(fā)率與誘發(fā)時間。實驗結(jié)果顯示如圖5所示，注射 Adv-pre-miR-26后小鼠的房顫發(fā)生率和房顫持續(xù)時間均明顯的受到抑制?？蛰d體組房顫的誘發(fā)率為48%，miR-26組房顫的誘發(fā)率為12. 5% (*p < 0. 05vs Adv-pDC316)；空載體組房顫的持續(xù)時間為2. 3秒，而注射Adv-pre-miR-沈后AF的持續(xù)時間僅僅為1. 1秒(*p < 0. 05vs Adv-pre-miR-328)。利用realtime PCR檢測注射Adv-pre-miR-沈后miR-沈的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示如圖6所示和Adv-pDC316相比，Adv-pre-miR-26組小鼠心房miR-沈的表達(dá)量升高 2. 5倍(*p < 0. 05vs Adv-pDC316)?？梢?，這種在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可用于后續(xù)蛋白表達(dá)及心電監(jiān)測的實驗中。通過實驗證明了在實驗性房顫中microRNA-沈表達(dá)異常下調(diào)。用腺病毒載體過表達(dá)microRNA-26能夠抑制房顫的發(fā)生，說明microRNA-沈是一個新的可用于制備預(yù)防和治療房顫疾病的藥物。 實驗例IAF模型的建立本實驗采用心房快速起搏法建立，將起搏電極縫植于27只犬的右心耳進行起搏 GOO次/分)，術(shù)后進行動態(tài)心電監(jiān)測。27只犬完成整個實驗。1只犬因起搏器故障而終止實驗；2只犬因囊袋血腫于術(shù)后第2周死亡；2只犬術(shù)后感染死亡；1只犬于術(shù)后第5周突然死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)左、右心耳有較多新鮮血栓，考慮和血栓栓塞有關(guān)。起搏前所有犬經(jīng)程序刺激均未誘發(fā)出AF。在犬心房植入起搏器，起搏前，所有犬期前程序刺激檢查均未發(fā)生AF。將剩余的 21只犬分成兩組，17只犬進行心房快速起搏，作為A-TP組；剩余4只不進行心房快速起搏， 作為control組。8周后，A-TP組17只犬中12只出現(xiàn)了自發(fā)性AF，Control組沒有犬出現(xiàn)自發(fā)性AF，心電圖檢測結(jié)果如圖7A所示。經(jīng)電刺激誘導(dǎo)AF時，A-TP組AF的發(fā)生率為100% (*p < 0. 05vs. control，AF發(fā)生率和持續(xù)時間如圖7B所示)，AF持續(xù)時間為3000士 180sec， 而control組AF的發(fā)生率只有40%，AF持續(xù)時間為3. 8士3.如ec。心電圖顯示，A-TP組P 波消失，RR間隔不等，心律100-190次/分。實驗例aniR-沈在房顫(AF)中的表達(dá)變化提取犬心房以及臨床上有房顫和無房顫患者心房的總RNA，利用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳對RNA質(zhì)量進行檢測。28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和^S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。利用real time PCR方法檢測miR_26的表達(dá)，結(jié)果miR-沈在房顫犬和房顫患者心房中的表達(dá)明顯下降，結(jié)果如圖8所示。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.microRNA-26在制備治療房顫藥物中的應(yīng)用，所述的microRNA-沈序列如下所示 miR-26a 5’ -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’ ；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。
2.microRNA-26在制備預(yù)防房顫藥物中的應(yīng)用，所述的microRNA-沈序列如下所示 miR-26a 5’ -UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’ ；及 / 或miR-26b 5’ -UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3，。
3.一種用于治療房顫的藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1或2所述的有效劑量的microRNA-沈及藥學(xué)上接受的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質(zhì)體。
5.如權(quán)利要求3或4所述的藥物組合物，其特征在于藥物組合物為注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了microRNA-26在制備藥物中的應(yīng)用，具體是用于制備預(yù)防和治療房顫的藥物。制備的藥物可以只含microRNA-26，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA-26及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的載體可為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成miR-26并與上述的適當(dāng)載體連接形成藥物，可制成注射制劑，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療心房顫動。
文檔編號A61K47/48GK102228697SQ201110167840
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者呂延杰, 楊寶峰, 潘振偉, 王志國 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)