專利名稱：同時(shí)用于ct與mri的雙顯影劑及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種納米級多功能多平臺顯影劑及其制作方法，尤指一種可以同時(shí)用于陰極射線計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)與核磁共振攝影(MRI)的雙顯影劑及其制作方法。
背景技術(shù)：
近年來，各種圖像檢查已是醫(yī)療上常用的疾病檢測方法之一。其中，顯影劑為一種在進(jìn)行圖像檢查時(shí)，可以提升各種不同組織之間的對比度，使圖像變得更清楚的藥劑。目前醫(yī)療上常用的圖像檢查包括有計(jì)算機(jī)斷層攝影(Computed tomography，CT)、及核磁共振攝影(Magnetic resonance imaging, MRI)等。其中，CT利用X射線穿透人體取得圖像后，再由計(jì)算機(jī)重組成三度圖像空間，以觀察身體內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。由于CT具有高分辨率，且可以完整呈現(xiàn)病灶，故為一種醫(yī)療上常用的圖像檢查技術(shù)。一般而言，CT所使用的顯影劑為碘顯影劑，但碘顯影劑為一種具有高滲透度的離子性顯影劑，容易對腎臟有所危害，且具有顯像時(shí)間短的缺點(diǎn)。因此，為改善碘顯影劑的缺點(diǎn)，目前已發(fā)展如聚合物包覆的硫化鉍(polymer-coated bismuth sulfide (Bi2S!3))、及聚乙二醇(PEG)包覆的金納米粒子等納米粒子型顯影劑。另一方面，MRI則是利用磁場原理，改變體內(nèi)氫原子的旋轉(zhuǎn)方向排列，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，以呈現(xiàn)人體組織的切片圖像。由于MRI是為一種非游離輻射技術(shù)，且對于水或其它生物分子具有高敏感度，已逐漸取代其它傳統(tǒng)檢查系統(tǒng)，而廣泛用于各種疾病檢驗(yàn)及組織觀察上。對大部分MRI檢查而言，均不需施打顯影劑，但若需更精密檢查時(shí)，仍需施打顯影劑。目前MRI常用的顯影劑包括釓(gadolinium，Gd3+)基T1顯影劑、及超順磁氧化鐵 (superparamagnetic iron oxide)納米顆粒型 T2 顯影齊[J。即便CT及MRI檢驗(yàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療用途上，但若患者需同時(shí)進(jìn)行CT及MRI檢驗(yàn)時(shí)，需等待其中之一顯影劑排除后，才可以進(jìn)行另一檢驗(yàn)，反而造成檢查時(shí)間加長。目前已發(fā)展出一種可以用于CT及MRI的雙顯影劑，其為一種金納米與釓離子螯合的復(fù)合納米粒子。然而，這種復(fù)合納米粒子工藝相當(dāng)復(fù)雜，且顯影效果仍不如預(yù)期。因此，目前極需發(fā)展出一種制備方法較簡單且具有良好顯影效果的CT及MRI的雙顯影劑，以在臨床上縮短檢查時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法，使能以簡單工藝制作出可以同時(shí)應(yīng)用于CT及MRI攝影的雙顯影劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于CT及MRI的雙顯影劑，使能解決傳統(tǒng)MRI/CT 顯影劑所產(chǎn)生的腎毒性及其它禁忌癥。為達(dá)成上述目的，本發(fā)明的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法包括下列步驟
(A)提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；
(B)加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進(jìn)行反應(yīng)，以得一鐵鉬納米粒子；(C)冷CN 102526769 A卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及(D)將該鐵鉬納米粒子與一表面改質(zhì)分子混合，以得到一表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑。此外，本發(fā)明還提供一種使用上述方法制備的CT及MRI的雙顯影劑，包括一鐵鉬納米粒子；以及一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素(biotin)；其中，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉬納米粒子如下式(I) 所示FexPt100_x (I)其中，χ為30 60，而巰基也可以稱之為硫醇基、或氫硫基。本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法，通過一種簡單工藝制作出具有高度生物兼容性的納米粒子，其中，表面改質(zhì)分子化學(xué)修飾于鐵鉬納米粒子表面，并露出表面修飾官能基以與后續(xù)生物分子連接。此外，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑，可以提升CT及 MRI攝影的辨識程度，并同時(shí)作為CT及MRI的雙顯影劑。相比于以往所使用的顯影劑，本發(fā)明所提供的顯影劑不會產(chǎn)生腎毒性及其它禁忌癥。在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法中，鉬化合物可以為至少一選自由 Pt(acac)2、PtCl2, PtCl4, H2PtCl4, H2PtCl6, K2PtCl4、及 K2PtCl6 所組成的群組。此外， 鐵化合物可以為至少一選自由I^e(CO) 5、Fe (acac)2, ！^ (acac) 3、及i^-oleate所組成的群組。再者，多元醇為C8_2(l的醇類。優(yōu)選為，多元醇為至少一選自由1，2_十六烷二醇(1， 2-hexa-decanediol) >1,2-十二；^二酉享(1, 2-Dodecanediol)、及聚乙二酉享(polyethylene glycol)所組成的群組。此外，表面改質(zhì)分子可以為一胺基表面改質(zhì)分子，如半胱胺(cysteinamine)、胱胺(cystamine)、或巰基烷基胺(mercaptoalkylamine)。其中，胺基表面改質(zhì)分子優(yōu)選是具有巰基(-SH)及胺基(-NH2),且胺基表面改質(zhì)分子通過巰基連結(jié)于鐵鉬納米粒子的表面，使鐵鉬納米粒子的表面修飾有胺基。除了可以于鐵鉬納米粒子表面以胺基表面改質(zhì)分子修飾外，還可以于鐵鉬納米粒子表面以具有羧基的分子、生物素、亞硝基三乙酸酯 (nitrilotriacetate)等可以與生物分子交聯(lián)的官能基進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法中，接口活性劑可以為至少一選自由油酸(oleic acid)、及油胺(oleyl amine)所組成的群組。優(yōu)選為，接口活性劑包括油酸、及油胺。優(yōu)選為，接口活性劑中油酸及油胺的體積比介于1 1至3 1之間。通過調(diào)整接口活性劑的成分比例，可以精確調(diào)整鐵鉬納米粒子尺寸與形狀。其中，鐵鉬納米粒子的粒徑可以為1 lOOnm，優(yōu)選為1 20nm。通過調(diào)整鐵鉬納米粒子尺寸與形狀，可以調(diào)控鐵鉬納米粒子活體生物分布、藥物動力學(xué)、循環(huán)代謝及排除時(shí)間。當(dāng)油酸及油胺的體積比為1 1時(shí)，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向?yàn)?111)面 (facet)，而可以形成八足狀結(jié)構(gòu)的納米粒子。當(dāng)油酸及油胺的體積比為3 1時(shí)，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向?yàn)?111)及(100)面，而可以形成立方八面體結(jié)構(gòu)的納米粒子。若反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，則所形成的鐵鉬納米粒子形狀則接近球狀。此外，在本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑的制作方法中，在步驟(D)后可以還包括一步驟(E)將表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑與一標(biāo)靶分子混合，以得到一具標(biāo)靶能力的分子造影雙顯影劑。因此，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑可以還包括一標(biāo)靶分子，其與表面改質(zhì)分子連接。其中，標(biāo)靶分子可以為一抗體、一蛋白質(zhì)、一核酸、一納米體、或一分子模板等。優(yōu)選為，標(biāo)靶分子為一抗體，其可以依照欲檢測的標(biāo)的進(jìn)行選擇，如抗Her2抗體， 其中Her2為人類表皮生長因子受體。例如，當(dāng)鐵鉬納米粒子連接有一胺基表面改質(zhì)分子， 即鐵鉬納米粒子表面修飾有胺基(-NH2),則可以選擇具有一羧基(-C00H)的標(biāo)靶分子，通過羧基與胺基的鍵結(jié)，以將標(biāo)靶分子與表面改質(zhì)分子連結(jié)，而形成一具標(biāo)靶能力的分子造影雙顯影劑。因此，本發(fā)明的CT及MRI的雙顯影劑及其制作方法，可以化學(xué)修飾方法，在鐵鉬納米粒子表面做一適合的生物修飾，由此可以精準(zhǔn)標(biāo)定生物體內(nèi)腫瘤位置，而作為一具標(biāo)靶能力的分子造影雙顯影劑。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例4的用于CT及MRI雙顯影劑的示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子的磁滯回線(hysteresis loop)圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子MTT試驗(yàn)結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子的血球溶解性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子于器官中的分布結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子體外MRI試驗(yàn)結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子體外CT試驗(yàn)結(jié)果圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑體外MRI試驗(yàn)結(jié)果圖。圖9為本發(fā)明實(shí)施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑體外CT試驗(yàn)結(jié)果圖。主要元件符號說明100 鐵鉬納米粒子101 胺基表面改質(zhì)分子102 抗體
具體實(shí)施例方式以下是通過特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以由本說明書所公開的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明也可以通過其它不同的具體實(shí)施例加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。在本發(fā)明中，用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法所采用的材料主要如下 二乙酰丙酮鉬(Platinum acetylacetonate, Pt(acac)2, ACR0S,97% )、五羰基鐵(iron pentacarbonyl，F(xiàn)e (CO) 5，Aldrich，99. 99 % )、1，2_ 十六烷二醇(1，2-hexadecanediol， Aldrich,90% )、二辛醚(dioctyl ether, ACR0S,90 % )、油胺(oleyl amine, Aldirch, 70%)、油酸(oleic acid，Aldrich，90% )、及半胱胺(cysteamine, Sigma,95% ) 實(shí)施例1-制備3 4nm的鐵鉬納米粒子在氮?dú)夥障聦t(acac)2(97mg)、l，2-十六烷二醇(195mg)、及二辛醚(IOmL)混合，并加熱至100°c，10分鐘。而后，在100°C下，在此混合溶液中加入!^e (CO) 5 (66 μ L)、油胺 (80 μ L)、及油酸(80 μ L)，并將此反應(yīng)混合物加熱至297°C。反應(yīng)30分鐘后，將產(chǎn)物冷卻至室溫，再添加乙醇以沉淀產(chǎn)物，而后以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子。在本實(shí)施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向?yàn)?111)。在此，使用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy，TEM)及能量散射X射線光譜儀(Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX)測量鐵鉬納米粒子的特性。在此，TEM及EDX分析是使用JEOL Philips/FEI Tecnai 20 G2 S-Twin透射電子顯微鏡。此外，實(shí)施例2及3也使用相同方式測量，故往后將不再贅述。首先，先將少量鐵鉬納米粒子分散于甲苯(toluene)中，而后將溶液滴至銅網(wǎng)支撐的非晶碳膜上。接著，以50k、100k、200k的倍率測量，并以X射線衍射儀(Bruker D8 Advance diffractometer)收集X射線衍射數(shù)據(jù)。此外，鐵鉬納米粒子粉末也放置在非晶硅硅片上，并以Cu Ka射線(λ =1.54178 Α)進(jìn)行測量。再者，磁性分析則是使用超導(dǎo)量子干涉石茲量儀(Superconducting quantum interference device (SQUID) magnetometer) (MPMS, Quantum Design)，且在 300K 下紀(jì)錄-10000 Oe 至 10000 Oe 的磁矩。經(jīng)TEM圖像測量后，本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 3. 58士0. 34nm。此外，經(jīng)EDX測量后，鐵鉬納米粒子組成為 ^58Ρ 42。再者，經(jīng)磁性分析后， 鐵鉬納米粒子在300Κ下的磁矩(magnetization, Ms)為1. 7emu/g Fe，如圖2所示。實(shí)施例2-制備6 7nm的鐵鉬納米粒子在氮?dú)夥障聦t (acac) 2 (97mg)、芐醚(benzyl ether) (4mL)、Fe (CO) 5 (66 μ L)、 油胺(100 μ L)、及油酸(100 μ L)混合。而后，將反應(yīng)溶液以15°c /分的加熱速率加熱至 240°C。反應(yīng)30分鐘后，將產(chǎn)物冷卻至室溫，再以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子。在本實(shí)施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向?yàn)?111)。經(jīng)TEM圖像測量后，本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 6. 12 士 0.63nm。此外，經(jīng)EDX測量后，本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子組成為i^e51Pt49。再者，經(jīng)磁性分析后，鐵鉬納米粒子在300K下的Ms為3. 2emu/gFe,如圖2所示。實(shí)施例3-制備12 13nm的鐵鉬納米粒子在氮?dú)夥障聦t(acac)2(195mg)、l，2-十六烷二醇(1.05g)、二辛醚(4mL)、 ！^ (CO)5(66 μ L)、油胺(4mL)、及油酸(4mL)混合。而后，將反應(yīng)溶液以15°C /分的加熱速率加熱至240°C，并將反應(yīng)溶液維持在240°C下60分鐘。接著，將反應(yīng)溶液冷卻至室溫，再添加乙醇以沉淀產(chǎn)物，而后以離心方式將產(chǎn)物分離，則得到本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子。在本實(shí)施例中，鐵鉬納米粒子的結(jié)晶方向?yàn)?100)。經(jīng)TEM圖像測量后，本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且粒徑為 12. 80士 1. 76nm。此外，經(jīng)EDX測量后，本實(shí)施例的鐵鉬納米粒子組成為 ^33Ρ 67。再者，經(jīng)磁性分析后，鐵鉬納米粒子在300Κ下的Ms為12. !Bemu/gFe，如圖2所示。實(shí)施例4-制備3 4nm的用于CT及MRI的雙顯影劑將實(shí)施例1的干燥鐵鉬納米粒子(IOOmg)利用超聲波震蕩分散于乙醇中。而后， 在室溫下，將半胱胺( Ig)添加并溶解于鐵鉬納米粒子分散液中，并在40 50°C下隔夜超聲波震蕩反應(yīng)溶液。接著，利用乙醇清洗產(chǎn)物以移除吸附于鐵鉬納米粒子的半胱胺。最后，將所得的胺基修飾的鐵鉬納米粒子收集并儲存于氮?dú)庀?。將所得的胺基修飾的鐵鉬納米粒子與鹽酸乙基-3-[3_ 二甲基胺基丙基]碳二亞胺(Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride, EDC)、及老鼠抗 Her2抗體混合，并置于4°C下攪拌1小時(shí)。而后，以13000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘以收集沉淀物，并以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗兩次，可以得本實(shí)施例的雙顯影劑。經(jīng)由上述工藝，本實(shí)施例的用于CT及MRI的雙顯影劑如圖1所示，包括一鐵鉬納米粒子100 ；—胺基表面改質(zhì)分子101，具有一巰基(-SH)、及一胺基(-NH2)，其中胺基表面改質(zhì)分子101通過巰基連結(jié)于鐵鉬納米粒子100的表面；以及一抗體102，具有一羧基 (-C00H)，其中通過羧基與胺基的鍵結(jié)，以將抗體102與胺基表面改質(zhì)分子101連結(jié)。其中， 鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)，且鐵鉬納米粒子組成是I^e58Pt4215實(shí)施例5-制備6 7nm的用于CT及MRI的雙顯影劑本實(shí)施例的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法與實(shí)施例4相同，除了使用實(shí)施例2的鐵鉬納米粒子取代實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子。實(shí)施例6-制備12 13nm的用于CT及MRI的雙顯影劑本實(shí)施例的用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法與實(shí)施例4相同，除了使用實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子取代實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子。評估測試[細(xì)胞株]人類口腔表皮癌細(xì)胞株(Human oral epidermoid carcinoma cell line，0ECMl) 以含有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。腎臟細(xì)胞(Vero cell)則以含有10 % (ν/ν)胎牛血清、2mM的L-麩胺酰胺(L-glutamine)、及50mg/mL的慶大霉素(gentamicin)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。人類膀胱癌細(xì)胞株(MBT-2)則取自由C3H/HeN老鼠的致癌物質(zhì)誘發(fā)的膀胱癌細(xì)胞，其中C3H/HeN老鼠是經(jīng)美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中(ATCC， Manassas, VA)取得。在此，細(xì)胞以含有10 %胎牛血清(FBQ、25mM的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid, HEPES)、2mM 的L-麩胺酰胺、及ImM的丙酮酸鈉(sodium pyruvate)，并在37°C的培養(yǎng)箱中，以含有5% CO2的空氣培養(yǎng)細(xì)胞株，且每兩天更換培養(yǎng)基。[體外細(xì)胞毒理試驗(yàn)(MTTassay)]在96孔盤中種殖切IO3腎細(xì)胞/孔，并以含有10% FBS、2mM L-麩胺酰胺、 及50mg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。M小時(shí)后，加入各種粒徑(實(shí)施例1 3)且連續(xù)10倍稀釋的鐵鉬納米粒子，使最終鐵鉬納米粒子濃度(鐵離子濃度)為0. 01至 IOOmM之間，并培養(yǎng)M小時(shí)。而后，使用5- 二甲基噻唑-2-基-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽 (5-dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性。當(dāng)MTT加入細(xì)胞后，在37°C下反應(yīng)4小時(shí)，以分光光度計(jì)測量懸浮液中紫色甲臜在 595nm的吸收值。MTT試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在M小時(shí)反應(yīng)后，當(dāng)鐵鉬納米粒子濃度為IOmM以下， 細(xì)胞活性(細(xì)胞生存率)大于90%，故無明顯的細(xì)胞毒性產(chǎn)生。此外，即便鐵鉬納米粒子濃度高達(dá)IOOmM,細(xì)胞活性仍約75%。[血球溶解性試驗(yàn)(hemolysis assay)]血球溶解性試驗(yàn)使用人體全血進(jìn)行試驗(yàn)。將實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子添加至 200 μ L的人類全血中，使最終鐵鉬納米粒子濃度(鐵離子濃度)為0. 0001至IOOmM之間，其中人類全血儲存在含有MIU肝素鈉(IU sodium heparin)的真空采血管中(Vacutainer，BD Inc. , USA) 0而后，以回轉(zhuǎn)式震蕩器均勻混合，并置于37°C下反應(yīng)4小時(shí)。接著，以 1200rpm轉(zhuǎn)速離心樣品10分鐘，并收集血清；再以13000rpm轉(zhuǎn)速離心血清15分鐘，以移除鐵鉬納米粒子。最后，以分光光度計(jì)分析懸浮液，而M5nm波長的吸收值即為紅血球含量。血球溶解性試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。在各種不同濃度及粒徑的鐵鉬納米粒子下，仍無明顯血球溶解情形發(fā)生(< 5% )。因此，由上述MTT試驗(yàn)及血球溶解性試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同粒徑的鐵鉬納米粒子均可以呈現(xiàn)高細(xì)胞生存率及低血球溶解性。[鐵鉬納米粒子在器官中的分布]首先，將由成功大學(xué)動物中心購得的六個(gè)月大的C3H/HeN公鼠，以40mg/Kg噴妥撒 (pentothal)麻醉，再從尾巴靜脈注射5mg/kg實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子。經(jīng)12，24,48， 96，168小時(shí)后，殺死老鼠。以鹽水灌注后，收集如腦、心臟、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、睪丸、及血液等組織，并以硝基-氫氯酸(nitro-hydrochloride acid)研磨細(xì)胞。過濾后，以火焰原子吸收光譜儀(flame atomic absorption spectrometer) (UNICAM solar M6 series) 分析溶液樣品，而分析結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，在一周后(168小時(shí))，多數(shù)鐵鉬納米粒子均排除體外。較大粒徑的鐵鉬納米粒子具有較高血清濃度、及較高血清半衰期；且在96小時(shí)后，三種粒徑的鐵鉬納米粒子含量均與背景值相同。在注射48小時(shí)后，血清中約含有102. 2μ g/g的實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子，但僅含有22. 2 μ g/g的實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子、及49. 6 μ g/g的實(shí)施例2 的鐵鉬納米粒子。鐵鉬納米粒子主要聚集在脾臟中，其次為肺及肝臟中，并隨著時(shí)間拉長而排除。實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子在器官中的濃度最高點(diǎn)是在注射12小時(shí)后，但實(shí)施例1及 2的濃度最高點(diǎn)則發(fā)生在注射48小時(shí)后。在注射12小時(shí)后的鐵鉬納米粒子在脾臟及肺臟中，實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子濃度為Ml. 5 μ g/g及120. 4 μ g/g,而實(shí)施例2的鐵鉬納米粒子濃度為204. 9 μ g/g及M7. 9 μ g/g。在注射48小時(shí)后，實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子在脾臟中的濃度為146. 6 μ g/g，在肝臟中的濃度為96. 5 μ g/g。此外，實(shí)施例2的鐵鉬納米粒子的非專一性肝吸收最低。此外，實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子在M小時(shí)內(nèi)均呈現(xiàn)短暫聚集， 且實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子在腦部中的濃度最高，此與血腦屏障(blood-brain-barrier) 的尺寸限制理論相符合。經(jīng)由上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鐵鉬納米粒子可以用于體內(nèi)試驗(yàn)上。[體外MRI及CT攝影]將不同濃度實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子(0. 01 IOOmM)與PBS控制組置于微量管中進(jìn)行MRI及CT對比造影試驗(yàn)。體外MRI試驗(yàn)參數(shù)如下所述T2加權(quán)三維快速回波序列(T2-Weighted three dimensional fast-field echo sequences)(重復(fù)時(shí)間為 550ms/回波時(shí)間為 15ms/偏向角為15° /信號提取(acquisition)數(shù)為3)，視野范圍140 X 100mm，矩陣大小256 X 196像素 (pixels)，切片厚度為1. 4mm。體外MRI試驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子均可呈現(xiàn)顯著的劑量依賴逆向磁振圖像對比(inverse MR image contrast)。經(jīng)量化后，如圖6所示，實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子可以呈現(xiàn)最佳的負(fù)向磁振對比(negative MR contrast)，且當(dāng)鐵鉬納米粒子濃度低至ImM Fe，信號強(qiáng)度減少86%。25mM ！^的實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子圖像信號減弱(image darkening)約觀％，而實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子圖像信號減弱約33%。此外，在體外試驗(yàn)中，實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子具有最佳劑量依賴逆向磁振圖像對比效果。此外，CT掃描則使用美國GE公司所生產(chǎn)的64排螺旋掃描CT(GE Light Speed VCT 64-detector CT)，參數(shù)如下切片厚度為0. 625mm ； 120kVp，30mA ；視野范圍512x 512，機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間0. 4s ；檢查臺移動速度40mm/rotation。體外CT試驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子均可以呈現(xiàn)劑量依賴正向?qū)Ρ仍鰪?qiáng)效果，且以ImM ！^濃度下效果最佳。經(jīng)量化后，如圖7所示，IOOmM !^e濃度(相當(dāng)于44.7mg FePt/mL)的實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子的CT信號，與一般常用的含碘CT試劑 (48. 4mg/mL)的信號相當(dāng)。換言之，在相同試劑濃度下，實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子的顯影效果與現(xiàn)今所用的含碘CT試劑效果相同。此外，實(shí)施例1及2的鐵鉬納米粒子的顯影效果約是現(xiàn)今所用的含碘CT試劑效果的兩倍。經(jīng)由上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子因其超順磁性而可以幫助縮短T2質(zhì)子弛豫效應(yīng)(proton relaxation)，且高X射線吸收系數(shù)(Pt成分的吸收系數(shù)為 4. 99cm2/g)可以提升CT對比度。此外，質(zhì)量磁性及X射線吸收與粒徑的關(guān)系，可以反應(yīng)至磁振顯影及CT對比上，故實(shí)施例1 3的鐵鉬納米粒子可以有效用于CT及MRI的雙顯影劑。[用于CT及MRI的雙顯影劑的體外測試]在此，使用野生細(xì)胞(MBT2)及MBT2 Her2抑制細(xì)胞(MBT-KD)作為細(xì)胞模型。107 個(gè)細(xì)胞使用4%的三聚甲醛(paraformaldehyde)固定后，再懸浮在15mL試管中，而后與實(shí)施例4及6的用于CT及MRI的雙顯影劑(FePt-anti-Her2)反應(yīng)，并以實(shí)施例1及3的鐵鉬納米粒子(FePt)作為對照組，其中最終鐵濃度為ImM。在反應(yīng)4小時(shí)后，IO7之系分別放置于微量管中，并測量其磁振圖像。在此，MRI試驗(yàn)參數(shù)如下所述仏加權(quán)序列，其中快速回波重復(fù)時(shí)間(TR)為550ms，回波時(shí)間(TE)為15ms，而回波鏈長度(echo train length, ET) 為10ms。而后，以上述體外CT攝影參數(shù)，進(jìn)行體外CT試驗(yàn)。雙顯影劑的體外MRI試驗(yàn)結(jié)果量化如圖8所示，而體外CT試驗(yàn)結(jié)果量化如圖9所示。如圖8所示，實(shí)施例1的鐵鉬納米粒子對MBT-KD細(xì)胞的磁振信號減少約3. 6 %， 但對MBT2細(xì)胞的信號減少約42%，此結(jié)果表示Her2/neu基因表現(xiàn)對3nm的鐵鉬納米粒子會產(chǎn)生非專一性影響。然而，實(shí)施例3的鐵鉬納米粒子對MBT-KD細(xì)胞及MBT2細(xì)胞均會使信號大幅度的減少(MBT-KD為47. 6%，而MBT2為49. 7% )，故Her2/neu基因表現(xiàn)對12nm 的鐵鉬納米粒子不會產(chǎn)生明顯的專一性影響。相反的，實(shí)施例4及6的雙顯影劑均會產(chǎn)生顯著的Herf/neu基因表現(xiàn)相關(guān)的信號減少。當(dāng)MBT-KD細(xì)胞的MRI信號與使用雙顯影劑的 MBT-KD細(xì)胞的MRI信號比較時(shí)，實(shí)施例4的雙顯影劑的MRI信號減少約73. 7%，而實(shí)施例 4的雙顯影劑減少約65. 0%。因此，鐵鉬納米粒子表面的胺基表面改質(zhì)分子(半胱胺)可以幫助細(xì)胞胞飲作用。此外，實(shí)施例4及6的雙顯影劑也對大量表現(xiàn)Her2/neU的細(xì)胞具有選擇性，且因?qū)嵤├?的雙顯影劑具有高磁化率，故可以呈現(xiàn)極佳磁振對比度。如圖9所示，相比于MBT-KD細(xì)胞，MBT2細(xì)胞的正向?qū)Ρ仍鰪?qiáng)為3. 3倍，但仍以12nm 粒子的CT對比增強(qiáng)最為顯著。12nm鐵鉬納米粒子對MBT-KD的CT對比增強(qiáng)為7. 7倍，而對 MBT2的CT對比增強(qiáng)為3. 1倍。此外，12nm的雙顯影劑可以明顯區(qū)分MBT-KD與MBT2的差另IJ，其中，12nm的雙顯影劑對MBT2的CT對比增強(qiáng)為MBT-KD的3. 1倍。
上述結(jié)果顯示，實(shí)施例6的12nm的表面修飾有抗Her2抗體的納米粒子，可以同時(shí)作為MRI (逆向?qū)Ρ?與CT(正向?qū)Ρ?的雙顯影劑。[用于CT及MRI的雙顯影劑的體內(nèi)測試]在此，使用轉(zhuǎn)殖有MBT2癌細(xì)胞的老鼠進(jìn)行體內(nèi)測試。將由成功大學(xué)動物中心購得的六至八個(gè)月大的C3H/HeN公鼠，通過背腹皮下注射IO7個(gè)癌細(xì)胞(溶于100 μ L正常鹽水中，以形成ΜΒΤ-2癌細(xì)胞損害。轉(zhuǎn)殖一周后可以觀察到癌細(xì)胞。使用動物麻醉傳遞系統(tǒng)(ADS 1000 ；Engler EngineeringCorp.，Hialeah, FL)，以混合有 100% O2 的 2%異氟燒(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)麻醉老鼠。經(jīng)靜脈注射實(shí)施例4及6的雙顯影劑(5mg Fe/ kg)后，進(jìn)行造影以分析癌細(xì)胞損傷情況。MTI攝影時(shí)序?yàn)樽⑸浜?及M小時(shí)，并以下列參數(shù)進(jìn)行T2加權(quán)磁振提取序列快速自旋回旋(fast spin echo)的TR/TE為3000ms/99. 7ms， 且ET為10ms。每一樣品的組織信號強(qiáng)度以圖像量化軟件，通過組織剖面圖像的標(biāo)準(zhǔn)感興趣區(qū)塊測量(standard region-of-interest measurements)進(jìn)行分析。而后，體內(nèi)微電腦斷層攝影(Skyscan 1076 X-ray Microtomograph, Skyscan, Aartselaar, Belgium)則是使用微聚焦 X 射線源(micro-focused x-ray)照射 (50keV/200fe)，每旋轉(zhuǎn)1°進(jìn)行一次每一圖像提取，共旋轉(zhuǎn)360 °。同時(shí)，使用軟件 (NRecon (Skyscan) software)進(jìn)行剖面圖像重組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于注射后直接進(jìn)行磁振造影(0小時(shí))，經(jīng)M小時(shí)后癌細(xì)胞損害信號強(qiáng)度明顯減少51%。反之，CT圖像分析，經(jīng)M小時(shí)后，癌細(xì)胞組織對比明顯增強(qiáng) 138%。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明實(shí)施例4至6的雙顯影劑可以選擇性的檢測癌細(xì)胞損害， 并可以提升T2MRI序列造影及CT攝影的對比度。尤其是，實(shí)施例6的粒徑為12nm的雙顯影劑效果更加顯著。上述實(shí)施例僅為了方便說明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權(quán)利范圍自應(yīng)以權(quán)利要求所述為準(zhǔn)，而非僅限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種用于CT及MRI的雙顯影劑的制作方法，其特征在于，包括下列步驟A，提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；B，加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進(jìn)行反應(yīng)，以得一鐵鉬納米粒子；C，冷卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及D，將該鐵鉬納米粒子與一表面改質(zhì)分子混合，以得到一表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，在步驟(D)后還包括一步驟E將該表面修飾的鐵鉬納米粒子雙顯影劑與一標(biāo)靶分子混合，以得到一具標(biāo)靶能力的分子造影雙顯影劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鉬化合物為至少一選自由 Pt (acac) 2、PtCl2, PtCl4, H2PtCl4, H2PtCl6, K2PtCl4、及 K2PtCl6 所組成的群組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵化合物為至少一選自由 Fe (CO) 5、Fe (acac) 2、Fe (acac) 3、及 i^e-oleate 所組成的群組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該接口活性劑為至少一選自由油酸、 及油胺所組成的群組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該接口活性劑包括油酸、及油胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作方法，其特征在于，油酸及油胺的體積比介于1 1至 3 1之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該多元醇為C8_2(l的醇類。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該多元醇為至少一選自由1，2_十六烷二醇、1，2_十二烷二醇、及聚乙二醇所組成的群組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為半胱胺、胱胺、或巰基烷基胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該標(biāo)靶分子為抗Her2抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子如下式所示其中，X為30 60。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子的粒徑為1 20nmo
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)。
15.一種用于CT及MRI的雙顯影劑，其特征在于，包括 一鐵鉬納米粒子；以及一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素；其中，該鐵鉬納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉬納米粒子如下式所示 FesPt100-X 其中，χ為30 60。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，還包括一標(biāo)靶分子，其與該表面分子連接，且該標(biāo)靶分子為一抗體、一蛋白質(zhì)、一核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為一胺基表面改質(zhì)分子，其具有巰基及胺基，且該胺基表面改質(zhì)分子通過該巰基連結(jié)于該鐵鉬納米粒子的表面，使該鐵鉬納米粒子的表面修飾有該胺基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的雙顯影劑，其特征在于，還包括一標(biāo)靶分子，其具有一羧基，且通過該羧基與該鐵鉬納米粒子表面上的該胺基的鍵結(jié)，以將該標(biāo)靶分子與該胺基表面改質(zhì)分子連結(jié)。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該表面改質(zhì)分子為半胱胺、胱胺、或巰基烷基胺。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該鐵鉬納米粒子的粒徑為1 20nmo
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該抗體為抗Her2抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙顯影劑，其特征在于，該雙顯影劑經(jīng)由下列步驟所制成 a，提供一混合溶液，其包含一鉬化合物、一鐵化合物、一多元醇、一界面活性劑、及一溶劑；b，加熱該混合溶液以使該鉬化合物與該鐵化合物進(jìn)行反應(yīng)，以得該鐵鉬納米粒子；c，冷卻該混合溶液，并將該鐵鉬納米粒子由該混合溶液中分離出；以及d，將該鐵鉬納米粒子與該表面改質(zhì)分子混合，以得到一用于CT及MRI的雙顯影劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的雙顯影劑，其特征在于，該接口活性劑包括油酸、及油胺。
24.根據(jù)權(quán)利要求第23項(xiàng)所述的雙顯影劑，其特征在于，油酸及油胺的體積比介于 1 1至3 1之間。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種同時(shí)用于陰極射線計(jì)算機(jī)斷層攝影與核磁共振攝影的雙顯影劑及其制作方法，其中雙顯影劑包括一鐵鉑納米粒子；一表面改質(zhì)分子，連結(jié)于該鐵鉑納米粒子的表面，使鐵鉑納米粒子的表面修飾有一胺基、一羧基、或一生物素；其中，鐵鉑納米粒子具有球狀結(jié)構(gòu)、八足狀結(jié)構(gòu)、立方八面體結(jié)構(gòu)、立方體結(jié)構(gòu)、或截角立方體結(jié)構(gòu)，且該鐵鉑納米粒子如下式(I)所示FexPt100-x(I)其中，x為30～60。
文檔編號A61K51/00GK102526769SQ201110268380
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳炳慶, 周尚威, 楊雨桑, 蕭宇宏, 謝達(dá)斌, 陳家俊 申請人:謝達(dá)斌, 陳家俊