專利名稱：紅景天苷在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，具體涉及紅景天苷在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅景天苷是從紅景天中分離提純的天然產(chǎn)物,具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強記憶、改善睡眠、消除憂郁感和保護心血管等多種藥理作用。經(jīng)年來研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷還有抗肝纖維、改善肝臟損傷的作用。王曉東等分別以CC14、D2半乳糖胺及卡 介苗加脂多糖誘導小鼠肝臟損傷模型，以ALT、NO和MDA、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量為指標，觀察紅景天苷對肝臟損傷的保護作用，結(jié)果表明紅景天苷能明顯降低肝損傷模 型的血清ALT、NO和肝勻漿MDA、TG含量，從而證明了其具有明顯的保肝作用。各種肝臟疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，藥物性肝病，慢性血吸蟲病以及一些代謝性或先天性慢性肝病都可通過肝纖維化發(fā)展成肝硬化。肝星狀細胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在肝臟炎癥狀態(tài)下，HSC經(jīng)多種細胞因子如血小板衍生生長因子(TOGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β UTGF-β I)的激活，活化為肌成纖維細胞并大量增殖，表達α-平滑肌肌動蛋白、合成分泌大量細胞外基質(zhì)，細胞可以收縮，亦可從Disse腔內(nèi)向肝細胞壞死區(qū)域遷移聚集。肝纖維化進程中，HSC所表現(xiàn)出的遷移特性，可導致炎癥區(qū)域活化的HSC數(shù)目增多，而加重病灶局部的纖維化程度，促使疾病進展。所以，如能抑制HSC在肝損傷時向炎癥區(qū)域遷移，就可能干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的目的。而HSC的遷移受到多種細胞因子和細胞外基質(zhì)成分的調(diào)控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最強的促進HSC增殖遷移的刺激因子。為此，本發(fā)明設(shè)計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出紅景天苷抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。目前，對紅景天苷在抑制肝星狀細胞遷移中的作用尚未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供紅景天苷的新用途。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供紅景天苷在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應(yīng)用。所述紅景天苷抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為10_4mol/L 10_7mol/L，優(yōu)選為105mol/L。本發(fā)明設(shè)計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出紅景天苷抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。實驗證明10_4mol/L、10_5mol/L、10_6mol/L和10_7mol/L 4個濃度梯度的紅景天苷均可抑制TOGF誘導的LX-2遷移；10_5mol/L紅景天苷抑制LX-2遷移的作用最強，且與10_4mol/L無統(tǒng)計學差異，這2組與10_6mol/L和10_7mol/L之間有統(tǒng)計學差異。在遷移同等條件下培養(yǎng)細胞時，4個濃度紅景天苷對細胞形態(tài)均無影響。遵從藥物篩選原則，首先選擇有統(tǒng)計學差異者，即抑制遷移效率最佳者；因此，選擇紅景天苷最佳藥物濃度為l(T5mol/L。從而本發(fā)明驗證了 ΙθΛιοΙ/L l(T7mol/L的紅景天苷均可抑制TOGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移，從而可干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的效果，即本發(fā)明驗證了紅景天苷可用于制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物。同時通過對比實驗發(fā)現(xiàn)l(T4mol/L l(T7mol/L青蒿琥酯、l(T4mol/L l(T7mol/L燈蓋花素、lCT4mol/L lCT7mol/L 紅景天式、lCT5mol/L lCT7mol/L 丹參酌■酸 B 鹽、lCT6mol/L和l(T7mol/L粉防己堿、l(T5mol/L l(T7mol/L黃芪總甙等6種中藥組分均可抑制I3DGF誘導的HSC的遷移；其中10_5mol/L紅景天苷抑制遷移作用最佳，與其它各濃度的各組分組比較均有顯著性差異。


圖1是本發(fā)明試驗例中細胞遷移杯(Transwell)的示意圖；細胞遷移杯為一個可·放置在孔板里的小杯子，其關(guān)鍵部分就是杯底層一張半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的許多微孔，孔徑為8. O μ m。將Transwell放入24孔培養(yǎng)板中形成Transwell與培養(yǎng)板的雙腔系統(tǒng)，Transwell內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,上下層培養(yǎng)液以半透膜相隔。將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，上層中的細胞亦可遷移至下層，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。圖2是本發(fā)明試驗例中不同濃度青蒿琥酯對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖2A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖2B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖3是本發(fā)明試驗例中不同濃度燈盞花素對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖3A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖3B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖4是本發(fā)明試驗例中不同濃度紅景天苷對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖4A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖4B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖5是本發(fā)明試驗例中不同濃度丹參酚酸B鹽對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖5A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200);圖5B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖6是本發(fā)明試驗例中不同濃度粉防己堿對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖6A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖6B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖7是本發(fā)明試驗例中不同濃度黃芪總甙對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖7A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖7B表示對LX-2形態(tài)的影響，X 200。圖8是本發(fā)明試驗例中各最佳濃度的青蒿琥酯、燈盞花素、紅景天苷、丹參酚酸B鹽、粉防己堿、黃芪總甙抑制I3DGF致LX-2遷移的比較示意圖(蘇木素染色，X200)。
具體實施例方式以下通過試驗例對本發(fā)明紅景天苷的藥理活性試驗及結(jié)果作進一步的闡述試驗例一、材料與方法(一)材料青蒿琥酯Artesunatum,分子式(C19H28O8),分子量384，純度彡 ％ % (by HPLC)；燈盞花素Breviscapi，分子式(C41H68O51)，分子量785，純度彡95% (by HPLC);紅景天苷:Salidroside，分子式(C14H2tlO7)，分子量 300. 30，純度彡 95 % (by HPLC);丹參酚酸 B 鹽Salvianolic acid Β-Mg2+，分子式(C36H3tlO16Mg)，分子量 742，純度彡 95 % (by HPLC);粉防己堿Tetrandrine,分子式(C38H42N2O6),分子量623,純度彡95 % (byHPLC);黃苗總式Astragaloside，分子式(C41H68O51)，分子量 785，純度彡 95% (by HPLC)。以上除丹參酚酸B鹽由中國科學院上海藥物研究所提供外，其它均購自于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。人肝星狀細胞株LX-2，其制備方法為約15g重正常人肝臟組織先后經(jīng)鏈酶蛋白酶和膠原酶消化后，由8. 2% Nycodenz離心分離得肝星狀細胞(HSC)。細胞用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。當細胞長滿培養(yǎng)皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化傳代，每7_10傳代一次。當HSC培養(yǎng)傳到4代，將SV40T-抗原DNA轉(zhuǎn)染入HSC，獲得細胞株LX-1。該細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)7代后，與原代細胞相比形態(tài)發(fā)生明顯變化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)半年后篩選得到的耐低血清(2 %胎牛血清)培養(yǎng)的細胞株(具體參見L Xu, A Y Hui,E Albanis,M J Arthur, S M 0’Byrne,WS Blaner,PMukherjee, S L Friedman,F J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005;54:142-151·)。0. 1% I 型膠原溶液(Col I，lot 107K2331)(美國 sigma 公司)。
PDGF (血小板衍生生 長因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB,純度> 97% (SDSPAGE)購于 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.各中藥組分濃度配制各中藥組分均取20mg。青蒿琥酯溶于5.2ml DMSO (二甲基亞砜)中，成10_2mOl/L儲存液；燈盞花素溶于4. 3mlDMS0中，成10_2mol/L儲存液；紅景天苷溶于6. 7ml DMSO中，成10_2mol/L儲存液；丹參酚酸B鹽溶于3.7ml DMSO中，成10_2mOl/L儲存液；粉防己堿溶于3. 2ml DMSO中，成10_2mOl/L儲存液；黃芪總甙溶于2. 5ml DMSO中，成10_2mOl/L儲存液。 上述各組分儲存液均分別經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾除菌，以含3 % FBS的DMEM培養(yǎng)基依次稀釋為 ΙθΛιοΙ/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 個濃度梯度。2.細胞遷移篩選實驗(采用如圖1所示的細胞遷移杯)(I)細胞培養(yǎng)與藥物孵育將LX-2用含10% FBS DMEM在Φ 100_的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細胞密度達到80 %左右。于遷移實驗開始前24h，將細胞按表I或表2分組，每組I皿并將培養(yǎng)液更換為3 %FBSDMEM。于遷移實驗開始12h前，按照分組情況加入培養(yǎng)液或相應(yīng)藥物的濃度進行孵育， 藥物孵育時間為12h。
表1.單一中藥組分篩選實驗細胞分組和孵育用藥
權(quán)利要求
1.紅景天苷在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅景天苷抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅景天苷抑制肝星狀細胞迀移的有效濃度為 10—5mol/L
全文摘要
本發(fā)明公開了紅景天苷在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計了以PDGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，發(fā)現(xiàn)10-4mol/L～10-7mol/L的紅景天苷均可抑制PDGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移。
文檔編號A61K36/41GK102988459SQ20111027465
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者徐列明, 張展 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院