專利名稱：免疫接種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對(duì)象的疫苗接種的改進(jìn)方法。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了使用皮膚抗原施用以放大和提高對(duì)象中針對(duì)所選病原體的先存免疫性(pre-existing immunity)。本發(fā)明公開(kāi)了使用皮膚施用聯(lián)合常規(guī)疫苗接種(vaccination)或啟動(dòng)(接觸抗原,priming)用于對(duì)象針對(duì)所選病原體的提高免疫化或疫苗接種。
背景技術(shù)：
對(duì)象的疫苗接種是ー種針對(duì)所選病原體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。疫苗接種可以是預(yù)防性的，即在對(duì)象暴露于該病原體之前進(jìn)行，和/或治愈性的，即在暴露后進(jìn)行，以便增加、擴(kuò)大或刺激對(duì)象針對(duì)致病體的免疫防御。常規(guī)疫苗接種包括將抗原胃腸外、鼻道或經(jīng)ロ給予對(duì)象。大多數(shù)疫苗接種程序包括將對(duì)病原體特異性的所選抗原(重復(fù)的)胃腸外給予(例如注射)到對(duì)象，由此誘導(dǎo)或放大對(duì)象針對(duì)該病原體的免疫系統(tǒng)。常規(guī)疫苗接種也可以經(jīng)ロ或經(jīng)鼻(給藥)。疫苗接種通常包括重復(fù)給藥方案，包括啟動(dòng)給藥，接著是ー個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)給藥。在大多數(shù)情況下，這樣的啟動(dòng)-加強(qiáng)疫苗接種，其需要多于一次的免疫化，多次利用相同疫苗作為同源增強(qiáng)劑來(lái)進(jìn)行。而且，在常規(guī)疫苗接種程序中，抗原通常聯(lián)合一種或多種佐劑使用，以便產(chǎn)生適當(dāng)免疫應(yīng)答。Wu等人(2005)描述了ー種常規(guī)異源啟動(dòng)-加強(qiáng)方法，其中所述啟動(dòng)通過(guò)注射第一抗原(編碼抗原的質(zhì)粒DNA)進(jìn)行并且加強(qiáng)通過(guò)注射第二制劑(編碼該相同抗原的復(fù)制-缺陷型腺病毒載體)進(jìn)行。這種方法已在針對(duì)大量病毒性病原體(包括HIV、丙肝病毒、埃波拉病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒)的疫苗的開(kāi)發(fā)中進(jìn)行測(cè)試。DNA啟動(dòng)后腺病毒加強(qiáng)也已被評(píng)價(jià)為用于針對(duì)細(xì)菌病進(jìn)行免疫化的方法(McConnell et al.，2007)。常規(guī)疫苗接種已經(jīng)利用不同種類的抗原例如蛋白、肽、細(xì)胞、失活病原體、類毒素、病毒樣顆粒等進(jìn)行考察。也已經(jīng)提出疫苗制劑在皮膚上的局部施用。尤其是，Partidos et al.2003已經(jīng)證實(shí),免疫應(yīng)答可以通過(guò)表皮途徑引起,經(jīng)過(guò)特定給藥條件，使用特定佐劑和皮膚的預(yù)處理。US 7，378，097還涉及在預(yù)處理皮膚上施用加佐劑的抗原組合物的疫苗接種。Mishra et al, 2006提出ー種使用新型囊狀構(gòu)建體、促融囊質(zhì)體的經(jīng)皮免疫化的系統(tǒng)，其經(jīng)由局部給藥遞送抗原。然而，這種囊狀系統(tǒng)是液體、非封閉性系統(tǒng)，并且需要在水合皮膚上與佐劑一起施用抗原。 Hammond et al, 2001還提出一種經(jīng)皮免疫化的方法，加佐劑的抗原液體溶液通過(guò)該方法局部地施用于水合皮膚。所有上述方法需要施用佐劑以引起免疫應(yīng)答。而且，它們施用液體制劑，并且引發(fā)的免疫應(yīng)答的特性既沒(méi)有控制也沒(méi)有進(jìn)行分析。W02007/122226和W02009/080933公開(kāi)了表皮免疫化，其使用施用于完整皮膚上的無(wú)佐劑的抗原制劑。這種施用表明，可以在沒(méi)有添加佐劑下且沒(méi)有皮膚預(yù)處理下通過(guò)抗原的皮膚施用而獲得保護(hù)性應(yīng)答。盡管有用于疫苗接種或保護(hù)哺乳動(dòng)物對(duì)象的上述策略和陽(yáng)性應(yīng)答，但在本領(lǐng)域仍然需要改進(jìn)的免疫化方法，其對(duì)于患者更方便并且誘導(dǎo)合適且有效的免疫應(yīng)答以預(yù)防或治療諸如傳染病的疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)?zhí)峁┅`種在哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)病原體形成免疫性的新方法。更具體地，本發(fā)明提供使用表皮抗原施用來(lái)放大和/或定向?qū)ο笾械南却婷庖摺Ｈ鐚⒃诒旧暾?qǐng)中公開(kāi)的，這種方法導(dǎo)致強(qiáng)的THl-定向免疫·應(yīng)答并且比當(dāng)前疫苗接種方案顯著更方便。尤其是，本發(fā)明表明皮膚加強(qiáng)引起先存免疫應(yīng)答放大和免疫應(yīng)答的THl極化，這特別適于有效疫苗接種。因此，本發(fā)明的ー個(gè)目的在于ー種用于在哺乳動(dòng)物對(duì)象中刺激和/或THl-定向針對(duì)病原體的先存免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在針對(duì)病原體具有先存免疫應(yīng)答的對(duì)象的皮膚上施用對(duì)該病原體特異性的抗原，所述皮膚施用導(dǎo)致所述應(yīng)答的刺激和THl-定向。本發(fā)明還涉及ー種對(duì)病原體特異性的抗原的制劑，其通過(guò)將所述制劑施用于哺乳動(dòng)物對(duì)象的皮膚而用于放大和/或THl定向該對(duì)象針對(duì)所述病原體的先存免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，該抗原制劑是干的和/或未加佐劑的。優(yōu)選地，抗原制劑施用于對(duì)象的完整皮膚。而且，在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗原制劑使用封閉性斑貼裝置而施用于對(duì)象的皮膚上。本發(fā)明還涉及對(duì)于病原體特異性的抗原的制劑用于制備藥物的用途，所述藥物通過(guò)將所述制劑施用于對(duì)象的皮膚而用于放大并且優(yōu)選地Thl-定向哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)所述病原體的先存免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述抗原是干的和/或未加佐劑的。如將在本申請(qǐng)中進(jìn)一步公開(kāi)的，先存免疫力可以由對(duì)象針對(duì)所述病原體的先前常規(guī)疫苗接種、對(duì)象針對(duì)所述病原體的先前常規(guī)免疫啟動(dòng)、和/或?qū)ο髮?duì)所述抗原的先前天然暴露導(dǎo)致。因此，本發(fā)明的另ー個(gè)目的涉及ー種針對(duì)所選病原體對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的方法，該方法包括:(i)向哺乳動(dòng)物常規(guī)給予對(duì)所述病原體特異性的抗原以引起或刺激對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答，和(ii)在該哺乳動(dòng)物的皮膚上隨后施用對(duì)該病原體特異性的抗原。如將記載的，這樣的皮膚施用允許免疫應(yīng)答的放大和Thl定向。步驟(ii)可以在步驟(i)之后立即進(jìn)行，或者在以后進(jìn)行，只要針對(duì)病原體的免疫力仍然在對(duì)象中存在。步驟
(ii)通常由1、2或3個(gè)加強(qiáng)處理構(gòu)成，其彼此可以以不同時(shí)間間隔進(jìn)行，取決于例如致病體，典型地在1-18個(gè)月之間。因此，本發(fā)明的另ー個(gè)目的涉及ー種用于針對(duì)所選病原體對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的抗原制劑，所述抗原首先常規(guī)地給予該哺乳動(dòng)物以引起或刺激對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答，井隨后施用于該哺乳動(dòng)物的皮膚上。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是ー種加強(qiáng)針對(duì)病原體免疫化的哺乳動(dòng)物對(duì)象中的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在所述對(duì)象的皮膚上施用對(duì)該病原體特異性的抗原，優(yōu)選在干燥的未加佐劑的制劑中。更優(yōu)選地，該抗原制劑是未加佐劑的并且施用于對(duì)象的完整皮膚區(qū)域。
本發(fā)明的另ー個(gè)目的涉及ー種放大和Thl-定向預(yù)先免疫化哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在所述預(yù)先免疫化對(duì)象的完整皮膚上施用對(duì)病原體特異性的抗原，優(yōu)選在干的和/或未加佐劑的制劑中。本發(fā)明還涉及對(duì)病原體特異性的抗原(優(yōu)選在干的和/或未加佐劑的制劑中)，通過(guò)將該抗原施用于對(duì)象的皮膚而用于放大和Thl-定向預(yù)先免疫化哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及ー種用于誘導(dǎo)或刺激哺乳動(dòng)物對(duì)象中的病原體特異性、Thl-定向的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該哺乳動(dòng)物常規(guī)給予對(duì)病原體特異性的抗原以引起或刺激針對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答；和隨后在該哺乳動(dòng)物的完整皮膚上施用對(duì)該病原體特異性的抗原，允許放大Thl-定向的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及ー種放大哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)病原體的先存免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將對(duì)所述病原體特異性的抗原的干且未加佐劑的制劑施用至該對(duì)象的完整皮膚。本發(fā)明還涉及ー種加強(qiáng)針對(duì)病原體預(yù)先免疫化的不如動(dòng)物對(duì)象中的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將對(duì)所述病原體特異性的抗原制劑在允許放大和Thl定向該免疫應(yīng)答的條件下施用于所述對(duì)象的皮膚上。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是ー種組合物，其包含對(duì)所選病原體特異性的抗原的注射制劑；和對(duì)所述所選病原體特異性的抗原的干且未加佐劑的制劑，適合給予至皮膚，用于單獨(dú)、依次施用至哺乳動(dòng)物對(duì)象。本發(fā)明還涉及ー種試劑盒，其包含對(duì)所選病原體特異性的抗原的注射制劑；和對(duì)所述所選病原體特異性的抗原的干且未加佐劑的制劑，適合給予至皮膚。本發(fā)明可以用于任何哺乳動(dòng)物，尤其是任何人對(duì)象，以誘導(dǎo)或放大針對(duì)任何病原體的預(yù)防性和/或治愈性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還可以用于獸醫(yī)領(lǐng)域，以治理動(dòng)物如家畜或?qū)櫸铮膛?、豬、馬、狗、貓等。特別適于針對(duì)傳染性病原體進(jìn)行疫苗接種。


fill皮膚加強(qiáng)對(duì)抗-HBsAg IgGl應(yīng)答的影響Mll皮膚加強(qiáng)對(duì)抗-HBsAg IgG2a應(yīng)答的影響Sll通過(guò)皮膚施用或注射兩次加強(qiáng)的小鼠中的產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞Mll通過(guò)皮膚施用或注射兩次加強(qiáng)的小鼠中的細(xì)胞因子分泌Mll通過(guò)皮膚施用或注射兩次加強(qiáng)的小鼠中的IL-5應(yīng)答(ELISA)Mll通過(guò)皮膚施用或注射兩次加強(qiáng)的小鼠中的IFN-應(yīng)答(ELISA)Sll在完整和膠帶剝離皮膚上誘導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的比較:特異性IgE(7A)和IgG2a(7B)的水平在完整和膠帶剝離皮膚上誘導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的比較:食道中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)S9:在完整和膠帶剝離皮膚上誘導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的比較:食道中的細(xì)胞因子的mRNA表達(dá):嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)(圖9A)、IL_5(圖9B)和IL_13(圖9C)
S 10:在完整和膠帶剝離皮膚上誘導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的比較:食道中的mRNA表達(dá):GATA-3 (圖 10A)、Foxp3 (圖 10B)
圖11:在完整和膠帶剝離皮膚上誘導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的比較:組織性數(shù)據(jù)-空腸中的絨毛/隱窩比
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及用于改進(jìn)疫苗接種的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及使用表皮抗原遞送來(lái)刺激對(duì)象中的先存免疫。本發(fā)明公開(kāi)了改進(jìn)的“啟動(dòng)-加強(qiáng)”疫苗接種方法，其中免疫系統(tǒng)通過(guò)常規(guī)給予啟動(dòng)抗原組合，并通過(guò)表皮施用加強(qiáng)抗原組合而加強(qiáng)。本發(fā)明還涉及施用表皮抗原給藥而用于在預(yù)先免疫化對(duì)象中針對(duì)病原體產(chǎn)生保護(hù)性THl-定向的免疫應(yīng)答的方法。這種方法對(duì)于患者安全、實(shí)用，并且在哺乳動(dòng)物對(duì)象中產(chǎn)生強(qiáng)Thl-定向的免疫應(yīng)答。本發(fā)明表明，在疫苗接種和/或天然暴露于病原體之前，通過(guò)常規(guī)啟動(dòng)引發(fā)的特定免疫反應(yīng)(其是TH2-定向的)，可以在對(duì)象的表皮加強(qiáng)后被有效地放大和THl-極化。呈現(xiàn)的結(jié)果表明，在無(wú)佐劑且沒(méi)有皮膚預(yù)處理下的表皮加強(qiáng)導(dǎo)致先存免疫應(yīng)答的有效放大和THl-定向。結(jié)果進(jìn)一歩表明，這樣的應(yīng)答在所述加強(qiáng)利用干抗原制劑和封閉性皮膚裝置進(jìn)行時(shí)尤其顯著。本發(fā)明可以用來(lái)誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答以及對(duì)任何病原體產(chǎn)生免疫力。本發(fā)明還可以用來(lái)預(yù)防或治療由病原體引發(fā)的疾病。本公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考以下定義將被最佳理解:
如本文中使用的，“常規(guī)”給藥或疫苗接種是指胃腸外、經(jīng)ロ或鼻道給藥或疫苗接種。胃腸外給藥可以通過(guò)注射(例如肌內(nèi)、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、刺穿、和/或經(jīng)皮給藥進(jìn)行。優(yōu)選的胃腸外給藥途徑是通過(guò)注射。表皮或皮膚施用是指在允許接觸皮膚的表面的條件下在對(duì)象的皮膚上施用抗原。根據(jù)本發(fā)明的皮膚施用優(yōu)選在完整(或未預(yù)先處理)的皮膚上進(jìn)行。皮膚施用應(yīng)維持足以允許抗原透入皮膚的淺層和/或抗原接觸免疫細(xì)胞的時(shí)間期。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“完整皮膚”是指角質(zhì)層的完整性應(yīng)被基本上保持。之前的工作已表明，對(duì)于有效的表皮免疫療法和增強(qiáng)的抗原透過(guò)以及免疫應(yīng)答的激活，需要去除皮膚的角質(zhì)層(例如通過(guò)磨蝕或深度膠帶剝離)，或者需要穿過(guò)角質(zhì)層(例如使用纖維操作針)(Frerichs et al., Vaccine 2008, p2782; Strid et al, Eur J.1mmunol2004p2100)。這些之前的工作表面，通過(guò)改變角質(zhì)層的完整性，角質(zhì)形成細(xì)胞和郎格爾漢斯細(xì)胞被活化或刺激，導(dǎo)致有機(jī)體的更好應(yīng)答。與這些之前的觀察結(jié)果相反，本發(fā)明表明優(yōu)選將抗原施用于完整(即非預(yù)先處理)皮膚上，例如在其中角質(zhì)層的完整性基本上保持的皮膚的表面或部分上。事實(shí)上本發(fā)明表明，為了避免偏向的Th2免疫應(yīng)答，很重要的是維持角質(zhì)層的完整以及位于該角質(zhì)層下方的角質(zhì)形成細(xì)胞和郎格爾漢斯細(xì)胞的天然活化狀態(tài)。通過(guò)維持這種完整性，獲得的應(yīng)答在耐受性方面的高度定向的。因此，盡管在施用部位處可以進(jìn)行皮膚表面的溫和清洗，例如水合、水清洗或非常溫和的單次剝離，以除去例如角化細(xì)胞(corneocyte ),但是皮膚不應(yīng)被預(yù)先處理以維持角質(zhì)層的基本完整性。尤其是，皮膚的膠帶剝離或強(qiáng)磨蝕不應(yīng)進(jìn)行，因?yàn)檫@樣的預(yù)先處理破壞或去除所有或部分的角質(zhì)層并且因此角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激。類似地，應(yīng)當(dāng)避免角質(zhì)層的穿孔。
如本文中描述的，術(shù)語(yǔ)“疫苗接種”通常是指向哺乳動(dòng)物依次給予ー種或多種抗原，以產(chǎn)生和/或增強(qiáng)針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。依次給藥包括啟動(dòng)免疫化，隨后的一次或多次加強(qiáng)免疫化。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“病原體”是指可以引起病理狀態(tài)的任何試劑。“病原體”的實(shí)例包括但不限于細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞，患病哺乳動(dòng)物細(xì)胞，癌哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、真菌、寄生物、病毒、朊病毒或毒素。優(yōu)選的病原體是傳染性病原體。在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，傳染性病原體是病毒，如肝炎病毒、輪狀病毒、雞水痘病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、流行性感冒、HIV、埃波拉病毒或狂犬病毒。傳染性病原體的具體實(shí)例包括但不限于白喉棒桿菌(C.diphteriae)、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)、百日咳鮑特菌(B.Pertussis)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、月思思炎病毒(Mumps)、風(fēng)疫病毒(Rubella)、帶狀皰疫病毒(Varicella)(水痘)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、輪狀病韋(Rotavirus)、HPV (人乳頭瘤病韋(HumanPapillomavirus))、非洲維蟲(chóng)病(African trypanosomiasis)(睡眠病)、炭疽(Anthrax)、禽流感(〃鳥(niǎo)類流感〃)，布路里潰瘍病(Buruli ulcer disease)、霍亂、克里木-剛果出血熱(Crimean-Congo haemorrhagic fever)、登革熱和出血性骨痛熱癥、埃博拉出血熱、腸道病毒-非脊髄灰質(zhì)炎，B型流感嗜血菌(HiB) ,hendra病毒、甲型肝炎、こ型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戍型肝炎、流感(季節(jié)性)，拉沙熱(Lassafever)、軍團(tuán)桿菌病、麻風(fēng)病、拒疾、馬爾堡出血熱(Marburg haemorrhagicfever)、麻疫、腦膜炎球菌性腦膜炎(Meningococcalmeningitis)、nipah病毒(Nipah virus)、痕疫、脊髓灰質(zhì)炎、裂谷熱、天花、結(jié)核病或黃熱病病原體。如本文中使用的，抗原是指可以在對(duì)象中引起T細(xì)胞或B細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何分子。對(duì)于病原體特異性的抗原典型地是從所述病原體獲得或來(lái)源于所述病原體的成分，其含有抗原決定基，并且其可以引起針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答。取決于致病體，抗原可以為各種性質(zhì)，如(多)肽、蛋白、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞等。也可以使用病原體(例如細(xì)菌，病毒)的活弱化形式、或其殺死或失活形式，或其純化材料如蛋白、肽、脂質(zhì)等?？乖梢允翘烊换蛉斯ぎa(chǎn)生的。它對(duì)于所治療的哺乳動(dòng)物可以是外源性的或內(nèi)源性的(硫腫瘤抗原)。抗原可以通過(guò)本領(lǐng)域本身已知的技術(shù)，例如合成或重組技術(shù)、或酶促方法產(chǎn)生。適合用于本發(fā)明的抗原是具體實(shí)例包括例如病毒性抗原，優(yōu)選病毒表面抗原，例如こ肝或甲肝病毒抗原(HBsAg，HAsAg)。其他抗原包括腫瘤相關(guān)抗原，即通過(guò)腫瘤細(xì)胞但不是通過(guò)正常細(xì)胞表達(dá)的抗原、細(xì)菌蛋白等。在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，抗原是蛋白、多肽和/或肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換地用來(lái)指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被修飾或非天然殘基，如相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)“蛋白”還包括不同抗原的片段或變體，如含有抗原決定基的片段，或獲自病原體的井隨后酶促、化學(xué)、機(jī)械或熱修飾的蛋白。如將在以下進(jìn)ー步討論的，抗原可以為各種狀態(tài)，如液體或干的。典型地，對(duì)于皮膚施用，抗原處于干的狀態(tài)，而對(duì)于常規(guī)疫苗接種或啟動(dòng)，抗原處于液體形式。

本發(fā)明涉及使用表皮抗原施用改善哺乳動(dòng)物對(duì)象中先存免疫的新方法。本發(fā)明可以用來(lái)改善、刺激、強(qiáng)化、擴(kuò)大和/或再極化先存免疫應(yīng)答，其可以由以下導(dǎo)致:
.對(duì)象針對(duì)所選病原體的在前常規(guī)疫苗接種；.對(duì)象針對(duì)所選病原體的在前常規(guī)啟動(dòng)；和/或.對(duì)象天然暴露于所選病原體。在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明因此在于，在已接受常規(guī)疫苗的哺乳動(dòng)物對(duì)象中使用抗原來(lái)刺激并優(yōu)選THl-極化針對(duì)病原體的已有免疫應(yīng)答，所述抗原通過(guò)皮膚施用給予對(duì)象。先存免疫性可以由在對(duì)象中長(zhǎng)時(shí)間以前(例如在童年期間)實(shí)施的常規(guī)疫苗導(dǎo)致。常規(guī)疫苗和皮膚遞送之間的時(shí)間期實(shí)際上可以顯著變化，只要對(duì)象仍然表現(xiàn)出先存免疫性。存在這樣的先存免疫性如果需要，可以通過(guò)常規(guī)方法驗(yàn)證。這種方法例如適于在童年期間針對(duì)肝炎或破傷風(fēng)疫苗接種的對(duì)象的情形。用于皮膚加強(qiáng)的抗原可以是無(wú)活性的或亞基(例如流感、こ肝或甲肝、百日咳)或活的弱化的(水痘、BCG、脊髄灰質(zhì)炎、流感、狂犬病、黃熱病
坐、
ノ o在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明在于在已接受常規(guī)啟動(dòng)的哺乳動(dòng)物對(duì)象中使用抗原來(lái)刺激并且優(yōu)選THl-極化針對(duì)病原體的現(xiàn)有免疫應(yīng)答，所述抗原通過(guò)皮膚施用給予對(duì)象。如在實(shí)施例中舉例說(shuō)明的，本 發(fā)明的發(fā)明人已證實(shí)，組合胃腸外啟動(dòng)和皮膚加強(qiáng)導(dǎo)致強(qiáng)且Thl-定向的免疫應(yīng)答。

在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，本發(fā)明因此涉及一種針對(duì)病原體對(duì)對(duì)象進(jìn)行疫苗接種的方法，包括對(duì)象用抗原的常規(guī)啟動(dòng)以引起或刺激針對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答的第一步驟，接著是通過(guò)皮膚施用對(duì)于病原體特異性的抗原加強(qiáng)免疫應(yīng)答的步驟。啟動(dòng)可以包括一個(gè)或多個(gè)相繼的抗原給藥。在ー種最典型的方法中，常規(guī)啟動(dòng)包括ー個(gè)或兩個(gè)抗原給藥。優(yōu)選的啟動(dòng)通過(guò)注射。對(duì)于常規(guī)給藥，抗原典型地組合佐劑。合適的佐劑包括例如活化或加速免疫系統(tǒng)以引起增強(qiáng)的抗原特異性免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)?？梢杂糜诒景l(fā)明的佐劑的實(shí)例包括無(wú)機(jī)鹽，如磷酸鈣、磷酸鋁和氫氧化鋁；免疫刺激性DNA或RNA，如CpG寡核苷酸；蛋白質(zhì)，如抗體或Toll樣受體結(jié)合蛋白；皂苷類，例如QS21 ;細(xì)胞因子；胞壁酰ニ肽衍生物；LPS ;MPL和衍生物包括3D-MPL ；GM-CSF (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子);咪喹莫特(imiquimod);交替離子；競(jìng)爭(zhēng)性或無(wú)能Freund佐劑；Ribi佐劑或細(xì)菌毒素,例如霍亂毒素或腸毒素(LT)。對(duì)于常規(guī)啟動(dòng)，因此使用啟動(dòng)抗原組合物，其包含抗原，典型地組合佐劑。這樣的組合物通常為液體形式，適于注射。該組合物可以進(jìn)一歩包含合適賦形劑如稀釋劑、載體、等滲溶液、水等。如上所述的，本發(fā)明將常規(guī)啟動(dòng)或疫苗接種與皮膚加強(qiáng)組合。皮膚加強(qiáng)的步驟典型地包括在允許接觸皮膚的條件下在對(duì)象的皮膚上施用抗原制劑。施用典型地在允許抗原透入表皮的角質(zhì)層和/或到達(dá)免疫細(xì)胞的條件下進(jìn)行和/或持續(xù)這樣的時(shí)間。皮膚施用優(yōu)選利用適于保持抗原制劑和對(duì)象的皮膚之間的接觸的裝置進(jìn)行。這樣的裝置包括但不限于斑貼、膠帶、繃帶、薄片、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他形式。優(yōu)選地，皮膚裝置是斑貼、甚至更優(yōu)選地是封閉性斑貼。優(yōu)選的斑貼裝置不改變皮膚的完整性。本申請(qǐng)中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，在使用封閉性皮膚斑貼裝置進(jìn)行皮膚加強(qiáng)時(shí)產(chǎn)生顯著Thl-定向免疫應(yīng)答。在最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法使用如在國(guó)際專利申請(qǐng)W02002/071950和WO2007/122226中描述的皮膚斑貼裝置。
這樣的裝置是封閉性的并且被構(gòu)造成使用干形式的抗原，在沒(méi)有添加粘合劑的情況下，該抗原通過(guò)靜電和/或范德華力被保持在斑貼上。這樣的裝置(稱為Viaskin )的制備和特性詳細(xì)公開(kāi)在以上引用的申請(qǐng)中，其以其整體通過(guò)引用并入本文中。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，特別適于使用包括背襯的裝置，其適于與皮膚形成氣密性封閉室，這種背襯在小室內(nèi)在其皮膚面對(duì)側(cè)上具有通過(guò)靜電力和/或范德華力粘附的干的抗原。在施用于皮膚后，小室中濕氣增大，導(dǎo)致抗原溶出并與皮膚接觸。在本發(fā)明的另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，利用封閉性斑貼裝置將抗原施用于哺乳動(dòng)物的皮膚上，該封閉性斑貼裝置包括抗原結(jié)合的載體。優(yōu)選地，在沒(méi)有添加的粘合劑下，抗原通過(guò)靜電力或范德華カ結(jié)合于載體。在特定實(shí)施方式中，斑貼的載體可以由玻璃或聚合物構(gòu)成，該聚合物選自由纖維素塑料(CA，CP)、聚氯こ烯(PVC)、聚丙烯、聚苯こ烯、聚氨酷、聚碳酸酯、聚丙烯酸類、聚烯烴、聚酷、聚こ烯和こ烯丙烯酸こ烯酯(EVA)組成的組。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用干的抗原制劑進(jìn)行皮膚加強(qiáng)，其優(yōu)選利用靜電皮膚裝置施用于皮膚上。在這方面，術(shù)語(yǔ)“干的”是指這樣的事實(shí)，即加強(qiáng)抗原制劑基本上是粉末化，例如為可以單個(gè)化或聚集的顆粒形式。盡管較不優(yōu)選，但是加強(qiáng)抗原制劑可以為液體形式并且利用已知裝置如具有儲(chǔ)罐或穿孔膜的封閉裝置施用。本發(fā)明的優(yōu)選方法組合液體、加佐劑的啟動(dòng)抗原制劑和干的加強(qiáng)抗原制劑。此外，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，加強(qiáng)抗原制劑在沒(méi)有佐劑下配制或使用。事實(shí)上，本發(fā)明表明，即使在加強(qiáng)制劑中沒(méi)有添加佐劑下，該方法導(dǎo)致強(qiáng)且THl-極化的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明的優(yōu)選方法組合液體的添加佐劑的啟動(dòng)抗原制劑和干的未加佐劑的加強(qiáng)抗原制劑。加強(qiáng)抗原制劑可以含有惰性賦形劑或其他成分，如滲透增強(qiáng)劑或水合剤。然而，優(yōu)選使用這樣的加強(qiáng)抗原制劑，其含有僅有的活性物質(zhì)的ー種或多種抗原，即沒(méi)有另外的活性物質(zhì)如佐劑或滲透增強(qiáng)劑。在加強(qiáng)步驟，一個(gè)或多個(gè)斑貼裝置可以一次或多次在沒(méi)有任何預(yù)處理下直接施用于完整皮膚，優(yōu)選地在身體的無(wú)毛部分。事實(shí)上，盡管被本申請(qǐng)涵蓋，但是在施用該裝置之前不需要處理皮膚。此外，本申請(qǐng)令人驚訝地表明，皮膚預(yù)處理實(shí)質(zhì)性地影響由表皮加強(qiáng)劑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型。更具體地，當(dāng)抗原制劑是未加佐劑的并且施用于完整皮膚上時(shí)，先存免疫應(yīng)答強(qiáng)烈放大并且Thl極化。這完全出乎意料并且是特別有利的。因此，本發(fā)明的ー個(gè)目的在于ー種在對(duì)象中誘導(dǎo)或增強(qiáng)Thl極化的抗原特異性免疫應(yīng)答，該方法包括在對(duì)象的完整皮膚上施用所述抗原的干且未加佐劑的制劑。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是ー種組合物，該組合物包含對(duì)所選病原體特異性的抗原的注射制劑，和對(duì)于所述所選病原體特異性的抗原的干的未加佐劑的制劑，用于單獨(dú)、順序地施用于哺乳動(dòng)物對(duì)象。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是如上定義的組合物，其用于在哺乳動(dòng)物對(duì)象中誘導(dǎo)、刺激或放大病原體特異性、Thl-定向的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是如上定義的組合物，其用于在哺乳動(dòng)物對(duì)象中加強(qiáng)對(duì)所選疾病 的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是ー種在針對(duì)病原體常規(guī)地免疫化的哺乳動(dòng)物對(duì)象中加強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在所述對(duì)象的未預(yù)處理皮膚上并且在沒(méi)有添加佐劑下施用對(duì)病原體特異性的抗原，這樣的使用導(dǎo)致免疫應(yīng)答的加強(qiáng)。術(shù)語(yǔ)“常規(guī)地免疫化”是指哺乳動(dòng)物之前已經(jīng)通過(guò)常規(guī)給藥而暴露于抗原(即，啟動(dòng)的)。由本發(fā)明的發(fā)明人呈現(xiàn)的結(jié)果令人驚訝地表明，在沒(méi)有佐劑和沒(méi)有皮膚預(yù)處理下的表皮加強(qiáng)，導(dǎo)致之前通過(guò)常規(guī)給藥引起或刺激的免疫應(yīng)答的有效放大和Thl-定向。在本發(fā)明的實(shí)施中，用于啟動(dòng)和加強(qiáng)的抗原可以相同或不同，只要該抗原對(duì)所選病原體是特異性的。典型地用于啟動(dòng)和加強(qiáng)的抗原含有至少ー個(gè)共有的T細(xì)胞和/或B細(xì)胞抗原決定基。而且，使用的抗原的量可以由技術(shù)人員修改。啟動(dòng)步驟可以依照公開(kāi)的劑量實(shí)施。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)，每個(gè)皮膚裝置上的抗原的量的范圍典型地為0.1至10000 u g,優(yōu)選地為 20 至 5000 u g。本發(fā)明的方法加強(qiáng)免疫化可以包括一次或多次加強(qiáng)施用，這可以使用相同或不同抗原，優(yōu)選相同抗原，以不同時(shí)間間隔實(shí)施，取決于對(duì)象、抗原、皮膚裝置、疾病等。

在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，每個(gè)抗原加強(qiáng)包括I至10次皮膚裝置是順序施用，典型地為I至5次，優(yōu)選為1、2或3次，在一段時(shí)間內(nèi)，該時(shí)間可以從I天延長(zhǎng)至幾個(gè)月。毎次施用彼此可以間隔I天至幾周，典型地為I周至10周。此外，本發(fā)明的優(yōu)選處理典型地包括1、2或3個(gè)抗原加強(qiáng)。第一個(gè)抗原加強(qiáng)可以在啟動(dòng)或暴露于病原體之后的任何時(shí)間進(jìn)行，只要仍然存在抗原特異性免疫細(xì)胞。優(yōu)選地，該第一個(gè)加強(qiáng)在啟動(dòng)后2至10周實(shí)施。因此，在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，該方法包括常規(guī)啟動(dòng)免疫化，接著典型地在3-6周后的單個(gè)抗原加強(qiáng)免疫化。如果需要，可以實(shí)施第二該和可選地第三個(gè)抗原加強(qiáng)。該第二和第三個(gè)加強(qiáng)可以在月時(shí)間間隔內(nèi)所述，例如在之前的加強(qiáng)之后的2-18個(gè)月。在這方面，在ー個(gè)特定實(shí)施方式中，所述方法包括常規(guī)啟動(dòng)免疫化，隨后典型地在3-6周之后，第一個(gè)抗原加強(qiáng)，并且典型地1-18個(gè)月之后，優(yōu)選1-12個(gè)月之后，例如3-6周之后，第二個(gè)抗原加強(qiáng)。在另ー個(gè)特定實(shí)施方式中，所述方法由以下構(gòu)成:(i)常規(guī)啟動(dòng)免疫化，(ii)典型地3-6周后，第一個(gè)抗原加強(qiáng)，(iii)典型地1-18個(gè)月后，優(yōu)選地1-12個(gè)月后，例如3-6周后，第二個(gè)抗原加強(qiáng)，和(iv)典型地1-18個(gè)月后，優(yōu)選地1-12個(gè)月后，例如3-6周后，第三個(gè)且最后ー個(gè)抗原加強(qiáng)?？乖木唧w劑量以及加強(qiáng)施用的數(shù)量和接觸的持續(xù)時(shí)間可以由技術(shù)人員改變，取決于對(duì)象、抗原制劑的性質(zhì)、使用的斑貼裝置的類型等。對(duì)于封閉性裝置，如Vkskin 裝置，接觸的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選包括在5至72小時(shí)之間。優(yōu)選地，對(duì)于每個(gè)施用，該裝置在皮膚素保持24至約60小時(shí)，更優(yōu)選約24小時(shí)至48小時(shí)，典型地24小時(shí)、36小時(shí)或48小時(shí)的時(shí)間。所述處理可以在任何時(shí)間停止，例如，一旦已經(jīng)建立足夠的免疫應(yīng)答的放大和/或Thl-定向。在這方面，本發(fā)明表明，由胃腸外啟動(dòng)引發(fā)的特定免疫反應(yīng)，其是Th2-定向的，可以在表皮加強(qiáng)后被有效放大和Thl-定向。Thl和Th2細(xì)胞是CD4+輔助T細(xì)胞的兩種類型，其不同之處在于細(xì)胞因子產(chǎn)生的模式。Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y、IL-2和TNF-P并且涉及在針對(duì)胞內(nèi)病原體和惡性腫瘤細(xì)胞的宿主抗性中是有益的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-1O和IL-13，其增大抗體反應(yīng)，包括IgE產(chǎn)生。Thl和Th2反應(yīng)相互是拮抗性的，使得它們通常平衡存在并且彼此交叉調(diào)控。在本發(fā)明的上下文中，免疫應(yīng)答的Thl定向是指作為本發(fā)明的加強(qiáng)的結(jié)果，Thl/Th2免疫細(xì)胞或細(xì)胞因子的比值增大，優(yōu)選至少10%。如實(shí)驗(yàn)部分公開(kāi)的，從根據(jù)本發(fā)明加強(qiáng)的對(duì)象提取的T細(xì)胞的上清，相比于通過(guò)常規(guī)給藥途徑加強(qiáng)的對(duì)象，含有顯著更高濃度的IFN-(其是主要的Thl細(xì)胞因子)和顯著更低濃度的IL-5，由此證實(shí)了免疫應(yīng)答的Thl定向。在ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，Thl定向是指，相比于使用常規(guī)給藥途徑處理的對(duì)象，IFN-的濃度或產(chǎn)生IFN-的細(xì)胞的數(shù)量增加至少，和或相比于使用常規(guī)給藥途徑處理的對(duì)象，IL-5的濃度或產(chǎn)生IL-5的細(xì)胞的數(shù)量降低至少10%。本發(fā)明的另ー個(gè)目的涉及ー種在常規(guī)免疫化哺乳動(dòng)物對(duì)象中放大或Thl定向針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在所述胃腸外免疫化對(duì)象的皮膚上施用對(duì)病原體特異性的抗原(未加佐劑下)。本發(fā)明的另ー個(gè)目的涉及ー種在常規(guī)免疫化哺乳動(dòng)物對(duì)象中放大和Thl定向針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在所述胃腸外免疫化對(duì)象的未預(yù)處理皮膚上施用對(duì)于丙酮特異性的抗原(未添加佐劑下)。給出以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明的目的而不是用于限制的目的。實(shí)施例
_4] 實(shí)施例1:通過(guò)皮膚加強(qiáng)的放大和THl-定向材料和方法動(dòng)物成年BALB/c小鼠購(gòu)自Charles River Laboratories (法國(guó))。所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)歐盟動(dòng)物護(hù)理規(guī)定進(jìn)行。杭原乙肝病毒的表面抗原，即HBsAg。皮膚裝置如在WO 2007/122226中描述的Viaskin甘裝置。該裝置是封閉性的且靜電的?？乖ㄟ^(guò)靜電力以干且未加佐劑形式保持在背襯載體的表面上。特異性I成、I甙1、I甙2a的定量血樣在免疫療法之前和期間從眶后靜脈叢收集并且血漿儲(chǔ)存在-30° C直至進(jìn)ー步分析。定量ELISA，使用ICH指南確認(rèn)的，被用于特異性IgGl和IgG2a。簡(jiǎn)言之，微滴定板用濃度為2 u g/ml的HBsAg涂覆。每孔分配每種血清的100 U I系列稀釋液并在4° C孵育24h。用過(guò)氧化酶標(biāo)記的杭-小鼠IgGl或IgG2a抗體用作示蹤劑。試劑(TMB)用作酶底物。稀釋曲線描圖并且血清的滴定在相同坐標(biāo)(y軸)確定。細(xì)朐因子產(chǎn)牛在最后一次采血樣后，通過(guò)脊骨位錯(cuò)殺死小鼠并且在無(wú)菌條件下收獲脾。ELISA 定量在24-孔微滴定板中在HBsAg (0 - 50 u g.mF1)存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(2.1O6個(gè)細(xì)胞/孔)。在體外刺激72h之后，收獲上清并利用CytoSetTM試劑盒(BioSource InternationalEurope, Belgium)根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-5和IFN y的定量。ELISpot根據(jù)制造商(BD, USA)的推薦，在ELISpot微滴定板(R&D system, USA)中在HBsAg (0-50 ug.mr1)存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在體外刺激48h后測(cè)定IL-5和IFN Y的定量。方皇 啟動(dòng):成年BALB/C小鼠(7個(gè)中的2組)用2mg HBsAg/10 u g AlOH常規(guī)地免疫化。 啟動(dòng)后第28天-血清收集-第1 組 “HBsAg/Alum”:用 2mg HBsAg/10 u g AlOH 加強(qiáng)-第2 組“ Viaskin /HBsAgpatches”:用加載了 IOOmg HBsAg 的Viaskin 加強(qiáng)。在施用后48小時(shí)除去Viaskin - 在啟動(dòng)后弟49天(在后加強(qiáng)I后21天) 血清收集 第I組:沒(méi)有加強(qiáng) 第2組:用加載有IOOmg HBsAg的Viaskin 加強(qiáng)用于加強(qiáng)I和2的斑貼用2種不同方法制備:對(duì)于加強(qiáng)1，通過(guò)凍干制備斑貼，而對(duì)于加強(qiáng)2，通過(guò)干燥制備斑貼。然而，在兩種制劑中，將抗原作為粉末加載在這些斑貼上。 在啟動(dòng)后弟63天(在后加強(qiáng)II后14天) 血清收集取脾用于T細(xì)胞應(yīng)答的分析 抗體定量:血清抗-HBsAg抗體(IgGl和IgG2a)在第0、28、49和63天試用抗原涂覆板通過(guò)ELISA定量。
T細(xì)胞應(yīng)答:體表外:-在加入布雷菲德菌素a(Brefeldin A) /莫能菌素(monensin)之前,脾細(xì)胞在有或沒(méi)有HBsAg(5mg/ml)下培養(yǎng)I小吋，以阻斷細(xì)胞因子分泌。-在再培養(yǎng)6小時(shí)后，下?lián)苡冕槍?duì)表面分子的抗體染色，然后在用針對(duì)IL-5、IL-2、IFN-的抗體染色之前固定和可滲透化處理。- (未示出):在任何實(shí)驗(yàn)組(除了在促分裂原刺激的對(duì)照脾細(xì)胞)中沒(méi)有檢測(cè)到高于背景的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞。在體外再刺激之后:-在分析之前脾細(xì)胞在有或沒(méi)有抗原(5mg/ml和20mg/ml)下培養(yǎng)72小吋。
IL-5和IFN-g產(chǎn)生脾細(xì)胞在有或沒(méi)有HbsAg下培養(yǎng)48小時(shí)后通過(guò)ELISpot定量。 在有或沒(méi)有HBsAg下培養(yǎng)72小時(shí)后通過(guò)ELISA確定培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子分泌。
統(tǒng)計(jì)分析將Graph Pad軟件(San Diego, USA)用于統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)比較處理小鼠與對(duì)照時(shí)利用方差分析(ANOVA)和Dunnett試驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)，或者當(dāng)將所有組彼此進(jìn)行比較時(shí)利用ANOVA和Tukey試驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)。A.結(jié)果本發(fā)明的表皮加強(qiáng)對(duì)抗-HBsAg IrGI應(yīng)答的影響(圖1)呈現(xiàn)的結(jié)果表明，IgGl通過(guò)第一次皮膚貼施用顯著加強(qiáng)(參見(jiàn)圖1，D49和D28的比較)。本發(fā)明的表皮加強(qiáng)對(duì)抗-HBsAg IgG2a應(yīng)答的影響(圖2)呈現(xiàn)的結(jié)果表明，IgG2a通過(guò)第一次皮膚貼施用的顯著加強(qiáng)參見(jiàn)圖1，D49和D28的比較)。 用本發(fā)明的表皮加強(qiáng)或HBsAg/A10H (ELISpot)兩次加強(qiáng)的小鼠中的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞(圖3) 圖3呈現(xiàn)的結(jié)果表明，在用Viaskin敗:或具有佐劑的肌肉內(nèi)注射加強(qiáng)的小鼠中，IFN--產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量類似，而IL-5產(chǎn)生細(xì)胞在用Viaskin 加強(qiáng)的小鼠中更少。因此，盡管用HBsAg/AlOH進(jìn)行了 Th2-誘導(dǎo)啟動(dòng)，但是Viaskin 加強(qiáng)引發(fā)了平衡的Thl/Th2應(yīng)答，與HBsAg/AlOH (通過(guò)肌肉內(nèi)注射)的優(yōu)先Th2應(yīng)答形成對(duì)照。用本發(fā)明的表皮加強(qiáng)或HBsAg/A10H (ELISA)兩次加強(qiáng)的小鼠中的細(xì)胞因子分泌(圖4)在72h，相比于用HBsAg/AlOH (通過(guò)肌肉內(nèi)注射)，在來(lái)自用Viaskin加強(qiáng)的小鼠的T細(xì)胞的上清中，IFN-以顯著更高的濃度存在并且IL-5以顯著更低的濃度存在。在用本發(fā)明的表皮加強(qiáng)或HBsAg/A10H ^LISA-ELISpot細(xì)節(jié))兩次加強(qiáng)的小鼠中的IL-5應(yīng)答 在72h,相比于首次試驗(yàn)小鼠,在用Viaskin 加強(qiáng)的小鼠中,IL-5以更高濃度存在。 在72h，相比于用HBsAg/AlOH,在用Viaskin 加強(qiáng)的小鼠中，IL-5以顯著更低濃
度存在。 觀察到相同分布，與再刺激條件無(wú)關(guān)(在體外通過(guò)體外ELISpot的用ELISA定量)。在用本發(fā)明的表皮加強(qiáng)或HBsAg/A10H ^LISA, ELISpot細(xì)節(jié))兩次加強(qiáng)的小鼠中的IFN-g應(yīng)答 來(lái)自免疫小鼠的脾細(xì)胞自發(fā)地釋放IFN-g，并且這種釋放在用Viaskin:: 加強(qiáng)的小鼠中更高。 如果這種自發(fā)釋放減少: IFN-在用HBsAg/AlOH加強(qiáng)的小鼠中比在首次試驗(yàn)小鼠中在顯著更高濃度下沒(méi)有被檢測(cè)到。
IFN-在用Viaskin 加強(qiáng)的小鼠中比在首次試驗(yàn)小鼠中在顯著更高濃度下被檢測(cè)到。B.結(jié)論
本發(fā)明的皮膚加強(qiáng)顯著增加用HBsAg/AlOH常規(guī)啟動(dòng)的小鼠中的抗-HBsAg IgGl和IgG2a應(yīng)答。IgGl和IgG2a水平類似于通過(guò)常規(guī)加強(qiáng)(用佐劑的肌肉內(nèi)注射)獲得的那些。皮膚加強(qiáng)增加IFN-并減少I(mǎi)L-5抗-HBsAg應(yīng)答。這些結(jié)果證實(shí)，在體內(nèi)，Th2_type應(yīng)答的成功放大和Thl再極化通過(guò)常規(guī)HBsAg/ALOH啟動(dòng)引發(fā)。實(shí)施例2:皮膚預(yù)處理對(duì)免疫應(yīng)答類型的影響A.材料和方法BALB/c小鼠用灌胃法對(duì)于作為佐劑的霍亂毒素混合的花生蛋白提取物(PPE)敏化達(dá)6周(一周一次)。然后，免疫療法進(jìn)行連續(xù)8周。10只敏化小鼠在完整皮膚上表皮地處理。10只小鼠在通過(guò)10次膠帶剝離預(yù)處理的皮膚上表皮地處理。膠帶剝離包括用粘合劑的10次剝離，這導(dǎo)致角質(zhì)層完整性的顯著變化。10只敏化小鼠沒(méi)有進(jìn)行處理。10只首次試驗(yàn)小鼠用作對(duì)照。在免疫療法結(jié)束時(shí)，所有的小鼠暴露于10-天持續(xù)的口服花生方案。在犧牲后，切片通過(guò)組織學(xué)分析在食道和空腸中進(jìn)行評(píng)價(jià)。Thl、Th2和Treg細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)通過(guò)TR-qPCR測(cè)量。血清學(xué)應(yīng)答(特異性IgE、IgGl和IgG2a)的測(cè)量在免疫療法之前和結(jié)束時(shí)通過(guò)ELISA完成。B.結(jié)果在完整皮膚上的表皮處理之后，SlgE降低和sIgG2a增加分別為0.036±0.0lvs
0.231 ±0.02 μ g/ml (EPIT vs Sham, ρ〈0.05)和 2.86±0.78vsl.06±0.28 μ g/ml (ρ〈0.05)。相反，在膠帶剝離皮膚上的免疫療法后，SlgE增加并且sIgG2a沒(méi)有改變，分別為
0.383 ± 0.08 μ g/ml (ρ〈0.0lvs Sham) and 1.252 ±0.22 μ g/ml (參見(jiàn)圖 7A 和 7B)。這些結(jié)果還表明，食管粘液中的嗜酸細(xì)胞濃度在Sham和剝離皮膚處理小鼠中(19.9±1.5和26.7±8.7)顯著高于完整皮膚上處理的小鼠中(2.7±0.9) (p<0.01和p<0.05)和首次試驗(yàn)小鼠中(1.1±0.7細(xì)胞/mm2) (p<0.01)(參見(jiàn)圖8)。此外，相比于Sham(2.57，2.60，2.50，ρ〈0.05)和剝皮處理(2.02，1.95，2.01，ρ〈0.05)，eotaxin (嗜酸細(xì)胞活化趨化因子)、IL-5和IL-13mRNA表達(dá)通過(guò)在完整皮膚上的表皮處理顯著降低(分別為
1.14，1.35，1.02)(參見(jiàn)圖 9A、B 和 C)。有意義的是，相比于Sham組(p〈0.05)，作為T(mén)h2轉(zhuǎn)錄因子的GATA_3mRNA在完整皮膚上處理的小鼠中顯著降低，如圖1OA所示。而且，相比于Sham(p>0.05)和剝皮(p〈0.001)，F(xiàn)oxp3 (一種Treg轉(zhuǎn)錄因子)在完整皮膚上處理的小鼠中顯著增加(參見(jiàn)圖10B)。最后，如圖11所示，十二指腸絨毛/隱窩-比值在Sham (2.1 ±0.2)和剝離處理小鼠(2.4±0.3)中比在完整皮膚處理(2.9±0.2) (p〈0.05)和首次試驗(yàn)(3.3±0.1)小鼠顯著降低(P〈0.001 和 ρ〈0.05)。C.討論 獲得的結(jié)果表明，在表皮免疫療法中，引發(fā)的免疫學(xué)應(yīng)答的外形取決于角質(zhì)層的完整性水平:在完整皮膚上，誘導(dǎo)了 IgE的減少/IgG2a的增加。
在具有變化的角質(zhì)層的處理皮膚上:誘導(dǎo)了 IgE/無(wú)IgG2a的增加。而且，在花生排他飲食之后:僅在剝離皮膚上處理的小鼠觀察到嗜酸細(xì)胞的高滲入。結(jié)論這些結(jié)果表明，利用封閉性裝置施用的使用未加佐劑的抗原加強(qiáng)，通過(guò)表皮療法可以獲得和擴(kuò)大有效的免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原施用于完整皮膚上時(shí)，所述加強(qiáng)引起Thl定向和特別強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
_6] 參考文獻(xiàn)Glenn, Scharton-Kersten et al.1999，"Advances in vaccine delivery:transcutaneousimmunisation."Expert Opin Investig Drugs8 (6):797-805;Kaiserlian and Etchart 1999^Epicutaneous and transcutaneousimmunization using DNA orproteins.〃Eur J Dermatol 9(3):169-76;Partidosj Beignon et al.2003, ^Delivering vaccines into the skinwithout needles andsyringes."Expert Rev Vaccines 2(6):753-61;"Immunity underthe skin:potential application fortopical delivery of vaccines."Vaccine21 (7-8):776-80).
Shiver, JW et al.,2002, Replication-1ncompetent adenoviral vaccinevector elicits effeetiveant1-1mmunodeficiency-virus immunity.”Nature415:331-335.
Woodland DL et al.，2004，“Jump-starting the immune system:prime_boosting com es ofage.，，Trends Immunol.25:98-104.
Wuj L et al.，2005，“Enhanced breadth of CD4 T-cell immunity by DNA primeandadenovirus boost immunization to human immunodeficiency virus Env and Gagimmunogens.” JVirol 79:8024-8031.
McConnell et al.，2007，uAdenovirus-based prime-boost immunization forrapid Vaccinationagainst Anthrax.》Molecular Therapy 15:203-210。
權(quán)利要求
1.一種用于放大哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)所述病原體的先存免疫應(yīng)答的對(duì)傳染性病原體特異性的抗原制劑，其中所述抗原制劑是未加佐劑的并且施用于所述對(duì)象的完整皮膚，并且其中所述放大的免疫應(yīng)答是Thl-定向的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述抗原制劑是干的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述抗原制劑施用于具有基本上未改變的角質(zhì)層的皮膚的區(qū)域上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述先存免疫性由所述對(duì)象之前針對(duì)所述病原體的胃腸外、經(jīng)ロ或經(jīng)鼻疫苗接種產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述先存免疫性由所述對(duì)象之前針對(duì)所述病原體的胃腸外、經(jīng)ロ或經(jīng)鼻免疫啟動(dòng)產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述先存免疫性由所述對(duì)象之前自然暴露于所述抗原產(chǎn)生。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述抗原制劑利用封閉性斑貼裝置施用于所述對(duì)象的皮膚上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗原制劑，其中所述封閉性斑貼裝置包括載體，其中所述抗原在沒(méi)有添加粘合劑下優(yōu)選地通過(guò)靜電カ或范德華力結(jié)合至所述載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述抗原作為1、2或3個(gè)抗原皮膚加強(qiáng)給予所述對(duì)象。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用 于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其包括第一抗原皮膚加強(qiáng)，優(yōu)選地在啟動(dòng)或暴露于所述抗原之后2-8周，可選的第二抗原皮膚加強(qiáng)，優(yōu)選地在所述第一加強(qiáng)之后的1-12個(gè)月，以及可選的第三抗原皮膚加強(qiáng)，優(yōu)選地在所述第二加強(qiáng)之后的1-12個(gè)月。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗原制劑，其中相同抗原用于皮膚加強(qiáng)和之前的啟動(dòng)或疫苗接種。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的用于放大先存免疫應(yīng)答的抗原制劑，其中所述傳染性病原體是病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或真菌。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗原制劑，其中所述抗原是病毒或細(xì)菌表面抗原。
14.一種用于加強(qiáng)針對(duì)所述病原體預(yù)先免疫化的哺乳動(dòng)物對(duì)象中的免疫應(yīng)答的對(duì)傳染性病原體特異性的抗原制劑，所述抗原制劑在允許放大和Thl定向所述免疫應(yīng)答的條件下以干的形式施用于所述對(duì)象的完整皮膚上。
15.一種對(duì)傳染性病原體特異性的抗原制劑，用于在哺乳動(dòng)物對(duì)象中誘導(dǎo)或刺激病原體特異性的Thl-定向的免疫應(yīng)答的方法中使用，所述方法包括: -向所述哺乳動(dòng)物胃腸外、經(jīng)ロ或經(jīng)鼻給予對(duì)所述病原體特異性的抗原以引起或刺激針對(duì)所述病原體的免疫應(yīng)答，和 -隨后在所述哺乳動(dòng)物的完整皮膚上施用對(duì)所述病原體特異性的抗原，允許放大Thl-定向的免疫應(yīng)答。
16.一種組合物，包含:-對(duì)所選傳染性病原體特異性的抗原的注射制劑；和 -適于給藥至皮膚的、對(duì)所述所選病原體特異性的抗原的干的未加佐劑的制劑， 用于單獨(dú)、依次施用于哺乳動(dòng)物對(duì)象。
17.一種試劑盒，包括: -對(duì)所選傳染性病原體特異性的抗原的注射制劑；和 -適于給藥至皮膚的、對(duì)所述所選病原體特異性的抗原的干的未加佐劑的制劑。
18.一種放大哺乳動(dòng)物對(duì)象中針對(duì)傳染性病原體的先存免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括將對(duì)所述病原體特異性的抗原的未加佐劑的制劑施用于所述對(duì)象的皮膚。
19.一種加強(qiáng)針對(duì)傳染性病原體預(yù)先免疫化的哺乳動(dòng)物對(duì)象中的免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括將對(duì)所述病原體特異性的抗原制劑在允許放大和Thl定向所述免疫應(yīng)答的條件下施用于所述對(duì)象的皮 膚上。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對(duì)象的疫苗接種的改進(jìn)方法。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了使用皮膚抗原施用以放大和提高對(duì)象中的針對(duì)所選病原體的先存免疫。本發(fā)明公開(kāi)了使用皮膚施用聯(lián)合常規(guī)疫苗接種或啟動(dòng)用于對(duì)象針對(duì)所選病原體的提高免疫化或疫苗接種。
文檔編號(hào)A61K39/29GK103096919SQ201180027846
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者克萊爾安妮·西格里斯特, 露西·蒙杜萊 申請(qǐng)人:Dbv技術(shù)公司