專利名稱：用于治療和預(yù)防腸道細(xì)菌感染的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胃腸道紊亂的治療或預(yù)防，涉及包含有胃腸道病原體抗原的疫苗，涉及從注射所述疫苗的動物(包括家畜和家禽)的血液、乳汁和禽蛋中獲得的免疫物質(zhì)及其制備方法。具體地，本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防胃腸道紊亂的化合物和組合物，例如由諸如腸毒性大腸桿菌(E.coli)的革蘭氏陰性菌引起的腹瀉，本發(fā)明還涉及腹瀉的治療或預(yù)防方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明可以用于治療和預(yù)防由一系列微生物所引起的胃腸道疾病，這些微生物包括大腸桿菌(E. coli)、沙門氏菌(Salmonella)、彎曲狀桿菌(Campylobacter)、螺旋桿菌(Helicobacter)、弧菌(霍亂菌，Vibrio)、志賀氏菌(Shigelia)、耶爾森鼠疫桿菌(Yersinia)和氣單胞菌(Aeromonas)。然而,為了公開起見,本發(fā)明將以其針對人體內(nèi)腸毒性大腸桿菌(ETEC)的應(yīng)用為例進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍并不限于這ー個(gè)特定的應(yīng)用。腸毒性大腸桿菌(ETEC)引起的腹瀉會給成人帶來極大的不適，并能導(dǎo)致未成年人和老年人的脫水死亡。很大一部分前往墨西哥、非洲和東南亞的旅游者所遭受的腹瀉就是由ETEC引起的。對于旅游者腹瀉，常用的治療方法是預(yù)防性抗生素治療，例如用阿莫西林治療。然而，抗生素耐藥性降低了抗生素治療的效果，便秘或腹瀉等副作用是常有的。癥狀性治療用于治療嘔吐和腹瀉，例如用鹽酸洛哌丁胺、硫酸阿托品和鹽酸地芬諾酷。然而洛哌丁胺和阿托品的使用不當(dāng)會導(dǎo)致嚴(yán)重的便秘，而地芬諾酯的使用不當(dāng)會導(dǎo)致依賴性。這些藥劑對于孩子們來說也是不適用的。進(jìn)ー步的治療包括使用等滲壓飲料的流體替代治療。然而，流體替代治療幾乎不能減輕病情，并且不會減少臨床腹瀉。進(jìn)ー步的癥狀治療和流體治療能夠治療癥狀，但不能根除病因。乳汁和禽蛋制品在減輕胃腸道紊亂疾病的癥狀中顯示出潛在的治療和預(yù)防作用。Peterson和Campbell在美國專利US 3，376，198中介紹了免疫產(chǎn)乳汁的蹄類動物以生產(chǎn)抗細(xì)菌和病毒的抗體或“保護(hù)性成分”。Carlendar等在BioDrugs, 2002,16 (6) :433-7中介紹了源于雞蛋黃的抗體在減少胃腸道開ロ部分(口腔)中巴斯德氏細(xì)菌中的應(yīng)用。Shimamoto 等在 Hepatogastroenterology, 2002,49 (45) :709-714 中介紹了雞蛋中產(chǎn)生的抗幽門螺旋桿菌的特異性抗體在減少胃病患者體內(nèi)幽門螺旋桿菌數(shù)量中的應(yīng)用。
Linggood等在美國專利US 4，971，794中介紹了高免疫牛初乳作為抗大腸桿菌的抗體源的用途。母牛用混合菌株的菌毛制品進(jìn)行疫苗接種。該專利介紹該疫苗必須包含表達(dá)Type I菌毛、CFA I菌毛、CFA 2菌毛和K88菌毛的多種大腸桿菌菌株的抗原。K88菌毛與豬的ETEC有夫。Hastings在美國專利US 5,017, 372中介紹了蹄類動物的高免疫初乳作為大腸桿菌抗體源的用途。蹄類動物的疫苗用下述方法制造不同類型的大腸桿菌在一定條件下生長得到CFA I或CFA 2，或者兩者同時(shí)得到。然后細(xì)菌用超聲波裂解以釋放出這些抗原，并加熱不穩(wěn)定的毒素。Freedman 等在 The Journal of Infection Diseases 1998,177 :662-7 中介紹了高免疫初乳作為抗大腸桿菌的抗體源的用途。疫苗的制備是讓細(xì)菌菌株在肉湯培養(yǎng)基中生長以優(yōu)化CFA的表達(dá)，然后使用沉降法及隨后的排阻色譜法或離子交換色譜法純化CFA。Teckett 等在 The New England Journal of Medicine,1988,5,12. ppl240_1243中描述了在牛的疫苗中引入多種失活(用甲醛或戊ニ醛處理)的細(xì)菌完整細(xì)胞懸液。所 述完整細(xì)胞懸液包含 O 型血清組06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148, 0153和0159的大腸桿菌以及熱不穩(wěn)定的腸毒素、霍亂毒素、CFAl和大腸桿菌表面抗原 3。大腸桿菌的 O 型抗原如 06，08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159是熱穩(wěn)定的抗原，位于細(xì)菌的細(xì)胞壁上而不是諸如菌毛(纖毛)或鞭毛的突出結(jié)構(gòu)上。這些O型抗原由與通常為大多數(shù)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁材料的核脂多糖復(fù)合物相連接的多糖的一部分所組成。由于O型抗原與細(xì)胞壁之間的緊密聯(lián)系，基于O型抗原的疫苗可以由細(xì)胞壁或完整的失活細(xì)菌制得。脂多糖內(nèi)毒素是細(xì)菌細(xì)胞外壁的一個(gè)常規(guī)部分，它們的毒性區(qū)域包埋在細(xì)胞壁中(參見Endotoxins in Health and Disease. 1999,第12章和其他章節(jié))。在常規(guī)的獸醫(yī)實(shí)踐中，使用完整細(xì)胞細(xì)菌抗原優(yōu)于使用単一 O型抗原組分這樣ー個(gè)事實(shí)的深層原因在于O型抗原是內(nèi)毒素一就動物福利和產(chǎn)量而言，在孕期牲畜身上使用高濃度內(nèi)毒素在實(shí)踐中被認(rèn)為是有問題的?，F(xiàn)有技術(shù)中使用乳制品和蛋制品預(yù)防胃腸道紊亂癥狀存在諸多問題?；魜y毒素(參見Teckett等，1988)很可能由于他們的高毒性而難以注冊。此外，熱不穩(wěn)定性毒素，盡管有很高的免疫性也難以獲得保護(hù)。上述方法生產(chǎn)得到的抗體的保護(hù)范圍難以令人滿意。一個(gè)附帶的問題是要產(chǎn)生令人滿意的預(yù)防效果需要大量的免疫濃縮物。當(dāng)使用完整細(xì)胞抗原時(shí)，會產(chǎn)生許多不同類型的抗體反應(yīng)，并且抗體滴定度的化驗(yàn)難以標(biāo)定。一個(gè)關(guān)鍵的問題是特定檢測的抗體是否有保護(hù)性。完整細(xì)菌細(xì)胞有許多未必與保護(hù)性有關(guān)的抗原。另外，包含革蘭氏陰性菌的疫苗極有可能產(chǎn)生不利的疫苗反應(yīng)，從而表現(xiàn)出由于不利的動物倫理報(bào)告和治療物品的不利反應(yīng)報(bào)告所帯來的調(diào)節(jié)問題。不利的疫苗反應(yīng)很可能會使牛奶廠的農(nóng)場主停止參與任何生產(chǎn)牛奶抗體的冒險(xiǎn)。這里對于本發(fā)明背景的討論用于解釋本發(fā)明內(nèi)容。這不應(yīng)認(rèn)為是承認(rèn)任何相關(guān)的物質(zhì)是公開、公知的，或者是任何國家的普通常識部分。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過對動物體或人體施以ー種疫苗或抗所述疫苗產(chǎn)生的高免疫物質(zhì)可以改善對革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的治療或預(yù)防。其中所述疫苗的特征在于該疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。因此，本發(fā)明一方面提供了一種治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的方法，該方法包括向一個(gè)個(gè)體施以ー種疫苗或者一種抗所述疫苗產(chǎn)生的高免疫物質(zhì)的步驟，其中所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。另ー方面，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的組合物,該組合物含有通過用ー種疫苗免疫宿主動物而制得的高免疫物質(zhì),所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。另ー方面，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防諸如ETEC的產(chǎn)腸毒素的革蘭氏陰性菌引起的胃腸道功能障礙的高免疫物質(zhì)的制備方法，所述高免疫物質(zhì)是抗ー種疫苗而產(chǎn) 生的，所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。另ー方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞壁抗原用于制備治療或預(yù)防諸如大腸桿菌(ETEC)的革蘭氏陰性菌引起的胃腸道疾病的高免疫物質(zhì)的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞壁抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特性，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。另ー方面，本發(fā)明提供了一種制備治療或預(yù)防動物胃腸道疾病的免疫球蛋白的方法，包括用一種疫苗免疫宿主動物，所述疫苗包含ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的，從而誘導(dǎo)宿主動物產(chǎn)生含有所述免疫球蛋白的高免疫物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的高免疫物質(zhì)可以是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黃或高免疫蛋黃提取物。所述細(xì)胞壁抗原中的至少一部分是指從完整細(xì)菌細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁碎片中分離得到的，在離心除去完整細(xì)胞或者固形細(xì)胞碎片后，至少10%的所述抗原能夠在上清液中被檢測到，該離心步驟應(yīng)當(dāng)在下述條件下進(jìn)行a)所述抗原未形成微團(tuán)或其他聚集結(jié)構(gòu)，b)沒有危及細(xì)胞壁的完整性。優(yōu)選的，至少20%的所述抗原能夠在上清液中被檢測到，更優(yōu)選的是至少30%的所述抗原能夠被檢測到。所述抗原優(yōu)選的主要從完整細(xì)菌細(xì)胞壁中分離得到。另ー個(gè)用于確定細(xì)胞壁抗原是獨(dú)立的還是從完整細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片中分離的方法如下所述1)通過使用劇烈的條件使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)降解并釋放出O型抗原，對含有O型抗原和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的水溶液進(jìn)行分析，以確定每毫升中O型抗原的總含量；2)通過培養(yǎng)基培養(yǎng)，革蘭氏陰性菌達(dá)到特定濃度，使其O型抗原含量與步驟I確定的O型抗原含量相等；3)測量每毫升步驟2的細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞壁的含量(數(shù)量)。所述細(xì)胞壁含量自然包含步驟I中測得的O型抗原的水平；4)比較步驟3中細(xì)胞壁的含量以及初始溶液中細(xì)胞壁的含量。如果相等，則可以推斷初始溶液中所有O型抗原都是與細(xì)胞壁相結(jié)合的。但是，如果初始溶液中細(xì)胞壁的含量低于步驟3中細(xì)胞壁的含量，則初始溶液中所含的O型抗原的含量大于細(xì)胞壁中預(yù)期的O型抗原的含量，因此一部分O型抗原是與細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片相分離的。如果步驟3中革蘭氏陰性細(xì)胞壁物質(zhì)(每毫升)的重量為W，那么每毫升初始溶液中革蘭氏陰性細(xì)胞壁物質(zhì)的重量優(yōu)選的是低于O. 8W，較優(yōu)選的是低于O. 3W，更優(yōu)選的是低于O. 1W。水相中脂多糖相關(guān)抗原(O型抗原)的量可以用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行測定，這些方法例如加熱、蛋白酶K消化以及在苯酹存在下進(jìn)ー步加熱(見實(shí)施例11)。Lyngby等描述了其他測定脂多糖相關(guān)抗原的方法。一個(gè)簡單的標(biāo)定脂多糖相關(guān)抗原的方法是與每毫升含有特定量的革蘭氏陰性菌或每毫升含有特定量的革蘭氏陰性細(xì)胞壁物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物相比較。較為有利的是與每毫升含有IO4UO6或108、或者更多微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物相比較。對于水相中革蘭氏陰性細(xì)胞壁物質(zhì)(完整細(xì)胞壁或碎片)的量的測定可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于特定細(xì)胞壁的標(biāo)準(zhǔn)物來分析。例如肽聚糖是與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁相關(guān)聯(lián)的，肽聚糖的分析方法Li等已作了描述。


圖I顯示了由水相制備的LPS分析的銀染SDS-PAGE凝膠圖譜。SDS-PAGE凝膠顯示苯酚預(yù)處理前后的樣品。處理后凝膠呈現(xiàn)出典型的LPS梯度。作為對照的左邊的條帶是煮沸后的細(xì)菌溶菌液。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的下述詳細(xì)描述中，發(fā)明人主要針對從適當(dāng)?shù)拿庖吣概＋@得的高免疫初乳和高免疫初乳提取物的生產(chǎn)及應(yīng)用進(jìn)行描述。但是，本發(fā)明的范圍不應(yīng)局限于此，應(yīng)當(dāng)理解，本方法同樣適用于高免疫雞蛋黃和高免疫雞蛋黃提取物的生產(chǎn)。高免疫初乳的制備方法通常包括以ー種疫苗免疫宿主動物，典型的是蹄類動物，所述疫苗含有O組血清型細(xì)胞壁抗原，其中至少一部分是從完整細(xì)胞壁分離得到。所述疫苗用于在宿主動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫球蛋白的產(chǎn)生，再從宿主的乳汁中獲取免疫球蛋白。高免疫初乳可以用于治療或預(yù)防動物、包括人和非人動物的胃腸道功能紊亂。初乳在人類包括成人和嬰幼兒的治療或預(yù)防中尤其有用。初乳還可以用于非人類動物比如小豬的治療或預(yù)防。源自以細(xì)胞壁抗原疫苗免疫的宿主動物的高免疫初乳可以直接以乳汁的形式服用，同樣的，含有高免疫初乳的乳汁也可以用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法進(jìn)行處理，以富集或分離免疫球蛋白。這些產(chǎn)品可以是全脂奶、脫脂奶或乳清蛋白質(zhì)。高免疫初乳衍的產(chǎn)品可以制成食品添加剤、水溶液、油類制品、乳液、凝膠等等，這些制品可以通過ロ服、局部、直腸、鼻吸、口腔、陰道給藥。所述制品的藥劑處方可以含有傳統(tǒng)的無毒的可接受的載體，并且還可以含有ー種或多種可接受的添加劑，包括可接受的鹽、聚合物、溶剤、緩沖劑、賦形劑、膨脹劑、稀釋劑、賦形劑、懸浮劑、潤滑剤、佐劑、載色劑、釋藥系統(tǒng)、乳化剤、崩解劑、吸收劑、防腐剤、表面活性剤、色素、香味劑或甜味劑。本發(fā)明優(yōu)選的劑型是加入飲料中的粉劑、丸剤、糖漿、膠囊、片劑、顆粒、滴丸、可咀嚼的藥錠或食品添加齊U，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。
如果上述組合物以片劑給藥，則所述片劑可以由活性成分和ー種或多種任意的附加成分通過壓制或者模制制成。壓制片劑可以使用合適的機(jī)器壓制而成，活性成分處于自由流動的形式，例如粉末或顆粒狀，可以選擇與粘結(jié)劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑相混合。模制片劑可以采用ー種合適的機(jī)器，將粉狀活性成分和適當(dāng)?shù)妮d體的混合物用惰性液體稀釋劑潤濕后模制。 O型抗原可以采用有效量的剪切、勻漿、加熱或者它們的有效結(jié)合從細(xì)菌細(xì)胞壁中分離。用于分離的優(yōu)選條件可以通過進(jìn)行以下試驗(yàn)來確定將完整細(xì)胞懸液進(jìn)行有利于分離的處理后離心，移去完整細(xì)胞和固形細(xì)胞碎片。收集無細(xì)胞的液相產(chǎn)物，根據(jù)下列方式上凝膠A)無細(xì)胞液體中LPS的分析在前述得到的液體樣品中加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)苯酚溶液，在65°C水浴中旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)15min,姆隔5min旋轉(zhuǎn)振蕩一次以使液體中蛋白質(zhì)變性。在4°C下離心lOmin，回收水相至ー個(gè)新的試管中。將I體積的3X的Laemmli緩沖液加入到2倍體積的樣品中，在15%的SDS-PAGE凝膠上分離。B) LPS 的銀染下述步驟優(yōu)選的用于LPS的染色(Hitchook和Brown, 1983)(i)在200ml含有25% (v/v)異丙醇的7% (v/v)醋酸溶液中定色過夜；(ii)于150ml蒸懼水中以I. 05g高碘酸和4mI含有25% (v/v)異丙醇的7% (v/V)醋酸溶液(使用前臨時(shí)配制)氧化5min ；(iii)用200ml的蒸懼水洗漆30min,共洗漆8次；(iv)在組成為 O. IM NaOH(28ml)，濃縮(29. 4% )氨水，20% (w/v)的硝酸銀(5ml)以及蒸餾水(115ml)的溶液(使用前臨時(shí)配制并不斷攪拌)中銀染IOmin ；(V)用200ml的蒸餾水洗滌lOmin，共洗滌4次；(vi)在250ml顯影液(梓檬酸[50mg]、37%的甲醒[O. 5ml]，蒸懼水[カロ至I升])中顯影5 IOmin,溶液使用前臨時(shí)配制并最好在26°C下操作以優(yōu)化LPS的染色；(vii)浸入終止液(200ml蒸懼水中加入IOml的7% [v/v]醋酸溶液)中Ihr ;(viii)在5%甘油中保存凝膠，并在纖維素膜間干燥。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，O型抗原從細(xì)菌細(xì)胞壁的分離是通過攪拌液體，例如，通過可以使用勻漿器，特別是安有一個(gè)轉(zhuǎn)子和一個(gè)定子的勻漿器。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)子外圍速率(m/s)與轉(zhuǎn)子-定子間隙(mm)的比值范圍為O. 2 20，優(yōu)選的為O. 4 12，更優(yōu)選的為O. 8 6，最選的為I 4?？梢允褂闷渌麆驖{器，只要它們的最大剪切范圍內(nèi)的剪切值與上述轉(zhuǎn)子-定子間隙的剪切值相似。在一個(gè)優(yōu)選的例子中，所述O型抗原從細(xì)胞壁的分離是通過在40 80°C的范圍內(nèi)進(jìn)行加熱處理，優(yōu)選的是在50 70°C的范圍內(nèi)。處理的時(shí)間優(yōu)選的為10 200分鐘，更優(yōu)選的是30 60分鐘。優(yōu)選的，所述疫苗還包含菌毛或類菌毛抗原CFA-UCFA-2或其它CFA，或其它工人的CFA，或者是它們的混合物，所述抗原至少一部分是從完整細(xì)菌細(xì)胞壁分離的。這些抗原可以與從細(xì)胞壁上脫落的菌毛有夫。制備所述分離的抗原或菌毛的方法在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，比如Linggood的美國專利US 4，971，794。
優(yōu)選的，從中分離每個(gè)類型的O型抗原的細(xì)菌是在単獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，并且在O型抗原從細(xì)菌分離后，所述抗原成分加在一起組成疫苗的成分。優(yōu)選的，疫苗中血清型O 型抗原選自06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159，以及其它與腸毒性大腸桿菌相關(guān)的血清型O型抗原。最優(yōu)選的，疫苗中血清型O型抗原包含078。含有O型抗原的液體可以含有外來的物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述液體用硫酸銨沉淀外來蛋白質(zhì)以進(jìn)ー步純化，純化時(shí)硫酸銨的濃度從O逐漸增加到20%,并離心除去外來物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述分離的O型抗原被進(jìn)ー步濃縮。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，上述液體中加入20 %的硫酸按后，進(jìn)一步加入硫酸按至終濃度為40 %,并尚心以使O型抗原存在于沉淀中。硫酸銨可以通過重懸和透析除去，例如通過ー種截留尺寸范圍為 1500 10000分子量單位(道爾頓)的薄膜。所述透析物質(zhì)優(yōu)選的組成為O. I 10mg/ml的蛋白質(zhì),更優(yōu)的是O. 3 3mg/ml的蛋白質(zhì)，將其加入到疫苗佐劑中，這些佐劑例如Montanide (銷售商Seppic,法國巴黎)、氫氧化招(購自Sigma化學(xué)公司，St Louis, MO, USA)或QullA(—種由抗原修飾的阜角苷/膽固醇微團(tuán)組成的ISC0M，在美國專利US 6，383，498中有描述)、或其它現(xiàn)有技術(shù)已知的疫苗佐劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，用于制備疫苗乳劑的佐劑為“Montanide ISA 206”，ー種NRA批準(zhǔn)的獸醫(yī)學(xué)的佐劑，由Seppic生產(chǎn)，并由澳大利亞的Tall Bennet供應(yīng)。Montanide ISA 206是ー種免疫促進(jìn)復(fù)合物，包含有含十八烯酸和無水甘露醇的油性溶液。該產(chǎn)品已被開發(fā)用于混合油型疫苗的生產(chǎn)，并且是毒理學(xué)控制的，且純度較高。該佐劑允許制備混合型“油包水包油(w/o/w) ”免疫原/佐劑的乳劑，有效、穩(wěn)定性好、流動性佳且易于注射。這種類型的配方通過水相中快速起效的抗原產(chǎn)生快速的免疫反應(yīng)并通過油相中封閉的抗原產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，I體積獲得的透析物質(zhì)加入到0. 3 3體積的疫苗佐劑中，優(yōu)選的是0. 7 I. 5體積的疫苗佐劑中。蛋白質(zhì)分析的許多方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，例如 Lowrey 蛋白質(zhì)分析法(J. Bio. Chem. 1951，193 :265-275)。接種疫苗導(dǎo)致高免疫初乳的產(chǎn)生，優(yōu)選的是在動物分娩前對動物注射2到8次疫苗，注射量為0.3 15ml。連續(xù)兩次免疫的時(shí)間間隔為I 4周，更好的是2 3周。初乳是從哺乳動物，優(yōu)選的是從蹄類動物，更優(yōu)選的是從奶牛獲得的。美國專利US 5，780，028提供了初乳的生產(chǎn)和加工，在此引作參考。經(jīng)處理的高免疫初乳可以制成片劑、膠囊內(nèi)的粉劑或加入飲料內(nèi)的添加剤，如美國專利US 5，780, 028中所描述。優(yōu)選的，含有高免疫初乳的配方還含有ー種食品級的抗菌劑組分，比如柑橘提取物以及碘基防腐剤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述抗菌劑組分是雙酚羥基苯化合物家族中的葡萄柚種子提取物，美國佛蒙特州Ripton的Nutribiotics公司有售，商品名為Citricidal0優(yōu)選的用于ロ服制劑配方高免疫初乳包含有抗多種抗原的抗體。所述優(yōu)選的高免疫初乳的獲得是通過分離所述抗原加入到兩批或多批疫苗中，并用單ー批次的疫苗免疫兩批或多批家畜，并將從家畜獲得的的初乳混合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,所述疫苗包含大腸桿菌O型抗原,這些抗原選自06,08,09，015，020，025，027，029，030，063，064，078，088，0105，0114，0115，0126，0127，0128，0148，0153，0159。優(yōu)選的，一個(gè)批次的疫苗含有大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，而其他批次的疫苗包含以下抗原06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型O型抗原和CFA2菌毛抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述血清型O型抗原選自06，08，078，0128。

本發(fā)明最廣闊的前景是應(yīng)用于治療和預(yù)防多種微生物引起的胃腸道疾病，特別適合于治療胃腸道毒性大腸桿菌感染，并特別適用于治療和預(yù)防旅游者腹瀉。因此，本發(fā)明的ー個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例涉及ー種上述的方法或應(yīng)用，其中革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，所述方法用于預(yù)防和治療腹瀉。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I、單ー菌株大腸桿菌疫苗的生產(chǎn)本實(shí)施例描述了本發(fā)明的疫苗的制備方法，其中的細(xì)胞壁抗原為078，菌毛抗原為CFA I方法。過程如下第O 天步驟A、菌株的復(fù)壯將被復(fù)壯的菌株是E.coli H10407 (Taurchek等，PNAS USA. 2003,99 :7066-7071)。從培養(yǎng)基冰箱取2個(gè)CFA平板(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)，置于生物安全操作柜。將裝有E.coli H10407的小瓶從液氮罐中取出，放入生物安全操作柜。打開小瓶，用滅菌的接種環(huán)取出少量凍化物，在CFA平板上劃線?！皬?fù)壯平板”于培養(yǎng)箱中在通氣條件下37°C培養(yǎng)過夜。第I 天步驟B、“初始懸液”的接種檢測每個(gè)“復(fù)壯平板”是否染菌，如未染菌則繼續(xù)。操作在生物安全操作柜中進(jìn)行，用滅菌的接種環(huán)從ー個(gè)“復(fù)壯平板”上取出少量菌落，接種到ー個(gè)含有20ml pH 7. 2磷酸緩沖溶液(PBS)的McCartney瓶中。所用的McCartney瓶和PBS均經(jīng)過高壓滅菌。步驟C、“疫苗平板”的接種將50 μ L “初始懸液”接種到每一個(gè)復(fù)合CFA平板上(配制成微生物營養(yǎng)平板以產(chǎn)生CFA)。CFA平板的配制以I %酸解酪素(BD Difco)和O. 15%酵母提取物(Oxoid)加入含有O. 005 ^MgSO4 (無水)和O. 0005% MnCl2 (四水合物)的2%瓊脂中，見Evens等的培養(yǎng)基制備(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)?！耙呙缙桨濉敝糜?7°C培養(yǎng)箱中，通氣條件下培養(yǎng)18 24小時(shí)。第2 天步驟D、“疫苗平板”上用于測試菌毛產(chǎn)量的血凝實(shí)驗(yàn)
進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)(Evens等，InfectImmun. 1977,18 :330-337)。為批次中將被使用的每ー個(gè)菌株測試ー個(gè)“疫苗平板”。如為陽性則繼續(xù)。步驟E、“疫苗平板”的洗滌將“疫苗平板”從培養(yǎng)箱中取出，檢測每個(gè)平板以防止染菌，棄去染菌的平板。操作在生物安全操作柜中進(jìn)行，用I. 5 2. Oml滅菌的O. IM磷酸鈉緩沖溶液(pH7. 2)洗下“疫苗平板”表面的細(xì)菌培養(yǎng)物，加入到滅菌的Schott瓶中。緩沖溶液使用前在冰浴中預(yù)冷。將疊氮鈉加到“疫苗洗液”中使之終濃度為0.05%。在“疫苗洗液”開始勻漿前在冰浴中保持至少30分鐘。步驟F、“疫苗洗液”的計(jì)數(shù)對“疫苗洗液”進(jìn)行計(jì)數(shù)。確保所用物料被充分?jǐn)嚢枰允辜?xì)菌團(tuán)塊分散，并且所選稀釋液與每批制備的洗液中細(xì)菌細(xì)胞的濃度相適應(yīng)。 步驟G、純度取樣收集足夠的物料用于測試每ー個(gè)“疫苗洗液”的純度(即3個(gè)HBA平板，3個(gè)TSA平板和3個(gè)MAC平板)。操作在生物安全操作柜中進(jìn)行，用每ー個(gè)“疫苗洗液”在3個(gè)HBA平板，3個(gè)TSA平板和3個(gè)MAC平板上劃線，用于平板篩選單ー菌落。將這些平板置于37°C培養(yǎng)箱在通氣條件下培養(yǎng)。第3 天步驟H、“純度試驗(yàn)平板”的第一次檢杳對“純度試驗(yàn)平板”進(jìn)行第一次檢查。如平板上僅含有E. coli菌落，則繼續(xù)。步驟I、“疫苗洗液”的勻漿將“疫苗洗液”在勻漿器中，每隔I分鐘勻漿一次，共15分鐘，毎次間隔的I分鐘置于冰浴中冷卻。將“勻漿的疫苗洗液”在高速離心機(jī)中于12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清I)，于4°C下儲藏I 3天。第4天步驟T、“純度試驗(yàn)平板”的第二次檢杳對“純化實(shí)驗(yàn)平板”進(jìn)行第二次檢查。如平板上僅含有E. coli菌落，則繼續(xù)。第6天步驟K、LPS組分的分離將HVW上清I在高速離心機(jī)中于12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清2)。在I個(gè)小時(shí)內(nèi)往HVW上清2中緩慢加入滅菌的飽和硫酸銨溶液至達(dá)到20%的飽和度。加入硫酸銨飽和溶液的過程中，將HVW上清2置于磁力攪拌器上攪拌。加料結(jié)束后讓物料平衡30分鐘。將HVW上清2在高速離心機(jī)中于12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清3)。在I小時(shí)內(nèi)往HVW上清3中慢慢加入滅菌的飽和硫酸銨溶液至達(dá)到40 %的飽和度。加入硫酸銨飽和溶液的過程中，將HVW上清3置于磁力攪拌器上攪拌。加料結(jié)束后讓物料平衡30分鐘。
將HVW上清3在高速離心機(jī)中于12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留沉淀(LPS組分)。將LPS組分用冷的O. 05M pH 7. 2的磷酸鈉緩沖溶液重懸，懸浮比率是每250個(gè)CFA平板IOml緩沖溶液，所述CFA平板用于產(chǎn)生“疫苗洗液”，LPS組分最初就是從“疫苗洗液”獲得。步驟L、LPS纟目分的誘析透析LPS組分，用截留量3500麗的透析膜 在4°C下于250 1000倍體積的O. 05MpH7. 2的磷酸鈉緩沖溶液中透析24 48小時(shí)。透析過程中，每2 8小時(shí)更換緩沖溶液。透析結(jié)束后，將“LPS透析液”置冰浴保藏直至用于蛋白質(zhì)含量分析。第7天步驟M、“LPS透析液”的蛋白質(zhì)含暈分析用Lowry蛋白質(zhì)分析法測量每一“LPS透析液”中的蛋白質(zhì)含量。在分析結(jié)果的基礎(chǔ)上稀釋每一“LPS透析液”，直至O. 05M pH 7. 2的磷酸鈉緩沖溶液中蛋白質(zhì)含量為lmg/ml,然后置于滅菌的Schott瓶中保存。步驟N、疫苗的滅活在每一“LPS透析液”中加入甲醛直至甲醛的終濃度為3%。將“福爾馬林化的LPS透析液”于4°C下保藏3天。第10 天步驟O、無菌檢測部分I通過將O. 5ml“福爾馬林化的LPS透析液”接種入3個(gè)TSB試管肉湯中，對每個(gè)“福爾馬林化的LPS透析液”進(jìn)行基本的無菌檢測?！盁o菌檢測試管”置于37°C培養(yǎng)箱中在通氣條件下培養(yǎng)。第14 天步驟P、無菌檢測部分2檢測“無菌檢測試管”是否生長缺乏。如純生長缺乏則繼續(xù)。(步驟Q)“福爾馬林化菌毛/LPS透析液”的保存將“福爾馬林化的LPS透析液”置于20°C以下以長時(shí)間保存。第14天或以后步驟R、輔佐階段I將“福爾馬林化的LPS透析液”置于水浴中至30°C。同時(shí)將等體積的佐劑(Montanide ISA 206)置于水浴中至 30°C。將佐劑倒入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的大燒杯中(S13)。用有3個(gè)葉片槳的Ika混合器以200rpm的速率攪拌佐劑。在2分鐘內(nèi)逐漸加入“福爾馬林化的LPS透析液”。將轉(zhuǎn)速提高至2000rpm維持10分鐘。于40°C保存24小時(shí)。第15天或以后步驟S、輔佐階段2在上述步驟L后的第一天，將“階段I輔佐的疫苗”置于水浴中至30°C。將加熱后的物料倒入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的大燒杯中(S13)。用有3個(gè)葉片槳的Ika混合器以200rpm的速率攪拌物料2分鐘。將轉(zhuǎn)速提高至2000rpm維持10分鐘。在4°C下保存24小吋。
步驟T、檢測乳化液的質(zhì)暈在步驟M后的第一天，用巴斯德吸管吸取一小份“階段2輔佐的疫苗”。用大約200ml的水裝入250ml的燒杯中。將一滴“階段2輔佐的疫苗”滴在水面上。如果液滴部分自稀釋，在水面上呈現(xiàn)牛奶狀表面，則它是水包油包水的，是可接受的。在4°C下保存24小時(shí)。 第16天或以后步驟U、裝里在生物安全操作柜中，用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的漏斗和量筒量取適當(dāng)體積的疫苗。對于250ml的枕頭包，其體積為253 255ml。將該物料倒入經(jīng)Y -射線滅菌的枕頭包中，然后用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的橡皮塞和金屬蓋封閉枕頭包的上ロ。重復(fù)該過程直至每批枕頭包達(dá)到合適的數(shù)量。步驟V、保留取樣取ー個(gè)保留樣品。步驟W、用于無菌測試和游離的福爾馬林水平測試的QC取樣用裝填結(jié)束后剩余的物料,取20ml樣品裝入經(jīng)蒸汽滅菌的McCartney瓶中。使用裝填剰余物料的同樣的漏斗和量筒。該樣品來進(jìn)行無菌測試和游離福爾馬林水平測試。步驟X、貼標(biāo)簽將甸批樣品貼上標(biāo)簽。于冰箱中保存。步驟Y、第一次無菌檢測裝填結(jié)束后第四天，如無菌檢測所述對“無菌檢測試管”和“無菌檢測平板”進(jìn)行第一次檢測。步驟Z、第二次無菌檢測裝填結(jié)束后第七天，如無菌檢測所述對“無菌檢測試管”和“無菌檢測平板”進(jìn)行第二次檢測。步驟AA、第三次無菌檢測裝填結(jié)束后第十一天，如無菌檢測所述對“無菌檢測試管”和“無菌檢測平板”進(jìn)行第三次檢測。步驟AB、第四次無菌檢測裝填結(jié)束后第十四天，如無菌檢測所述對“無菌檢測試管”和“無菌檢測平板”進(jìn)行第四次檢測。步驟AC、產(chǎn)品應(yīng)用如果滿足下述規(guī)格，所述批次是可以應(yīng)用的 物理形態(tài)塑料枕頭包中呈奶油狀的液體，貼有包含名稱為“ Anadis E.coliVaccine”的經(jīng)核準(zhǔn)的標(biāo)簽。 純度第一和第二次純度檢測中，每ー菌株的所有純度試驗(yàn)平板上均呈現(xiàn)E. coli的純生長現(xiàn)象。 無菌性在無菌性檢測和初始正式的無菌檢測時(shí)，平板上或試管中均沒有任何生長的跡象，或者在描述的無菌檢測的再次檢測過程中也沒有任何生長的跡象。
效カ:得到的產(chǎn)品中每毫升含有大于或等于I. Oml蛋白質(zhì)。 游離的福爾馬林水平QC樣品中該水平不超過O. 002% w/v ο 乳化質(zhì)量一滴乳化的疫苗滴于水面上，部分自稀釋，在水中呈現(xiàn)奶油狀。實(shí)施例2、高免疫初乳的制備實(shí)施例制得的疫苗按以下方法用于制備高免疫初乳讓注冊獸醫(yī)用乳化的含有佐劑的疫苗以2ml的注射量 通過脖子側(cè)面的肌肉注射免疫母牛。妊娠期為6 8. 5個(gè)月的母牛每隔2周注射一次，共注射5次，于分娩前I個(gè)月停止。取挑選的免疫母牛的血液進(jìn)行檢測，并分析以確定特定抗體的水平。分析結(jié)果用于確定是否達(dá)到了令人滿意的滴定度。為了限制自主接種的可能性，免疫只讓注冊獸醫(yī)實(shí)施，并讓有經(jīng)驗(yàn)的牲畜飼養(yǎng)人員協(xié)助。免疫期間，應(yīng)對母牛進(jìn)行適當(dāng)限制，比如避免賽跑、擁擠、處于旋轉(zhuǎn)的擠奶場，以保持脖子肌肉的清潔。注射部位在免疫前進(jìn)行修剪并消毒，隨后的注射在同一牲畜的交替部位上進(jìn)行。收集首次擠奶得到的新鮮高免疫初乳后的制備方法如下所述。實(shí)施例3、疫苗的制備本實(shí)施例描述的疫苗的制備根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的典型過程進(jìn)行。牛疫苗和抗E. coli H10407、菌毛抗原以及毒素的初乳抗體按照下述方法制備初乳抗體的制備。從用腸毒性E. coli菌株H10407、一種挑選的菌毛抗原和熱不穩(wěn)定的腸毒素(LT)免疫的母奶牛的初乳中分離抗體。母牛處于獸醫(yī)的監(jiān)管下，并圈養(yǎng)在試驗(yàn)用的奶牛場。參見J. Husu等(1993)。疫苗制備。用于生產(chǎn)疫苗的細(xì)菌抗原由腸毒性E.coli菌株H10407 (078 :H11 CFA/I+ ST+ LT+)制得。三個(gè)抗原由該菌株純化而得(i)福爾馬林滅活的完整細(xì)胞懸液(IO9個(gè)細(xì)菌/ml)(ii)熱不穩(wěn)定的腸毒素(2mg/ml)(iii) CFA/I (2mg/ml)疫苗的制備是將等體積的每種抗原與等體積的Freund不完全佐劑進(jìn)行乳化而得。除了上述抗原外，還用到一種市售的含有從E. coli K88ac、K99和987P的菌毛抗原提純的油性佐劑疫苗(E. coli Vaccine ；Commonwealth Serum Laboratories Ltd)。初乳的加工和乳清免疫球蛋白的分離。收集哺乳期第一周的免疫母牛的初乳。乳液收集到単獨(dú)的容器中，冰凍保存直至加工。簡而言之，離心除去牛奶脂肪，脫脂牛奶用巴氏德法在56°C消毒30分鐘，然后通過凝乳而凝結(jié)。除去含有酪蛋白的凝乳，將乳清離心，棄取細(xì)小的沉淀。在持續(xù)攪拌下將等體積的飽和硫酸銨溶液慢慢加入到乳清中。離心后，收集得到的沉淀，棄去含有乳糖和鹽的上清液。沉淀物溶于相當(dāng)于原溶液體積的30%的0. 32M NaCl中。該溶液進(jìn)ー步在具有螺旋式透析膜SIY 30筒的Amicon設(shè)備中用5體積的鹽液透析。抗體溶液濃縮至固體含量為10%，快速冷凍，并凍干。最后，凍干的抗體粉末用 射線(25KGrays)滅菌。參見 Hilpert (1984) ,Antibodies-A Laboratory Manual (1988)
和 Cravioto 等(1982)。
實(shí)施例4、從細(xì)胞壁分離的O型抗原的測定本實(shí)施例提供了一種產(chǎn)生106CfU/ml革蘭氏陰性菌、從這些細(xì)菌提取O型抗原以及檢測從這些細(xì)菌的細(xì)胞壁分離的O型抗原的量的方法。本實(shí)施例的方法能夠計(jì)算出“LPS-細(xì)菌當(dāng)量”ー這是含有給定量的LPS的細(xì)菌的數(shù)量值。以下實(shí)施例中，3mg/ml的LPS等同于106cfu/ml的革蘭氏陰性菌ETEC。試劑磷酸緩沖液鹽(PBS)按下表制備的SDS-PAGE裂解緩沖液(20ml)
最終
2 M Tris-HCL pH 6.8 10.0 ml(IM)
dH202.4 ml
10% SDS4.0 ml(2%)
甘油2.0 ml(10%)
0.05% 溴酚藍(lán)0.8 ml(0.002%)*在使用前每960 μ L緩沖液中加入40 μ L 2_巰基こ醇(4% )步驟I、細(xì)菌菌株在營養(yǎng)瓊脂平板(NA)上于37°C下培養(yǎng)過夜。2、第二天收集細(xì)菌加入到PBS,并達(dá)到O. 5McFariane當(dāng)量(I X 108cfu/ml)。3、細(xì)菌懸液用PBS稀釋100倍至I X 106cfu/ml。4、稀釋液等分成Iml的式樣量至滅菌的Eppendorf試管中，于13000rpm離心3分鐘形成菌團(tuán)。5、離心后棄去上清，菌團(tuán)在50μ L SDS-PAGE裂解液中重懸。6、然后將樣品煮沸10分鐘，迅速用冰冷卻，并在離心機(jī)中脈沖以收集濃縮液。7、將2. 5μ L蛋白酶K(20mg/ml)加入到每個(gè)試管中，于60°C水浴中保溫I小時(shí)。8、保溫結(jié)束后，向每個(gè)試管中加入等體積的苯酚，旋轉(zhuǎn)振蕩，然后進(jìn)ー步在65°C的水浴中保溫15分鐘，每5分鐘旋轉(zhuǎn)振蕩一次。9、樣品于4°C下離心10分鐘，取水相加入到新的試管中用于LPS的定量分析。LPS的定量分析色原內(nèi)毒素檢測(LAL)是ー種革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素定量測試方法。將樣品與試劑盒中提供的LAL混合并于37°C保溫10分鐘。然后將底物溶液與LAL樣品混合并進(jìn)一歩于37°C保溫6分鐘。然后加10%的SDS終止反應(yīng)。如果樣品中有內(nèi)毒素，將檢測到吸光度為405nm的黃色。利用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線測算樣品中內(nèi)毒素的量。I、苯酚抽提的LPS樣品用LAL試劑水稀釋到1ml，另外的稀釋液用于LAL分析(1/10，1/50，1/250，1/1250)。2、用LAL試劑水制備兩份連續(xù)稀釋液，制備的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(3 O. 02 μ g/ml)。
3、96 孔板法
樣品空白
測試樣品或內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)50 μ -
LAL試劑水-50 μ
LAL50 μ 50 μ
混合并在37°C下保溫10分鐘
顯色底物100 μ 100 μ混合并在37°C下再保溫6分鐘
終止緩沖液(10% SDC)50 μ 50 μ 在ELISA平板閱讀器上讀取OD 405nm的數(shù)值4、繪制得到OD測量值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0D對內(nèi)毒素濃度)。5、通過讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD計(jì)算未知樣品的內(nèi)毒素濃度，然后計(jì)算所含內(nèi)毒素的量。實(shí)施例5、高免疫初乳提取物用于人的治療通過ロ服用源于經(jīng)細(xì)菌抗原和毒素免疫的牛的牛初乳提取物制備的藥片防止由腸毒性大腸桿菌(ETEC H10407)引起的腹瀉。藥片由Anadis有限公司用經(jīng)多種細(xì)菌抗原和毒素免疫的奶牛的初乳制備得到。兩項(xiàng)雙盲試驗(yàn)包括總共90個(gè)健康志愿者，通過服用對抗劑量為1-2 X IO9E. coli 078的藥片(和安慰劑)來測試保護(hù)效果。有30個(gè)參與人員的第一次研究評估含有400mg用碳酸氫鈉緩沖液提取的初乳提取物的藥片的效果。該治療組的保護(hù)效果為93.4%，相比之下，安慰劑治療組的保護(hù)效果僅為26. 7%。第二次研究試驗(yàn)，含有400mg用緩沖液提取的初乳提取物的藥片的保護(hù)效果為85. 7%，非緩沖液提取的初乳提取物的藥片的保護(hù)效果為80% ;含有200mg非緩沖飲料提取的初乳提取物的藥片的保護(hù)效果為64. 3% ;相比之下，安慰劑治療組的保護(hù)效果僅為14. 3%。在防止志愿者對抗致病劑量的腸毒性大腸桿菌引起的腹瀉臨床癥狀時(shí)，有活性的藥片組方的治療效果明顯(P <0.001)好于安慰劑。研究表明，含有對抗多種腸毒性細(xì)菌和毒素的抗體的牛初乳提取物的藥片組方具有潛在的防止與這些細(xì)菌有關(guān)的臨床性腹瀉的作用。緩沖液提取物和非緩沖液提取物的差別不是很大。實(shí)施例6、高免疫初乳提取物用于人的治療本實(shí)施例描述的對人的保護(hù)試驗(yàn)使用的初乳藥片通過實(shí)施例3描述的疫苗誘導(dǎo)的高免疫初乳制備得到。招募了 22個(gè)健康成年志愿者并予以登記以進(jìn)行雙盲試驗(yàn)。其中一半服用以碳酸氫鈉溶液提取的大腸桿菌特異性牛免疫球蛋白藥片，另一半服用以碳酸氫鈉溶液提取的脫脂乳安慰劑。志愿者進(jìn)行分派治療，每天服用3次，共7天。第七天一種挑戰(zhàn)性的IXlO9E. coli菌株H10407(ETEC 078)作為飲料發(fā)放給所有參與者。然后觀察參與者的ETEC誘導(dǎo)的胃腸道疾病癥狀。
各組中腹瀉的發(fā)病率為產(chǎn)品組4/11，安慰劑組7/11 (P = 0.2)。與安慰劑組相比，(高免疫初乳藥片的)治療提供了 44%的抗ETEC H10407引起的腹瀉的預(yù)防功效。實(shí)施例7、抗體滴定度檢測方法本實(shí)施例描述了完整E.coli細(xì)胞涂覆于微量滴定平板上的Elisa分析方法。該分析方法是ー種抗體滴定度的分析方法，顯色反應(yīng)是由羊抗牛IgG-過氧化物酶共軛物催化的。含有O. 5微克的加熱致死的E. coli細(xì)胞的100 μ L碳酸鈉-碳酸氫鈉涂覆緩沖溶液分配于96孔Maxisorp免疫平板(Nunc, Roskilde,Denmark)的姆個(gè)孔中，4°C過夜?？装逡院?137mM NaCl，I. 5mM KH2PO4,0. 8mM Na2HPO4,pH 7. 4 的 PBS-0. 05% Tween 緩沖液洗滌6次。將100 μ I每種測試血清或初乳用含有12mg/ml酪素的PBS-Tween稀釋，加入每個(gè)孔中并于37°C下保溫2h?？装逵肞BS-Tween緩沖溶液洗滌6次，此后100 μ I羊抗牛IgG-過氧化物酶共輒物(Southern Biotacnology Associates, Inc. , Birmingham, AL, USA)用PBS-Tween-酪素按I : 4000的比例稀釋，加入到每個(gè)孔中。孔板于37°C保溫lh，并洗滌6 次。將 100 μ I 過氧化物酶底物(Kirkgaard and Perry Lab, Inc. , Gaithersburg,MD, USA)加入姆個(gè)孔中并置室溫直至顯色。加入2M硫酸終止反應(yīng),孔板在Diagnostics PasteurLP400孔板讀取器(Sanofi,Mames-la-Coquette,France)于450mm讀取。結(jié)果通過對至少兩個(gè)獨(dú)立樣品的重復(fù)孔的平均剰余O.D.值(減去空白樣讀數(shù)后)的分析來表示。實(shí)施例8、選擇性的免疫方案使用實(shí)施例I的方法制備的抗原生產(chǎn)血清抗體。母牛的免疫方法如實(shí)施例2所述，只是三次注射的中間間隔為2周。最后一次注射兩周后，取血樣進(jìn)行抗體滴定度檢測。實(shí)施例9、使用完整細(xì)胞抗原生產(chǎn)血清抗體為了比較分離的細(xì)胞壁抗原和完整細(xì)胞抗原的免疫反應(yīng)的目的，使用下述方法生產(chǎn)抗完整細(xì)胞抗原的血清抗體。完整細(xì)胞抗原按下述方法制備將E. coli H10407接種在IOOml Luria肉湯培養(yǎng)基中，在振蕩下37°C保溫過夜。得到的培養(yǎng)物通過離心得到細(xì)菌小球，再懸浮于IOOml滅菌的PBS緩沖液中，并于100°C加熱2. 5小吋。蛋白質(zhì)濃度的測量用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析法，并調(diào)節(jié)至lmg/ml。使用佐劑如實(shí)施例I所描述。母牛用實(shí)施例7的方法進(jìn)行免疫，血樣的收取如實(shí)施例7所描述。實(shí)施例10、完整細(xì)胞抗原與分離的細(xì)胞壁抗原的比較按照實(shí)施例7的方法取自A組(18頭母牛)的血清按照實(shí)施例7所描述的方法進(jìn)行Elisa分析。按照實(shí)施例9的方法取自B組(14頭母牛)的血清按照實(shí)施例6所描述的方法進(jìn)行Elisa分析。結(jié)果為
A組B組
EIA單位(平均)86096
EIA 單位(范圍)300-160030-300用本發(fā)明的疫苗(A組)產(chǎn)生的抗體的滴定度明顯高于用完整細(xì)胞疫苗(B組)產(chǎn)生的抗體的滴定度。該結(jié)果令人驚奇，因?yàn)樵摰味ǘ仁怯猛暾?xì)胞固定在Elisa平板上而檢測得到的。實(shí)施例11、動物安全性通過對根據(jù)實(shí)施例2的方案免疫的1200頭奶牛的ー項(xiàng)調(diào)查顯示，沒有明顯的福利問題或者副反應(yīng)或者產(chǎn)量的減少。實(shí)施例12下述分析基于母牛初乳中抗體的應(yīng)用來進(jìn)行定居因子(colonisation factor)的免疫印跡分析。根據(jù)本發(fā)明的方法制得的抗體，附帶將CFA(菌毛)合并入疫苗?；n緩沖液和試劑
IOXTris/甘氨酸/SDS電泳緩沖液Tris 15g甘氨酸 72gSDS5g用dH20制成I升，以1/10稀釋以制備“工作溶液”。轉(zhuǎn)移緩沖溶液(IOOml)
Tris0.56 g
甘氨酸0.30 g
dHiO80 ml
甲醇20 ml
10% SDS360 μ 按上述順序混合各試劑并冷藏直至使用。3 X Laemmli 緩沖液(8ml)
dH200.8 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.83.0 ml
甘油2.4 ml
SDS0.48 g
2-β_巰基乙醇*1.2 ml
0.05% (w/v)溴釀藍(lán)0.6 mlt*使用時(shí)加入。將I體積的Laemmli緩沖液與2體積的樣品混合?；n粗制定居因子的制備將腸毒性大腸桿菌(ETEC)菌株接種在一式兩份的CFA培養(yǎng)平板上，于37°C培養(yǎng)過夜(CF生產(chǎn))，然后置室溫下(CF生產(chǎn)抑制)。刮取一半平板的細(xì)胞加入Iml的PBS中，上下吸取以重懸。簡單旋振。
將細(xì)胞懸液置于60 °C水浴中保溫30min以釋放定居因子。離心(14，000rpm/20min)得到細(xì)胞小球，回收上清液移至干凈的試管中。制備的粗制品中應(yīng)當(dāng)含有定居因子和LPS,這是所用菌株表達(dá)的?！?SDS-PAGE將15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠和4%積層凝膠按下表灌膠
權(quán)利要求
1.抗ー種疫苗所產(chǎn)生的高免疫物質(zhì)在制備治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的ロ服藥物制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗含有一種或多種細(xì)胞壁抗原，該抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征，所述抗原的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，且所述抗原為ー種脂多糖相關(guān)抗原，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關(guān)抗原的量大于每毫升104/ml的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中脂多糖相關(guān)抗原的量。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關(guān)抗原的量大于每毫升io6/mi的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中脂多糖相關(guān)抗原的量。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關(guān)抗原的量大于每毫升108/ml的革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)液中脂多糖相關(guān)抗原的量。
5.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原中的至少20%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原中的至少40%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原中的至少60%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
8.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 8ffo
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 3ffo
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在干，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 1W。
11.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗進(jìn)ー步含有菌毛或類菌毛抗原CFA-I或CFA-2、或者其它定居因子或公認(rèn)的定居因子、或者是它們的組合，所述抗原中至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升所述水相中CFA的量大于每毫升在促進(jìn)CFA生成的培養(yǎng)條件下生長的IO4革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)液中CFA抗原的量。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在干，每毫升所述水相中CFA的量大于每毫升在促進(jìn)CFA生成的培養(yǎng)條件下生長的IO6革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)液中CFA抗原的量。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在干，每毫升所述水相中CFA的數(shù)量大于每毫升在促進(jìn)CFA生成的培養(yǎng)條件下生長的IO8革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)液中CFA抗原的量。
15.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少20%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少40%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少60%是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
18.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原從細(xì)菌細(xì)胞壁的分離是通過勻漿或者加熱的方式、或者是它們的有效組合。
19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述勻漿是在轉(zhuǎn)子-定子裝置中進(jìn)行的，其中轉(zhuǎn)子的外圍速率(m/s)與轉(zhuǎn)子-定子間隙(mm)的比值在O. 2 20的范圍內(nèi)。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)子的外圍速率(m/s)與轉(zhuǎn)子-定子間隙(mm)的比值在O. 4 12的范圍內(nèi)。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)子的外圍速率(m/s)與轉(zhuǎn)子-定子間隙(mm)的比值在O. 8 6的范圍內(nèi)。
22.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，勻漿器中高剪切區(qū)域的剪切速率與權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)子-定子裝置所產(chǎn)生的剪切速率相當(dāng)。
23.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原從細(xì)胞壁的分離是通過在40 80°C的范圍內(nèi)持續(xù)加熱處理10 200分鐘。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原從細(xì)胞壁的分離是通過在50 70°C的范圍內(nèi)加熱處理。
25.如權(quán)利要求23或24所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原從細(xì)胞壁的分離是通過持續(xù)加熱處理30 60分鐘。
26.如權(quán)利要求I 25中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌選自螺旋菌屬、弧菌屬、腸桿菌屬。
27.如權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。
28.如權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大腸桿菌為ETEC、EHEC或EPEC。
29.如權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌是ETEC，且所述脂多糖相關(guān)抗原選自以下 O 型抗原組06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，.0148，0153，0159和其它與腸毒性大腸桿菌相關(guān)的血清型O型抗原。
30.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原包含078。
31.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分離的O型抗原通過硫酸銨沉淀法純化。
32.如權(quán)利要求31所述的應(yīng)用，其特征在于，初始的沉淀作用用于去除外來蛋白質(zhì)，而最后的沉淀作用用于從沉淀物獲取O型抗原。
33.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包含至少兩種O型抗原，単一的O型抗原是在單獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)基中生長并分離的，在単一的O型抗原從細(xì)胞壁分離后，所述抗原被一起加入疫苗中。
34.如權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗還包含CFA-I和/或CFA-2。
35.如權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其特征在于，所述至少兩種O型抗原包括大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少兩種O型抗原選自以下組06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA 2 菌毛抗原。
36.如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗包括ー種佐劑，該佐劑選自Montanide、QullA、氫氧化鋁中的ー種或多種。
37.如權(quán)利要求I 36中任ー項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高免疫物質(zhì)的制備是通過用所述疫苗免疫宿主動物以弓I發(fā)對所述疫苗的免疫反應(yīng)，然后從所述免疫動物收集高免疫物質(zhì)。
38.如權(quán)利要求37所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高免疫物質(zhì)包括高免疫初乳或高免疫蛋黃。
39.如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高免疫初乳的制備是通過將所述抗原分成兩批或多批單ー的疫苗，井分別以單ー批次的疫苗免疫兩批或多批牲畜，接著將來自牲畜的初乳混合。
40.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高免疫物質(zhì)至少通過過濾、巴氏德消毒和/或除去異相的方法被部分純化。
41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高免疫物質(zhì)還包含ー種食品級的抗菌劑組分。
42.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其特征在于，所述食品級的抗菌劑組分選自由乳鐵傳遞蛋白、柑橘提取物或碘基防腐劑中的ー種或多種。
43.一種用于治療和預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的組合物，其特征在于，該組合物含有具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特性的高免疫物質(zhì)，該高免疫物質(zhì)是通過用ー種含有一種或多種細(xì)胞壁抗原的疫苗免疫宿主動物而制得，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 8W。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 3W。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述疫苗包含ー個(gè)水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關(guān)抗原的重量與每毫升細(xì)胞壁物質(zhì)的重量為W的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的脂多糖相關(guān)抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片的重量小于O. 1W。
47.如權(quán)利要求46所述的組合物，其特征在干，所述高免疫物質(zhì)是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黃或高免疫蛋黃提取物。
48.如權(quán)利要求47所述的組合物，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌選自螺旋菌屬、弧菌屬、腸桿菌屬。
49.如權(quán)利要求46所述的組合物，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。
50.如權(quán)利要求49所述的組合物，其特征在于，所述大腸桿菌為ETEC、EHEC或EPEC。
51.如權(quán)利要求50所述的組合物，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為ETEC，并且脂多糖相關(guān)抗原選自以下 O 型抗原組06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159以及其它與腸毒性大腸桿菌相關(guān)的血清型O型抗原。
52.如權(quán)利要求51所述的組合物，其特征在于，所述脂多糖相關(guān)抗原包含078。
53.如權(quán)利要求51所述的組合物，其特征在于，所述疫苗包含至少兩種O型抗原，単一的O型抗原是在單獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)基中生長并分離的，在単一的O型抗原從細(xì)胞壁分離后，所述抗原一起被加入疫苗中。
54.如權(quán)利要求53所述的組合物，其特征在于，所述疫苗還包含CFA-I和/或CFA-2。
55.如權(quán)利要求54所述的組合物，其特征在干，所述至少兩種O型抗原包括大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少兩個(gè)O型抗原的其它抗原選自06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA2 菌毛抗原。
56.如權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于，該化合物含有經(jīng)過處理以富集或分離抗體的高免疫初乳。
57.如權(quán)利要求56所述的組合物，其特征在于，所述經(jīng)處理的高免疫初乳配制成ロ服劑型配方。
58.如權(quán)利要求57所述的組合物，其特征在于，所述經(jīng)處理的高免疫初乳配制成藥片或者包裹于膠囊中的粉劑。
59.如權(quán)利要求58所述的組合物，其特征在于，還包含ー種食品級的抗菌劑組分。
60.如權(quán)利要求59所述的組合物，其特征在干，所述食品級的抗菌劑組分選自乳鐵傳遞蛋白、柑橘提取物或碘基防腐劑中的ー種或多種。
61.如權(quán)利要求60所述的組合物，其特征在于，用于旅游者腹瀉的治療或預(yù)防。
62.如權(quán)利要求43 61中任一項(xiàng)所述組合物在治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病中的應(yīng)用。
63.細(xì)胞壁抗原在制備用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的高免疫物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在干，所述細(xì)胞壁抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。
64.如權(quán)利要求63所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌是腸毒性大腸桿菌。
65.ー種免疫球蛋白的制備方法，該免疫球蛋白用于治療或預(yù)防動物體內(nèi)革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的，其特征在于，該方法包括用一種疫苗免疫宿主動物，該疫苗含有ー種或多種具有O組血清型作用特征或脂多糖相關(guān)抗原作用特性的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的，由此誘導(dǎo)宿主動物產(chǎn)生含有所述免疫球蛋白的高免疫物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療和預(yù)防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的方法。該方法包括向一個(gè)個(gè)體施以一種疫苗或者一種抗所述疫苗產(chǎn)生的高免疫物質(zhì)的步驟，所用疫苗包含有一種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關(guān)抗原作用特征的細(xì)胞壁抗原，所述抗原中至少一部分是從細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞壁碎片分離的。本發(fā)明還公開了含有高免疫物質(zhì)的組合物，以及所述組合物和疫苗的用途。
文檔編號A61K35/74GK102698258SQ20121005540
公開日2012年10月3日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者戈特弗里德·利希蒂, 格蘭特·托馬斯·羅林, 羅伊·邁克爾·羅賓斯-布朗 申請人:阿納迪斯有限公司