專利名稱：桑枝皮中具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性生物堿純化方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有降血糖作用的桑枝皮中水溶性生物堿的分離提純方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是由于胰島素分泌不足和/或胰島素作用受損引起的一組以高血糖為特征的代謝性疾病。其表現(xiàn)為血液及尿液中葡萄糖濃度異常升高，血糖、尿糖過高時可出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，即多飲、多尿、多食及體重減輕，且伴有疲乏無力。糖尿病一般分為I 型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病等幾種類型。糖尿病不僅可以引起微血管并發(fā)癥，如周圍神經(jīng)病變、眼部病變、糖尿病腎病等，而且也可以引起嚴(yán)重的大血管并發(fā)癥，如心肌梗死、 中風(fēng)、下肢血管阻塞性病變等。這些并發(fā)癥危害極大，降低了人們的生活質(zhì)量，給人們帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此治療糖尿病、控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展已顯得越來越重要。流行病學(xué)的研究表明，空腹血糖水平與餐后血糖水平這兩大血糖指標(biāo)中，餐后血糖水平尤為重要，它是葡萄糖耐受受損(IGT)的病人發(fā)展為II型糖尿病的重要因素。而且， 餐后血糖水平是引起糖尿病人大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥的重要因素，而這些并發(fā)癥是引起糖尿病死亡率增大的一個主要原因。所以，嚴(yán)格控制餐后血糖對糖尿病的防治具有非常重要的意義，而能夠顯著降低餐后血糖水平的抗糖尿病藥物具有很大的應(yīng)用價值。食物中的碳水化合物大部分是淀粉、多糖或寡糖。與膳食一起進(jìn)食后，α-糖苷酶抑制劑可與雙糖、多糖或淀粉競爭而與唾液和胰液中的α-糖苷酶結(jié)合，占據(jù)酶上的結(jié)合位點，使雙糖、多糖或淀粉的消化受阻。未被消化的碳水化合物被運送至小腸中下段及結(jié)腸，從而使碳水化合物的消化吸收發(fā)生在整段小腸中，延緩和延長了餐后單糖(葡萄糖)的吸收，餐后血糖的增高被顯著減小。?？浦参锏母?、莖、葉均含有α-糖苷酶抑制成分。經(jīng)檢索中國專利申請?zhí)?20061011164. 3的專利公開了一種從桑枝中提取制備α -糖苷酶抑制劑及其應(yīng)用，該專利是以桑枝為原料進(jìn)行提取抑制α-糖苷酶有效部位。我們經(jīng)過實驗證實桑枝中的α-糖苷酶抑制成分主要分布在皮質(zhì)部分，而桑枝木質(zhì)部分α -糖苷酶抑制成分含量僅是皮質(zhì)部分的十分之一。桑蠶養(yǎng)殖是我國傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)之一，在桑蠶養(yǎng)殖地區(qū)每年都要進(jìn)行一至二次桑枝的修剪，大量桑枝用于木材加工，而木材加工只用桑枝的木質(zhì)部分，皮質(zhì)部分必須去掉。因此，以桑枝皮為藥材，來源廣泛，價格便宜。在提取時由于將木質(zhì)部分去掉，使原料體積減少一半以上，大大節(jié)省了提取溶媒用量，以及人工工時和能源；其木質(zhì)部分可以用于木材加工的原料；皮質(zhì)部分在提取降血糖作用的水溶性生物堿后還可作為天然紡織纖維的原料，具有良好的綜合利用前景。另外，該專利所得到的具有降血糖活性的生物堿有效部位含量占提取物的重量百分比在50%以上,而其代表成分l-deoxynojirmycin(l-脫氧野尻霉素DNJ)最高含量為總生物堿的50%，也就是說DNJ占總提取物的25%。
專利申請?zhí)枮?00810021592. X中描述了從桑皮中得到一種具有降血糖作用的提取物，但未提及有效部位，更未提及有效成分的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種從桑枝皮中提取具有降血糖作用的水溶性生物堿的分離提純方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的從桑枝皮中提取、分離、純化獲得具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性總生物堿的制備方法，包括如下步驟第I、以桑枝皮為原料，以水醇=100%-20% O %-80 %為提取溶劑，提取溶劑的體積為桑枝皮重量的6-10倍；調(diào)節(jié)提取液ΡΗ2-7，加熱回流，提取液過濾，重復(fù)2次提取， 除去藥渣,合并2次的濾液；第2、加熱減壓濃縮第I步獲得的提取液，至原桑枝皮重量的1/2 I倍；第3、加入體積百分含量為75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量為第2步得到的濃縮提取液體積的3 5倍，在4 30°C進(jìn)行醇沉淀；離心或過濾，除去殘渣和不溶物，得到上清液；第4、取第3步獲得的醇沉淀濃縮后的上清液，經(jīng)陽離子交換樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用O. 2 I. 5mol氨水洗脫，洗脫液上陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，調(diào)PH8 ；第5、采用膜過濾，濾液冷凍干燥成干粉，或?qū)⑹占褐苯訃婌F干燥成型制成干粉， 得淡黃色的水溶性總生物堿提取物，該提取物具有對α -糖苷酶的抑制活性。所述淡黃色的水溶性總生物堿提取物中I-脫氧野尻霉素含量占總提取物的 50-70%。以上所述方法獲得的桑皮水溶性總生物堿的應(yīng)用，將所述的桑皮水溶性總生物堿與藥物制劑所允許的藥物輔料結(jié)合，用于制備降血糖藥物，可制備成適合于使用的各種劑型。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果I.本發(fā)明以桑枝皮為藥材，來源廣泛，價格便宜。在提取時由于將木質(zhì)部分去掉， 使原料體積減少一半以上，大大節(jié)省了提取溶媒用量，以及人工工時和能源；2.本發(fā)明以桑枝皮為藥材，通過提純工藝的改進(jìn)，使具有α-糖苷酶的抑制活性的水溶性總生物堿提取物中I-脫氧野尻霉素含量達(dá)到50%以上；3.本發(fā)明為桑蠶養(yǎng)殖業(yè)的綜合利用提供了一個新的途徑桑枝的木質(zhì)部分可以用于木材加工的原料；皮質(zhì)部分在提取降血糖作用的水溶性生物堿后還可作為天然紡織纖維的原料，具有良好的綜合利用前景。


圖I桑枝皮水溶性生物堿總提取物(樣品)對α -糖苷酶的抑制曲線。
具體實施例方式一.桑皮水溶性生物堿總提取物的制備及應(yīng)用
首先將桑枝皮粉碎，加入提取溶劑(水醇=100% -20% 0% -80%為提取溶劑，調(diào)節(jié)提取液PH2-7)，提取溶劑的體積為桑枝皮重量(Kg)的6-10倍；加熱回流，過濾，重復(fù)提取2次，合并2次的濾液；提取液濃縮至原桑枝皮重量的1/2 I倍；加入體積百分含量為75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量為第2步得到的濃縮提取液體積的3 5倍，在4 30°C進(jìn)行醇沉淀；離心或過濾，除去殘渣和不溶物，得到上清液；取醇沉淀濃縮后的上清液，經(jīng)陽離子交換樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用O. 2 2mol氨水洗脫，洗脫液經(jīng)陰離子交換樹脂，用去離子水沖洗，收集不吸附部分，收集液調(diào)PH8;采用膜過濾，濾液冷凍干燥成干粉，或?qū)V液直接噴霧干燥成型制成干粉，得淡黃色的水溶性總生物堿提取物，該提取物具有對α -糖苷酶的抑制活性，I-脫氧野尻霉素的含量為水溶性總生物堿提取物的50-70%。實施例I將粉碎的桑枝皮lKg，加水10L，調(diào)pH2，加熱回流2小時，過濾；重復(fù)提取2次，合并2次濾液，濃縮至500mL，加入95%乙醇1500mL，室溫靜置過夜，過濾，除去不溶物，濾液上ZeiOlit 225陽離子樹脂，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用Imol氨水洗脫，洗脫液上 D380陰離子樹脂，收集不吸附部分，調(diào)pH8，過膜，濾液干燥，即得淡黃色水溶性總生物堿提取物 I. 3g，DNJ-含量 62%。實施例2將粉碎的桑枝皮lKg，加80%甲醇8L，調(diào)pH7，加熱回流2小時，過濾；重復(fù)提取2 次，合并2次濾液，濃縮至500mL，加入95%乙醇1500mL，室溫靜置過夜，過濾，除去不溶物， 濾液上0017陽離子樹脂，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用O. 5mol氨水洗脫，洗脫液上 D261陰離子樹脂，收集不吸附部分，調(diào)pH8，用膜過濾，濾液干燥，即得淡黃色水溶性總生物堿提取物llg，DNJ-含量69%。實施例3將粉碎的桑枝皮lKg，加60%乙醇6L，調(diào)pH4，加熱回流2小時，過濾；重復(fù)提取2 次，合并2次濾液，濃縮至500mL，加入95%乙醇1500mL，室溫靜置過夜，過濾，除去不溶物， 濾液上Amberlite IR120陽離子樹脂，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用O. 2mol氨水洗脫，洗脫液上D371陰離子樹脂，收集不吸附部分，調(diào)pH8，用膜過濾，濾液干燥，即得淡黃色水溶性總生物堿提取物I. 6g，DNJ-含量57%實施例4、(水溶性總生物堿提取物用于制備降血糖藥物)稱取桑枝皮水溶性總生物堿提取物30g，加入羧甲基纖維素鈉(內(nèi)加)5. Og,交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(內(nèi)加)4. 5g，淀粉88g，混勻，用50%乙醇準(zhǔn)備軟材，過16目篩制粒，干燥， 加入微粉硅膠I. 5g，硬脂酸鎂I. 0g，過16目篩整粒壓片，制1000片。二、桑枝中DNJ成分的分布實驗①稱取粉碎過2目篩的不同品種的干燥桑枝100g，每個品種3份，加入pHl的水溶液，加熱回流，過濾，重復(fù)提取2次，合并2次的濾液，濃縮至一定體積，測定DNJ含量。結(jié)果見表I ;
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②稱取粉碎過2目篩的不同品種的干燥桑枝木芯100g，每個品種3份，加入pHl的水溶液，加熱回流，過濾，重復(fù)提取2次，合并2次的濾液，濃縮至一定體積，測定DNJ含量。 結(jié)果見表I ;③稱取粉碎過2目篩的不同品種的干燥桑枝皮100g，每個品種3份，加入pHl的水溶液，加熱回流，過濾，重復(fù)提取2次，合并2次的濾液，濃縮至一定體積，測定DNJ含量。結(jié)果見表I ;表I、不同品種的桑枝各部位DNJ百分含量
桑樹品種桑枝％。桑枝皮％。桑枝木芯％。桂桑優(yōu)2.3657.2000.892沙二 X倫1091.8325.2360.467桂桑621.7214.4680.474實驗結(jié)果表明，不同品種桑枝中DNJ的含量雖有差異，但DNJ含量并沒有顯著性差異；而DNJ在桑枝皮、桑枝木芯中的分布卻有明顯差異在皮質(zhì)部分含量最高,而桑枝木芯部分DNJ成分含量僅是皮質(zhì)部分的十分之一，甚至更低。三、桑皮水溶性生物堿總提取物對α-糖苷酶抑制作用將DNJ標(biāo)準(zhǔn)品、桑皮水溶性生物堿總提取物和阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品各10毫克，分別用ImLO. 2mol/L PBS (pH = 6. 8)將樣品超聲溶解，并10倍系列稀釋為1,0. 1,0.01,0. 001，
O.0001，O. 00001mg/mL的樣品，分別取樣品20 μ L加入96孔板中，加入30 μ L腸粗酶溶液， 37°C孵育5min后，加入100 μ L麥芽糖啟動反應(yīng)，37°C反應(yīng)30min后，加入IOyL 0. lmol/L 的鹽酸終止反應(yīng)，取反應(yīng)液50 μ L，加入150 μ L的葡萄糖工作液37°C反應(yīng)15min，490nm測定OD值，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作圖，見圖I。根據(jù)α -糖苷酶的抑制曲線結(jié)果如圖所示，桑枝皮水溶性總生物堿提取物(圖中為樣品)、1_脫氧野尻霉素(DNJ)標(biāo)準(zhǔn)品、阿卡波糖呈現(xiàn)出相平行的對α-糖苷酶抑制效果，其中桑枝皮水溶性總生物堿提取物(圖中為樣品)比阿卡波糖的抑制α-糖苷酶IC5tl 的濃度低近一個數(shù)量級。
權(quán)利要求
1.一種從桑枝皮中提取、分離、純化獲得具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性總生物堿的制備方法，其特征是包括如下步驟第I、以桑枝皮為原料，以水醇=100%-20% 0%-80%為提取溶劑，提取溶劑的體積為桑枝皮重量的6-10倍；調(diào)節(jié)提取液ΡΗ2-7，加熱回流，提取液過濾，重復(fù)2次提取，除去藥渣；第2、加熱減壓濃縮第I步獲得的提取液，至原桑枝皮重量的1/2 I倍；第3、加入體積百分含量為75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量為第2步得到的濃縮提取液體積的3 5倍，在4 30°C進(jìn)行醇沉淀；離心或過濾，除去殘渣和不溶物，得到上清液；第4、取第3步獲得的醇沉淀濃縮后的上清液，經(jīng)陽離子交換樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用O. 2 I. 5mol氨水洗脫，洗脫液上陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，收集液調(diào)PH8;第5、采用膜過濾，濾液冷凍干燥成干粉，或?qū)⑹占褐苯訃婌F干燥成型制成干粉，得淡黃色的水溶性總生物堿提取物，該提取物具有對α -糖苷酶的抑制活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述淡黃色的水溶性總生物堿提取物中I-脫氧野尻霉素含量占總提取物的50% -70%。
3.權(quán)利要求I所述方法獲得的桑皮水溶性總生物堿的應(yīng)用，其特征是將所述的桑皮水溶性總生物堿與藥物制劑所允許的藥物輔料結(jié)合，用于制備降血糖藥物，制備成適合于使用的各種劑型。
全文摘要
一種從桑枝皮中提取純化具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性總生物堿的方法及應(yīng)用。該純化方法以桑枝皮為原料，加入提取溶劑(水醇=100%-20%0%-80%)提取，加熱回流，過濾，重復(fù)提取2次，合并2次的濾液，濃縮；加入體積百分含量為75%～100%的甲醇或乙醇，在4～30℃進(jìn)行醇沉淀；離心或過濾，除去殘渣和不溶物，取醇沉淀濃縮后的上清液，經(jīng)陽離子交換樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用0.2～2mol氨水洗脫，洗脫液經(jīng)陰離子交換樹脂，用去離子水沖洗，收集不吸附部分，調(diào)pH8；采用膜過濾，濾液干燥，制成干粉，得淡黃色的水溶性總生物堿提取物，該提取物具有對α—糖苷酶的抑制活性，并且DNJ—含量為50-70%。
文檔編號A61K36/605GK102600245SQ20121011847
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者劉新元, 周德英, 朱元元, 朱曉丹, 白鋼, 聶萬達(dá) 申請人:南開大學(xué), 天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠