專利名稱：人工熊膽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熊膽技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種人工熊膽。
背景技術(shù)：
熊膽與 牛黃、麝香并稱為中藥三件寶。熊膽為熊科動(dòng)物黑熊(Selensrctosthibetsuns cuvier)或棕熊(vrsus actos L.)的干燥膽,始載于《唐本草》一向以貴重藥材而聞名，其味苦無毒，有清肝明目，抗菌消炎，利膽排石，擴(kuò)冠降脂等功效，用于驚風(fēng)抽搐、目赤、咽喉腫痛、膽結(jié)石、心血管疾病、病毒感染等病癥。熊膽是我國(guó)中醫(yī)藥臨床的傳統(tǒng)中藥，用途廣泛，療效顯著。傳統(tǒng)方法是冬季捕獲剖腹取膽，一熊一膽，導(dǎo)致現(xiàn)在野生熊類資源枯竭。為了保護(hù)熊類，八十年代人們發(fā)明了養(yǎng)熊活體引流取膽的方法，目前市場(chǎng)上流通的熊膽粉基本都是人工活熊引流熊膽汁干燥粉，其有效成分接近于天然熊膽粉。隨著人們動(dòng)物保護(hù)意識(shí)的提高，取締養(yǎng)熊取膽業(yè)已成為當(dāng)今熱門話題，我國(guó)政府也逐步加強(qiáng)了對(duì)野生熊類資源的保護(hù)工作，大力支持天然熊膽的替代品研究工作，不久的將來，引流取膽的做法將被取締，因而人工合成熊膽是一種既能滿足臨床用藥需要，又能徹底保護(hù)熊類資源不被破壞的根本方法，即符合世界動(dòng)物保護(hù)潮流，又符合國(guó)家政策、法規(guī)支持、保護(hù)的范疇。象人工牛黃、人工麝香一樣，熊膽的人工制成品的開發(fā)研制乃當(dāng)務(wù)之急，意義重大，前景十分廣闊。理想的人工熊膽應(yīng)該是成分含量比例與天然品一致，原料來源廉價(jià)易得，制作工藝簡(jiǎn)單，成本低于天然品等。近年來涉及人工熊膽的制造思路總計(jì)有5個(gè)專利文獻(xiàn)，按申請(qǐng)年限順序排列如下(I) CN1357334A 2002_7_10，章貴榮等《人造熊膽粉》方法是用禽膽汁在強(qiáng)氧化劑和還原劑的作用下，將膽汁中的?；蛆Z去氧膽酸轉(zhuǎn)化成牛磺熊去氧膽酸，然后添加膽汁色素、膽汁酸成分，加工配制成人造熊膽粉。該法的優(yōu)點(diǎn)是改變了以往從雞膽中提取鵝去氧膽酸，再轉(zhuǎn)化成熊去氧膽酸的常規(guī)做法，而是直接由膽汁直接轉(zhuǎn)化，而且不破壞結(jié)合型膽汁酸成分，思路較新穎。缺點(diǎn)是雞膽中膽汁酸不僅含有牛磺鵝去氧膽酸、?；悄懰?、牛磺去氧膽酸，同時(shí)還含有甘氨鵝去氧膽、甘氨膽酸、甘氨去氧膽酸等成分，在氧化、還原反應(yīng)下，其他雜質(zhì)成分也同時(shí)參與轉(zhuǎn)化，雜質(zhì)成分也在不斷放大，最后體系成分復(fù)雜，使該人造熊膽的成份、含量及其比列很難與天然品一致。(2) CN1465384A 2004_1_7，江崇波《人工熊膽及其制造方法》是將?；切苋パ跄懰徕c、混合膽素、多種氨基酸、礦質(zhì)元素等通過一定工藝，制成人工熊膽。該法制成的人工熊膽與天然品有著相同、相似的理化性狀，各種成分的含量比例用紅外和液相檢測(cè)圖譜顯示與天然品極為相似。(3)CN1513480A 2004-7-21楊澤民等《人工熊膽》方法是將牛磺熊去氧膽酸鈉、雞膽膏、膽紅素混合制成人工熊膽。其方法先進(jìn)處是利用雞膽中膽汁酸成分絕大多數(shù)與天然熊膽相似特性，采用雞膽膏做基質(zhì)，可以補(bǔ)充大量已知未知成分，而且大大降低了配方成本。缺點(diǎn)是雞膽中含有大量蛋白成分，不經(jīng)處理直接做人工熊膽成分添加，會(huì)導(dǎo)致成分中膽汁酸、氨基酸、膽色素等組分與雞膽一致，而與熊膽差別很大，添加膽紅素系來源于其它動(dòng)物源，其提取純化后成本不菲，會(huì)高于一般人工活熊引流熊膽。(4)CN102058621A 2011-5-18陳寶香《人工熊膽》，專利方法是利用兔膽、雞膽、鴨膽、鵝膽混合而成制成人工熊膽。缺點(diǎn)是?；切苋パ跄懰岷繕O低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到熊膽粉目前2010版規(guī)定的30%以上標(biāo)準(zhǔn)，還含有過量的石膽酸等有細(xì)胞毒性的有害物質(zhì)，其組分與熊膽粉相似，但含量比例與天然熊膽有明顯差別。(5) CN101721428A 2010-6-9傅軍《人工熊膽的合成新技術(shù)》方法是將處理過的禽膽添加?；切苋パ跄懰?、氨基酸、微量元素等制成人工熊膽。該申請(qǐng)的配方工藝路線方法與以上(2)法完全一致。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種人工熊膽，該人工熊膽在CN1465384A2004-1-7的基礎(chǔ)上，根據(jù)天然熊膽膽汁酸、膽色素、氨基酸、微量元素等有效成分，采用幾種天然動(dòng)物膽汁相似的成分進(jìn)行分離純化篩選基質(zhì)物質(zhì)，進(jìn)一步補(bǔ)充添加不足的功能成分，這樣合成的人工熊膽不僅 成本低廉，而且能夠替代天然熊膽。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種人工熊膽，其特征在于，該人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下
牛磺熊去氧膽酸鈉 35 48 混合膽素50 63 氨基酸I 3 微量元素0.5 I ;所述的混合膽素為禽膽汁中的一種或幾種的混合物、和牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁、狗膽汁中的一種或幾種的混合物。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下
牛磺熊去氧膽酸鈉 40 43 混合膽素55 58氨基酸I 3 此配方更接近于天然熊膽。
微量元素0.5 I。天然熊膽的化學(xué)成分很復(fù)雜，種屬、產(chǎn)地及捕殺季節(jié)不同，差異很大。歸納有以下幾類①膽汁酸類?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、?；悄懰?，及微量的牛磺去氧膽酸或甘氨去氧膽酸，還有部分以上單體分解物。②氨基酸類賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、?；撬岬娶勰懮仡惸懠t素、膽綠素等 ④其他類膽固醇、脂肪、磷脂、無機(jī)鹽等其中膽汁酸中，含游離型和結(jié)合型熊去氧膽酸占17% 74%，其中?；切苋パ跄懰岷空伎偰懰岬?5% 70.9%。普遍認(rèn)為?；切苋パ跄懰崾墙獐d作用的主要成分，也是含量最多的特征成分。禽膽汁含有多種有效成分，主要含牛磺(甘氨)鵝去氧膽酸、牛磺(甘氨)膽酸、?；?甘氨)去氧膽酸、別膽酸、膽綠素、粘蛋白、無機(jī)鹽等。羊膽汁主要成分有膽汁酸鹽、膽色素(膽紅素、膽綠素)、粘蛋白、膽留醇等。其中膽酸為I，O % 23. 4 %，去氧膽酸I. 4 7. 6 %，鵝去氧膽酸O. 4 % 9. 6 %，膽甾酸總量 3. 5% 32. 1%。羊膽中含膽酸與去氧膽酸，含膽紅素也含膽綠素。羊膽中膽酸含量比牛膽高。羊膽汁中，?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸含量比牛膽汁高。兔膽的主要膽汁酸為去氧膽酸、膽酸二者的比例為9 1，還含有膽綠素。兔膽和熊膽在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、抗電驚厥、對(duì)心臟正性肌力作用、常壓耐缺氧以及對(duì)小鼠胃腸推進(jìn)等項(xiàng)藥理作用方面相似或強(qiáng)于熊膽。故從藥理學(xué)角度，兔膽與熊膽作用相似。狗膽在色澤、熒光、入水現(xiàn)象等方面與熊膽有著極大的相似性。狗膽汁中含?；悄懰?、?；侨パ跄懰?、牛磺鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰峒芭；鞘懰?、膽紅素等，狗膽汁中含有20種人體需要的氨基酸，其中16種氨基酸超過豬膽中同種氨基酸的含量，還有2種氨基酸超過熊膽中同種氨基酸的含量，其中?；撬岷孔罡?12. 62%)。據(jù)有關(guān)報(bào)道顯示，各種動(dòng)物膽汁中膽紅素，乳牛及狗含量最高，豬膽次之，牛膽汁再次之。狗膽中含有9種人體必需的微量元素，其中鈣與銅含量超過熊膽與豬膽。對(duì)增加心肌收縮力，增加冠狀動(dòng)脈血流量有著重要意義。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的禽膽汁為雞膽汁、鴨膽汁或鵝膽汁。作為優(yōu)選的技術(shù)方案1，所述混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、牛膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 I I. 5 O. 5 O. 8 I I. 5。作為優(yōu)選的技術(shù)方案2，所述混合膽素為雞膽汁、鵝膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 3 4 O. 5 O. 7 O. 5 O. 7 I
I.2 2 2. 5。作為優(yōu)選的技術(shù)方案3，所述混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、鵝膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 O. 5 O. 8 I I. 2 O. 5 O. 8 I I. 2 2 2. 5。作為優(yōu)選的技術(shù)方案4，所述混合膽素為雞膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 O. 5 O. 8 I I. 2 O. 5 O. 8 2。上述的混合膽素，其制備方法包括將禽膽中的I種以上、和牛羊膽、兔膽、狗膽中的一種或幾種的混合物破碎，濾布?jí)悍謩e濾，收集膽汁，冷藏去油脂，利用PH值的變化分離析出蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等雜質(zhì)成分，加熱變性物理法離心去出雜質(zhì)，離心液真空濃縮成稠膏備用。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的?；切苋パ跄懰徕c的制備方法，包括(I)取喹啉和二甲基甲酰胺混合，在O 5°C下不斷攪拌，加入氯甲酸乙酯，攪拌均勻后，滴加到冰浴中的KOH溶液中，攪拌反應(yīng)IOmin 20min，用二氯甲烷萃取，去水相，有機(jī)相干燥，過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇和無水乙醚，攪拌下加入三氟化硼乙醚試劑，保持溫度30 40°C反應(yīng)4h 5h，靜置分層，收集乙醚層，減壓蒸餾，收集125 130°C /15Pa餾分，得蠟狀物EEDQ mp56 58°C ;(2)熊去氧膽酸和牛磺酸在堿性條件下采用步驟(I)制得的EEDQ縮合劑(N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1, 2-dihydro-quinoline)進(jìn)行縮合反應(yīng)，即得橫熊去氧膽酸鈉。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(I)中的喹啉與二甲基甲酰胺的比例為8 12 40 60(g/mL);所述喹啉與氯甲酸乙酯的質(zhì)量比為8 12 7 11 ;所述喹啉與無水乙醇的比例為8 12 : 8 12(g/mL);所述無水乙醇與無水乙醚的體積比為8 12 40 60 ;所述三氟化硼乙醚試劑與無水乙醇的體積比為O. 15 O. 25 8 12。所述步驟⑵具體如下稱取5mmol熊去氧膽酸與6. 5mmolEEDQ,加入IOmlDMF溶液中攪拌溶解，將6mmol?；撬崤cO. 9ml三乙胺分別加入上述溶解液中，不斷攪拌反應(yīng)，反 應(yīng)物在90°C攪拌回流Ih后去熱源，再攪拌Ih至室溫，用冷乙醚結(jié)晶，冷藏過夜。過濾，沉淀物用乙醚洗滌，溶于30ml 二氯甲烷中，過濾除不溶物，在0°C左右將澄清液慢慢加入120ml乙醚后過濾，沉淀用乙醚洗滌后溶于30ml O. 2mol/LNa0H甲醇溶液中，攪拌下加入IOOml乙醚，產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，用乙醚洗后真空干燥得白色粉末?；切苋パ跄懰徕c。上述方案將EEDQ試劑自行合成，較好的解決了價(jià)格昂貴問題，反應(yīng)條件溫和可控。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的?；切苋パ跄懰徕c的另一種制備方法，包括(I)以熊去氧膽酸為原料，經(jīng)過乙?；ⅤＢ然磻?yīng)得到混合酸酐溶液；(2)將?；撬崛苡谔妓徕c溶液中，得到牛磺酸的碳酸鈉溶液；將所述牛磺酸的碳酸鈉溶液滴加到步驟(I)中的混合酸酐溶液中，攪拌，濾除沉淀得濾液；(3)將步驟(2)中的濾液的pH調(diào)整為6 7，濃縮干燥得牛磺熊去氧膽酸粗品干燥物；(4)將步驟(3)中的濃縮干燥物脫鹽純化和重結(jié)晶，即得?；切苋パ跄懰?。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(I)中的乙?；?、酰氯化的具體過程如下在反應(yīng)釜中加入質(zhì)量比為8 10 I的丙酮和熊去氧膽酸，分散均勻，冷卻至-5 -10°C，得到冷卻后的混合液；向冷卻后的混合液中滴加用丙酮稀釋后的三乙胺溶液，滴加完畢后再滴加氯甲酸乙酯，繼續(xù)在-5 -10°C攪拌，過濾，過濾后的濾液即為混合酸酐溶液；其中三乙胺與熊去氧膽酸的質(zhì)量比為2 3 10;三乙胺與用于稀釋的丙酮的體積比為3 2 ;所述步驟(3)使用鹽酸調(diào)節(jié)pH ；所述步驟(3)中的濃縮干燥為將調(diào)節(jié)pH后的濾液蒸干，然后在70°C 90°C下減壓抽干；所述脫鹽純化的具體過程如下，向步驟(3)中的?；切苋パ跄懰岽制犯稍镂镏屑尤霟o水乙醇，70 90°C回流處理，待鹽松散后過濾，除鹽和未反應(yīng)的牛磺酸，在濾液攪拌下加入乙酸乙酯-丙酮混合溶液中，劇烈攪拌，產(chǎn)生白色沉淀，室溫下靜置12h 24h，吸取上層液，過濾收集濾餅；其中?；切苋パ跄懰岽制犯稍镂锱c無水乙醇的質(zhì)量體積比I : 4 5g/L ;所述重結(jié)晶的具體過程如下將所述濾餅用水溶解，再加入丙酮溶液中攪拌，2°C 5°C冷藏8 12h，過濾得白色漿狀物，70 90°C真空干燥，粉碎；其中水與丙酮溶液的體積比為I : 5 10。進(jìn)一步的，所述步驟(2)中的碳酸鈉溶液為lmol/L ;所述?；撬崤c碳酸鈉溶液的質(zhì)量體積比為18 23 100g/mL。進(jìn)一步的，所述氨基酸為天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸的混合物。進(jìn)一步的，所述礦質(zhì)元素為含鉀、鎂、錳、鋅、銅、鐵、鉻、鈣的食用藥用級(jí)鹽類化合物。一種人工熊膽粉，將上述原料，在60°C 90°C水平薄膜干燥，即得。本發(fā)明的人工熊膽是在CN1465384A 2004_1_7，江崇波《人工熊膽及其制造方法》的研究基礎(chǔ)上，模擬天然熊膽的化學(xué)成分和特征成分，設(shè)計(jì)篩選可食用動(dòng)物膽汁、膽色素、 氨基酸、微量元素等成分為人工熊膽基質(zhì)，根據(jù)各種活性成分的含量及比例相似原理，確定一個(gè)較穩(wěn)定的配方，體現(xiàn)了人工熊膽成分的多樣性和協(xié)同性。本發(fā)明通過十多年的研究改進(jìn)，主要是通過篩選與熊膽主要成分相似的動(dòng)物膽汁加以生化分離，最大限度保留原膽汁中全價(jià)的膽汁酸、氨基酸、膽色素、微量元素等生物活性成分，添加牛磺熊去氧膽酸鈉原料藥、添加補(bǔ)充部分氨基酸、微量元素等使人工熊膽的配方更趨于合理，成份更趨于天然，本發(fā)明優(yōu)于現(xiàn)有人工熊膽，不僅產(chǎn)品價(jià)格低廉，而且無論在外觀性狀、理化鑒別還是內(nèi)在質(zhì)量上、藥理藥效等方面都與天然熊膽相似，產(chǎn)品質(zhì)量符合升級(jí)后的2010年版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是理想的熊膽人工替代品。本發(fā)明的產(chǎn)品在物理性狀、鑒別特征、顏色氣味、理化性質(zhì)、主要成分含量及比例等方面均符合熊膽粉國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)各項(xiàng)規(guī)定。本發(fā)明人工熊膽粉整體藥理學(xué)試驗(yàn)證明，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、保肝利膽等方面具有與天然熊膽相似的藥理作用，完全可以替代天然熊膽粉，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且價(jià)格較天然(引流)熊膽粉低，易被接受。另外，分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了本發(fā)明人工熊膽粉具有抑制MGc80-3 (腫瘤細(xì)胞)生長(zhǎng)和增殖作用。本發(fā)明不僅工藝簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化大生產(chǎn)，溶劑采取廉價(jià)、常用、易得品，可以精餾回收套用，利用率達(dá)60%，大大降低生產(chǎn)成本，凸顯經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明采用仿生學(xué)原理，將天然熊膽中?；蛆Z去氧膽酸、?；悄懰?、膽紅素、膽綠素、多種氨基酸、膽固醇、脂肪、無機(jī)鹽等含量及其比例作為基質(zhì)物主要化學(xué)成分指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，篩選組配，形成復(fù)合膽素浸膏。本發(fā)明生產(chǎn)工藝參仿熊膽汁干燥工藝，60°C 90°C水平薄膜干燥，具有和天然熊膽一樣的性狀，氣腥味極苦微回甜，棕褐色玻璃樣光澤，水試在水面旋轉(zhuǎn)避塵，下沉黃線不擴(kuò)散；火試起泡無煙和羽毛氣味；其它理化指標(biāo)與熊膽粉保持一致。復(fù)合膽素是以禽膽包括雞、鴨、鵝膽為基礎(chǔ)，利用禽膽汁中主要膽汁酸成分與熊膽主要成分相同或相似；牛羊膽、兔膽、狗膽等動(dòng)物的膽富含膽色素、膽汁酸等有效成分可以彌補(bǔ)單純禽膽作為人工熊膽基質(zhì)成分的不足。各種動(dòng)物膽汁中膽紅素，乳牛及狗含量最高，豬膽次之，牛膽汁再次之。本方法不用單獨(dú)添加膽紅素及部分氨基酸組分，盡量減少有機(jī)化學(xué)合成品添加，盡量采取天然膽汁的有效成分，不僅大大降低產(chǎn)品成本，而且產(chǎn)品安全性明顯提高。有益效果
(I)配方更安全采用幾種天然可食用動(dòng)物膽汁作為人工熊膽基本組分添加物，不僅可以補(bǔ)充、調(diào)整、替代天然熊膽膽汁酸成分，而且具有毒性低、副作用少，容易被吸收等特點(diǎn)，更安全可
O(2)本配方盡量減少或不加膽色素、微量元素?zé)o機(jī)鹽等人為添加物，按仿生學(xué)原理組方，使配方中有效物質(zhì)含量及其比列更接近天然熊膽，在紅外光譜、液相色譜等分析結(jié)果表明與天然熊膽相似或相同。(3)本配方采用幾種常見動(dòng)物膽汁為配方，膽源易采、易得、易加工，而且具有顯著臨床功效。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖I為實(shí)施例5中人工熊膽粉與天然熊膽粉、TUDCA的紅外吸收光譜；其中a_天然熊膽粉，b-TUDCA，c-人工熊膽粉；圖2為本發(fā)明的?；切苋パ跄懰徕c的一種反應(yīng)式；圖3為本發(fā)明的牛磺熊去氧膽酸鈉的另外一種反應(yīng)式。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例I人工熊膽配方
?；切苋パ跄懰徕c 40 混合膽素56 氨基酸3. 微量元素I其中氨基酸是指天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸的等比混合物。微量元素是指鉀、鎂、錳、鋅、銅、鐵、鉻、鈣等8種金屬的食用藥用級(jí)鹽類化合物的混合物?；旌夏懰貫殡u膽汁、鴨膽汁、牛膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 : I : O. 5 : I。雞膽汁的制備將雞膽破碎，濾布?jí)悍謩e濾，收集膽汁，冷藏去油脂，利用pH值的變化分離析出蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等雜質(zhì)成分，加熱變性物理法離心去除雜質(zhì)，離心液真空濃縮成稠膏備用。鴨膽汁、牛膽汁和狗膽汁的制備方法如雞膽汁的制備方法。具體制造工藝取20L去離子水加熱至80°C，加入?；切苋パ跄懰?公斤攪拌下令其熔融，在加入300g氨基酸混合物、IOOg微量元素混合物，充分?jǐn)嚢枞芙?，將混合膽?. 6公斤干膏粉加入，不斷攪拌使其全部溶解，再攪拌I小時(shí)，鋪于烘盤上80°C以下烘干8 10小時(shí)，取出粗粉即得。實(shí)施例2此實(shí)施例與實(shí)施例I不同的是混合膽素不同，其余與實(shí)施例I相同。 此實(shí)施例中使用的混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、牛膽汁和狗膽汁的混合物，它們的膽汁的質(zhì)量比6 : I : O. 5 : I。實(shí)施例3此實(shí)施例與實(shí)施例I不同的是混合膽素不同，其余與實(shí)施例I相同。此實(shí)施例中使用的混合膽素為雞膽汁、鵝膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的膽汁的質(zhì)量比為 6 : 3 : O. 5 : O. 5 : I : 2。實(shí)施例4此實(shí)施例與實(shí)施例I不同的是混合膽素不同，其余與實(shí)施例I相同。此實(shí)施例中使用的混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、鵝膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的膽汁的質(zhì)量比為 6 : O. 5 : I O. 5 1:2。實(shí)施例5此實(shí)施例的與實(shí)施例I不同的是混合膽素不同，其余與實(shí)施例I相同。此實(shí)施例中使用的混合膽素為雞膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的膽汁的質(zhì)量比為6 : O. 5 : I : O. 5 : 2。取人工熊膽與天然熊膽及TUDCA的紅外吸收光譜圖(如圖I所示)在4000 1800CHT1，1333 800011^,700 400cm 1 譜圖基本一致，1554CHT1 峰為 TUDCA 的 IR 特征峰，從人工熊膽和天然熊膽譜圖中二者峰高及比值，可以推測(cè)人工熊膽TUDCA的量高于天然品。實(shí)施例I 5中的配方可以在這個(gè)范圍內(nèi)調(diào)整該人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下?；切苋パ跄懰徕c 35 48 混合膽素50 63
氨基酸I 3
微量兀素0.5 I?；蛘咴谙率龅姆秶鷥?nèi)調(diào)整；
?；切苋パ跄懰徕c.40 43
混合膽素55 58
氨基酸I 3
微量元素0.5 I。此范圍內(nèi)的配方更接近天然天然熊膽。實(shí)施例6上述實(shí)施例I中的?；切苋パ跄懰徕c可以通過下述方法制得，具體如下(I)取IOg喹啉和45ml 二甲基甲酰胺放入三口燒瓶中，在O 5°C下不斷攪拌，力口入9g氯甲酸乙酯，攪拌均勻后，滴加到冰浴中的100ml 7% KOH溶液中，攪拌反應(yīng)lOmin，用二氯甲烷萃取，去水相，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥12h 24h，過濾，減壓濃縮，加入IOml無水乙醇和45ml無水乙醚，攪拌下加入O. 2ml三氟化硼乙醚試劑，保持溫度30 40°C反應(yīng)4h，靜置分層，乙醚層用碳酸氫鈉飽和溶液處理，用無水硫酸鈉干燥12 24h，過濾，濾液常壓蒸除溶劑后，減壓蒸餾，收集125 130°C/15Pa餾分，得蠟狀物EEDQ(5. 3g，25% )mp56 58 °C ；(2)稱取5mmol熊去氧膽酸與6. 5mmolEEDQ,加入IOmlDMF溶液中攪拌溶解，將6mmol?；撬崤cO. 9ml三乙胺分別加入上述溶解液中，不斷攪拌反應(yīng)，反應(yīng)物在90°C攪拌回流Ih后去熱源，再攪拌Ih至室溫，用冷乙醚結(jié)晶，冷藏過夜。過濾，沉淀物用乙醚洗滌，溶于30ml 二氯甲烷中，過濾除不溶物，在0°C左右將澄清液慢慢加入120ml乙醚后過濾，沉淀用乙醚洗滌后溶于30ml0. 2mol/LNaOH甲醇溶液中，攪拌下加入IOOml乙醚，產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，用乙醚洗后真空干燥得白色粉末?；切苋パ跄懰徕c(4. 25mmol，產(chǎn)品得率85% )。實(shí)施例7上述實(shí)施例I中的?；切苋パ跄懰徕c可以通過下述方法制得，具體如下(I) IOg熊去氧膽酸原料(25. 5mmol), 2. 7g三乙胺(26. 5mmol)溶于丙酮IOOml溶液中，冷卻至-5 -10°C，向溶液中滴加2. 9g氯甲酸乙酯(25.97mmol)，滴加完畢后繼續(xù)在-5 -10°C攪拌20min，過濾除去三乙胺鹽，濾液備用；(2)?；撬峥s合反應(yīng)將?；撬?g(31. 875mmol)溶于22ml lmol/L碳酸鈉溶液中，滴加到前項(xiàng)所得混合酸酐溶液中，在20 30°C下30min內(nèi)均速添加完畢，快速攪拌3h 4h，濾除沉淀，濾液備用；(3)調(diào)酸與濃縮干燥上述濾液用2mol/LHCL溶液調(diào)pH6 7，回收蒸干溶液，80°C下繼續(xù)減壓抽干，得?；切苋パ跄懰岣稍镂?；所述的減壓抽干可以選取的溫度范圍為70°C 90°C，本實(shí)施例中選取 80 0C ；(4)脫鹽純化向上述干燥物中添加40ml無水乙醇80°C左右進(jìn)行回流處理lh，待鹽松散后過濾除鹽和未反應(yīng)的?；撬?，將濾液攪拌下加入IOOOml乙酸乙酯-丙酮(50 50v/v)混合溶液中，劇烈攪拌，產(chǎn)生大量白色沉淀，室溫下靜置一夜，吸取上層液，過濾收集濾餅，待進(jìn)一步純化；所述的回流處理的溫度可以選取70°C 90°C，本實(shí)施例中選取80°C，回流處理的時(shí)間根據(jù)具體情況可以為Ih 2h ;
(5)精制重結(jié)晶上述濾餅用IOOml水溶解，加入900ml丙酮溶液中攪拌，2°C 5°C冷藏12h，過濾得白色漿狀物，80°C真空干燥，粉碎得牛磺熊去氧膽酸。所述的真空干燥的溫度可以選取70°C 90°C，本實(shí)施例中選取80°C。產(chǎn)品得率為76%。本發(fā)明人工熊膽臨床前預(yù)實(shí)驗(yàn)研究I整體藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)I. I對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響結(jié)果與對(duì)照組比較，天然熊膽粉組和人工熊膽粉4g/kg和2g/kg組均能明顯減少小鼠扭體次數(shù)。I. 2對(duì)二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響結(jié)果與對(duì)照組比較，天然熊膽粉4g/kg組、人工熊膽粉4g/kg和2g/kg組均能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳殼腫脹作用。I. 3對(duì)士的寧誘發(fā)小鼠驚厥潛伏期的影響。結(jié)果與對(duì)照組比較，天然熊膽粉、人工熊膽粉4g/kg組均有拮抗士的寧誘發(fā)小鼠驚厥的作用。I. 4對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響結(jié)果與對(duì)照組比較，天然熊膽粉和人工熊膽粉4g/kg組均能明顯抑制小鼠自主活動(dòng)次數(shù)。I. 5對(duì)2，4 二硝基酚所致大鼠發(fā)熱體溫的影響表5天然與人工熊膽粉降低體溫作用
權(quán)利要求
1.一種人工熊膽，其特征在于，該人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下 ?；切苋パ跄懰徕c 35 48 混合膽素50 63氨基酸I 3微量元素0.5 I ; 所述的混合膽素為禽膽汁中的一種或幾種的混合物，和牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁、狗膽汁中的一種或幾種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種?；切苋パ跄懰徕c的制備方法，其特征在于，所述人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下 牛磺熊去氧膽酸鈉 40 43混合膽素55 58氨基酸I 3微量元素0.5 I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種牛磺熊去氧膽酸鈉的制備方法，其特征在于，所述的禽膽汁為雞膽汁、鴨膽汁或鵝膽汁。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、牛膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 I I. 5 O. 5 O. 8 I I. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述混合膽素為雞膽汁、鵝膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 : 3 4 : 0.5 O.7 O. 5 O. 7 I I. 2 2 2. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述混合膽素為雞膽汁、鴨膽汁、鵝膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 :0.5 0.8 I I. 2 O. 5 O. 8 I I. 2 2 2. 5 ;或所述混合膽素為雞膽汁、牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁和狗膽汁的混合物，它們的質(zhì)量比為6 8 O. 5 O. 8 I I. 2 O. 5 0.8 : 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述的?；切苋パ跄懰徕c的制備方法，包括 (I)取喹啉和二甲基甲酰胺混合，在O 5°C下不斷攪拌，加入氯甲酸乙酯，攪拌均勻后，滴加到冰浴中的KOH溶液中，攪拌反應(yīng)IOmin 20min，用二氯甲烷萃取，去水相，有機(jī)相干燥，過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇和無水乙醚，攪拌下加入三氟化硼乙醚試劑，保持溫度30 40°C反應(yīng)4h 5h，靜置分層，收集乙醚層，減壓蒸餾，收集125 130°C /15Pa餾分，得蠟狀物EEDQ mp56 58°C ;(2)熊去氧膽酸和?；撬嵩趬A性條件下采用步驟(I)制得的EEDQ縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，即得?；切苋パ跄懰徕c。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述步驟(I)中的喹啉與二甲基甲酰胺的比例為8 12 40 60g/mL ;所述喹啉與氯甲酸乙酯的質(zhì)量比為8 12 7 11 ;所述喹啉與無水乙醇的比例為8 12 : 8 12g/mL ;所述無水乙醇與無水乙醚的體積比為8 12 40 60 ;所述三氟化硼乙醚試劑與無水乙醇的體積比為O. 15 O. 25 8 12。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種人工熊膽，其特征在于，所述礦質(zhì)元素為含鉀、鎂、錳、鋅、銅、鐵、鉻、鈣的食用藥用級(jí)鹽類化合物。
10.一種人工熊膽粉，其特征在于，將權(quán)利要求I或2所述的人工熊膽，在60°C 90°C水平薄膜干燥，即得。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種人工熊膽，該人工熊膽的配方中包括的組份及其質(zhì)量百分比如下?；切苋パ跄懰徕c35～48，混合膽素50～63，氨基酸1～3，微量元素0.5～1；所述的混合膽素為禽膽汁中的一種或幾種的混合物、和牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁、狗膽汁中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明人工熊膽粉整體藥理學(xué)試驗(yàn)證明，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、保肝利膽等方面具有與天然熊膽相似的藥理作用，完全可以替代天然熊膽粉，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且價(jià)格較天然(引流)熊膽粉低，易被接受。另外，分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了本發(fā)明人工熊膽粉具有抑制MGc80-3腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用。
文檔編號(hào)A61K35/413GK102836175SQ20121016269
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者江崇波 申請(qǐng)人:杭州寶積生物科技有限公司