一種短肽、載銅納米生物材料及在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種自組裝短肽,它的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO:1所述。一種載銅納米生物材料,為RP自組裝短肽、RAD16-II自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質(zhì),所述混合溶液中,RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM,RAD16-II自組裝短肽的濃度為2mM~8mM、CuSO4的濃度為10μM~100μM,所述RP自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO:1所述,所述RAD16-II自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO:2所述。實驗表明,所述載銅納米生物材料可在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中應(yīng)用。
【專利說明】一種短肽、載銅納米生物材料及在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域,特別涉及自組裝短肽、含自組裝短肽的載銅納米生物材料及其在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自組裝短肽是一種新型的納米生物材料,自20世紀90年代問世以來,受到了人們的廣泛重視,得到了快速的發(fā)展,并在細胞三維培養(yǎng)及制備疏水藥物載體、止血藥物、燒傷治療藥物、抑菌藥物、白血病治療或預(yù)防藥物等方面應(yīng)用。但是,制備出更多的自組裝短肽、擴大自組裝短肽的應(yīng)用范圍仍然是科技工作者關(guān)注的問題。
[0003]下肢缺血性疾病是一種世界范圍內(nèi)常見的下肢動脈慢性狹窄或閉塞導(dǎo)致的外周血管病,下肢缺血性疾病主要包括下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)、血栓閉塞性脈管炎(TAO)和糖尿病動脈硬化閉塞癥(DAO)。下肢缺血性疾病往往由于病側(cè)主要動脈嚴重閉塞,造成遠端供血障礙,其最終結(jié)局往往是截肢甚至死亡。下肢缺血性疾病發(fā)病率都在逐年急速上升。據(jù)統(tǒng)計,在西方國家最新的重度下肢缺血(Critical limb ischemia, CLI)的發(fā)病率為500-1000/百萬人/年,在美國每年病例數(shù)量為150000-300000。CLI第一年的死亡率和發(fā)病率超過了惡性腫瘤,死亡率為25%,截肢率為30%。在我國,現(xiàn)有下肢缺血病人2000萬以上,年增長高達60萬。近年來,隨著引起血管疾病危險因素的增多,如高血脂、高血壓、糖尿病等疾病發(fā)病人數(shù)的急速增加以及老齡化時代的到來,下肢缺血性疾病已逐漸凸顯出嚴重的危害程度和發(fā)病率逐年增高的趨勢,面對如此嚴峻形勢,如何減少患者的致殘率、挽救已瀕于截肢的病人肢體,是醫(yī)療領(lǐng)域急需解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種自組裝短肽和含自組裝短肽的載銅納米生物材料,本發(fā)明的再一目的是證明載銅納米生物材料能使病變組織器官的血管新生,以便開發(fā)出一類治療下肢缺血性疾病的新型藥物。
[0005]本發(fā)明所述自組裝短肽,命名為RP,其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所述,其理論分子量為3066.15道爾頓。本發(fā)明所述載銅納米生物材料,為上述RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質(zhì),所述混合溶液中,RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM,RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~~8mM、CuSO4的濃度為ΙΟμΜ~ΙΟΟμΜ,所述RAD16-1I自組裝短肽已公開[見ShuguangZhang.Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cellcultures.Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 413 - 420],其氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所述。本發(fā)明所述載銅納米生物材料,其制備方法如下:
[0006](I)去離子水的滅菌處理
[0007]將去離子水在蒸汽壓103.4kPa、溫度121.3°C下處理至少30分鐘,然后冷卻至室溫;
[0008](2)原料溶液的配制
[0009]在室溫、常壓下將CuSO4用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成CuSO4溶液,然后在超凈臺的無菌環(huán)境中將CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性濾器過濾除菌,所述CuSO4溶液中,CuSO4的濃度是上述形成凝膠狀物質(zhì)的混合液中的CuSO4濃度的2倍倍;
[0010]在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將RP自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RP自組裝短肽溶液,所述RP自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO:1所述,所述RP自組裝短肽溶液中,RP自組裝短肽的濃度是上述形成凝膠狀物質(zhì)的混合液中的RP自組裝短肽濃度的2倍倍;
[0011]在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將RAD16-1I自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RAD16-1I自組裝短肽溶液,所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:2所述,所述RAD16-1I自組裝短肽溶液中,RAD16-1I自組裝短肽的濃度是上述形成凝膠狀物質(zhì)的混合液中的RAD16-1I自組裝短肽濃度的2倍倍;
[0012](3)混合液的配制
[0013]所述混合液由步驟(2)配制的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液組成,CuSO4溶 液的量按混合液中CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M計量,RP自組裝短肽溶液的量按混合液中RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM計量,RAD16-1I自組裝短肽溶液的量按混合液中RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM計量,在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將計量好的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液加入反應(yīng)容器中,并混合均勻;
[0014](4)成膠
[0015]將步驟(3)所配制的混合液在室溫、常壓下超聲反應(yīng)20 min~40min,然后在常壓、4°C的環(huán)境中放置12小時~24小時,即形成的凝膠狀的載銅納米生物材料。
[0016]上述方法中,超聲反應(yīng)的超聲功率為160W~200W。
[0017]動物實驗表明,用本發(fā)明所述載銅納米生物材料對下肢缺血動物模型干預(yù)治療,可使缺血下肢的血管新生,從根本上改善缺血下肢的血供,顯著減少了缺血下肢的局部壞疽(見實施例5、實施例6)。
[0018]本發(fā)明所述載銅納米生物材料可以通過添加藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑,制成適于臨床使用的治療下肢缺血性疾病的藥物。
[0019]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0020]1、本發(fā)明提供了一種新型自組裝短肽,增加了自組裝短肽的種類。
[0021]2、實驗表明,本發(fā)明所述載銅納米生物材料可促進缺血下肢的血管新生,從根本上改善缺血下肢的血供,顯著減少缺血下肢的局部壞疽,對下肢缺血動物模型取得了顯著的治療效果。
[0022]3、本發(fā)明所述載銅納米生物材料是通過對缺血下肢進行肌肉局部注射的方式進行治療,較之搭橋、介入等手術(shù)方式治療,操作更加簡單,易于推廣。
[0023]4、本發(fā)明可為下肢缺血疾病的治療提供一種有效的新藥品,具有明顯的社會效益和經(jīng)濟效益?!緦@綀D】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明所述方法制備的自組裝短肽RP純化后的高效液相色譜圖(HPLC);
[0025]圖2是本發(fā)明所述自組裝短肽RP的質(zhì)譜圖;
[0026]圖3是實施例2所制備的RAD16-1I自組裝短肽純化后的高效液相色譜圖(HPLC);
[0027]圖4是實施例2所制備的RAD16-1I自組裝短肽的質(zhì)譜圖;
[0028]圖5是原子力顯微鏡(AFM)圖,圖中,Cu-NM代表本發(fā)明所述載銅納米生物材料;
[0029]圖6是實驗小鼠的缺血下肢病理評分照片
[0030]圖7是實驗小鼠的缺血下肢病理評分圖,圖中,Cu-NM代表本發(fā)明所述載銅納米生物材料;
[0031 ] 圖8是實驗小鼠的缺血下肢治療后第28天的血流灌注量測定照片,圖中,Cu-NM代表本發(fā)明所述載銅納米生物材料;
[0032]圖9是實驗小鼠的缺血下肢治療后第28天的血流灌注量測定圖,圖中,Cu-NM代表本發(fā)明所述載銅納米生物材料,**,表示Cu-NM治療組與對照組(Control組)具有顯著性差異(P〈0.01)。
【具體實施方式】
[0033]實施例1:自組裝短肽RP的合成
[0034]1、材料及設(shè)備
[0035]1.1 試劑
[0036]芴甲氧羰基(Fmoc)- 氨基酸為美國SIAM公司產(chǎn)品;PyBOP、Boc-His-Merrifield resin樹脂、六氫吡唳、二甲基吡唳為Merck公司產(chǎn)品;二甲基甲酰胺(DMF)為日本三星公司產(chǎn)品(使用前先經(jīng)茚三酮浸泡和3A分子篩脫水,并測定無游離氨基);二氯甲烷(DCM),為中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品(使用前用無水碳酸鉀浸泡處理);三氟乙酸(TFA)為GEEL BELGIUM公司產(chǎn)品;甲醇為上海振興化工一廠產(chǎn)品;HPLC甲醇為Merck公司產(chǎn)品;四氫呋喃為上?;瘜W(xué)試劑站中心化工廠產(chǎn)品。
[0037]1.2 儀器
[0038]431A型多肽合成儀為Applied biosystems產(chǎn)品,高效液相色譜儀為安捷倫1100色譜儀,制備色譜儀為WATERS600E ;冷凍干燥機(FREEZE DRYER 18)為LABC0NC0產(chǎn)品;質(zhì)譜儀為 Finnigan LCQ。
[0039]2、制備方法
[0040]2.1肽鏈的合成:
[0041]肽鏈的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保護基團的脫除用30%六氫吡啶的DMF溶液;肽鏈從樹脂上的切落用切肽試劑(三氟乙酸/結(jié)晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1)。
[0042]接肽前樹脂處理:
[0043]①稱取100毫克Boc- His -Merrifield resin到砂芯過濾反應(yīng)器中;
[0044]②加入二氯甲烷浸泡洗滌6 次,每次5毫升,過濾除去洗滌的二氯甲烷;
[0045]③加入10%的TFA (二氯甲烷作溶劑)5毫升,室溫反應(yīng)2小時,以除去樹脂上氨基酸N端的BOC保護基;[0046]④加入二氯甲烷浸泡洗滌3次,每次5毫升,然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作溶劑) 5毫升,2次中和PH值后再用二氯甲烷洗滌6次,DMF洗滌5次即可放入儀器反應(yīng)器中進行接肽反應(yīng)。
[0047]接肽在431 A多肽合成儀上進行,稱取IOOmg His -Merrifield resin放入反應(yīng)器中,然后按下列量在合成儀中依次加入各種Fmoc-氨基酸(反應(yīng)過程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反應(yīng)容器,而是按照多肽的序列順序從C端逐漸加入,每一個氨基酸反應(yīng)周期時間為40分鐘,在加入氨基酸的同時要加入相同摩爾的PYBOP試劑和HOBT試劑)
[0048]以下是序列中需要加入氨基酸的量:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種自組裝短肽,其特征在于它的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:1所述。
2.一種載銅納米生物材料,其特征在于該材料為RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質(zhì),所述混合溶液中,RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM,RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM、CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M,所述RP自組裝短肽為權(quán)利要求1所述自組裝短肽,所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID Ν0:2所述。
3.權(quán)利要求2所述載銅納米生物材料的制備方法,其特征在于工藝步驟如下: (1)去離子水的滅菌處理 將去離子水在蒸汽壓103.4kPa、溫度121.3°C下處理至少30分鐘,然后冷卻至室溫; (2)原料溶液的配制 在室溫、常壓下將CuSO4用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成CuSO4溶液,然后在超凈臺的無菌環(huán)境中將CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性濾器過濾除菌,所述CuSO4溶液中,CuSO4的濃度是權(quán)利要求2所述混合液中的CuSO4濃度的2倍~4倍; 在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將RP自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RP自組裝短肽溶液,所述RP自組裝短肽為權(quán)利要求1所述自組裝短肽,所述RP自組裝短肽溶液中,RP自組裝短肽的濃度是權(quán)利要求2所述混合液中的RP自組裝短肽濃度的2倍4倍; 在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將RAD16-1I自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RAD16-1I自組裝短肽溶液,所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所述,所述RAD16-1I自組裝短肽溶液中,RAD16-1I自組裝短肽的濃度是權(quán)利要求2所述混合液中的RAD16-1I自組裝短肽濃度的2倍倍; (3)混合液的配制 所述混合液由步驟(2)配制的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液組成,CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M計量,RP自組裝短肽溶液的量按混合液中RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM計量,RAD16-1I自組裝短肽溶液的量按混合液中RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM計量, 在超凈臺的無菌環(huán)境中于室溫、常壓下將計量好的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液加入反應(yīng)容器中,并混合均勻; (4)成膠 將步驟(3)所配制的混合液在室溫、常壓下超聲20 min~40min,然后在常壓、4°C的環(huán)境中放置12小時~24小時,即形成凝膠狀的載銅納米生物材料。
4.權(quán)利要求2所述載銅納米生物材料在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/16GK103467577SQ201210188770
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】唐成康, 康裕建 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院