I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法
【專利摘要】一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，所述I型膠原改性的多孔鈦涂層采用生物化學(xué)改性方法，以共價(jià)鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原。與物理吸附的膠原改性多孔鈦涂層相比，本發(fā)明提供的共價(jià)接枝的I型膠原改性多孔鈦涂層所固定的膠原量增加約一倍；固定穩(wěn)定性更好，在7天后仍保留有90%以上；并且具有更好的生物學(xué)性能，可應(yīng)用于促進(jìn)誘導(dǎo)骨組織生長的骨植入材料。本發(fā)明工藝簡單、效率高、可重復(fù)性好，為醫(yī)用生物涂層技術(shù)提供新的方法。
【專利說明】I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，具體涉及一種采用共價(jià)鍵接枝方式在等離子體噴涂鈦涂層表面固定有I型膠原并具有良好生物學(xué)性能的I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，屬于醫(yī)用生物涂層【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]鈦和鈦合金等是臨床上常用的骨植入材料。利用等離子體噴涂方法在其表面制備的多孔鈦涂層，是改善其與骨組織結(jié)合的常用方法。多孔結(jié)構(gòu)能夠增加骨和植入體表面之間的機(jī)械嵌合作用，使植入體與骨組織間的結(jié)合強(qiáng)度明顯提高。等離子體噴涂鈦涂層的人工關(guān)節(jié)等硬組織植入體已獲臨床應(yīng)用。然而，鈦涂層屬于生物惰性涂層，不具生物活性，對骨組織的生長并沒有促進(jìn)誘導(dǎo)作用，其臨床使用效果仍有待改善。
[0003]為了賦予鈦涂層生物活性，改善臨床使用效果，人們采用多種方法對其進(jìn)行表面改性。利用等離子噴涂、表面礦化等技術(shù)在多孔鈦涂層表面沉積生物活性陶瓷涂層，可以有效地改善鈦涂層的生物活性。例如中國專利CN101342387A公開一種鈦涂層表面快速生成磷灰石的活化方法。但生物活性陶瓷涂層在體內(nèi)容易降解，影響涂層的長期穩(wěn)定性?；瘜W(xué)處理也可以改善鈦涂層的生物活性，但與生物活性陶瓷涂層如羥基磷灰石涂層相比，仍存在較大差距。
[0004]生物化學(xué)方法是一類新型的生物材料表面改性方法，其目的是將細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原)、酶或者多肽固定在生物材料上，構(gòu)建仿生中間層，以引發(fā)特殊細(xì)胞和組織的響應(yīng)。I型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)主要組成部分，影響著細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化。通過物理吸附，在鈦涂層表面固定I型膠原，能夠提高鈦涂層的生物學(xué)性能和細(xì)胞相容性(StefanRammelt, et al.Journal of Orthopaedic Research.2004(22):1025-1034.)。例如，中國專利CN102145194A公開一種將具有多孔磷酸鈣涂層的金屬基材浸入膠原溶液后風(fēng)干以制得多孔磷酸鈣-膠原復(fù)合涂層的方法；中國專利CN101984144A公開一種采用電化學(xué)共沉積法在鈦基板上以此組裝磷酸鈣層和膠原層的方法。但物理吸附固定的膠原有限，并且不穩(wěn)定，容易脫附。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法。在上述現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人意識到通過化學(xué)方法將I型膠原共價(jià)鍵接枝在多孔鈦涂層表面，不但能夠獲得穩(wěn)定的仿生中間層，而且能夠提高所固定I型膠原的量以及固定的穩(wěn)定性，從而獲得相對于物理吸附方法生物學(xué)性能更好的改性多孔鈦涂層。
[0006]在此，本發(fā)明提供一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，即采用生物化學(xué)改性方法，以共價(jià)鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原的I型膠原改性的多孔鈦涂層。
[0007]與物理吸附的膠原改性多孔鈦涂層相比，本發(fā)明提供的共價(jià)接枝的I型膠原改性多孔鈦涂層所固定的膠原量增加約一倍；固定穩(wěn)定性更好，在7天后仍保留有90%以上；并且具有更好的生物學(xué)性能，可應(yīng)用于促進(jìn)誘導(dǎo)骨組織生長的骨植入材料。
[0008]另一方面，本發(fā)明還提供所述多孔鈦涂層的制備方法，包括堿處理、硅烷化處理和共價(jià)鍵固定I型膠原。
[0009]較佳地，所述堿處理包括將多孔鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h。
[0010]較佳地,所述硅烷化處理米用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷為硅烷化劑。
[0011]所述硅烷化處理可以采用甲苯為溶劑，加熱回流反應(yīng)6~12h。
[0012]較佳地，所述共價(jià)鍵固定I型膠原包括將經(jīng)硅烷化處理的多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中并采用1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為羧基活化劑。
[0013]更佳地,所述共價(jià)鍵固定I型膠原可以是在濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺以使其在反應(yīng)體系中的濃度分別為2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
[0014]所述共價(jià)鍵固定I型膠原的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4~10h。
[0015]較佳地，在所述硅烷化處理之前還包括去離子水陳化處理。
[0016]所述去離子水陳化可以是將經(jīng)堿處理的多孔鈦涂層在去離子水中40~80°C下保溫3~7天。
[0017]本發(fā)明工藝簡單、效率高、可重復(fù)性好。本發(fā)明所提供的I型膠原改性的多孔鈦涂層，具有良好的穩(wěn)定性和生物學(xué)性能，解決了現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，可改善鈦涂層的臨床效果，為醫(yī)用生物涂層技術(shù)提供新的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是鈦涂層改性前后的表面形貌:(a)堿處理的鈦涂層(TC-A) ； (b)硅烷化的鈦涂層(TC-AA) ； (c)物理吸附固定I型膠原的鈦涂層(TC-AC) ； (d)共價(jià)鍵接枝固定I型膠原的鈦涂層(TC-AAC)，均放大1000倍；
圖2是鈦涂層改性前后的紅外光譜；
圖3是I型膠原的固定效果分析:(a)固定膠原量測定；(b)膠原的固定穩(wěn)定性分析；圖4是共價(jià)鍵接枝固定I型膠原鈦涂層的生物學(xué)性能實(shí)驗(yàn):(a)hMSCs的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)；(b)hMSCs的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；(c)hMSCs細(xì)胞分化的堿性磷酸酶活性檢測實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合附圖及下述【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實(shí)施方式和/或附圖僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0020]基于I型膠原良好的生物學(xué)性能和細(xì)胞相容性，本發(fā)明采用生物化學(xué)改性方法，以共價(jià)鍵接枝方式，將I型膠原固定在等離子體噴涂多孔鈦涂層表面，從而獲得生物學(xué)性能更好的I型膠原改性的多孔鈦涂層。作為示例，其具體工藝如下。
[0021](I)鈦涂層的制備:利用等離子體噴涂技術(shù)制備鈦涂層。
[0022](2)堿處理:將所述 鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h，取出后可用去離子水超聲清洗，超聲清洗可以持續(xù)約5分鐘。這里采用5~IOM的NaOH作為堿處理的堿液，但應(yīng)理解其他合適的堿液也是適用的，例如氫氧化鉀。
[0023](3)去離子水陳化:將經(jīng)堿處理得到的多孔鈦涂層浸泡在去離子水中40~80°C下保溫3~7天?？梢悦刻鞊Q一次水，最后40°C下干燥。
[0024](4)硅烷化:將干燥的多孔鈦涂層浸泡在濃度為5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應(yīng)6~12h，冷卻后，分別用酒精、去離子水超聲清洗1-2次，真空干燥。這里采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)為硅烷化劑，采用甲苯作為溶劑，但應(yīng)理解其他合適的硅烷化劑、溶劑也是適用。
[0025](5)共價(jià)鍵固定I型膠原:將所述硅烷化多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中(例如濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液)中，滴加入1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)水溶液(例如120mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)水溶液(例如30mg/mL)，使得EDC最終溶度為2~3.5mg/mL,NHS最終溶度為0.25~0.875mg/mL,反應(yīng)4~IOh后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥。
[0026]下面進(jìn)一步例舉實(shí)施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的試劑的量和濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度也僅是合適范圍中的一個(gè)示例，即、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。
[0027]實(shí)施例1
[基于共價(jià)鍵固定I型膠原 的改性鈦涂層的制備]
利用等離子體噴涂技術(shù)制備鈦涂層(標(biāo)記為TC)，所制備的鈦涂層浸入5M NaOH溶液中，在80°C下保溫12h，用去離子水超聲清洗后，在去離子水中60°C下陳化7天，一天換一次水，40°C下干燥。堿處理改性鈦涂層標(biāo)記為TC-A。將干燥的樣品TC-A浸泡在濃度為10%的APS/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應(yīng)12h。冷卻后用酒精超聲清洗I次，去離子水超聲清洗2次，真空干燥。硅烷化的鈦涂層標(biāo)記為TC-AA。將樣品TC-AA浸泡在濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中。每38mL膠原溶液中滴入120mg/mL EDC水溶液和30mg/mL NHS水溶液各ImL,使得EDC最終溶度為3mg/mL, NHS最終溶度為0.75mg/mL。反應(yīng)6h后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥，樣品標(biāo)記為TC-AAC。
[0028]對比例I
[用物理吸附方法將I型膠原固定在鈦涂層表面]
將實(shí)施例1中的中間樣品TC-A浸泡在lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中，6小時(shí)后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥，樣品標(biāo)記為TC-AC。
[0029]圖1為鈦涂層表面固定I型膠原前后的表面形貌。在(c)、(d)中均能觀察到纖維狀的I型膠原，表明通過吸附固定方式和共價(jià)鍵固定方式，I型膠原成功地固定在鈦涂層表面，得到新型的膠原改性鈦涂層。
[0030]由圖2所示的鈦涂層改性前后的紅外光譜可以看出:與TC-AA譜圖相比，TC-AAC譜圖上的S1-O-Si系列特征吸收峰(1020-12900^1)減弱，而氨基系列特征吸收峰(1300-1700^1)增強(qiáng)，進(jìn)一步表明制備出新型膠原改性鈦涂層。
[0031][改性鈦涂層的膠原固定效果實(shí)驗(yàn)]
利用天狼猩紅染色法，從定量和固定穩(wěn)定性兩方面來考察膠原固定效果:將樣品TC-AC和TC-AAC浸泡在濃度為lmg/mL的天狼猩紅-飽和苦味酸溶液中，2小時(shí)后取出，去離子水沖洗，真空干燥。用0.1M的NaOH溶液將染料洗脫下來，然后用紫外分光光度計(jì)測定染料-NaOH溶液在540nm下的吸光度值，與吸光度值-膠原量標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得出固定膠原的量。將樣品TC-AC和TC-AAC各4個(gè)浸泡在tris_HCl溶液中，37度下分別孵育1、3、5、7天。用天狼猩紅染色法測量樣品表面剩余膠原量。
[0032]圖3所示是I型膠原的固定效果分析。從圖3 (a)中可以看出-JC-AAC的膠原量可達(dá)391 μ g/cm2,大于TC-AC的191 μ g/cm2,表明共價(jià)鍵固定方式能夠固定較多的膠原。在圖3 (b)中，TC-AC的膠原在5天內(nèi)就脫附殆盡，而TC-AAC的膠原7天后仍保留有90%以上，表明共價(jià)鍵固定的膠原穩(wěn)定性更好。
[0033][改性鈦涂層的生物學(xué)性能實(shí)驗(yàn)]
用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)來考察共價(jià)鍵固定I型膠原鈦涂層的生物學(xué)性能:用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行為；用BCA法對hMSCs的堿性磷酸酶(ALP)的活性進(jìn)行定量測定。
[0034]圖4為共價(jià)鍵固定I型膠原改性鈦涂層的生物學(xué)性能實(shí)驗(yàn)。從圖中可以看出?與TC相比，表面固定了 I型膠原的改性鈦涂層，能夠促進(jìn)hMSCs的粘附(圖4(a))、增殖(圖4(b))和堿性磷酸酶的活性表達(dá)(圖4(c))，具有更好的生物學(xué)性能。而與TC-AC相比，TC-AAC具有更好的促進(jìn)效果。結(jié)果表明:在鈦涂層上共價(jià)鍵固定I型膠原，能夠提高鈦涂層的生物學(xué)性能。
[0035]產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性:本發(fā)明通過共價(jià)鍵接枝方式，將I型膠原固定在多孔鈦涂層表面，獲得一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，具有良好穩(wěn)定性和生物學(xué)性能，不但能夠加強(qiáng)鈦和鈦合金等骨植入材料與 骨組織間的結(jié)合強(qiáng)度，而且改善多孔鈦涂層的臨床使用效果，促進(jìn)誘導(dǎo)骨組織的生長，在醫(yī)學(xué)生物涂層【技術(shù)領(lǐng)域】有廣闊的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，其特征在于，采用生物化學(xué)改性方法，以共價(jià)鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原。
2.—種權(quán)利要求1所述的多孔鈦涂層的制備方法，其特征在于，包括堿處理、硅烷化處理和共價(jià)鍵固定I型膠原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述堿處理包括:將多孔鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述硅烷化處理采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷為硅烷化劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述硅烷化處理采用甲苯為溶劑，加熱回流反應(yīng)6~12h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2~5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述共價(jià)鍵固定I型膠原包括將經(jīng)硅烷化處理的多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為羧基活化劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺以使其在反應(yīng)體系中的濃度分別為2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6 或7所述的改性方法，其特征在于，所述共價(jià)鍵固定I型膠原的反應(yīng)時(shí)間為4~IOh。
9.根據(jù)權(quán)利要求2~8中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在所述硅烷化處理之前還包括去離子水陳化處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述去離子水陳化包括:將經(jīng)堿處理的多孔鈦涂層在去離子水中40~80°C下保溫3~7天。
【文檔編號】A61L27/56GK103785066SQ201210431500
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月1日
【發(fā)明者】敖海勇, 鄭學(xué)斌, 湯亭亭, 謝有桃, 季衍, 黃利平 申請人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所, 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院