鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體及其制備方法，該二價蛋黃抗體包含鴨病毒性肝炎DHAV-1型和鴨病毒性肝炎DHAV-3型蛋黃抗體，該制備方法包括：（1）采用鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分別接種SPF雞胚和易感鴨胚，然后收獲尿囊液，將該收獲的病毒液按比例混合，甲醛滅活并制備疫苗；(2)使用該疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，免疫后抽樣測定雞高免蛋黃中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗體中和效價≥1∶8192，之后收集該雞的高免蛋；(3)將該高免蛋蛋殼消毒，收集蛋黃后加入等體積蒸餾水，攪拌混勻，低溫巴氏滅活；酸化蒸餾水法提純、辛酸法提純；微濾，超濾。本發(fā)明提供的二價蛋黃抗體，成本低，效價高，可對DHAV-1和DHAV-3引起的鴨病毒性肝炎做到有效的控制，可獲得顯著的社會效益。
【專利說明】鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高免疫蛋黃抗體，具體地說，涉及一種鴨病毒性肝炎的蛋黃抗體?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis, DVH)是由小RNA病毒科腸病毒屬的鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus, DHV)引起雛鴨的一種急性、高度致死性、烈性傳染病。本病常年發(fā)生，自然狀態(tài)下只感染3周齡內(nèi)的雛鴨，常造成重大的經(jīng)濟損失，威脅著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將鴨病毒性肝炎劃歸為B類動物疾病。
[0003]鴨肝炎病毒有歷史上分為血清型I型、II型和III型，三者間沒有抗原相關(guān)性。其中I型鴨病毒性肝炎呈世界性分布。II型鴨病毒性肝炎是1965年發(fā)現(xiàn)于英國，且自20世紀80年代中期暴發(fā)后，該地區(qū)也再未見該病的發(fā)生。III型1969年發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島地區(qū)。II型、III型目前已被重新分類為鴨星狀病毒屬成員，分別稱為鴨星狀病毒I型(duck astrovirus 1，DAstV-1 )、鴨星狀病毒2型(DAstV-2)。2009年，國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)在小 RNA 病毒科中新成立禽肝病毒屬(Avih印atovirus)，傳統(tǒng)的血清I型鴨肝炎病毒屬于其中的鴨甲型肝炎病毒(DHAV)，被稱為DHAV-1，DHAV還包括另外兩個血清型即DHAV-2、DHAV-3, DHAV-2和DHAV-3分別與DHAV-1無血清交叉中和作用。Wang L等(2008)則按基因分型稱之為A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)、C型(DHAV-C)。研究表明，根據(jù)衣殼蛋白編碼序列所區(qū)分的基因型與采用中和試驗所區(qū)分的血清型存在對應關(guān)系。
[0004]國內(nèi)外學者就DHV血清型的流行狀況開展了研究。2007年，Tseng從1989-1990年臺灣地區(qū)暴發(fā)鴨病毒性 肝炎的病鴨體內(nèi)分離病原，通過中和試驗證明是一株新型鴨肝炎病毒，N-DHV (可稱作DHAV-2)，目前僅發(fā)現(xiàn)于臺灣地區(qū)。2007年，韓國Kim等從2003年和2004年暴發(fā)鴨病毒性肝炎的病鴨體內(nèi)分離到一株病毒，與DHV-1的血清型不同，稱為DHV-AP (又稱作 DHAV-3)。
[0005]以往在我國流行的主要是I型鴨肝炎病毒，采用傳統(tǒng)的弱毒疫苗和高免蛋黃抗體進行I型DHV的預防和治療。但近幾年來，不斷有使用I型鴨肝炎弱毒疫苗或高免蛋黃抗體進行預防或治療無效的鴨群爆發(fā)疑似鴨肝炎，懷疑為新型鴨肝炎。而近年來，韓國新型(DHAV-3)在我國的地區(qū)分布已較為廣泛。蘇敬良等(新型DHV的分離及初步鑒定，中國獸醫(yī)科技，2002，32 (I):15^16)經(jīng)過病原分離鑒定和鴨胚血清中和試驗，分離到與DHV-1、DHV-1II無血清學交叉免疫反應的小RNA病毒，稱為新型鴨肝炎病毒；黃安國等(新型鴨肝炎病毒的分離與初步鑒定，廣西畜牧獸醫(yī)，2003，19 (5) =198^199)也從以I型鴨病毒性肝炎高免蛋黃抗體或I型鴨肝炎弱毒疫苗不能治愈或預防的類似I型鴨病毒性肝炎的發(fā)病鴨群中分離到新型鴨肝炎病毒。隨后劉建等(新型DHV流行病學調(diào)查及免疫防治試驗，中國獸醫(yī)雜志，2006，42(2):3飛)從北京、河北、山東和廣西等地送檢并具有明顯的肝臟出血病變特征的雛鴨肝臟中分離到9株病毒株，通過對其進行血清學鑒定，發(fā)現(xiàn)其中7株為新型鴨肝炎病毒，2株為I型鴨肝炎病毒。這些研究結(jié)果就可以揭示近年來不少地區(qū)雛鴨在發(fā)生鴨病毒性肝炎后注射高免血清或高免蛋黃抗體治療無效的原因。
[0006]研究結(jié)果已顯示我國多個地區(qū)同時流行DHAV-1和DHAV-3，且兩者間缺乏交叉保護，對DHAV-3所引起的DVH還缺乏有效的控制措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了滿足生產(chǎn)上對DVH有效防治技術(shù)的迫切需求，及時控制國內(nèi)DVH的發(fā)生，本發(fā)明利用傳統(tǒng)的I型(DHAV-1)鴨肝炎病毒與新型(DHAV-3)鴨肝炎病毒制備了二價蛋黃抗體。
[0008]為此，本發(fā)明提供了一種鴨病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VPl基因編碼氨基酸的序列包含如圖6所示的具有49-T、196-N、207-E三個氨基酸取代位點和197_Q、198_S、199-D三個共有位點。
[0009]優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎病毒株為鴨病毒性肝炎病毒SDl株，所述SDl株保藏地址為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0.V201225。
[0010]本發(fā)明提供了一種DNA序列，它實質(zhì)上含有seq N0.1的核苷酸序列，本發(fā)明中的術(shù)語“實質(zhì)上含有”是指本發(fā)明的核苷酸序列在保持其功能的范圍內(nèi)，序列號I堿基序列可以發(fā)生置換、插入或缺失等變異。
[0011]本發(fā)明提供了一種VPl抗原蛋白，所述的VPl抗原蛋白包含如圖6所示的具有49-T、196-N、207-E三個氨基酸取代位點和197-Q、198-S、199-D三個共有位點的鴨病毒性肝炎病毒VPl共有序列。
[0012]本發(fā)明的主要目的在于提供一種鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，所述二價蛋黃抗體包含鴨病毒性肝炎DHAV-1型和鴨病毒性肝炎DHAV`-3型蛋黃抗體。所述抗體效價高且成本較低，能夠有效控制目前國內(nèi)流行的不同血清型的鴨病毒性肝炎。
[0013]本發(fā)明另一目的在于提供一種鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體的制備方法，所述方法安全、易于使用，所述制備方法包括:
[0014](I)采用鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分別接種9日齡SPF雞胚和10日齡易感鴨胚，然后收獲尿囊液，將所述收獲的病毒液按比例混合，甲醛滅活并制備疫苗；
[0015](2)使用所述制備的疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，免疫后抽樣測定雞高免蛋黃中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗體中和效價> I: 8192，之后收集所述雞的高免蛋；
[0016](3)將所述高免蛋蛋殼消毒，收集蛋黃，所述蛋黃加入等體積蒸餾水，攪拌混勻，低溫巴氏滅活；酸化蒸餾水法提純、辛酸法提純；微濾，超濾。
[0017]優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株為DRL-62株、所述DHAV-3型毒株為SDl。
[0018]優(yōu)選地，所述免疫程序為:所述產(chǎn)蛋雞120日齡時肌肉注射Iml/只，14日后等劑量肌肉注射，所述二免10日后再用等劑量肌肉注射進行三免，所述三免后10日再用等劑量肌肉注射進行第四次強化免疫。
[0019]優(yōu)選地，所述低溫巴氏滅活條件為62.5°C加熱滅活30min ；
[0020]優(yōu)選地，所述酸化蒸餾水法提純步驟為:先在隔層反應罐中加入相當于所述蛋黃6倍體積的滅菌蒸餾水，所述蒸餾水pH值為4.2，并降溫至4°C，然后，將滅活的所述蛋黃液加入，攪拌，4°C靜置4h，離心分離上清液；
[0021]所述辛酸法提純步驟為:按所述上清液總量的0.2%體積加入辛酸，攪拌，室溫放置4h，過濾至澄清，再按所述濾液總量的0.1%加入飽和甲醛溶液，攪拌，室溫放置24h。
[0022]優(yōu)選地，所述微濾使用0.22 μ m微孔濾芯過濾除菌，所述超濾用截留分子量為1000KDa的超濾膜過濾除病毒。
[0023]本發(fā)明再一目的在于提供了鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體在制備預防和治療鴨病毒性肝炎的藥物中的應用。
[0024]本發(fā)明的還一目的在于提供了一種預防和治療鴨病毒性肝炎的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的由VPl基因編碼氨基酸基因序列包含如圖6所示的具有49-T、196-N.207-E三個氨基酸取代位點和197-Q、198-S、199-D三個共有位點的鴨病毒性肝炎毒株所制備抗原以及藥學上可接受的載體。
[0025]優(yōu)選地，所述鴨病毒性肝炎病毒為SDl株。
[0026]所述預防和治療鴨病毒性肝炎的疫苗組合物使用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備。
[0027]本發(fā)明還提供了所述的疫苗組合物在制備預防和治療鴨病毒性肝炎的藥物中的應用。
[0028]技術(shù)效果
[0029]1.本發(fā)明采用了物理、化學等多重滅活技術(shù)，使用酸化水稀釋法結(jié)合辛酸法、高速離心、超濾等現(xiàn)代生物技術(shù)，將蛋黃中的免疫球蛋白進行有效的分離純化，蛋黃抗體中不含任何有害物質(zhì)和外源性污`染，安全性高，注射免疫鴨群時對胴體品質(zhì)無影響，可工業(yè)化生產(chǎn)。
[0030]2.本發(fā)明所獲得的鴨病毒性肝炎毒株，具有良好的免疫原性，制備的滅活疫苗，抗體產(chǎn)生速度快，抗體效價高，安全性好，以此制備的蛋黃抗體能有效地防治DHAV-3型病毒的侵染，保存、運輸(2l°C)和使用方便，使用效果穩(wěn)定，有效地防控鴨病毒性肝炎的發(fā)生。
[0031]3.發(fā)明人在研究所獲得的鴨病毒性肝炎毒株SDl株的VPl基因序列時，意外發(fā)現(xiàn)其中VPl基因編碼氨基酸基因序列包含的如圖6所示的具有49-T、196-N、207-E三個氨基酸取代位點和197-Q、198-S、199-D三個共有位點對其免疫原性具有重要作用。在后續(xù)實施例證明，其他鴨病毒性肝炎毒株VPl基因序列突變了相應相同的位點，也具有同樣的作用。
[0032]4.本發(fā)明提供的二價蛋黃抗體，成本低，效價高，動物實驗表明可以對DHAV-1和DHAV-3引起的鴨病毒性肝炎做到有效的控制，可獲得顯著的社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為利用DHV I型標準株引物RT-PCR檢測DRL-62株和SDl株VPl結(jié)果；
[0034]圖2為利用DHV韓國新型毒株引物RT-PCR檢測DRL-62株和SDl株VPl結(jié)果；
[0035]圖3為SDl VPl基因與DHV參考毒株核苷酸序列同源性分析；
[0036]圖4為SDl VPl基因與DHV參考毒株氨基酸序列同源性分析；
[0037]圖5為SDl VPl基因與DHV參考毒株核苷酸序列進化樹；
[0038]圖6為SDl VPl基因與DHV參考毒株氨基酸序列比對分析；
[0039]圖7為SDl VPl蛋白親水性、抗原指數(shù)、表面可及性分析?！揪唧w實施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0041]鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體的制備方法采用如下的步驟:鴨肝炎病毒DHAV-1、DHAV-3種毒的繁育、免疫用疫苗的制備、產(chǎn)蛋雞的免疫、蛋黃抗體的提取。本發(fā)明實施例中所選用的DHAV-1毒株為DRL-62株，DHAV-3毒株為SDl株，其具體方法為:
[0042]1.毒種的來源鴨肝炎病毒DRL-62株(ATCC保藏，保藏號VR-1313) ；SD1株由普萊柯生物工程股份有限公司分離，(CCTCC保藏，保藏號:CCTCC N0.V201225)。
[0043]2.毒種繁殖將鴨肝炎病毒DRL-62株毒種用滅菌PBS溶液作1: 100稀釋，經(jīng)尿囊腔接種擴11日齡SPF雞胚，每胚0.lml。置37°C繼續(xù)孵育，棄去48小時內(nèi)的死胚，收獲48~96小時死亡雞胚，置2~8°C冷卻12~24小時。將檢驗無菌的胚液混合后，定量分裝，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。
[0044]將鴨肝炎病毒SDl株毒種用滅菌PBS溶液作1: 100稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10-?2日齡易感鴨胚，每胚0.2ml。置37 °C繼續(xù)孵育，棄去48小時內(nèi)的死胚，收獲48~96小時死亡鴨胚，置2~8°C冷卻12~24小時。將檢驗無菌的鴨胚液混合后，定量分裝，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。
[0045]3.免疫用滅活苗的制備:
[0046]3.1病毒液的收獲將收獲的病毒液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，吸取上清液于滅菌容器，加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為0.15%，密閉后置37°C溫箱中作用24小時(期間振搖3~4次)。
[0047]3.2免疫用滅活苗的制備油相配制:取注射用白油94份，司本-806份混合后，加入硬脂酸鋁2份，邊加熱邊攪拌至透明后高壓滅菌備用，即為油相。水相配制:將DRL-62株抗原與SDl株抗原以1:1的比例混合均勻，按抗原的4%加入滅菌吐溫-80，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，即為水相。乳化:取油相2份置油相罐內(nèi)，開動電機攪拌，徐徐加入1份水相，再以3400轉(zhuǎn)/分鐘乳化10分鐘即可。在乳化終止前加入1%硫柳汞，使其終濃度為
0.01%。取樣3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，應不分層。分裝:定量分裝，加蓋密封。
[0048]4.免疫
[0049]4.1免疫程序蛋雞120日齡左右用滅活油苗肌肉注射Iml/只，14日后用滅活苗肌肉注射Iml/只，二免10日后再用滅活苗肌肉注射Iml/只進行三免，三免后10日再用滅活苗肌肉注射Iml/只進行第四次強化免疫。
[0050]4.2采蛋從四免后每隔10日抽樣測定雞高免蛋黃中DRL-62抗體、SDl抗體中和效價I: 8192為合格，之后即可收集高免蛋，置4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0051]5.蛋黃抗體的制備
[0052]5.1蛋黃的收獲及滅活將蛋殼消毒，采取手工或機械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃。充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)121°C 30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62.5°C加熱滅活30min。
[0053]5.2抗體的酸化蒸餾水法提純先在隔層反應罐中加入相當于原蛋黃6倍體積的pH值為4.2的滅菌蒸餾水，并降溫至4°C。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4°C靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機HOOOrpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應罐中。
[0054]5.3抗體的辛酸法提純按總量的0.2%(體積比)加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清，再按總量的0.1%加入飽和甲醛溶液于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫放置24h，期間振搖數(shù)次。
[0055]5.4過濾除菌用0.22 μ m微孔濾芯過濾除菌。用截留分子量為1000KDa的超濾膜
過濾除病毒。
[0056]5.5抗體效價測定中和試驗
[0057]將DHV DRL-62株稀釋成每0.1ml含200ELD5(I，與等量2倍系列稀釋的待檢抗體混合，37°C作用I小時，期間搖晃數(shù)次。每個稀釋度接種5枚9日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，另設病毒液與等量滅菌PBS混合的病毒對照組和PBS空白對照組各5枚，置37°C培養(yǎng)168小時，記錄48~168小時的雞胚死亡數(shù)，判定結(jié)果?？瞻讓φ战M應全部健活，病毒對照組應全部死亡。
[0058]將DHV SDl株稀釋成每0.1ml含200ELD5(I，與等量2倍系列稀釋的待檢抗體混合，37°C作用I小時，期間搖晃數(shù)次。每個稀釋度接種5枚10日齡易感鴨胚，每胚0.2ml，另設病毒液與等量滅菌PBS混合的病毒對照組和PBS空白對照組各5枚，置37°C培養(yǎng)168小時，記錄48~168小時的鴨胚死亡數(shù)，判定結(jié)果?？瞻讓φ战M應全部健活，病毒對照組應全部死亡。
[0059]能使50%雞(鴨)胚不發(fā)生死亡的最高抗體稀釋倍數(shù)即為該抗體的中和效價。
[0060]5.6提純的蛋黃抗體凍干向提純并經(jīng)檢驗合格的蛋黃抗體液加入凍干保護劑分裝于西林瓶入凍干箱，凍干過程中溫度最低降至一 40°C，在此溫度下保持4h，制品以1.(TC /h升溫18~20h，至基本干燥，再以4-6℃ /h升溫至25°C干燥至完全凍干，壓塞出箱，貯存于
2~8℃。
[0061]實施例1DHV SDl分離株分子生物學鑒定
[0062]1.鴨肝炎病毒SDl株病毒為新分離鑒定的病毒，其具有以下特征:
[0063]1.1DHAV-3和DHAV-1引起的臨床癥狀極為相似，主要表現(xiàn)為:雛鴨發(fā)病突然，很快出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，抽搐，并很快死亡，死后雛鴨呈角弓反張姿勢。病理變化表現(xiàn)為肝臟腫大，肝表面有大量的出血點及出血斑，并且隨著死亡時間的延長，出血表現(xiàn)越為明顯。
[0064]1.2根據(jù)GenBank已發(fā)表的DHV基因組序列設計多對特異的引物，按常規(guī)RT-PCR方法擴增VPl基因，對分離株SDl的VPl基因進行了序列測定分析。結(jié)果表明，SDl的VPl基因與中國及韓國DHAV-3的VPl序列相似性最高，與DHAV-1和臺灣DHAV-2的相似性均較低。核苷酸序列及進化關(guān)系分析結(jié)果表明分離毒與中國及韓國DHAV-3之間的遺傳距離最近，而與DHAV-1和臺灣DHAV-2之間存在較大差異。
[0065]1.3VP1氨基酸序列的比對分析及親水性、抗原指數(shù)和表面可及性分析顯示，DHVSDl分離株與其它國內(nèi)DHAV-3間氨基酸位點的變化均位于親水性區(qū)域和可及性區(qū)域，加之與DHAV-1的差異共同提示DHV SDl分離株VPl蛋白上可能存在完全不同的抗原表位，同時也將體現(xiàn)在免疫保護性上。
[0066]1.4血清交叉中和試驗表明DHV SDl分離株與DHAV-1間無交叉保護作用，二者分屬不同的血清型。SDl分尚株與國內(nèi)分尚DHAV-3毒株間有交叉保護作用，且相互間的中和保護作用SDl株優(yōu)于對比毒株。
[0067]1.5理化特性鑒定結(jié)果顯示，該毒株可抵抗氯仿、乙醚、熱、胰酶、酸的處理。
[0068]該病毒株免疫原性良好，四免后10日抽樣測定雞高免蛋黃中DRL-62抗體中和效價1:17620、SDl抗體中和效價1:13932 ;治療試驗表明二價蛋黃抗體能有效控制目前國內(nèi)流行的不同血清型的鴨病毒性肝炎的發(fā)生，保護率達到80%~100%。
[0069]本發(fā)明所述的鴨病毒性肝炎SDl株于2012年06月08日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位簡稱:CCTCC，保藏編號:CCTCCN0.V201225，分類命名:鴨病毒性肝炎病毒，英文名稱為 Duck hepatitis virus SDl Strain,拉丁文名稱為 Tarpeiapulli,保藏單位地址:湖北省武漢市典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0070]2.RT-PCR[0071]從病鴨肝臟中分離病毒提取RNA，根據(jù)GenBank公布的DHAV-1毒株DRL-62株、韓國DHAV-3毒株N-DHV株基因組全序列，使用下列引物對VPl序列進行RT-PCR(參照大連寶生物工程有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法):
[0072]①DHAV-1 型上游引物:5’ -GGTGATTCTAACCAGTTGG-3’，
[0073]下游引物:5’-TTCAATTTCCAGATTGAGT-3’ ；
[0074]②DHAV-3 型上游引物:5 ’ -CAGATGGCCGCCAATGATCAG-3，，
[0075]下游引物:5’ -GTCTCTGACATTTCGAAATTGGTATGA-3 ’。
[0076]陽性擴增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序。
[0077]3.基因序列分析
[0078]使用DNAStar7.1分析軟件將分離毒株VPl基因核苷酸序列與I型DHV標準株DRL-62及GenBank中登陸的其它DHV毒株(見表1)核苷酸序列進行同源性比較分析，并使用Megalign中的方法繪制系統(tǒng)進化樹，進行遺傳進化分析。
[0079]表1參考毒株及其GenBank登錄號
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種鴨病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VPl基因編碼氨基酸的序列包含如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個氨基酸取代位點和197-Q、198-S、199-D三個共有位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨病毒性肝炎病毒，所述的鴨病毒性肝炎病毒為鴨病毒性肝炎病毒SDl株，所述SDl株保藏地址為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0.V201225。
3.—種DNA序列，它實質(zhì)上含有seq N0.1的核苷酸序列。
4.一種VPl抗原蛋白，所述的VPl抗原蛋白包含如圖六所示的具有49-T、196-N、207-E三個氨基酸取代位點和197-Q、198-S、199-D三個共有位點的鴨病毒性肝炎病毒VPl共有序列。
5.一種鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，其特征在于，所述二價蛋黃抗體包含鴨病毒性肝炎DHAV-1型和鴨病毒性肝炎DHAV-3型蛋黃抗體。
6.—種鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體的制備方法，所述制備方法包括: (1)采用鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分別接種9日齡SPF雞胚和10日齡易感鴨胚，然后收獲尿囊液，將所述收獲的病毒液按比例混合，甲醛滅活并制備疫苗； (2)使用所述制備的疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，免疫后抽樣測定雞高免蛋黃中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗體中和效價> I: 8192，之后收集所述雞的高免蛋； (3)將所述高免蛋蛋殼消毒，收集蛋黃，所述蛋黃加入等體積蒸餾水，攪拌混勻，低溫巴氏滅活；酸化蒸餾水法提純、辛酸法提純；微濾，超濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述鴨病毒性肝炎DHAV-1型毒株為DRL-62株、所述DHAV-3型毒株為SDl株。`
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述低溫巴氏滅活條件為62.5°C加熱滅活30mino
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述酸化蒸餾水法提純步驟為:先在隔層反應罐中加入相當于所述蛋黃6倍體積的的滅菌蒸餾水，所述蒸餾水pH值為4.2，并降溫至4°C，然后，將滅活的所述蛋黃液加入，攪拌，4°C靜置4h，離心分離上清液； 所述辛酸法提純步驟為:按所述上清液總量的0.2%體積加入辛酸，攪拌，室溫放置4h，過濾至澄清，再按所述濾液總量的0.1%加入飽和甲醛溶液，攪拌，室溫放置24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述微濾使用0.22μπι微孔濾芯過濾除菌，所述超濾用截留分子量為1000KDa的超濾膜過濾除病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求5~10任一項中所述的鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體在制備預防和治療鴨病毒性肝炎的藥物中的應用。
12.一種預防和治療鴨病毒性肝炎的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述毒株制備的抗原以及藥學上可以接受的載體。
【文檔編號】A61K39/42GK103865884SQ201210530208
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司