專利名稱：降低鋅指蛋白ctcf表達(dá)的物質(zhì)在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低鋅指蛋白CTCF表達(dá)的物質(zhì)在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鋅指蛋白CTCF又稱CCCTC結(jié)合因子，是由727個(gè)氨基酸組成的高度保守的多鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。它參與多種生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，包括轉(zhuǎn)錄激活或抑制、染色質(zhì)絕緣、基因印記及X染色體失活等。研究發(fā)現(xiàn)CTCF參與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。人們已在乳腺癌、前列腺癌及腎母細(xì)胞瘤中找到了 CTCF鋅指結(jié)構(gòu)的腫瘤特異性突變。該突變使得CTCF喪失與下游腫瘤靶基因的結(jié)合能力，導(dǎo)致這些基因表達(dá)異常，由此引發(fā)腫瘤。此外，CTCF可通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生。研究者在腎母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌和直腸癌中發(fā)現(xiàn)CTCF結(jié)合位點(diǎn)存在異常甲基化現(xiàn)象，并推測(cè)由此可引發(fā)CTCF結(jié)合功能喪失，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。可見CTCF遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。白血病是造血干/祖細(xì)胞在分化不同階段發(fā)生凋亡障礙、分化受阻及惡性增殖而引發(fā)的造血系統(tǒng)惡性疾病。該疾病是兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤和最常見的死亡原因。我國(guó)每年新發(fā)兒童白血病1.5萬例左右，其中兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia,ALL)是最常見的類型，占兒童白血病的75%。20世紀(jì)80年代后，由于多藥聯(lián)合強(qiáng)化療及有力的支持治療，兒童ALL的治愈率已達(dá)80%左右，但近30年來ALL治愈率無明顯提高，主要原因是白血病的發(fā)病機(jī)理至今不明。此外，白血病復(fù)發(fā)也是重要因素之一。目如兒童白血病的復(fù)發(fā)率聞達(dá)15%左右，已成為影響白血病患兒康復(fù)的最關(guān)鍵因素，不僅給患兒本身、而且給家庭及社會(huì)帶來了不可彌補(bǔ)的嚴(yán)重傷害和不和諧因素。因此，深入探討白血病的發(fā)病機(jī)理、探索兒童白血病的藥物靶點(diǎn)將有助于兒童白血病的診治。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種可促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的短發(fā)夾RNA(shRNA, short hairpin RNA)及其相關(guān)生物材料。本發(fā)明所提供的可促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的短發(fā)夾RNA，名稱為shRNA-3，形成莖環(huán)(Stem-1oop)結(jié)構(gòu),所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖(Stem)的一條鏈序列是SEQ ID N0.1,所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列是SEQ ID N0.2。其中，SEQ ID N0.1由19個(gè)核糖核苷酸組成，SEQ ID N0.2由19個(gè)核糖核苷酸組成。所述短 發(fā)夾RNA中的環(huán)(loop)只要滿足使所述短發(fā)夾RNA能產(chǎn)生由SEQ ID N0.1所示的單鏈RNA和SEQ ID N0.2所示的單鏈RNA組成的雙鏈小干擾RNA (siRNA)即可。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.3。
其中，SEQ ID N0.3由47個(gè)核糖核苷酸組成，SEQ ID N0.3的第1-19位與SEQ IDN0.1 相同，SEQ ID N0.3 的第 29-47 位與 SEQ ID N0.2 相同。本發(fā)明所提供的ShRNA-3相關(guān)的生物材料為I)至6)中任一種:I)編碼 shRNA-3 的 DNA 分子；2)含有I)所述DNA分子的表達(dá)盒；3)含有I)所述DNA分子的重組載體、或含有2)所述表達(dá)盒的重組載體；4)含有I)所述DNA分子的重組微生物、或含有2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有3)所述重組載體的重組微生物；5)含有I)所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、或含有2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、或含有權(quán)利要求3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；6)小干擾RNA，一條鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.1，另一條鏈的核苷酸序列如SEQID N0.2。上述shRNA-3相關(guān)的生物材料中，I)所述編碼shRNA_3的DNA分子具體可為I)至
3)中的任一種的雙鏈DNA分子:
I) 一條鏈的核苷酸序列是SEQ ID N0.4，另一條鏈的的核苷酸序列是SEQ ID
N0.5。2)所述DNA分子的編碼序列是SEQ ID N0.4的第1_47位；3)所述DNA分子的編碼序列是SEQ ID N0.5的第12_58位。其中，SEQ ID N0.4由54個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，SEQ ID N0.5由58個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。SEQ ID N0.4的第1-47位與SEQ ID N0.5的第12-58位反向互補(bǔ)。上述shRNA-3相關(guān)的生物材料中，2)所述表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)shRNA-3的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)shRNA-3基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止shRNA-3基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)盒由U6啟動(dòng)子(其序列如SEQ ID N0.8所示)、編碼shRNA-3的DNA分子和終止編碼shRNA-3的DNA分子的Pol III終止子(序列為5’ -TTTTT-3’)組成。3)所述重組載體具體可為用編碼shRNA-3的DNA分子替換pDsU6的Sac I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-3的重組表達(dá)載體pDsU6-sh-3，或?yàn)橛镁幋ashRNA-3的DNA分子替換pDsU6_GFP的BamH I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-3的重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_3。pDsU6_GFP是用GFP (綠色熒光蛋白)基因替換pDsU6的Afl II和BamH I之間片段得到的表達(dá)GFP的重組表達(dá)載體。4)所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。5)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不包括動(dòng)物和植物的繁殖材料。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供shRNA-3及其相關(guān)生物材料在治療和/或預(yù)防白血病方的面應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用為Cl至C4中的任一種:Cl、治療和/或預(yù)防白血病的產(chǎn)品(如藥物)，它的活性成分包括bl_b3中的至少一種:bl、shRNA-3;b2、編碼 shRNA-3 的 DNA 分子；b3、上述shRNA-3相關(guān)的生物材料。
C2、促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品(如藥物)，它的活性成分包括所述bl_b3中的至少一種；C3、所述bl_b3中至少一種物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防白血病的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用；C4、所述bl_b3中至少一種物質(zhì)在制備促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用。上述Cl和C2的產(chǎn)品中，活性成分也可只為bl_b3中的至少一種。本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是提供降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)的用途。本發(fā)明所提供的降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)的用途，為al或a2:al、降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防白血病的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用； a2、降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)在制備促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用。其中，所述降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)為所述bl_b3中的至少一種。上述用途中，所述鋅指蛋白CTCF的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，所述鋅指蛋白CTCF基因的編碼序列如SEQ ID N0.6的第445-2628位所示。其中，SEQ ID N0.7由727個(gè)氨基酸殘基組成，SEQ ID N0.6由3946個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，其編碼序列是第445-2628位。上文中所述白血病細(xì)胞可為體內(nèi)的細(xì)胞，也可為細(xì)胞系，如人前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系NALM-6。實(shí)驗(yàn)證明，以鋅指蛋白CTCF的mRNA為靶點(diǎn)，將RNA干擾重組表達(dá)載體——表達(dá)shRNA-3的重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh-3轉(zhuǎn)入B淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞系NALM-6中獲得的白血病重組細(xì)胞，其鋅指蛋白CTCF表達(dá)水平明顯低于對(duì)照，細(xì)胞總體凋亡比例為28%，是對(duì)照的3.8倍。本發(fā)明證明鋅指蛋白CTCF是一個(gè)抗凋亡因子，在ALL細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，干擾CTCF的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，并增加白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本發(fā)明為白血病治療提供了一條新的途徑，鋅指蛋白CTCF有望成為抗白血病治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為RNA干擾重組白血病細(xì)胞中CTCF的Western blot結(jié)果。其中，上一排為以CTCF單克隆抗體為一抗檢測(cè)鋅指蛋白CTCF，下一排為以GAPDH單克隆抗體為一抗檢測(cè)內(nèi)參 GAPDH。圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)RNA干擾重組白血病細(xì)胞中的Annexin V(+)/PI (-)細(xì)胞比例。圖3為重組白血病細(xì)胞早期凋亡比例柱形統(tǒng)計(jì)圖。圖1-3 中的 sh-luc、sh-CTCF-l、sh_CTCF_2 和 sh_CTCF_3 分別代表重組白血病細(xì)胞 NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc、NALM-6/pDsU6-GFP-sh_l、NALM-6/pDsU6-GFP-sh_2 和NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。載體pDsU6:記載在下述文獻(xiàn)中:Shilai Bao, Tao Lu, Xin Wang, HuyongZheng,L1-E Wang, Qingyi Weij Walter N Hittelman and Lei L1.Disruption of theRad9/Radl/Husl(9 -1 -1)complex leads to checkpoint signaling and replicationdefects.0ncogene, 2004，23，5586 - 5593。公眾可從首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。B-ALL細(xì)胞系NALM-6 (前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系NALM-6)記載在下述文獻(xiàn)中:郜慧芳，張寒，裴珮，劉怡，李志剛，姜錦，張瑞東，高超，戚豫，鄭胡鏞.剪接因子SF2/ASF在兒童白血病細(xì)胞中的表達(dá).《首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》，2009年6月第30卷第03期。公眾可從首都 醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1、鋅指蛋白CTCF的RNA干擾重組表達(dá)載體構(gòu)建1、RNA干擾靶序列的選擇針對(duì)鋅指蛋白CTCF編碼基因CTCF的全長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID N0.6)，選擇如下三段DNA序列為RNA干擾的靶序列:sh-1:SEQ ID N0.6 的第 809-827 位(即 5，-TGACTGTACCTGTTGCTAC-3，)sh-2:SEQ ID N0.6 的第 1103-1122 位(即 5，-ATGTAGATGTGTCTGTCTAC-3，)sh-3:SEQ ID N0.6 的第 1398-1416 位(即 5，-TACTCGTCCTCACAAGTGC-3，)SEQ ID N0.6中第445-2628位為開放閱讀框，編碼SEQ ID N0.7所示的鋅指蛋白CTCF。2、小干擾 RNA (siRNA)分別設(shè)計(jì)針對(duì)步驟I鋅指蛋白CTCF的三種靶序列的三種siRNA( siRNA-Ι、siRNA_2和siRNA-3)。siRNA-1的靶序列為sh_l，siRNA-2的靶序列為sh_2，siRNA-3的靶序列為sh_3。I) siRNA-ΙsiRNA-1-F:5，-ugacuguaccuguugcuac-3’ ；siRNA-1-R:5，-guagcaacagguacaguca-3，；2) siRNA-2siRNA-2-F:5，-auguagaugugucugucuac-3，；siRNA—2-R:5，-guagacagacacaucuacau—3，。3) siRNA-3siRNA-3-F:5’ -uacucguccucacaagugc-3’ (SEQ ID N0.1)；siRNA-3-R:5，-gcacuugugaggacgagua-3，(SEQ ID N0.2)。3、短發(fā)夾 RNA (shRNA) 根據(jù)步驟2的三種siRNA，設(shè)計(jì)產(chǎn)生siRNA-1的shRNA_l、產(chǎn)生siRNA_2的shRNA_2、產(chǎn)生 siRNA-3 的 shRNA-3。
shRNA-K shRNA-2和shRNA_3的序列如下(大寫字母為環(huán)序列，其余序列為莖序列，形成反向重復(fù)序列):shRNA-Ι:5， -ugacuguaccuguugcuacUUCAAGAGAguagcaacagguacaguca-3，；shRNA-2:5， -auguagaugugucugucuacUUCAAGAGAguagacagacacaucuacau-3> ；shRNA-3:5’ -uacucguccucacaagugcUUCAAGAGAgcacuugugaggacgagua-3’ (SEQ ID N0.3)。同時(shí)，將沉默熒光素酶基因的shRNA-luc作為對(duì)照:shRNA-luc:5， -gaagcgcauccaauaccagcUUCAAGAGAgcugguauuggaugcgcuuc-3，熒光素酶(Iuciferase)是一個(gè)在前B急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系NALM-6細(xì)胞中沒有表達(dá)的蛋白，所以將以熒光素酶為靶點(diǎn)的shRNA-luc作為對(duì)照。4、編碼siRNA及shRNA的DNA分子的設(shè)計(jì)與合成I)以sh-Ι為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-Ι的雙鏈DNA分子(名稱為sh_CTCF_l)的兩條單鏈DNA序列如下:CTCF-ssDNA809-l-F:
5， -tgactgtacctgttgctacTTCAAGAGAgtagcaacaggtacagtcacTTTTTA-3> ；CTCF-ssDNA809-l-R:5， -AGCTTAAAAAgtgactgtacctgttgctacTCTCTTGAAgtagcaacaggtacagtca-3’。2)以sh-2為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-2的雙鏈DNA分子(名稱為sh_CTCF_2)的兩條單鏈DNA序列如下:CTCF-ssDNA1103-2-F:5， -atgtagatgtgtctgtctacTTCAAGAGAgtagacagacacatctacatcTTTTTA-3> ；CTCF-ssDNA1103-2-R:5， -AGCTTAAAAAgatgtagatgtgtctgtctacTCTCTTGAAgtagacagacacatctacat-3’。3)以sh-3為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-3的雙鏈DNA分子(名稱為sh_CTCF_3)的兩條單鏈DNA序列如下:CTCF-ssDNA1398-3-F (SEQ ID N0.4):5， -tactcgtcctcacaagtgcTTCAAGAGAgcacttgtgaggacgagtacTTTTTA-3> ；CTCF-ssDNA1398-3-R (SEQ ID N0.5):5， -AGCTTAAAAAgtactcgtcctcacaagtgcTCTCTTGAAgcacttgtgaggacgagta-3’。4)以熒光素酶為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-luc的雙鏈DNA分子(名稱為sh-luc)的兩條單鏈DNA序列如下:IucDNA-F:5， -gaagcgcatccaataccagcTTCAAGAGAgctggtattggatgcgcttccTTTTTTTA-3> ；IucDNA-R:5， -AGCTTAAAAAAAggaagcgcatccaataccagcTCTCTTGAAgctggtattggatgcgcttc-3’。上述8條單鏈DNA由Invitrogen公司合成，下劃線部分為Hind III粘性末端序列。各取5 μ g (IOng/ μ I)互補(bǔ)的單鏈DNA混合，100°C熱處理5分鐘后，室溫退火，獲得雙鏈DNA分子，取雙鏈DNA分子5 μ g進(jìn)行磷酸化處理，獲得雙鏈DNA反應(yīng)體sh_CTCF_l、sh-CTCF-2、sh-CTCF-3 和 sh-luc。其中，上述磷酸化處理的反應(yīng)體系(50 μ I):雙鏈DNA5 μ g, IOXT4KinaseBuffer5 μ I, ATP (IOmM) 5 μ I, T4Polynucleotide Kinase (IOU/μ I) 2 μ I,用 ddH20 補(bǔ)充至 50 μ I。上述磷酸化處理的反應(yīng)條件:37°C水浴反應(yīng)I小時(shí)，再100°C 10分鐘后慢慢冷卻到室溫，得到可用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的雙鏈DNA反應(yīng)體。5、鋅指蛋白CTCF的RNA干擾重組表達(dá)載體構(gòu)建I) RNA 干擾重組表達(dá)載體 pDsU6-sh-l、pDsU6-sh-2、pDsU6-sh_3 和 pDsU6_sh_luc的構(gòu)建取載體pDsU6先用Sac I酶切后，用T4Polymerase Klenow片段進(jìn)行末端補(bǔ)平處理，凝膠回收的線性化片段再用Hind III酶切消化，回收pDsU6載體的骨架片段，分別與步驟4獲得的四種雙鏈DNA反應(yīng)體連接，得到四種RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-sh_l、pDsU6_sh_2、pDsU6_sh_3、pDsU6-sh_luc,經(jīng)測(cè)序證實(shí)，pDsU6_sh_l 為用 sh-CTCF-l 替換pDsU6的Sac I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-Ι的重組表達(dá)載體，pDsU6-sh_2為用sh-CTCF-2替換pDsU6的Sac I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-2的重組表達(dá)載體，pDsU6-sh-3為用sh-CTCF-3替換pDsU6的Sac I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-3的重組表達(dá)載體，pDsU6_sh_luc為用sh-luc替換pDsU6的Sac I和Hind III之間片段得到的表達(dá)shRNA-luc的重組表達(dá)載體。2) GFP標(biāo)記的RNA干擾重組表達(dá)載體的獲得載體p DsU6-GFP-sh-l、pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh-3、pDsU6-GFP-sh-luc的構(gòu)建方法:分別取上述構(gòu)建的RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-sh-l、pDsU6-sh-2、pDsU6-sh-3、pDsU6-sh-luc 及表達(dá) GFP 的重組表達(dá)載體 pDsU6_GFP 進(jìn)行 BamH I 和 Hind III雙酶切，消化后的片段經(jīng)凝膠回收；將上述四種RNA干擾重組表達(dá)載體的回收片段分別與pDsU6-GFP載體片段進(jìn)行連接，從而獲得表達(dá)GFP的RNA干擾重組載體pDsU6-GFP-sh_l、pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh_3、pDsU6-GFP-sh_luc，經(jīng)測(cè)序證實(shí) pDsU6-GFP-sh_l 為用sh-CTCF-l替換pDsU6-GFP的BamH I和Hind III之間片段得到的表達(dá)GFP和shRNA-Ι的重組表達(dá)載體；pDsU6-GFP-sh-2 為用 sh-CTCF-2 替換 pDsU6_GFP 的 BamH I 和 Hind III之間片段得到的表達(dá)GFP和shRNA-2的重組表達(dá)載體；PDsU6-GFP-sh-3為用sh-CTCF-3替換pDsU6-GFP的BamH I和Hind III之間片段得到的表達(dá)GFP和shRNA-3的重組表達(dá)載體；pDsU6-GFP-sh-luc為用sh-luc替換pDsU6_GFP的BamH I和Hind III之間片段得到的表達(dá)GFP和shRNA-luc的重組表達(dá)載體。上述載體pDsU6_GFP的構(gòu)建方法如下:以pGFP_Nl (購(gòu)自Clontech)為模板，在引物 P5 (5， -AAGGATCCATTACCGCCATGCATTAG-3，)和 P6 (5，-CCTACGCCTTAAGATACATTG-3，)的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增GFP基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I單酶切，消化片段經(jīng)凝膠回收；取載體pDsU6進(jìn)行Afl II單酶切，用T4Polymerase Klenow片段進(jìn)行末端補(bǔ)平處理,凝膠回收之后線性化片段再用BamH I酶切消化，消化后片段經(jīng)凝膠回收；將這兩種回收片段連接，獲得載體pDsU6-GFP，經(jīng)測(cè)序證實(shí)pDsU6-GFP是用GFP (綠色熒光蛋白)基因替換pDsU6的Afl II和BamH I之間片段得到的表達(dá)GFP的重組表達(dá)載體。
實(shí)施例2、RNAi基因敲除重組載體轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞1、轉(zhuǎn)染用細(xì)胞的培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前24h，用含有10%胎牛血清(FBS)的RPM1-1640培養(yǎng)基在15ml培養(yǎng)皿、37°C和5%C02條件下培養(yǎng)B-ALL細(xì)胞系NALM-6達(dá)到75% 90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2、轉(zhuǎn)染將實(shí)施例1獲得的帶有GFP標(biāo)簽的RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_l、pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh-3 以及載體 pDsU6-GFP-sh_luc (RNAi 陽性對(duì)照，用于沉默熒光素酶基因)分別轉(zhuǎn)染步驟I培養(yǎng)的細(xì)胞，獲得含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh-l的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-l、含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_2的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2、含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_3的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3和含載體pDsU6-GFP-sh_luc的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc。上述轉(zhuǎn)染的具體方法如下:計(jì)數(shù)步驟I培養(yǎng)的NALM-6細(xì)胞密度，取含2 X IO6個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，90g離心5分鐘，棄培養(yǎng)基，采用100 μ I電轉(zhuǎn)液(Nucleofector Solution, Lonza)重懸細(xì)胞；轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至L 5ml Eppendorf管，加入2 μ g DNA質(zhì)粒，指腹輕彈充分混合；將細(xì)胞/DNA混懸液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，避免氣泡，蓋上杯蓋；將電轉(zhuǎn)杯放置于電轉(zhuǎn)儀的電轉(zhuǎn)座(NucleofectorDevice, Lonza)上，選擇電轉(zhuǎn)程序C_005(專適用于NALM-6細(xì)胞系);取2ml預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基(10%F BS)與電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞懸液混合，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，避免對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行反復(fù)抽吸；轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中，37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于下述實(shí)施例的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3、Western Blot檢測(cè)重組白血病細(xì)胞中鋅指蛋白CTCF的表達(dá)取實(shí)施例2中轉(zhuǎn)染72h后的四種重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-l、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2、NALM-6/pDsU6-GFP-sh_3 和 NALM-6/pDsU6-GFP-sh_luc，分別提取總蛋白，以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)參，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，檢測(cè)鋅指蛋白CTCF的一抗為CTCF(分子量83KDa)單克隆抗體(購(gòu)自Millipore)，檢測(cè)內(nèi)參GAPDH的一抗為GAPDH (分子量34KDa)單克隆抗體(購(gòu)自中國(guó)上海康城公司)，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明:含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh-l的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-l、含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_2的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2和含RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_3的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3中，鋅指蛋白CTCF表達(dá)水平均低于對(duì)照含載體pDsU6-GFP-sh_luc的重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc，其中RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP_sh_l和RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh-3的干擾效果較好。上述提取總蛋白的具體方法如下:90g離心5分鐘收集重組白血病細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，加150 300μ I RIPA緩沖液[20mM Tris pH7.5,50mM NaCl,2mM Na3VO4, IOmM NaF, ImM EDTA, 0.l%TritonX-100和蛋白酶抑制劑(Roche)]，冰上裂解30min，收集細(xì)胞。8V電壓超聲10秒X 2次，間隔40秒；4°C, 12000rpm離心30min ;吸取上清,利用Brandford法進(jìn)行蛋白定量；各取20 μ g總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。
Western blot檢測(cè)的具體方法如下:I)電泳及轉(zhuǎn)膜:對(duì)待測(cè)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先在電壓80V下電泳10_30分鐘，待染料前沿進(jìn)入分離膠后，將電壓提高到160V繼續(xù)電泳約I小時(shí)，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，400mA (100V)，I 小時(shí)(或 350mA (95V)，1.5 小時(shí))。2)封閉膜:用 TBS-T 溶液洗(Nacl8.0g,20mlIM Tris-Hcl, Tween_202ml，加蒸餾水950ml，標(biāo)定PH值至7.6，再定容至1L)NC膜10-15分鐘。將NC膜放入含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液中，室溫封閉I小時(shí)(或4°C 12-24小時(shí))。3)免疫雜交:A、一抗孵育:將CTCF單克隆抗體或GAPDH單克隆抗體按1:2000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液中，室溫下與NC膜在脫色搖床上一起孵育約I小時(shí)(40分鐘至I小時(shí)20分鐘)，用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分鐘，重復(fù)3次。B、二抗孵育:將結(jié)合辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG抗體按1:3000稀釋在含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液中，室溫下與NC膜在脫色搖床上一起孵育約45分鐘(40分鐘至I小時(shí)20分鐘)，用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分鐘，重復(fù)3次。4)ECL試劑顯色:使用ECL蛋白雜交檢測(cè)試劑盒(瑞典Amersham公司),參照操作說明進(jìn)行NC膜顯色反應(yīng)。實(shí)施例4、重組白血病細(xì)胞的凋亡檢測(cè)選取RNA干擾效果較好的重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_l和pDsU6-GFP-sh_3進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取實(shí)施例2 中轉(zhuǎn)染72h后的三種重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-l、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3和NALM-6/pDsU6-GFP-sh_luc，分別用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果表明:重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-l、NALM-6/pDsU6-GFP-sh_3和對(duì)照(重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc )的細(xì)胞總凋亡比例分別為7.5%、28%和7.4%，說明RNA干擾重組表達(dá)載體pDsU6-GFP-sh_3能有效降低/抑制CTCF在細(xì)胞中的表達(dá)，NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3細(xì)胞總體凋亡比例是對(duì)照(重組白血病細(xì)胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc)的 3.8 倍。上述流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡百分比的具體方法如下:300g離心5分鐘收集重組白血病細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，使用Annexin V-APC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自美國(guó)BD公司，BD Pharmingen556547)標(biāo)記細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSAria II)收集10000個(gè)GFP陽性的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的凋亡百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察白血病細(xì)胞系在凋亡方面的變化特點(diǎn)。實(shí)施例3、4證明，鋅指蛋白CTCF是一個(gè)抗凋亡因子，在ALL細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，干擾CTCF的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞——白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，并增加白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
權(quán)利要求
1.形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQID N0.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列是SEQ ID N0.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.3。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述短發(fā)夾RNA的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子為I)至3)中的任一種: 1)一條鏈的核苷酸序列是SEQ ID N0.4，另一條鏈的的核苷酸序列是SEQ ID N0.5。
3)所述DNA分子的編碼序列是SEQ ID N0.4的第1_47位； 2)所述DNA分子的編碼序列是SEQID N0.5的第12-58位。
5.與權(quán)利要求1或2所述短發(fā)夾RNA的相關(guān)生物材料，為I)-5)中的任一種: 1)含有權(quán)利要求3或4 所述DNA分子的表達(dá)盒； 2)含有權(quán)利要求3或4所述DNA分子的重組載體、或含有I)所述表達(dá)盒的重組載體； 3)含有權(quán)利要求3或4所述DNA分子的重組微生物、或含有I)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有2)所述重組載體的重組微生物； 4)含有權(quán)利要求3或4所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、或含有I)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、或含有權(quán)利要求2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 5)小干擾RNA，一條鏈的核苷酸序列如SEQID N0.1，另一條鏈的核苷酸序列如SEQ IDN0.2o
6.治療和/或預(yù)防白血病的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品的活性成分包括bl-b3中的至少一種: bl、利要求I或2所述的短發(fā)夾RNA ； b2、權(quán)利要求3或4所述的DNA分子； b3、權(quán)利要求5所述的相關(guān)生物材料。
7.促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品的活性成分包括bl-b3中的至少一種: bl、利要求I或2所述的短發(fā)夾RNA ； b2、權(quán)利要求3或4所述的DNA分子； b3、權(quán)利要求5所述的相關(guān)生物材料。
8.降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)的用途，所述用途為al或a2: al、降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防白血病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； a2、降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)在制備促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述降低鋅指蛋白CTCF基因表達(dá)的物質(zhì)為bl-b3中的至少一種: bl、利要求I或2所述的短發(fā)夾RNA ； b2、權(quán)利要求3或4所述的DNA分子； b3、權(quán)利要求5所述的相關(guān)生物材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其特征在于:所述鋅指蛋白CTCF的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，所述鋅指蛋白CTCF基因的編碼序列如SEQ ID N0.6的第445-2628位所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了降低鋅指蛋白CTCF表達(dá)的物質(zhì)在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。降低鋅指蛋白CTCF表達(dá)的物質(zhì)具體可為形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其名稱為shRNA-3，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQ ID No.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列是SEQ ID No.2。本發(fā)明證明鋅指蛋白CTCF是一個(gè)抗凋亡因子，在ALL細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，干擾CTCF的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明為白血病治療提供了一條新的途徑，鋅指蛋白CTCF有望成為抗白血病治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103233009SQ20131015340
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者鄭胡鏞, 鮑時(shí)來, 張寒, 朱琳, 劉瀟 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院, 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所